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24/02/2016 17:25:51
Diretor
Arnaldo Colozzi Filho
Vice-diretor
Nelson Harger
Tesoureiro
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Telles
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Cincias
Agrrias Agrcola
Chefe do Diretor
Departamento
e Engenharia
Eduardo
Teixeira
da Silva
Nerilde
Favaretto
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Curitiba PR
2016
24/02/2016 17:25:51
Editor Executivo
lisson Nri
Reviso e Diagramao
MultCast
Capa
Paulo Marangoni
24/02/2016 17:25:51
AUTORES
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Arlei Maceda
24/02/2016 17:25:51
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PREFCIO
Qualidade do solo a capacidade do solo cumprir suas funes na natureza.
Um bom indicador de qualidade do solo aquele capaz de elucidar os processos
biolgicos, fsicos e qumicos do solo e integrar propriedades ecolgicas do sistema
solo-planta.
As transformaes e as reaes que ocorrem no solo so realizadas
pelos organismos edficos, responsveis pelas mudanas no sistema, e o seu
comportamento reflete as alteraes ocorridas no solo, sejam induzidas pelo homem
ou por eventos naturais.
Por este motivo, os atributos biolgicos do solo so os mais sensveis e
apropriados para discriminar sistemas quanto sua capacidade de cumprir funes.
O Guia Prtico de Biologia do Solo vem ao encontro da demanda atual da cincia do solo
em determinar a qualidade do solo de sistemas manejados pelo homem, possibilitando
o estudo da capacidade desses sistemas oferecerem servios ambientais sociedade.
Este Guia prtico oferece mais do que a metodologia adequada, oferece o
passo a passo necessrio para que pesquisadores, estudantes e interessados possam
lograr xito nos seus estudos em qualidade do solo.
Profa. Dra. Fabiane Machado Vezzani
UFPR/SCA/DSEA
24/02/2016 17:25:51
24/02/2016 17:25:51
SUMRIO
CAPTULO I
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO.................................... 11
CAPTULO II
Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO.................................................. 14
CAPTULO III
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS............................................................................................... 17
PROTOCOLO I CONTAGEM DE BACTRIAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE...................... 20
CAPTULO IV
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS ESPORULADAS.................................................................... 23
PROTOCOLO II CONTAGEM DE BACTRIAS
ESPORULADAS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE (CLARK, 1965)...................................................... 25
CAPTULO V
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
FUNGOS.................................................................................................... 27
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CAPTULO IX
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATO................. 54
PROTOCOLO VII CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE........................................................ 57
CAPTULO X
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES DE LEGUMINOSAS............ 60
PROTOCOLO VIII ISOLAMENTO DE RIZBIO
DE RAZES DE PLANTAS LEGUMINOSAS...................................... 63
CAPTULO XI
Diana Signor, Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS.............................. 67
PROTOCOLO IX INOCULAO DE SEMENTES
DE LEGUMINOSAS........................................................................... 70
CAPTULO XII
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
RESPIRAO MICROBIANA................................................................... 72
PROTOCOLO X RESPIRAO BASAL DO SOLO
EM SISTEMA ESTTICO, MTODO DE ALEF (1995).................... 75
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CAPTULO XIII
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
BIOMASSA MICROBIANA....................................................................... 78
PROTOCOLO XI MTODO DE RESPIRAO INDUZIDA
(RIS) PELO SUBSTRATO (ANDERSON; DOMSCH, 1978
DESCRITO POR HOPPER, 2006)..................................................... 81
CAPTULO XIV
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS..................................... 84
PROTOCOLO XII DETERMINAO DA TAXA
DE DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS........................ 87
CAPTULO XV
Jair Alves Dionsio, Ana Luiza Mattana e Diana Signor
PROTOZORIOS...................................................................................... 89
PROTOCOLO XIII MTODO CULTURAL PARA
CONTAGEM DE PROTOZORIOS DO SOLO,
ADAPTADO DE SINGH (1946)......................................................... 92
CAPTULO XVI
Arlei Maceda
NEMATOIDES........................................................................................... 96
PROTOCOLO XIV MTODO DE AVALIAO DA
DENSIDADE DE NEMATOIDES NO SOLO........................................99
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CAPTULO XVII
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MESOFAUNA.......................................................................................... 103
PROTOCOLO XV EXTRAO DA MESOFAUNA
EDFICA PELO MTODO DO FUNIL DE BERLESETULLGREN MODIFICADO............................................................. 107
CAPTULO XVIII
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
MACROFAUNA....................................................................................... 113
PROTOCOLO XVI MTODO DE EXTRAO DA
MACROFAUNA EDFICA (ANDERSON; INGRAM, 1993)........... 116
CAPTULO XIX
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MINHOCAS............................................................................................. 119
PROTOCOLO XVII MTODO DE EXTRAO DE
MINHOCAS DO SOLO COM EXTRATO DE CEBOLA
(STEFFEN et al., 2010).................................................................... 123
REFERNCIAS....................................................................................... 125
ANEXOS.................................................................................................. 142
ANEXO 1................................................................................................. 142
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ANEXO 2
TESTE DE GRAM EM SOLUBILIDADE COM KOH (RYU, 1940)........144
ANEXO 3
DETERMINAO DA CAPACIDADE DE RETENO DE GUA
DO SOLO CONFORME MONTEIRO E FRIGHUETTO (2000)........145
ANEXO 4
PADRONIZAO DE SOLUO DE HIDRXIDO
DE SDIO 0,5 N........................................................................................ 147
ANEXO 5
SOLUO DESS (250 ML).................................................................149
ANEXO 6
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA, ENTOGNATHA) (GISIN, 1960).............................150
ANEXO 7
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)....................................................151
ANEXO 8
CHAVE PARA IDENTIFICAO DE ALGUMAS FAMLIAS
DE OLIGOCHAETA (TALAVERA, 1990)...........................................152
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CAPTULO I
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
O laboratrio, independentemente do tipo de atividade, um local de trabalho onde as pessoas esto expostas a riscos fsicos, qumicos, biolgicos, ergonmicos e, por isso, possui grande potencial para a ocorrncia de acidentes. Em razo
disso, so apresentadas neste captulo algumas normas que devem ser seguidas
pelos usurios visando a minimizar acidentes.
a)
b)
12
d) Segurana em laboratrios
E
m grande parte, os acidentes em laboratrio esto associados
ocorrncia de fogo, provenientes de produtos qumicos inflamveis
ou falhas na rede eltrica. Em virtude disso, para evitar incndios
fundamental localizar a chave geral de eletricidade do laboratrio e
aprender a deslig-la;
Verificar a existncia de extintores de incndio, confirmar se esto
dentro do prazo de validade, reconhecer o seu tipo em funo das
classes de fogo e certificar-se da forma correta de utiliz-los;
Disponvel em: http://www.unesp.br/proex/repositorio/programasproex/proema/gere/Guia_de_
neutralizacao_quimicos.htm
13
Telefones de emergncia
Empresas ou instituies de ensino necessitam de orientaes
para atendimento emergencial de acidentes em laboratrios. Dessa
forma, fundamental que os nmeros dos telefones de emergncia (Tabela 1) estejam fixados em local visvel, alm do Servio de
informaes de emergncia: Pr-Qumica (0800 11 8270).
