Un Papel Para El cido rico En La Progresin De La Enfermedad Renal

Resumen. La hiperuricemia est asociada con

enfermedad renal, pero por lo general se
considera un marcador de la disfuncin renal en
lugar de un factor de riesgo para la progresin.
Estudios recientes han informado que la
hiperuricemia leve en ratas normales inducidas
por el inhibidor de la uricasa, cido oxnico (AO),
result en hipertensin, enfermedad vascular
intrarrenal, y lesin renal. Esto condujo a la
hiptesis de que el cido rico puede contribuir a
la enfermedad renal progresiva. Para examinar el
efecto de la hiperuricemia en la progresin de la
enfermedad renal, las ratas se alimentaron con AO
2% durante 6 semanas despus de nefrectoma de
5/6 del rin (RK) con o sin el inhibidor de la
xantina oxidasa, alopurinol, o el agente
uricosrico,
benziodarona.
Dadas
las
observaciones de que el cido rico induce la
enfermedad vascular, tambin se analiz el efecto
del cido rico en las clulas del msculo liso
vascular en cultivo. Ratas RK desarrollaron
hiperuricemia transitoria (2,7 mg/dl en la semana
2), pero entonces los niveles volvieron a la lnea
de base a la semana 6 (1,4 mg/dl). En contraste,
Ratas RK+AO desarrollaron hiperuricemia ms alta
y ms persistente (6ta semana, 3,2 mg / dl). Las
ratas hiperuricmicas demostraron mayor presin
arterial (PA), mayor proteinuria y creatinina srica
en relacin a las ratas RK. Las ratas RK
hiperuricmicas tenan mayor hipertrofia renal y
glomeruloesclerosis (24,2 2,5 versus 17,5
3,4%;

P< 0,05) y fibrosis intersticial (1,89 0,45

versus
1,52 0,47; P< 0,05). Las ratas
hiperuricmicas
desarrollaron
enfermedad
vascular que consiste en el engrosamiento de las
arterias preglomerulares con proliferacin de las
clulas de msculo liso; estos cambios fueron
significativamente ms graves que un grupo RK
histrico con PA similar. El alopurinol redujo
significativamente los niveles de cido rico y
bloque los cambios funcionales e histolgicos
renales. Benziodarona redujo los niveles de cido
rico menos efectivamente y slo mejor
parcialmente PA y la funcin renal, con un efecto
mnimo sobre los cambios vasculares. Para
comprender
mejor
el
mecanismo
de
la
enfermedad vascular, la expresin de COX-2 y de
la
renina
fue
examinada.
Las
ratas
hiperuricmicas mostraron un aumento de la
expresin de la renina renal y COX-2; este ltimo,
especialmente
en
los
vasos
arteriales
preglomerulares. En estudios in vitro, las clulas
musculares lisas vasculares cultivadas con cido
rico tambin generaron COX-2 con una
proliferacin tiempo-dependiente, lo que fue
impedido por cualquier inhibidor del receptor de
COX-2 o TX-A2. La hiperuricemia acelera la
progresin renal en el modelo RK a travs de un
mecanismo relacionado con presin arterial
sistmica alta y mediado por COX-2; la
enfermedad vascular inducida por tromboxano.
Estos estudios proporcionan evidencia directa de
que el cido rico puede ser un verdadero
mediador de la enfermedad renal y su progresin.

La
hiperuricemia
ha
sido
asociada
con
enfermedad renal. Aproximadamente 20 a 60% de
los pacientes con gota tienen insuficiencia renal
leve o moderada; antes de la disponibilidad de
agentes reductores de cido rico, alrededor de
10 a 25% de los pacientes con gota desarrollaron
enfermedad renal en etapa terminal. La lesin
histolgica denominada "nefropata gotosa" se
compone
de
glomerulosclerosis,
fibrosis
intersticial, y arteriolosclerosis renal, a menudo
con depsito focal intersticial de cristales de
urato. Estos hallazgos histolgicos se han
observado en las autopsias de 79 a 99% de los
pacientes con gota.

A pesar de la asociacin de gota con enfermedad

renal, existe controversia en cuanto a si el cido
rico tiene un papel etiolgico. En primer lugar,
ha sido difcil atribuir la lesin renal generalizada
en la gota a la deposicin de cristales de urato, ya
que a menudo slo son focalmente presentes. En
segundo lugar, muchos pacientes con gota tienen
hipertensin o son de edad avanzada, y las
lesiones renales podran simplemente reflejar el
dao renal hipertensivo o asociarse con el
envejecimiento. En tercer lugar, los resultados de
los estudios se mezclan en cuanto a si la
reduccin de cido rico ralentizar la progresin
renal en pacientes con gota. La incapacidad para
resolver este problema ha hecho hincapi en la
necesidad de estudios adicionales.