Telefone
14
CAPTULO II
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
A base fundamental para estimar a densidade populacional microbiana
ou a atividade biolgica do solo a maneira de realizar a sua amostragem, pois dela
dependero os resultados esperados e as interpretaes para os mais diversos tipos
de solo, sistemas de manejo e coberturas.
No tocante biologia do solo, diferentemente da fertilidade, no existem parmetros estabelecidos para se determinar o nmero de amostras por rea.
Recomenda-se retirar o maior nmero possvel, para melhor representar a rea,
evitando-se erros por sub ou superestimao de valores. Para tal, podem ser seguidas as orientaes utilizadas na avaliao da fertilidade do solo, na qual a rea
dividida em subreas homogneas. Dessa forma, so utilizados como critrios para
subdiviso da rea: relevo, tipo de solo (cor, textura e profundidade), cobertura
vegetal, uso de condicionadores, corretivos e/ou fertilizantes.
Aps a diviso da rea, obtm-se subreas homogneas que podem atingir
at 20 ha. De acordo com Serrat et al. (2002), sero realizadas coletas de amostras
compostas por subrea. Cada amostra composta formada por nmero varivel de
amostras simples, em funo da dimenso da rea (Tabela 2).
Outra definio importante a determinao da profundidade de coleta das subamostras, devido s grandes diferenas nas formas de preparo do solo.
Lynch (1986) e Catellan e Vidor (1990), observaram que no plantio direto as amostragens devem ser realizadas na camada superficial do solo (0 a 5 cm), pois onde
h maiores concentraes de matria orgnica e biota do solo e, no plantio convencional, as amostragens devem explorar a camada mais profunda (0 a 20 cm).
Em reas de cultivo agrcola ou em experimentos nos quais as culturas
so semeadas com espaamento definido (milho, soja e trigo, por exemplo), a
amostragem deve ser feita nas entrelinhas, para no superestimar os parmetros
microbiolgicos em consequncia da adio de fertilizantes. Quando no h definio de linhas de plantio (campo nativo e pastagens, por exemplo), coletam-se
amostras ao acaso.
15
Fonte
10 m2 a vrios hectares
20
Comisso (1994)
20
10 a 20
15
IAPAR (1996)
Machado (1999)
16
17
CAPTULO III
BACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os organismos procariotos so agrupados em dois domnios Bacteria e
Archea. As principais diferenas entre eles esto na composio qumica, na atividade e no ambiente em que se desenvolvem. A composio qumica da parede
celular das bactrias constituda por peptideoglicano, que lhes d forma, confere
fora e rigidez. J as arqueas apresentam grande diversidade e no contm peptideoglicano, alm de possuir capacidade de se desenvolver em condies extremas
de temperatura, salinidade e presso.
As clulas bacterianas so constitudas por parede celular, membrana
plasmtica e algumas espcies possuem uma terceira camada externa denominada
cpsula, formada por polissacardeos com consistncia de muco, o que lhes confere resistncia. Flagelos e fmbrias tambm podem fazer parte da sua constituio
(TORTORA et al., 2013).
De acordo com a composio qumica e a integridade da parede celular,
as bactrias se dividem em: Gram-positivas e Gram-negativas. As Gram-positivas
possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cidos teicoicos e as Gram-negativas possuem peptideoglicano e uma membrana externa composta de lipopolissacaredos, lipoprotenas e fosfolipdios (TORTORA et al., 2013; DUNLAP, 2010). Reproduzem-se muito rpido por diviso simples (fisso binria) que pode acontecer
em aproximadamente 20 minutos, como o caso da Escherichia coli. Por isso, a partir
de uma nica bactria pode-se chegar a cinco bilhes delas aps 12 h de cultivo.
As bactrias so os seres vivos mais antigos da terra, esto amplamente
distribudas no ar, no solo e na gua e so os micro-organismos mais simples, do
ponto de vista estrutural, e de menor tamanho (0,2 a 2,0 mm de dimetro e 2,0 a
8,0 mm de comprimento). Durante o processo de diviso celular, por fisso binria,
o material gentico (DNA), que no est envolvido por uma membrana, duplicado
e a clula se divide em duas (TORTORA et al., 2013).
Bactrias podem ser autotrficas ou heterotrficas. No solo, a maioria
heterotrfica e necessita de uma fonte de carbono orgnico para sua nutrio. De
18
19
observaram em rea de minerao e metalurgia de chumbo as seguintes densidades populacionais de bactrias: 1,97 a 34,53 x 105 e 7,6 a 103 x 104 (UFC g-1) de
solo seco, respectivamente para os solos Neossolo Litlico sobre mata nativa sem
evidncia de contaminao com Pb e Neossolo Litlico Quartzarnico com cobertura de samambaias (Pteridium aquilinum) e capim elefante (Peninsetum purpureum),
com pilhas de rejeito na superfcie do solo.
As bactrias exercem importante funo na decomposio da matria orgnica, na ciclagem de nutrientes, na fixao biolgica de nitrognio (simbitica e
assimbitica, na agregao do solo), e no desenvolvimento de doenas, como tambm so indicadoras de qualidade do solo.
20
PROTOCOLO I
CONTAGEM DE BACTRIAS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)
b)
Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
2. Metodologia
a)
d)
21
Quantidade (g L-1)
K2HPO4
1,0
MgSO4.7H2O
0,2
CaCl2.2H2O
0,1
NaCl
0,1
FeCl3
0,002
KNO3
0,5
Asparagina
0,5
Manitol
1,0
gar
15,0
1.000,0 mL
22
j)
3. Clculo
UFC g-1 = (mdia das contagens x diluio selecionada x 10) g-1*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
4. Resultados
Tabela 4. Densidade populacional de bactrias em diferentes solos.
Unidades formadoras de colnias (UFC g-1)
Solo
Diluio
selecionada
Repeties
1
A
B
C
D
E
Mdia
3
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CAPTULO IV
BACTRIAS ESPORULADAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Algumas bactrias, quando em condies ambientais adversas, iniciam
um processo em que a clula se desidrata e forma-se uma parede espessa, dentro
da membrana celular, ao redor de seu citoplasma e cromossomo, formando uma estrutura conhecida como endsporo (esporo bacteriano). As bactrias que formam
esses endsporos so conhecidas como bactrias esporuladas (BROCK, 2012).
Os endsporos bacterianos so capazes de permanecer em estado latente, desidratados, por longos perodos de tempo e sobreviver em condies de escassez de umidade, temperatura elevada, presena de cidos e lcalis e falta de
nutrientes. Quanto necessidade de oxignio, as bactrias esporuladas podem ser
aerbias estritas, anaerbias facultativas, anaerbias obrigatrias ou microaerfilas (TORTORA et al., 2013). Os principais gneros que formam endsporos so
Bacillus e Clostridium.