Para investigar el papel de cido rico en la

enfermedad renal, se desarroll recientemente un
modelo de la hiperuricemia en ratas. La mayora
de los mamferos tienen un cido rico srico bajo
debido a la presencia de uricasa; en los seres
humanos y los grandes simios, el gen de la
uricasa est mutado y se vuelve no funcional. Por
lo tanto, se indujo hiperuricemia inducida en
ratas al proporcionar dosis bajas de cido oxnico,
un inhibidor de la uricasa. A diferencia de los
modelos anteriores de inhibicin de uricasa, que
se traducen en uricosuria masiva con deposicin
de cristales intrarrenales y nefropata obstructiva;
este modelo ha dado lugar a una hiperuricemia
leve y sin depsito de cristales intrarrenales. Sin
embargo, se desarroll lesin renal intersticial
sutil, y esta se asoci con la activacin del
sistema renina-angiotensina (SRA) y el desarrollo
de hipertensin. Los animales hiperuricmicos
tambin desarrollaron una arteriolopata aferente
independiente de los cambios en la PA. La lesin
vascular fue mediada en parte por efectos
directos de cido rico para inducir la
proliferacin vascular de clulas de msculo liso
(VSMC) y tambin por la activacin del SRA.
Mientras que la hiperuricemia indujo lesin renal y
enfermedad vascular en ratas normales, tambin
demostr acelerar la lesin vascular inducida por
ciclosporinas y la enfermedad renal intersticial. La
exacerbacin de la nefrotoxicidad por ciclosporina
mediada por el cido rico tambin se asoci con
un aumento de la activacin del SRA y el bloqueo
de las vas especficas de xido ntrico.
La observacin de que la hiperuricemia leve
activa el SRA y causa la enfermedad renal a
travs de una va independiente de cristales
plante la hiptesis de que la hiperuricemia puede
ser un factor de riesgo general para la progresin
renal. Curiosamente, la hiperuricemia es una
caracterstica comn de la enfermedad renal de
todas las etiologas; cuando la tasa de filtrado
glomerular (TFG) cae, aumenta el cido rico en
suero debido a la excrecin renal reducida. La
hiperuricemia en pacientes con insuficiencia renal
es generalmente leve, debido a un aumento
compensatorio en la excrecin fraccional,
reduccin de la produccin, y el aumento de la
excrecin de cido rico a travs de vas no
renales (gastrointestinales). Debido a que la
hiperuricemia es a menudo leve, la gota es rara
en pacientes con enfermedad renal en fase
terminal y el aumento de cido rico es a menudo
considerado inocuo. Sin embargo, la posibilidad
de
que
la
hiperuricemia
podra
estar
contribuyendo a la progresin renal no ha sido
probada. Para probar esta hiptesis, se analiz el
papel del cido rico en el modelo clsico de la
progresin renal inducida por la nefrectoma 5/6
(modelo de rin remanente). Adems, dado el
hecho de que en la corteza renal se incrementa la

expresin de COX-2 despus de la ablacin renal

subtotal y la COX-2 es un regulador importante de
la produccin de renina, tambin se investig los
cambios en la COX-2 por hiperuricemia.

Materiales y Mtodos
Protocolo Experimental
Todos los procedimientos en animales fueron
aprobados por los Comits de Cuidado de
Animales de la Universidad de Washington y el
Colegio Baylor de Medicina. Las ratas macho
Sprague-Dawley (190 a 200 g; Simonsen
Laboratorios, Gilroy, CA) fueron sometidos a un
rin remanente (RK) operacin despus de la
medicin de lnea de base de PA y la funcin
renal. La operacin de RK se realiz mediante una
nefrectoma derecha subcapsular y la reseccin
quirrgica de los tercios superiores e inferiores del
rin izquierdo en total de 17 ratas. Despus de la
asignacin al azar por el porcentaje de peso del
rin remanente eliminado [(peso del rin
derecho-Peso de polos superior e inferior del rin
izquierdo) / peso del rin derecho X 100], los
animales se dividieron en cuatro grupos. El grupo
1 (n=4) recibi dieta normosdica (dieta NS)
(0,27% NaCl) (RK); el grupo 2 (n=5) recibi dieta
conteniendo cido oxnico 2% (AO, inhibidor de
uricasa heptica; Sigma, St. Louis, MO) (RK+AO);
el grupo 3 (n=4) recibieron dieta NS + AO 2% y
alopurinol (inhibidor de la xantina oxidasa, 13
mg/dl en el agua potable; Schein Pharmaceutical,
Florham Park, NJ) (RK+AO+AP); y el grupo 4 (n=4)
recibi dieta NS, AO 2% y benziodarona (agente
uricosrico, 13 mg/dl en el agua potable; Sanofi,
Barcelona, Espaa) (RK+AO+BZ). EL AO 2%
podra ser dado sin aparente toxicidad en ratas de
acuerdo con los estudios anteriores, y no hubo
mortalidad durante el perodo de estudio. Las
dosis de AP y BZ se determinaron sobre la base
del efecto de disminucin de cido rico en los
estudios anteriores. Las ingestas diarias medias
de alopurinol y benziodarona fueron de 20,4
5,3 mg/kg por da y 21,3

6,2 mg/kg por da

en los grupos RK+AO+AP y RK+AO+BZ,

Respectivamente. A las 6 semanas, las ratas se
sacrificaron para la evaluacin histolgica.

PA sistlica, cido rico, proteinuria

y la funcin renal
La PA sistlica se control mediante un manguito
de esfigmomanmetro en la cola utilizando un
sistema automatizado con un sensor fotoelctrico
(CITI; Ciencias de la Vida, Woodland Hills, CA) que
ha
demostrado
que
se
correlaciona
estrechamente con la medicin intraarterial de PA.
Todas
las
ratas
fueron
acondicionadas
previamente para esta mquina al menos dos

veces antes de la medicin real de la PA. La

concentracin de cido rico en suero se
determin mediante el mtodo de carbonato de
fosfotungstato y el mtodo estndar de cido
rico (Sigma, St. Louis, MO). La excrecin de
protenas urinarias (24 h) se midieron usando el
mtodo del cido sulfosaliclico, y el nitrgeno
ureico en sangre y la creatinina se determinaron
colorimtricamente utilizando un kit comercial
(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO).

Morfologa
Renal
inmunohistoqumica

Los tejidos para su examen microscpico y tincin

con inmunoperoxidasa fueron fijados en solucin
de metilo de Carnoy y embebidos en parafina.
Secciones de 4 micras se tieron con el reactivo
de cido perydico de Schiff (PAS) y contrastadas
con hematoxilina. La tincin de inmunoperoxidasa
indirecta de las secciones de 4 micras se realiz
como se ha descrito anteriormente, con
anticuerpos
monoclonales
especfico
y
anticuerpos policlonales dirigidos a los siguientes
antgenos: actina de msculo liso (-SMA) con
anticuerpo monoclonal de ratn (SM-1; Sigma,
St. Louis, MO), renina con anticuerpo monoclonal
de
ratn
anti-humano
(Sanofi
Recherche,
Motpellier, Francia); colgeno
tipo III con
anticuerpo de cabra anti-humano (Southern
Biotechnology, Birmingham, AL); COX-2 con el
anticuerpo policlonal de conejo anti-ratn
(Cayman, Ann Arbor, MI); monocitos-macrfagos
con anticuerpo monoclonal de ratn ED-1
(Serotec, Indianapolis, IN). Los controles incluan
la omisin del anticuerpo primario y la sustitucin
del anticuerpo primario con el conejo preinmune o
suero de ratn.
Para examinar si existe alguna evidencia de
proliferacin endotelial o del msculo liso, se
realiz doble inmunotincin con actina de las
clulas musculares lisas y un anticuerpo contra el
antgeno nuclear de proliferacin celular (PCNA)
(PC 10; Cappel, Aurora, OH). Las secciones de
tejido se incubaron primero con el anticuerpo
PCNA durante la noche a 4 C, seguido
secuencialmente por IgG biotinilado de caballo
anti-ratn en suero, conjugado con peroxidasa de
avidina D, y el desarrollo de color con
diaminobencidina (DAB) con cloruro de nquel.
Despus de la incubacin en H2O2 al 3% durante
8 min para eliminar cualquier actividad de
peroxidasa remanente, las secciones se incubaron
con anticuerpo primario durante 3 h a
temperatura ambiente, seguido IgG biotinilado de
caballo anti-ratn durante 30 min a temperatura
ambiente. Despus de la incubacin con fosfatasa
alcalina de estreptavidina (Vector, Burlingame,
CA), se desarroll el color usando el kit de
sustrato de AP-RED (Zymed, San Francisco, CA).

Cuantificacin de datos morfolgicos

Todos los anlisis fueron ciegos. El nmero de
clulas endoteliales y de msculo liso fueron
contados en la arteriola aferente, la arteria
interlobular, y la arteria arqueada. Se evaluaron
todas las arteriolas y arterias seccionadas
transversalmente disponibles en cada seccin.
Los
buques
que
no
fueron
seccionados
transversalmente, proporcionando una pared
asimtrica, se excluyeron del presente anlisis.
Para evaluar la hipertrofia de clulas del msculo
liso y/o hiperplasia, el rea de la pared de la
seccin transversal y el grosor de cada arteria se
midi por anlisis de imgenes por ordenador
(Optimas 6.2; Media Cybernetics, Silver Springs,
MD). Las arterias y arteriolas se identificaron por
su localizacin anatmica y el patrn de
ramificacin de los vasos circundantes y la forma
del endotelio y las clulas musculares lisas, que
se describen en otra parte. Teniendo en cuenta el
ciclo de reduccin continua de la arteria
interlobular, se evalu la arteria interlobular en el
mismo nivel de cada rin (1/3 proximal de la
unin cortico-medular). Las arteriolas aferentes
cuidadosamente diferenciadas de las arteriolas
eferentes por sus caractersticas generales,
incluyendo la presencia de clulas endoteliales
finas y continuas con una pared de msculo liso
ms gruesa que la de la arteriola eferente.
La expresin de renina se cuantific por el nmero
de glomrulos con tincin positiva para la renina
yuxtaglomerular utilizando un mnimo de 40
glomrulos en cada biopsia, un mtodo que ha
sido previamente demostrado que se correlaciona
con cambios en el contenido de la renina tejido.
La expresin de COX-2 cortical se midi como el
porcentaje de rea positiva a inmunotincin a
COX-2 en la corteza renal utilizando el analizador
de imgenes computarizado. El porcentaje de
glomeruloesclerosis y la puntuacin de fibrosis
tubulointersticial (0-5) se evaluaron sobre la base
de la tincin de PAS como se describi
anteriormente.

Generacin de Ratas COX-1 y COX-2

ribosonda para ensayo de proteccin
de RNasa (RPA)
Un fragmento de ADNc de COX-1 producido por
BstX1 (desde el bp 1350 a bp 1690), 340 bp, se
embota y se subclon en el sitio Smadi de
pGEM4Z. Un fragmento de 241 bp de rata COX-2
de ADNc producido por BamHI y EcoRI (desde el
bp 409 hasta el bp 650) se subclon en pGEM4Z.

RPA para COX-1 y COX-2 ARNm

Despus de la incubacin de VSMC con cido
rico para 4, 8, y 24 h, el ARN total se prepar a
partir las monocapas de VSCM utilizando el

protocolo de aislamiento de ARN total de

RNeasy96 fabricado por Qiagen (Valencia, CA).
Despus de la determinacin de la pureza del ARN
y la concentracin por espectrofotometra, 2 g
de muestras de ARN se hibridaron durante 30
minutos a 90 C con una mezcla de ribosonda
marcada con 32P-UTP y la limpieza de genes (L32)
(1 x

105

cpm para cada sonda), y el EPR se

realiz como se ha descrito previamente

utilizando un kit RPA (21) (Torrey Pines Biolabs,
Houston, TX) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La hibridizacin del ARN protegido se
desnaturaliz a 85 C y fue sometido a
electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%.
Los geles se transfirieron a papel de filtro
Whatman 3M, se secaron, y se expusieron a una
pelcula estera Kodak X-O durante la noche a -70
C.