Cada endsporo contm uma cpia completa do cromossomo bacteriano,
concentraes mnimas restritas de protenas, alta concentrao de clcio e circundado por uma parede de peptidoglicano, crtex (pseudopeptidoglicano), capa
(queratina) e membrana lipoproteica. Este revestimento responsvel pela resistncia a muitas substncias agressivas (TORTORA et al., 2013).
O endsporo uma estrutura que no apresenta metabolismo, podendo ser reativada quando as condies ambientais voltam a ser favorveis. Por
exemplo, esporos com 7.500 anos de Thermoactinomyces vulgaris, isolados do lodo
congelado, germinaram quando reaquecidos e colocados em um meio nutriente
(TORTORA et al., 2013).
A germinao do esporo bacteriano pode ser comparada germinao de
uma semente. Entretanto, nas bactrias o esporo est relacionado sobrevivncia e
no reproduo. O endsporo no se divide e a clula-me origina, normalmente,
apenas um esporo (TORTORA et al., 2013).
24
25
PROTOCOLO II
CONTAGEM DE BACTRIAS ESPORULADAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
(CLARK, 1965)
1. Material
a)
b)
Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky, esferas de vidro ( 2,00 mm);
c)
Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de
tubos e microscpio estereoscpio (lupa);
2. Metodologia
a)
b)
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e)
f)
Descartar as ponteiras utilizadas em um bquer contendo soluo de detergente (Anexo 1) aps cada transferncia;
j)
Espalhar o inculo na superfcie do meio com o auxlio da ala de Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a em
lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;
k) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante 7 dias;
l)
3. Clculo
Realizar o clculo conforme Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
27
CAPTULO V
FUNGOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os fungos so micro-organismos eucariticos, pertencentes ao domnio Eucarya, podendo ser unicelulares (leveduras) ou multicelulares, micro ou macroscpicos.
So os principais decompositores da natureza, desdobrando os produtos orgnicos e
reciclando carbono, nitrognio e outros compostos do solo (TORTORA et al., 2013).
A maioria dos fungos multicelular formando uma rede de filamentos denominados hifas, as quais podem ser septadas ou asseptadas (cenocticas). O conjunto de hifas recebe o nome de miclio, um tecido prprio dos fungos responsvel
por todas as funes vegetativas do organismo. O componente principal da parede
celular dos fungos a quitina, porm outros polissacardeos como mananas, galactosanas e quitosanas substituem a quitina em algumas paredes celulares fngicas
(DUNLAP et al., 2010)
Quanto nutrio e fisiologia os fungos no possuem pigmentos fotossintetizantes, crescem melhor em pH cido, a maioria aerbico e quimio-heterotrficos (TORTORA et al., 2013).
A obteno de alimento efetua-se por absoro, o miclio secreta enzimas
extracelulares que digerem compostos orgnicos complexos. Em outras situaes,
o miclio emite haustrios, que so estruturas que penetram no tecido dos organismos hospedeiros absorvendo o alimento (TORTORA, 2013).
Os fungos se reproduzem de forma sexuada e assexuada. Ocorre o crescimento por meio da disseminao de filamentos de hifas, produo de esporos
ou simples diviso celular, como nas leveduras com brotamento (DUNLAP et al.,
2010). A sistemtica de classificao dos fungos baseada em aspectos macroscpicos (aspecto das colnias) e microscpicos (presena ou ausncia de septos nas hifas e caractersticas dos esporos) e, recentemente, utilizando a filogenia molecular.
Estes micro-organismos esto agrupados no Reino Fungi, subdivididos
nos Filos Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota (KIRK et al.,
28
2008). O Filo Chytridiomycota apresenta zosporos mveis uniflagelados polarmente, pode ser parasito de plantas, algas e larvas de insetos, decompem celulose,
queratina e quitina (ex.: Alomyces e Rhizophydium). O Filo Zygomycota possui hifas
no septadas, a estrutura de reproduo assexuada o esporngio e o zigsporo
o esporo sexual. A maioria saproftica, alguns fitopatognicos ou parasitas de
outros fungos e englobam parte das endomicorrizas arbusculares (ex.: Mucor; Rhizopus e Zygorhynchus). O Filo Ascomycota possui hifas septadas, esporos sexuais
denominados ascsporos e formam esporos de resistncia: os clamidsporos ou
esclercios. Decompe substncias recalcitrantes, como celulose e lignina, formam
lquens e micorrizas, sendo alguns fitopatgenos (ex.: Endothia, Claviceps e Saccharomyces). O Filo Basidyomycota apresenta hifas septadas, reproduo assexuada,
produzindo condios ou artrosporos, ou sexuadamente, pela produo de um basdio com seus basidisporos haplides. So decompositores de materiais lenhosos,
fitoparasitas, sendo representados pela maioria das ectomicorrizas, muitos cogumelos, inclusive os comestveis (ex.: Agaricus, Porta e Boletus).
A partir da adoo de parmetros moleculares para estudos filogenticos,
foi criado um grupo artificial denominado de fungos mitospricos (antigo filo Deuteromycota), para agrupar aquelas espcies que possuem somente a fase de reproduo assexuada. Eles, muitas vezes, possuem tambm a alternativa do sexo denominada de ciclo parassexual ou parassexualidade. A maioria saprfita, muitos so
parasitas de plantas, animais e outros fungos e muitos deles so endofticos (ex.:
Aspergillus, Penicillium e Fusarium) (ARAJO et al., 2010).
Os fungos predominam em solos cidos, onde h menor competio
com bactrias e actinobactrias. So encontrados em faixas de pH variando de 2,0
a 9,0. A umidade ideal para o desenvolvimento est entre 60 e 70 % da capacidade
de campo do solo. Toleram ampla faixa de temperatura, mas as espcies mesoflicas so predominantes nos solos. A disperso dos esporos ocorre por diversos
agentes como a gua, o vento, as sementes, os insetos, outros artrpodos, e o
homem (JONES; HARRISON, 2004).
Os fungos contribuem com a maior parcela da biomassa microbiana do
solo, de 70 a 80 %, e podem atingir at 5 t ha-1 (BRANDO, 1992). Apesar de
apresentarem baixa densidade populacional (de 104 a 106 g-1 de solo), possuem
hifas de elevado comprimento e dimetro, o que eleva a biomassa (ALEXANDER,
1980). Os principais gneros que ocorrem no solo so Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Rhizoctonia. Nakagawa e Andra (2006) constataram densidade popula-
29
cional, (UFC g-1) de solo, de fungos 7 x 102, em solo contaminado com hexacloro
benzeno (BHC), no entanto quando o solo recebeu adio de bagao de cana-de-acar e cal essa densidade atingiu 15,35 x104.