Efecto in-vitro del cido rico y del

inhibidor selectivo de COX-2 sobre la
proliferacin de clulas musculares
lisas
Las ratas de clulas musculares lisas vasculares
(RVSMC) fueron adquiridas de la American Type
Culture Collection (CRL-2018) y se cultivaron en
DMEM suplementado con FBS 10%, gentamicina
(G418, 50 mg/ml), y L-glutamina. Despus de que
le crecimiento celular fue de 70%, confluyeron en
placas de mltiples pocillos (Beckton Dickinson,
Franklin Lakes, NJ), el medio de cultivo fue
cambiado a un medio libre de suero durante 24 a
48 h antes de cada experimento. Despus de la
sincronizacin del crecimiento celular, las clulas
se lavaron tres veces con HBSS y se expusieron a
cido rico (3 mg/dl) (Sigma, St. Louis, MO) para
6, 24, 48, y 72 h. En cada punto de tiempo, el
nmero de clulas se cont por hemocitmetro y
contador Coulter. Alternativamente, se determin
el nmero de clulas usando el ensayo de
proliferacin celular CellTiter (Promega, Madison,
WI). La proliferacin celular tambin se evalu
mediante la medicin de la captacin de timidina
3H. El efecto de un inhibidor selectivo de la COX-2
(NS398 [10

M/L]; Cayman Chemical, Ann

Arbor, MI) y el tromboxano A2 (TXA-2) antagonista

de los receptores (SQ-29548 [2,5 M/ml?]; Biomol,
Plymouth Meeting, PA) sobre la proliferacin de
SMC inducida por cido rico, tambin fue
evaluada. No haba pruebas de citotoxicidad a las
concentraciones de todos los reactivos utilizados,
como se documenta mediante tincin con azul de
tripano y la liberacin de LDH.

Anlisis estadstico

Todos los datos se presentan como media de SD

. Las diferencias en los diferentes parmetros

entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de
dos vas, seguido de la correccin para
comparaciones mltiples. Las diferencias en los
parmetros en cada punto de tiempo despus de
la ciruga RK y administracin de medicamentos
se compararon mediante la prueba de t pareada.
La relacin entre las variables fue evaluada
mediante el anlisis de correlacin de Pearson. La
significancia se define como P< 0.05.

Resultados
La hiperuricemia induce hipertensin
e hipertrofia renal en el modelo de
rin remanente
Los niveles basales de cido rico promedio
fueron de 1,1 mg/dl en los cuatro grupos (Figura
1). En ratas RK, se observ un aumento transitorio
de cido rico (semana 2, 2,7

0,6 mg/dl, P<

0,05), pero los niveles regresaron al nivel basal en

la semana 6 (1,4

0,5 mg/dl). En contraste,

las ratas RK+AO desarrollaron hiperuricemia ms

grave y persistente (semana 2, 4,0
mg/dl; semana 6, 3,2

0,6

0,6 mg/dl; P< 0,01

versus solo RK la semana 2 y 6).

Este aumento de cido rico en suero en ratas
RK+AO fue seguido por una elevacin de la
presin arterial a las 4 semanas en comparacin
con las ratas solo RK (Figura 1B). Alopurinol, un
inhibidor de la xantina oxidasa, disminuy
significativamente el nivel de cido rico en el
suero y previno el desarrollo de la hipertensin.

La
hiperuricemia
acelera
la
progresin renal en el modelo de
rin remanente
Los niveles basales de creatinina en suero fueron
comparables en cuatro grupos (RK versus RK+ AO
versus RK+ AO+ AP versus RK+ AO+ BZ, 0,72

0,01 versus 0,69

0,05 versus 0,70

0,04 versus 0,75

0,03 mg/dl). A las 6

semanas de administracin de AO, ratas RK+ AO

mostraron peor funcin renal con alta creatinina
en suero en comparacin con el grupo de slo RK
(1,44

0,08 versus 1,23

0,13 mg/dl, RK+

AO versus RK; P< 0,05). La administracin de

alopurinol o benziodarona impidi el aumento de
la creatinina srica (RK+ AO+ AP, 1,12

0,15

mg/dl; RK+ AO+ BZ, 1,23 0,15 mg/dl; p< 0,05

versus RK+AO, respectivamente).

Figura 1. Cambios del cido rico en suero (A) y PA (B) en el

rin remanente (RK; ), rin remanente + cido oxnico
(RK+AO ---), rin remanente + cido oxnico +
alopurinol (RK + AO + AP X-), y el rin remanente + cido
oxnico + benziodarona (RK + OA + BZ -o-). P< 0,05 de RK
versus RK +AO + AP.

Benziodarona (agente uricosrico) slo redujo

parcialmente el cido rico y tuvo un menor
efecto sobre la presin arterial (Figura 1).
Durante el perodo de estudio, la ingesta media
diaria de alimento fue similar entre los grupos (RK
versus RK+AO versus RK+ AO+ AP frente RK+
AO+ BZ, 24
22

0,4 frente a 21

0,6 frente a 22

0,5 frente a

Despus de la ablacin renal, las ratas RK

mostraron un aumento progresivo de la excrecin
urinaria de protenas. La administracin de AO en
ratas RK result en mayor proteinuria a las
semanas 4 y 6 (Figura 2) en comparacin con las
ratas RK. Tanto el alopurinol y benziodarona
impidieron el aumento de la proteinuria obtenida
por AO (Figura 2). El alopurinol fue especialmente
eficaz y redujo la proteinuria en el mismo nivel
que el observado en el modelo RK solo.
Las ratas RK mostraron evidencia clsica de
enfermedad
renal
progresiva
con
glomeruloesclerosis focal y fibrosis intersticial. Las
ratas
RK+AO
mostraron
caractersticas
histolgicas similares; en particular, no hubo
evidencia de obstruccin tubular a partir de
cristales. La glomeruloesclerosis fue ms comn
en las ratas RK+AO en comparacin con las ratas
RK (24,2

2,5 versus

17,5

3,4%; P<

0,05) (Figura 3).

0,5 g/kg). A pesar de

la ganancia de peso corporal comparable, el peso

del rin remanente (RKW) y la relacin RKW/peso
corporal (PC) a las 6 semanas fueron
significativamente mayores en ratas RK+AO, lo
que sugiere una hipertrofia renal ms severo
(Tabla 1). El porcentaje de aumento en RKW/PC en
ratas RK+AO fue de 1,6 veces en comparacin
con las ratas RK (RK+ AO versus RK, 380,4
37,3 versus 241,9

20,5%; P< 0,05). La

hipertrofia renal inducida por el cido oxnico se

previno significativamente por la administracin
de alopurinol o benziodarona (Tabla 1).
Figura 2. Cambios en la proteinuria en las ratas RK, (),
RK+AO (-), RK + AO + AP (X-), y RK + OA + BZ (-o-).

*P< 0,05 de RK versus RK +AO + AP. #P< 0,05 de RK versus

RK +AO + AP versus RK +AO + BZ

La fibrosis intersticial tambin fue mayor en las

ratas RK+AO en comparacin con solo RK (1,89

0,45 versus 1,52

0,47; P< 0,05) (Figura

3). El alopurinol impidi tanto el aumento de la

glomeruloesclerosis y fibrosis intersticial. En
contraste, el agente uricosrico, benziodarona,
fue capaz de prevenir el aumento de la
glomerulosclerosis pero no el aumento de la
fibrosis intersticial en ratas RK+AO (Figura 3).

La Hiperuricemia Induce Enfermedad

Vascular Preglomerular Severa en
Ratas RK
Los vasos arteriales preglomerulares (arteria
arqueada, arterias interlobulares, y arteriolas
aferentes) de las ratas RK+AO mostraron
diferencias dramticas en comparacin con las
ratas de control RK (Figura 4, A a C). Las ratas
RK+AO mostraron un marcado incremento en el
espesor de la pared del vaso, as como un
aumento en el nmero de clulas del msculo liso

(Figura 4B). En algunas ratas RK+AO, los vasos

arteriales mostraron cambios consistentes con
una arteriopata obliterante (Figura 4C). La doble
tincin de PCNA y -SMA documentaron la
presencia de numerosa proliferacin SMC en el
grupo de ratas RK+AO en comparacin con las
ratas de control RK (Figura 4, D y E).
La fibrosis adventicia periarterial tambin fue
prominente en las ratas RK+AO (Figura 4F) en
asociacin con mayor infiltracin celular. La
cuantificacin del nmero de clulas de msculo
liso en proliferacin (PCNA / -SMC + clulas) y el
espesor de la pared medial de los diversos vasos
preglomerulares se muestra en la Tabla 2. Otro
hallazgo
caracterstico
en
los
vasos
preglomerulares era la infiltracin de macrfagos
inflamatorios evaluados por clulas ED-

+
1 ,

especialmente en reas subendoteliales y

adventicia. Tambin hubo algunas clulas ED-

+
1 en el medio.

Tabla 1. Cambios en el peso corporal (PC) y en el peso del rin remanente (RKW) a las 6
semanas

AO, cido oxnico; AP, alopurinol; BZ, benziodarona. Los datos son expresados en el promedio de SD
PC basal y RKW despus de 6 semanas de la ciruga RK.
Incremento RKW= (RKW/PC en la sexta semana)/ (RKW basal/PC) X 100.
RKW basal= Peso basal del rin derecho - (peso del polo superior e inferior del rin izquierdo).
e= P < 0.05 versus RK, RK+AO+AP, y RK+AO+BZ.

El alopurinol previno significativamente la

proliferacin de las clulas musculares lisas (SMC)
y el engrosamiento de la pared engrosamiento de
la arteriola aferente y la arteria interlobular en
ratas RK-OA (Tabla 2). Por el contrario,
benziodarona no mostr ningn efecto sobre la
proliferacin de SMC. Curiosamente, el nmero de
clulas endoteliales en las arterias interlobulares
y arqueadas tambin se increment con la
administracin de AO (Tabla 2) y no se vio
afectada por la administracin de alopurinol o
benziodarona.

vascular observada en las ratas RK+AO podra

atribuirse a lesin inducida por una presin ms
alta. Para diferenciar el efecto de la elevacin de
la hiperuricemia inducida por la PA de la
hiperuricemia en s, sobre la proliferacin de SMC,
se evaluaron los cambios en los vasos
preglomerulares en un grupo control RK con PA
comparable a las ratas RK+AO (n=6; RK+AO
versus RK histrico con PA alta, 177,8
versus 175,7

20,1

45,8 mm de Hg; p= NS) y los

pesos corporales (336,6

23,2 versus 362,5

55,4 g; p= NS). Como se muestra en la

Figura 5, el nmero de clulas musculares lisas de

las arterias preglomerulares en las ratas RK+AO
fue mayor en comparacin con las ratas RK con
PA comparable. Esto sugiere que el aumento de
PA observada en las ratas RK+AO no tiene en
cuenta las diferencias en lesin vascular
observadas.

Figura 3. Comparacin de las cicatrices renales. (A)

glomeruloesclerosis; (B) fibrosis tbulo-intersticial en las ratas
RK, RK+AO, RK+AO+AP, RK+AO+BZ. *p< 0.05 versus RK,
RK+OA+AP, y RK+AO+BZ; #p< 0.05 versus RK and RK+AO+AP.

Figura 5. Efecto de la hiperuricemia en la proliferacin de SMC

independiente de PA. El nmero de clulas musculares lisas
(SMC) de las arterias interlobulares en las ratas RK+AO fue
significativamente mayor en comparacin con las ratas RK con
PA comparable. *p< 0,05 versus PA normal, RK, y RK con PA
elevada.

Figura 4. La morfologa de los vasos preglomerulares en las

ratas RK y RK+AO. En comparacin con las ratas RK (A, X400,
PAS; D, X400, doble tincin PCNA+ -SMA), hubo marcado
engrosamiento de la pared con proliferacin de clulas
musculares lisas (SMC) en ratas RK+AO (B, X400, PAS; E,
X400, doble tincin PCNA+ -SMA). Las arterias ocasionales en
las ratas RK+AO mostraron un aumento en el nmero de
clulas musculares lisas, la migracin de SMC en la ntima
consistente con una arteriopata obliterante (C, X400, PAS). La
fibrosis perivascular de la adventicia tambin era prominente
en las ratas RK+AO (F, X400, inmunotincin de colgeno III).