As principais funes dos fungos no solo so atividade quimioheterotrfica sobre os restos vegetais, formao de relaes simbiticas mutualsticas (micorrizas) e parasticas (doenas) na maioria das plantas e produo de antibiticos.
So ainda agentes de controle biolgico de fungos fitopatognicos e nematoides
fitoparasitas (ex.: Arthrobotrys, Dactylaria e Dactyella) (GRAMINHA et al., 2001),
como tambm, indicadores de qualidade do solo.
30
PROTOCOLO III
CONTAGEM DE FUNGOS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Captulo II
(p. 14);
b)
Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
c)
Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos e microscpio estereoscpio (lupa);
f)
Quantidade (g L-1)
K2HPO4
1,0
MgSO4.7H2O
0,5
Peptona
5,0
Dextrose
10,0
Rosa Bengala1
0,3
gar
15,0
1.000,0 mL
Obs.: Ajustar o pH para 5,4 com HCl diludo, antes da adio do gar; Adicionar sulfato de estreptomicina (30 mg L-1
de meio) esterilizado por filtrao, dissolvido em 10 mL de lcool etlico a 1 %, antes de verter em placas, com o
meio de cultura temperatura de 45 a 50 C.
31
2. Metodologia
a)
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo cinco esferas de vidro e 90 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d)
j)
32
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
33
CAPTULO VI
MICORRIZAS ARBUSCULARES
Alessandra Monteiro de Paula
Os fungos micorrzicos arbusculares (FMA) formam uma associao simbitica mutualstica com as razes da maioria das plantas terrestres, originando
as micorrizas arbusculares. Os FMA so atualmente classificados como um grupo
monofiltico, Filo Glomeromycota, Classe Glomeromycetes (glomeromicetos), organizados em quatro ordens, treze famlias, dezenove gneros e, aproximadamente, 215 espcies (SOUZA et al., 2010). A participao desses fungos no processo de
colonizao do ambiente terrestre pelas plantas foi confirmada com a identificao
da presena de trs genes micorrzicos em um ancestral comum das plantas terrestres (WANG et al., 2006).
As micorrizas arbusculares (MA), associao simbitica formada pelos
FMA e as razes das plantas, podem ser encontradas na maioria dos taxa vegetais,
sendo a ausncia da simbiose restrita a poucas famlias de plantas. Como exemplo, podem ser mencionadas as famlias Juncaceae, Caryophyllaceae e Brassicaceae
(BERBARA et al., 2006), possivelmente em consequncia do processo evolutivo,
relacionado com algumas caractersticas peculiares como: a presena de compostos
fungistticos, a insuficincia de sinais moleculares ou fatores estimulantes para o
estabelecimento da simbiose ou, ainda, a existncia de barreiras fsicas para a penetrao da hifa do fungo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Descritos como simbiotrficos obrigatrios, os FMA apenas completam seu ciclo de vida na presena de
um hospedeiro compatvel. Essa caracterstica limita os estudos de determinados
tpicos da biologia desses fungos e, tambm, restringe a aplicao biotecnolgica
desses organismos (SOUZA et al., 2010).
Os glomeromicetos so assexuados, formam esporos que variam de 22 a
1.050 mm de dimetro, destacando-se entre os maiores do Reino Fungi, e formam
miclio asseptado ou cenoctico, podendo ocorrer formao ocasional de septos em
alguns estgios do desenvolvimento de alguns gneros (SOUZA et al., 2010), distribudos em hifas externas que se ramificam, ocupando os espaos entre as partculas
do solo e hifas intrarradiculares, que colonizam os tecidos das razes das plantas.
34
35
d)
e)
Efeito na estrutura do solo: pela agregao das partculas e da estabilizao dos agregados; e,
f)
36
PROTOCOLO IV A
EXTRAO DE ESPOROS DE FUNGOS MICORRZICOS
ARBUSCULARES DO SOLO PELO MTODO DO
PENEIRAMENTO MIDO (GERDEMANN; NICOLSON,
1963) E DETERMINAO DO NMERO DE ESPOROS
DE FMA EM AMOSTRA DE SOLO
1. Material
a)
b)
c)
d) Soluo: sacarose 50 %; e,
e)
2. Metodologia
a)
b)
Acrescentar 1 L de gua potvel e agitar com um basto de vidro, at formar uma suspenso de solo;
Descartar o sobrenadante, acrescentar soluo de sacarose 50 % para ressuspender o material depositado no fundo do tubo e centrifugar novamente por 2 minutos a 2.000 RPM;
37
f)
g)
3. Clculo
(N de esporos de FMA) g-1 de solo = [(mdia dos 40 campos visuais x 289) g*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
38
4. Resultados
Tabela 6. Densidade de esporos de fungos micorrzicos arbusculares (FMA) nos diferentes
solos.
Solo
A
B
C
D
E
Esporos (n g-1)
250 mm
100 mm
45 mm
Total
39
PROTOCOLO IV B
CLARIFICAO E COLORAO DE RAZES
DE PLANTAS DE ACORDO COM (BRUNDRETT
et al., 1996A) PARA AVALIAO DA TAXA DE
COLONIZAO MICORRZICA PELO MTODO DE
GIOVANNETTI E MOSSE (1980)
1. Material
a) As razes da planta que ser avaliada devero ser lavadas em gua corrente para retirar o excesso de terra. A partir das razes limpas, retirar
de 1,00 a 2,00 g de razes finas e jovens para conduzir os processos de
clarificao e colorao;
b)
2. Metodologia
a)
40
temperatura variando de 60 a 90 C. O tempo de aquecimento e de permanncia na soluo de KOH pode variar entre espcies de planta, em
funo das caractersticas das razes (as mais escuras e fibrosas demandam maior tempo para clarificao). Recomenda-se retirar uma amostra
e avaliar em microscpio estereoscpico aps um perodo de 15 a 30 minutos para razes mais finas, como de gramneas e, entre 45 e 60 minutos para razes mais grossas, como de espcies arbreas. Em alternativa
ao banho-maria, possvel utilizar o autoclave para realizar essa etapa.
De acordo com Brundrett et al. (1996a), 1 h a 60 C em banho-maria
equivale a 5 minutos em autoclave a 121 C;
b) Uma vez clarificadas, lavar a amostra em gua ou em soluo cida diluda vrias vezes antes de seguir para a etapa de colorao;
c)
Para colorao, a amostra deve ser imersa na soluo contendo o corante soluo de tinta de caneta 5 % (Anexo 1). Para acelerar o processo, a
amostra pode ser novamente conduzida ao aquecimento, em banho-maria,
recomendando-se o mesmo perodo de observao da eficincia do tempo
de exposio ao corante, como descrito na etapa de clarificao, ou apenas
deixada em repouso na soluo corante por 12 h. A soluo de colorao
pode ser reutilizada de 5 a 10 vezes ou at perder a intensidade do corante,
devendo-se ter o cuidado de filtrar com uma peneira de malha fina, aps o
uso na colorao de uma amostra;
d)
Aps a colorao, as razes esto prontas para avaliao da taxa de colonizao micorrzica. A amostra deve ser retirada da soluo de colorao e
pode ser preservada em soluo de glicerol 50 % (Anexo 1) em quantidade suficiente para cobrir as razes;
e) Uma vez coloridas, as razes seguem para avaliao da colonizao radicular e clculo da porcentagem de colonizao ou taxa de colonizao
micorrzica;
f)
41
Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.
Mosse (1980).
Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.
42
3. Clculo
% de colonizao micorrzica = [pontos de razes colonizadas
(pontos de razes colonizadas + pontos de razes no-colonizadas)] * 100
4. Resultados
Tabela 7. Taxa de colonizao micorrzica em plantas.
Planta
A
B
C
D
E
43
CAPTULO VII
ACTINOBACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os actinomicetos, atualmente denominados actinobactrias (BRENNER et
al., 2004), so classificados dentro do Filo e da Classe Actinobacteria, que compreende seis ordens, 39 famlias, 139 gneros e centenas de espcies. As actinobactrias
compartilham duas caractersticas: todas so Gram positivas e apresentam alta razo
de G + C (guanina/citosina) em seu DNA, podendo exceder 70 % do total de bases
nucleotdicas, variando de 51 % em Corynebacterias a mais de 70 % em Streptomyces
e Frankias. Podem ser aerbias, microaerfilas ou anaerbias (LACAZ et al., 2002).
Actinobactrias apresentam grande variedade morfolgica, podendo ser
cocoides (Micrococcus) ou cocobacilos (Arthrobacter), outros em forma de hifas curtas
e rudimentares (Nocardia spp.) e, ainda, alguns com miclio ramificado (Streptomyces
spp.) (VENTURA et al., 2007). Tambm, exibem diversas propriedades fisiolgicas
e metablicas, tais como a produo de enzimas extracelulares e a formao de uma
ampla variedade de metablitos secundrios. A maioria dos antibiticos utilizados
atualmente so derivados de produtos naturais de actinobactrias e fungos (RAJU
et al., 2010). Tambm, exibem diversas propriedades fisiolgicas e metablicas, tais
como a produo de enzimas extracelulares e a formao de uma ampla variedade de
metablitos secundrios (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
As actinobactrias possuem diferentes estilos de vida, assim o Filo inclui
os patgenos humanos (Mycobacterium spp., Nocardia spp., Tropheryma spp., Corynebacterium spp. e Propionibacterium spp.), os habitantes do solo (Streptomyces spp.), os
comensais de plantas (Leifsonia spp.), as fixadoras de nitrognio simbiontes (Frankia)
e as do trato gastrointestinal (Bifidobacterium spp.) (VENTURA et al., 2007).
As actinobactrias produzem elementos filamentosos em forma de miclio, semelhantes a hifas fngicas (SCHLEGEL, 1993). Em algumas espcies, reproduzem-se pela formao de esporos, esporangisporos ou conidisporos. Os
esporos constituem a sua principal forma de multiplicao, so resistentes a dessecaes e podem auxiliar na sobrevivncia das espcies durante a estiagem. Em
44
45
46
PROTOCOLO V
CONTAGEM DE ACTINOBACTRIAS PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)
b)
Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
c)
Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador
de tubos; e,
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura casenatodextrose-gar (Tabela 8);
e)
f)
Quantidade (g L-1)
Amido
10,0
Casena
0,3
KNO3
2,0
NaCl
2,0
K2HPO4
2,0
MgSO4.7H2O
0,05
FeSO4.7H2O
0,01
gar
gua destilada q.s.p.
Obs. Ajustar o pH para 6,5 ou 6,6, com HCl diludo, antes da adio do gar.
15,0
1.000,0
47
2. Metodologia
a)
b)
c)
f)
j)
k) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante uma semana;
l)
48
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
49
CAPTULO VIII
MICRO-ORGANISMOS CELULOLTICOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
A celulose o mais abundante composto orgnico presente na natureza,
representando de 15 a 60 % da matria seca dos vegetais incorporados ao solo.
Encontra-se em plantas, sementes, algas, fungos e cistos de protozorios, sendo
o principal componente dos vegetais, constituindo, por exemplo, quase 100 % do
algodo (CARVALHO et al., 2009).
Celulose um carboidrato composto de unidades de anidroglicose unidas
pelas ligaes b 1-4 nos tomos de carbono, com nmero varivel entre 2.000 e
10.000 unidades por molcula e, em alguns casos, atingindo at 15.000 unidades,
em longa cadeia linear no ramificada (CERRI et al., 1993). Possui frmula emprica
(C6H1005)n, com um valor mnimo de n = 200. A estrutura da molcula de celulose
pode ser visualizada na Figura 3:
50
O contedo de celulose das plantas superiores nunca fixo e a concentrao varia com a idade e a espcie da planta. especialmente abundante em materiais lenhosos, na palha, restolho e folhas.
Grande parte das populaes microbianas heterotrficas do solo representada por bactrias, fungos e actinobactrias, e caracteriza-se pela habilidade de decompor celulose, utilizando-a como fonte de carbono e energia. Esses
micro-organismos constituem um grupo funcional denominado micro-organismos celulolticos.
A degradao da celulose no solo se d pelo complexo enzimtico denominado celulase, produzido por bactrias aerbias e anaerbias, actinobactrias e fungos, sendo estes os principais agentes de degradao (CATELLAN; VIDOR, 1990a).
A celulase uma mistura de enzimas envolvidas na degradao da celulose. Os trs
maiores grupos de celulase que participam da hidrlise so: endoglucanase, hexoglucanase ou cellobiohydrolase e betaglucosidase (SUN; CHANG, 2002).
Em ambiente aerbio, os micro-organismos oxidam a glicose via ciclo
dos cidos tricarboxlicos (CTA) e a decomposio resulta na produo de CO2 e
substncia celular, com a participao de todos, principalmente dos fungos, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichun, Myrothecium, Paecolomyces, Penicillium
e Trichoderma (LYND et al., 2002). As principais bactrias aerbias produtoras de
celulase, que desdobram a celulose, so Cellulomonas, Bacillus subtilis, B. polymyxa, B. brevis, B. licheniformis e B. cereus. Entre as actinobactrias, destacam-se as
termoflicas Thermomonospora e Thermoactinomyces e a mesoflica Streptomyces
(SINGH; HAYASHI, 1995).
As actinobactrias so estimuladas somente no final da decomposio
dos resduos orgnicos, por apresentarem desenvolvimento mais lento (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006).
Silva Filho e Vidor (1984) constataram que a maior populao de micro-organismos celulolticos, no Rio Grande do Sul, ocorreu em solos com pastagem
cultivada (103 UFC g-1 de solo), superior ao solo submetido a diferentes sistemas de
manejo convencional, plantio direto, rotao de culturas e campo nativo.