El papel de la PA en los cambios

vasculares
inducidos
por
la
hiperuricemia
Debido a que las ratas RK+AO tenan mayor PA
sistlica en comparacin con las ratas de control
RK (Figura 1), la hiptesis de que la lesin

La hiperuricemia activa el SRA y la

va de COX-2 en el modelo RK
Hemos
informado
anteriormente
que
la
hiperuricemia incrementa la expresin de renina
en las clulas yuxtaglomerulares de las ratas
normales y en ratas tratadas con ciclosporina.
Tambin hemos demostrado que la arteriopata
preglomerular en ratas hiperuricmicas se puede
prevenir mediante el tratamiento con inhibidores
de la ECA o bloqueadores del receptor de
angiotensina II tipo 1 (AT1). Por ello, se investig
si
existe
incremento
de
la renina por
hiperuricemia en el modelo RK.
En consonancia con los otros estudios, se hall
una mayor expresin de renina en ratas RK+AO
versus solo RK (RK+AO versus RK, 39,2

7,39

versus a 31,2

4,48% de glomrulos con

tincin de renina yuxtaglomerular; p< 0,05). Tanto

alopurinol (20,2
(27,8

7,93%) como benziodarona

8,35%) redujeron significativamente la

expresin de renina renal inducida por AO

(p<0,005). Hubo una fuerte correlacin entre la
cantidad de renina con el cido rico en suero, en
ratas individuales (

0,52; p< 0,05) (Figura 6).

Figura 6. Correlacin del cido rico srico con la expresin de

renina en la corteza renal

Un importante regulador de la expresin de renina

es la ciclooxigenasa 2 (COX-2). Por lo tanto, se
examin la expresin de COX-2 en este modelo.
En
la
corteza
de
la
rata
normal,
la
inmunoreactividad a COX-2 est presente casi
exclusivamente en las clulas de la mcula densa.
De acuerdo con los estudios de Wang et al. en el
modelo RK, la expresin de COX-2 se increment
en las ratas RK en comparacin con las ratas
normales

(0,10

0,01

versus

0,24

0,05%; p< 0,05), especialmente en las clulas

tubulares de la rama ascendente cortical. Las
ratas RK+AO mostraron an mayor expresin de
COX-2 que implicaba no slo a la rama
ascendente cortical, sino tambin las clulas del
msculo liso en las arteriolas aferentes e
interlobulares (Figura 7).

Figura 7. Expresin de COX-2 en las ratas RK y RK+AO. En las

ratas normales y ratas RK, la inmunoreactividad a COX-2 est
presente casi exclusivamente en las clulas de la mcula
densa (A, ratas RK, x200), mientras que en las ratas RK+AO se
muestran mayor expresin de COX-2, que involucra no slo a
las clulas tubulares de la rama ascendente gruesa cortical,
sino tambin s las clulas de msculo liso en las arteriolas
aferentes (C, x400, flecha) y las arterias interlobulares (D,
x400).

El aumento de la expresin de COX-2 se cuantific

por anlisis de imagen computarizado de la
corteza.
Las
ratas
RK+AO
mostraron
significativamente mayor expresin de COX-2 que
las ratas solo RK (0,24

0,05 versus 0,70

0,36%; p< 0,05); y alopurinol (0,27

como benziodarona (0,48

0,18%) y

0,26%) podran

impedir el aumento de la expresin COX-2. Dentro

de las ratas individuales, los niveles de cido rico
estuvieron directamente correlacionados con el
grado de expresin de COX-2 (Figura 8A). A su
vez, la expresin de la COX-2 tambin se
correlacion con el aumento de la renina
yuxtaglomerular (Figura 8B). Estos estudios
demuestran que tanto la COX-2 y SRA se indujo
con la hiperuricemia en el modelo RK.

Tabla 2. Cambios macrovasculares en las ratas RK y ratas RK + administracin AO

a los datos son expresados como un promedio de SD

. SMC, clulas musculares lisas. CE, clulas endoteliales.

b p< 0.05 versus RK and RK+AO+ AP.

c p<0.05 versus RK.

de msculo liso (VSMC) en la aorta de la rata

(Figura 9A).

Figura 8. Correlacin de la expresin de COX-2 con la expresin

de cido rico srico (A) y renina (B)

El
cido
rico
estimula
la
proliferacin
de
las
clulas
musculares lisas vasculares (VSMC)
a travs de la va de COX-2
La observacin de que el cido rico indujo
enfermedad vascular independientemente de la
PA sugiri un potencial efecto directo del cido
rico en las clulas musculares lisas. De acuerdo
con la constatacin in vivo, la estimulacin con
cido rico (3 mg/dl; Sigma, St. Louis, MO) result
en un incremento tiempo-dependiente de clulas

Se observ la expresin in-novo de COX-2 de

msculo liso en la pared vascular de las ratas
RK+AO; por lo tanto, la hiptesis de que la
expresin de COX-2 inducida por cido rico,
puede desempear un papel importante en el
desarrollo de arteriopata observado en las ratas
RK+AO. En consonancia con esta observacin, se
encontr que el cido rico podra inducir un
aumento marcado del ARNm de COX-2 en clulas
musculares lisas vasculares cultivadas (Figura 9B),
mientras que se observ una expresin
comparable de ARNm de COX-1. Para determinar
el papel de la COX-2 en la proliferacin de SMC, se
examin el efecto de un inhibidor selectivo de la
COX-2 (NS398 [10 M/L]: Cayman Chemical, Ann
Arbor, MI) en el nmero de SMC. NS398 inhibe
significativamente la proliferacin de SMC
inducida por el cido rico (Figura 9C), lo que
sugiere el posible papel de las prostaglandinas
generadas por la COX-2 en la proliferacin de SMC
mediada por el cido rico. Es importante
destacar que, NS398 no afect el nmero de
clulas en ausencia de estimulacin de cido
rico. Estudios previos han informado que la
angiotensina II inducida por la proliferacin de
VSMC es mediada por la generacin de COX-2 y
tromboxano (TXA-2). Por lo tanto, se plante la
hiptesis de que TX-A2 puede ser un mediador
probable de la respuesta proliferativa de VSMC a
cido rico. VSMC se incubaron con cido rico (3
mg/dl) en ausencia o en presencia del antagonista
selectivo TXA2 (SQ-29548 [2,5 M/ml]; Biomol,
Plymouth
Meeting,
PA).
SQ-29548
redujo
significativamente la proliferacin de SMC
inducida por cido rico.