Dionsio (1996), trabalhando em reas de cultivo de Eucaliptus grandis com
calagem, adubao mineral e orgnica, e combinaes das formas de adubao, constatou que as densidades de micro-organismos celulolticos na camada do solo de 0,0
a 5,0 cm foram superiores nos tratamentos que receberam adubao orgnica.
51
PROTOCOLO VI
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
CELULOLTICOS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE
1. Material
a)
Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador de tubos;
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura celulosegar (Tabela 9);
e)
Outros: funil plstico ( 10,0 cm), micropipetas com ponteiras de 0,1 mL,
peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), lixeira para resduos biolgicos,
luvas de proteo (nitrlica descartvel), parafilm, pera insufladora e gs
butano; e,
f)
Quantidade (g L-1)
NaNO3
0,5
K2HPO4
1,0
MgSO4.7H2O
0,5
FeSO4.7H2O
0,01
Celulose*
12,0
gar
15,0
1.000,0
52
2. Metodologia
a)
Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10, em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos celulolticos e a outra para a
determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1) (diluio 1:10);
c)
Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador mecnico (@ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das partculas
maiores;
d)
e)
f)
g)
h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e transferir para placas de Petri contendo o meio de cultura celulose-gar;
i)
j)
Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante 7 dias;
k)
l)
53
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
54
CAPTULO IX
MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE
FOSFATO
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Entre os elementos essenciais, o fsforo (P) ocupa, aps o nitrognio
(N), posio de destaque em relao composio dos seres vivos, tendo em vista
sua atuao estrutural, funcional e na transferncia de energia. O fsforo ocorre no solo em quantidade total normalmente elevada, porm em baixas quantidades disponveis para as culturas, principalmente nos solos tropicais. Diante
dessas circunstncias, a solubilizao biolgica causada pelos micro-organismos
do solo surge como uma alternativa para elevar a disponibilidade de fsforo nestas regies. Este fato tem despertado a ateno para a utilizao desses micro-organismos como inoculante comercial ou no manejo de suas populaes a fim
de promover uma melhor utilizao do P existente no solo ou daquele adicionado
como fertilizante (SILVA FILHO; VIDOR, 2001).
Os micro-organismos solubilizadores de fosfato, que constituem um grupo funcional, esto presentes na maioria dos solos investigados e o processo de solubilizao que realizam pode ser influenciado pelo tipo de solo, espcie e idade da
planta. Com relao s plantas, h maior quantidade de bactrias solubilizadoras
na rizosfera de leguminosas do que em gramneas (NAHAS et al., 1994). Segundo
Barroti e Nahas (2000), a populao de micro-organismos solubilizadores varia de
105 a 106 clulas g-1 de solo seco em leguminosas forrageiras e de 103 a 106 clulas g-1
em gramneas forrageiras.
Dentre os principais grupos microbianos que apresentam capacidade de
solubilizar fosfato no solo destacam-se vrios gneros de bactrias, como Bacillus,
Thiobacillus, Mycobacterium, Micrococcus entre outros; quanto aos fungos, os gneros Aspergillus, Penicillium, Sclerotium e Rhizopus apresentam atividade solubilizadora; para actinobactrias merece destaque o gnero Streptomyces. De acordo com
Kucey (1983), os fungos so mais eficientes na solubilizao do que as bactrias,
mas estas so mais numerosas podendo atingir densidades populacionais de 105
a 107 por grama de solo.
55
Nahas et al. (1994), estudando micro-organismos solubilizadores de fosfato em diversos solos, avaliaram que o nmero de fungos solubilizadores em termos relativos (30,2 %) foi superior ao de bactrias (16,4 %). No mesmo estudo,
afirmam ainda que os fatores que favorecem o aumento da populao microbiana
do solo tambm estimulam a populao de solubilizadores.
De acordo com Eira (1992), o mecanismo bsico de solubilizao do fosfato se d por trs maneiras distintas: a) cidos minerais fracos (H2CO3), formados
a partir das excrees radiculares e do metabolismo respiratrio dos micro-organismos; b) cidos minerais fortes (HNO2, HNO3, H2SO4), formados pela oxidao
do nitrognio e do enxofre, respectivamente; c) cidos orgnicos (ctrico, oxlico,
glucnico entre outros), formados no metabolismo microbiano ou excretados pelas
plantas superiores.
A mineralizao do fosfato ocorre por ao das enzimas fosfatases, oriundas da atividade de plantas e de micro-organismos, sobre o fsforo orgnico, tambm liberando fosfato disponvel s plantas. Fungos apresentam atividade principalmente da fosfatase cida, enquanto que, em bactrias, predomina a ao da
fosfatase alcalina (EIRA, 1992). Segundo Dionsio (1996), a taxa de solubilizao
maior em solos com mais material energtico, como restos de cultura, disponveis
aos micro-organismos, resultando numa maior produo de cidos orgnicos.
Os elementos C, N, Fe, Ca e K apresentam funes que sugerem as suas
participaes no processo de solubilizao de fosfatos. Oefeito da fonte de N tem
sido relacionado ao balano de ons absorvidos (FERNANDES; SOUZA, 1990; DARRAH, 1993). Demodo geral, a solubilizao aumenta com a absoro de fontes amoniacais e diminui com as ntricas. Redues nos nveis de Fe, Ca e K interferem na
sntese de vrias enzimas e a diminuio destas, provoca acmulo de cidos orgnicos que vo contribuir para a solubilizao do fosfato no solo (SILVA FILHO, 2001).
O manejo agrcola do solo tambm contribui para o tamanho e a atividade da populao microbiana. Todavia, os fatores que regulam a composio da
populao microbiana no so, ainda, plenamente conhecidos, sendo esta uma importante rea a ser explorada pela pesquisa. Mais importante do que o nmero
de solubilizadores a determinao da atividade da populao existente no solo
(SILVA FILHO; VIDOR, 2001).
Silva Filho e Vidor (1984) avaliaram a populao microbiana do solo, na
camada de 0 a 20 cm de profundidade, submetido a diferentes sistemas de manejo, no municpio de Santo ngelo-RS, e observaram que a densidade populacional,
56
UFC g-1 de solo, de solubilizadores de fosfato foi: 13 x 104; 48 x 104 e 53 x 104, respectivamente, solo erodido, plantio convencional e solo em recuperao.
Os micro-organismos solubilizadores de fosfatos inorgnicos representam um grande potencial para a agricultura em clima tropical, porm atualmente
no possvel contar com essa tecnologia.