La hiperuricemia es frecuente en pacientes con

enfermedad renal, pero casi nunca ha sido
considerado como un factor de riesgo para la
progresin. Sin embargo, dos estudios han
encontrado que la hiperuricemia es un factor de
riesgo independiente para la progresin de la
nefropata por IgA. Adems, en un estudio
reciente de 6400 sujetos con funcin renal
normal, un cido rico srico >8,0 mg/dl, en
comparacin con un nivel de cido rico srico
<5,0 mg/dl, se asoci con un 2,9 veces mayor
riesgo de el desarrollo de insuficiencia renal
dentro de 2 aos en los hombres y un aumento
del riesgo 10,0 veces mayor en las mujeres. Este
aumento del riesgo relativo fue independiente de
la edad, ndice de masa corporal, presin arterial
sistlica, colesterol total, albmina srica,
glucosa, tabaquismo, consumo de alcohol, hbitos
de ejercicio, proteinuria y hematuria. De hecho,
un cido rico elevado era ms predictivo para el
desarrollo de insuficiencia renal de proteinuria.
Por ello, se investig los efectos y el mecanismo
de accin de la hiperuricemia en la progresin de
la enfermedad renal en el modelo clsico RK en
ratas.
El cido rico srico aument en las ratas RK,
pero fue mayor en las ratas en que se administr
AO 2% (inhibidor de la uricasa). El nivel de cido
rico srico alcanz su punto mximo a las 2
semanas, tanto en ratas RK y RK+AO y luego
disminuy gradualmente durante las 4 semanas
siguiente. La cada de cido rico en las ratas RK
y RK+AO puede reflejar excrecin extrarrenal
(principalmente
entrica)
y la produccin
deprimida de cido rico (reduccin de la
actividad xantina oxidasa) en la insuficiencia renal
crnica como inform Vaziri et al.

Figura 9. Proliferacin VSMC inducida por el cido rico a

travs de la va COX-2. La estimulacin con cido rico (3
mg/dl, -) result en incremento tiempo-dependiente en
el nmero clulas de msculo liso de la aorta (A, n= 6) en
comparacin con los medios de control sin cido rico ( --o--).
Se observ un marcado aumento de la expresin de ARNm de
COX-2 en VSMC cultivadas a las 4 y 8 h despus de la
estimulacin con cido rico (B, n=3) en contraste con ningn
cambio en la expresin de ARNm de COX-1. Los inhibidores
selectivos de COX-2 (NS398, 10 M/L) inhibieron la
proliferacin de SMC inducida por cido rico, mientras que
NS398 no afect la absorcin de 3H-timidina en ausencia de
estimulacin UA (C, n=6 por grupo). *p< 0,01 versus otros
grupos.

Discusin

Se encontraron varios descubrimientos nuevos en

este estudio. El principal hallazgo novedoso fue
que
hiperuricemia
moderada
exacerb
marcadamente la progresin renal. En concreto,
las ratas hiperuricmicas RK+AO mostraron ms
hipertrofia
renal,
hipertensin,
proteinuria,
insuficiencia renal, y mayor glomeruloesclerosis y
fibrosis intersticial. La lesin renal no parece estar
mediada por depsito de cristales de urato, ya
que no haba caractersticas de
obstruccin
tubular consistente con el depsito de cristales de
urato intrarrenal.
Uno de los mecanismos por los que el cido rico
puede haber exacerbado la lesin renal puede ser
la activacin del SRA, que se ha demostrado ser
un importante mediador de la progresin de la
enfermedad renal, no slo por sus efectos
hemodinmicos para aumentar la presin
sistmica y glomerular; tambin, por su efecto
fibrognico directo sobre las clulas renales y
vasculares. Hemos informado anteriormente de
que la administracin de AO a ratas normales

aumenta la expresin de renina yuxtaglomerular y

que el tratamiento con enalapril puede controlar
la PA, mejorar la arteriolopata, y prevenir el dao
renal en este modelo. Tambin se encontr que el
tratamiento con AO en un modelo de nefropata
inducida
por
ciclosporina
resultaba
en
hiperuricemia, aumento de la expresin de renina
y progresin acelerada. Saito et al. tambin
inform que los niveles de cido rico en suero de
seres humanos se correlacionan con la actividad
de la renina plasmtica. Aunque no se midi la
actividad de la renina plasmtica, se ha
documentado un aumento en la expresin de
renina renal en las ratas hiperuricmicas que se
correlacionaban con el cido rico srico. Adems,
la prevencin de hiperuricemia en las ratas AO
tratadas con alopurinol, y en menor medida con
benziodarona, result en niveles ms bajos de
renina y a su vez con menos lesin renal.
Un segundo hallazgo nuevo en el estudio fue la
observacin de que las ratas RK hiperuricmicas
desarrollaron vasculopata preglomerular severa.
Aunque el engrosamiento de las arteriolas
aferentes se haba observado en estudios
anteriores de ratas hiperuricmicas con funcin
renal normal, la hiperuricemia se asoci con una
vasculopata severa en el modelo RK. Los vasos
preglomerulares mostraron engrosamiento con un
aumento en el nmero SMC y la infiltracin de
macrfagos en las reas subendoteliales, media y
adventicia. Estos cambios vasculares, que en
ocasiones dieron lugar a una arteriopata
obliterante, podran potenciar la lesin renal al
causar isquemia de la circulacin postglomerular.
La reduccin en el lumen tambin podra
proporcionar un estmulo para el aumento de la
expresin de renina y tambin podra contribuir al
desarrollo de la hipertensin marcada en estas
ratas.
Se estudi el mecanismo para el desarrollo de la
enfermedad
vascular.
Hemos
informado
anteriormente, como lo hizo Rao et al., que el
cido rico puede estimular directamente la
proliferacin de VSMC. En este estudio, hemos
identificado un nuevo mecanismo que implica la
COX-2. Especficamente, se encontr que las
clulas musculares lisas vasculares (VSMS) de la
aorta de rata mostraban expresin de ARNm de
COX-2 despus de la incubacin con cido rico.
La incubacin de las SMC, ya sea con un inhibidor
de COX-2 o con un inhibidor de receptor TX-A2
podra prevenir la proliferacin en respuesta al
cido rico. La COX-2 tambin demostr que se
expresa de novo en los vasos preglomerulares de
las ratas RK+AO, y su expresin est
correlacionada tanto con los niveles de cido
rico, como con el grado de proliferacin de SMC.
Por tanto, estos estudios sugieren un papel crtico
de la mediacin del cido rico, del tromboxano
generado por COX-2 en la proliferacin de VSMC