57
PROTOCOLO VII
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)
Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos;
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %), Meio de cultura dextroseextrato de levedura (Tabela 10);
e)
f)
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10 em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos solubilizadores de fosfato e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250,0 mL contendo cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1) (diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d)
58
Glicose
10,0 g
Extrato de levedura
0,5 g
2,0 mL
Soluo CaCl2 (1 %)
2,0 mL
1,0 mL
Soluo de micronutrientes
2,0 mL
Fe-EDTA
10,0 mL
KNO3
0,1 g
gar
15,0 g
1.000,0 mL
g)
Descartar a ponteira utilizada em um bquer contendo gua e detergente, aps cada transferncia;
h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e transferir para placas de Petri contendo o Meio de cultura dextrose-extrato de
levedura. Para cada diluio usar trs repeties. Logo, sero utilizadas
nove placas de Petri para anlise posterior;
i)
59
k)
l)
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
60
CAPTULO X
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES
DE LEGUMINOSAS
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
O nitrognio um nutriente requerido em grandes quantidades pelas
plantas, representando 78 % da composio da atmosfera, porm encontra-se na
forma elementar (N2), utilizvel apenas por determinadas espcies de micro-organismos procariticos. Para assegurar a utilizao pelos vegetais, necessria que
ocorra a reduo deste elemento para a forma de amnia (NH3), por meio do processo denominado fixao biolgica de nitrognio (FBN).
A FBN, uma reao bioqumica extraordinria que ocorre por ao da enzima nitrogenase, ocorre em micro-organismos diazotrficos e o segundo processo
biolgico mais importante do planeta, perdendo apenas para a fotossntese (SIQUEIRA; FRANCO, 1988). Pode ser realizada de forma simbitica, definida por associaes mutualistas entre micro-organismos fixadores de nitrognio e espcies vegetais,
quanto assimbitica, promovida por micro-organismos fixadores de vida livre.
A quebra da tripla ligao covalente, presente na molcula de N2, demanda grande quantidade de energia e pode ser feita industrialmente ou por micro-organismos diazotrficos. O processo industrial conhecido como reao de Haber-Bosch e utiliza temperaturas que variam de 400 a 600 C e presses superiores a
107 Pascal (de 100 a 200 atm), com utilizao de energia de derivados de petrleo
(HUNGRIA et al., 1994, 2006). A reao industrial representada por:
N2 + 3 H2 2 NH3.
Quando ocorre a FBN (N2 reduzido a NH3), tambm h um grande custo
energtico para o organismo que realiza a fixao. No entanto, devido ao da
nitrogenase, a reao pode ocorrer temperatura e presso atmosfrica ambiente, com consumo de trifosfato de adenosina (ATP) e representada por (HUNGRIA et al., 1994):
61
62
63
PROTOCOLO VIII
ISOLAMENTO DE RIZBIO DE RAZES
DE PLANTAS LEGUMINOSAS
1. Material
a)
b)
Quantidade (g L-1)
Manitol
10,0
K2HPO4
0,5
MgSO4.7H2O
0,2
NaCl
0,1
Extrato de levedura
0,5
gar
15,0
1.000,0
Obs.: Ajustar o pH final para 6,8; 1Acrescentar azul de bromotimol (5 mL L-1 de meio de cultura, Anexo 1)
64
2. Metodologia
2.1. Coleta de ndulos
a)
Cavar a uma profundidade de 30 cm para plantas herbceas e a uma profundidade maior para arbreas;
f)
g)
Retirar o excesso de solo com as mos sobre uma peneira, cuidando para
que os ndulos no se percam.
b) Levar o material ao laboratrio e lavar com gua da torneira, com cuidado, sobre uma peneira (malha de 2,0 mm), para evitar que as razes e
os ndulos se percam;
c)
d) Na capela de fluxo laminar, os ndulos dessecados devem ser reidratados, ficando de molho em frascos com gua por 30 a 40 minutos;
e)
f)
g)
h)
Aps a ltima lavagem, macerar os ndulos com basto de vidro, aproveitando a gua da ltima lavagem;
65
i)
j)
3. Resultados
Algumas caractersticas morfolgicas e culturais do rizbio em meio de
cultura YMA com azul de bromotimol.
b)
66
a)
67
CAPTULO XI
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Para que uma leguminosa seja cultivada, sem adio de adubo nitrogenado, mineral ou orgnico, preciso que forme uma associao simbitica mutualstica com uma bactria denominada rizbio. Nessa associao, formam-se ndulos nas
razes da planta, que fornece energia na forma de carboidrato para a bactria, que
cede, em troca, nitrognio amoniacal, fixado a partir do N2 atmosfrico.
A maneira mais prtica de transferir rizbio para a semente por meio da
inoculao. Segundo Brasil (2004), inoculante todo material que possui micro-organismos, atua favoravelmente no desenvolvimento das plantas e contm bactrias
vivas, especficas para cada espcie ou grupo de leguminosas.
Os inoculantes brasileiros para leguminosas devem atender s normas
definidas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), conforme recomenda Embrapa (2011):
A base de clculo para o nmero de clulas por semente a concentrao do produto comercial registrada no MAPA impressa na
embalagem do inoculante.
68
incio do sculo XX, e fludos (lquidos, com a bactria estabilizada em seus processos metablicos por protetores celulares). No incio dos anos 1990, comearam
a surgir os inoculantes lquidos, que hoje representam a maior parte do mercado
nacional, em funo da facilidade de sua aplicao.
So consagradas as seguintes vantagens do uso de inoculantes:
A inoculao de sementes de leguminosas feita com o objetivo de estabelecer uma populao vigorosa de rizbios em torno das razes, sendo a inoculao simples e a peletizao os principais mtodos utilizados. A primeira consiste
na aplicao do produto contendo as estirpes do rizbio nas sementes antes da semeadura, sendo utilizado para leguminosas de sementes grandes como soja, feijo
e amendoim, por exemplo, que so semeadas em reas sem problemas de acidez ou
deficincia nutricional e sob condies fsicas favorveis (umidade e temperatura).
A segunda utilizada principalmente com sementes de leguminosas forrageiras de
tamanho pequeno (trevos, alfafa e estilosantes, por exemplo), semeadas a lano; nelas o rizbio pode encontrar no solo condies adversas que afetem sua sobrevivncia, tais como baixa umidade, altas temperaturas, pH cido e deficincia nutricional.
A peletizao consiste em revestir sementes com material seco, inerte e
de gro fino, como o carbonato de clcio ou o fosfato de rocha, formando uma capa
protetora. Esta estrutura protege o inoculante durante a fase que antecede a emisso de razes, transporta nutrientes e possibilita que as sementes inoculadas sejam
misturadas ao adubo. Alm disso, permite a incorporao de inseticidas, fungicidas, fertilizantes e reguladores de crescimento (VIDOR et al., 1983).
A inoculao pode ser realizada nas sementes, com inoculante lquido ou
turfoso, ou no solo. Nas sementes, realiza-se preferencialmente, em mquinas prprias, mquina de tratamento de sementes, betoneira ou tambor com eixo excntrico, para garantir a maior aderncia do inoculante semente (EMBRAPA, 2011).
Para que a inoculao das sementes de leguminosas tenha sucesso, algumas medidas devem ser adotadas, dentre as quais destaca-se a aplicao de micro-
69
nutrientes e o uso de fungicidas. Para a cultura da soja, recomenda-se de 2,0 a 3,0 g ha-1
de cobalto e de 12,0 a 30,0 g ha-1 de molibdnio via semente ou em pulverizao
foliar, nos estdios de desenvolvimento V3 (3 interndio) a V5 (5 interndio)
(EMBRAPA, 2013).