en este modelo. Curiosamente, la COX-2 tambin

ha sido recientemente demostrada ser importante
en el mecanismo por el que la angiotensina II
estimula la proliferacin de VSMC.
Adems de la COX-2, es probable que la
angiotensina II tambin est contribuyendo a la
vasculopata. Como se ha mencionado, la renina
tambin se increment en este modelo y se
correlacion con la cantidad de COX-2. No est
claro si el aumento de la renina refleja los efectos
directos del cido rico en las clulas
yuxtaglomerulares o un efecto indirecto a travs
de la estimulacin de la COX-2 en la mcula densa
y las arteriolas o un efecto indirecto en relacin
con el desarrollo de enfermedad vascular por la
perfusin renal reducida. En cualquier caso, la
generacin de angiotensina II puede dar lugar a la
proliferacin de VSMC e hipertrofia as como a la
infiltracin de clulas inflamatorias. Hemos
informado anteriormente de que la vasculopata
en ratas normales con hiperuricemia inducida por
AO se puede evitar en gran medida mediante el
bloqueo del SRA, y tambin han encontrado que
la proliferacin de VSMC mediad por cido rico
puede ser parcialmente inhibida por el bloqueo
del receptor AT1. Por tanto, es probable que tanto
la angiotensina II y COX-2 estn implicadas en la
proliferacin vascular y la inflamacin observada
en nuestro modelo. Estudios in vivo para evaluar
el efecto de la inhibicin del SRA o COX-2 en este
modelo de enfermedad renal progresiva con
hiperuricemia proporcionaran una prueba ms
directa de la importancia de estos sistemas.
Es importante destacar que los cambios
observados en los vasos preglomerulares en las
ratas RK+AO no fueron nicamente una
consecuencia de la elevacin de la presin arterial
sistmica (Figura 5), como se evidencia por los
cambios vasculares ms prominentes en los vasos
preglomerulares de las ratas RK hiperuricmicas
en comparacin con las ratas RK histricos con PA
sistmica comparable; pero con niveles de cido
rico significativamente menores. Este hallazgo
sugiere que la vasculopata inducida por el cido
rico es independiente de la presin arterial
sistmica elevada. Adems, aunque el aumento
de expresin de la COX-2 se inform en arterias
de ratas hipertensas, el aumento de la expresin
cortical de la COX-2 inducida por la ablacin renal
o infusin de angiotensina II ha demostrado ser
independiente de la PA.
Una observacin interesante fue que el alopurinol
fue notablemente eficaz en la reduccin de cido
rico y la prevencin de la disfuncin renal
inducida por AO, proteinuria, hipertensin,
enfermedad vascular, hipertrofia renal, y la
cicatrizacin renal. El beneficio del alopurinol est
correlacionado con su capacidad para reducir el
cido rico. Sin embargo, es posible que algunos

de los beneficios tambin podran referirse a la

conocida capacidad del alopurinol para prevenir la
formacin oxidante. La benziodarona, un agente
uricosrico, fue menos eficaz en la reduccin de
cido rico y redujo slo parcialmente el aumento
de la expresin de renina; esto se explica su
beneficio parcial en el proceso de la enfermedad.
Curiosamente, fue ms eficaz en el bloqueo de los
cambios
glomerulares
(proteinuria
y
glomeruloesclerosis) que los cambios vasculares o
intersticiales. Esto puede reflejar que los cambios
glomerulares pueden estar mediadas ms por un
fenmeno de umbral relacionado con el nivel de
cido rico. Otra posibilidad, es que la lesin
intersticial no fue bloqueada con la mayor eficacia
debido a que los efectos del aumento de cido
rico urinario en las clulas tubulares se
produjeron como consecuencia de la accin
uricosrica de la benziodarona.

En resumen, hemos identificado al cido rico

como un nuevo y potencialmente importante

mediador de la progresin renal en el modelo de

rin remanente de la enfermedad renal
progresiva. La hiperuricemia increment la PA
sistmica, proteinuria, disfuncin renal y dao
renal progresivo. La hiperuricemia tambin induce
la enfermedad vascular a travs de una va COX2-dependiente. Aunque hay que tener cuidado en
la interpretacin de los modelos animales para
enfermedades
humanas,
estos
estudios
proporcionan un mecanismo para explicar los
ltimos datos epidemiolgicos que muestran que
el cido rico es un factor de riesgo
independiente para la progresin renal. Adems,
nuestros estudios sugieren que la hiperuricemia
puede ser uno de los mecanismos clave y
previamente desconocidos para la activacin del
sistema renina angiotensina y de la va de la COX2 en la enfermedad renal progresiva. Se necesitan
estudios para determinar si el tratamiento
temprano de la hiperuricemia puede retrasar la
enfermedad renal progresiva en los seres
humanos.