Para minimizar o efeito de doenas do solo e outras transmitidas pelas
sementes, necessrio, na maioria das vezes, utilizar fungicidas. Porm, muitos
apresentam toxicidade ao rizbio, causando expressiva mortalidade. Como alternativa menos prejudicial ao rizbio, so recomendadas pela Embrapa (2013) as
seguintes misturas:
Carboxin + Thiram;
Difenoconazole + Thiram;
Carbendazin + Captan;
Thiabendazole + Tolylfluanid; e,
Carbendazin + Thiram.
70
PROTOCOLO IX
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
1. Material
a) Sementes de soja e trevo;
b)
c)
2. Metodologia
2.1. Inoculao Simples Inoculante turfoso
a)
Misturar separadamente a soluo de sacarose a 10,0 % (Anexo 1) ao inoculante em um bquer de 500 mL;
b) Adicionar esta pasta s sementes, misturando-as em betoneira ou tambor com eixo excntrico, at que apresentem uma camada de revestimento uniforme do inoculante envolvendo-as;
c)
Misturar o adesivo com o inoculante, respeitando as propores em funo da quantidade de semente a ser inoculada (Tabela 12 );
71
b)
c)
Tabela 12. Quantidades de material utilizado em funo do tamanho das sementes de leguminosas a serem peletizadas (FARIA et al., 1984 citado por DE-POLLI, 1985).
Materiais utilizados na inoculao e no revestimento de sementes
Goma arbica
40 % ou goma
caseira 7 % (mL)
Inoculante (g)
Semente (kg)
Calcrio ou
calcrio +
micronutrientes
(1:1) (kg)
Sementes
grandes:
soja, feijo,
fava, caupi,
amendoim,
guandu, leucena,
ervilha, etc.
500
100
25
Sementes
mdias:
calopognio,
siratro, soja
perene,
centrosema, etc.
500
100
10
08
Sementes
pequenas:
estilosantes,
lotononis,
desmodium, etc.
500
100
10
Leguminosa
72
CAPTULO XII
RESPIRAO MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
A respirao microbiana (absoro de O2 e/ou liberao de CO2), resultante da atividade exclusiva das bactrias, fungos, algas e protozorios do solo e
incluem as trocas gasosas provenientes dos metabolismos aerbio e anaerbio (ANDERSON, 1982). O procedimento realizado em laboratrio, sob temperatura e
umidade controladas. J o termo respirao do solo resulta de toda atividade metablica dos organismos do solo (micro e macro-organismos e razes de plantas).
O mtodo de estudo utiliza a insero de cmaras (respirmetros) na superfcie do
solo para quantificar a liberao de CO2.
A respirao microbiana corresponde oxidao da matria orgnica por
organismos do solo que, portanto, utilizam o O2 como aceptor final de eltrons, at
CO2 (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Assim, essa microbiota a principal responsvel pela decomposio dos resduos orgnicos, pela ciclagem de nutrientes e pelo
fluxo de energia no interior do solo, exercendo influncia tanto na transformao
da matria orgnica, quanto na estocagem do carbono e nutrientes minerais, com
consequente liberao de CO2 para a atmosfera (JENKINSON; LADD, 1981).
Para se estimar as respiraes microbiana ou do solo diversos mtodos podem ser utilizados, baseando-se no consumo de O2 ou na liberao de CO2.
Para o consumo de O2, utiliza-se a cromatografia gasosa ou o eletrorespirmetro.
Para a liberao de CO2, utiliza-se a titulao (quando este gs capturado por
NaOH ou KOH), condutividade eltrica, cromatografia gasosa, espectroscopia de
infravermelho (IRGA) ou por 14C, neste caso quando se deseja monitorar compostos orgnicos especficos.
A vantagem de se medir o CO2 ao invs do O2 est no fato deste refletir
a atividade de micro-organismos aerbios e anaerbios (RODRIGUES; DE-POLLI,
2000), pois no solo, em ambiente aerbio, pode haver stios de anaerobiose.
Segundo Grisi (1995), o estudo da respirao do solo ou da respirao
microbiana pode ser realizado em dois sistemas:
73
74
a 30/1), poder ocorrer imobilizao temporria do N mineral pelos micro-organismos do solo, o que pode induzir a uma deficincia temporria de N para as plantas.
A estimativa das respiraes, microbiana ou do solo, por meio da liberao de CO2, uma das mais eficientes ferramentas para se avaliar a recuperao de
reas degradadas, pelo baixo custo, eficincia e indicar mudanas rpidas (PASSIANOTO et al., 2001).
Catellan e Vidor (1990b), trabalhando com diferentes sistemas de culturas, entre eles siratro, campo nativo e solo descoberto, encontraram os seguintes
valores de respirao microbiana, respectivamente: 92,3; 207,0 e 57,8 mg C-CO2
kg-1 de solo, mdia de 12 coletas, na camada de 0 a 5 cm, durante dez dias de incubao. Os resultados permitem concluir que os sistemas com cobertura vegetal e
efeito rizosfrico tendem a apresentar maiores valores de respirao basal, se comparados com solos sem cobertura vegetal.
75
PROTOCOLO X
RESPIRAO BASAL DO SOLO EM SISTEMA
ESTTICO, MTODO DE ALEF (1995)
1. Material
a)
b)
c)
d) Solues: fenolftalena (0,1 %), HCl 0,5 N, BaCl2 (50 %) e NaOH 0,5N;
e) Outros: micropipetas com ponteiras de 1,0 mL e 10,0 mL, trado calador, peneiras nmero 10 (abertura de 2,00 mm) e nmero 20 (abertura
de 0,85 mm), luvas de proteo (nitrlica descartvel), pera insufladora,
balde plstico de 5,0 L ou 8,0 L, esptula, substratos orgnicos: aveia,
milho, soja, alfafa, hmus, serragem, celulose, esterco bovino; e,
f)
2. Metodologia
2.1. Respirao basal do solo (RBS)
a) Pesar 10,00 g de solo mido para determinar a massa de solo seco (item 3);
b)
c)
Pesar 100,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), em triplicata, e transferir para um frasco de
vidro com tampa hermtica;
Para cada dez frascos de vidro a serem incubados, realizar uma prova em
branco, que corresponde a um frasco contendo apenas um tubo de ensaio
com 15 mL de NaOH 0,5 N padronizado (Anexos 1 e 4) e outro contendo
10,0 mL de gua destilada;
76
f)
Aps a padronizao (Anexo 4), titular o excesso de NaOH com HCl 0,5 N
(Anexo 1).
b)
c)
f)
g)
3. Clculo
1. Calcular a respirao basal do solo (RBS) de acordo com Stotzky (1965):
RBS ou RIS C-CO2 mg kg-1 h-1 = {[(b-a) x N x E x 1.000]/g*}/h
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
77
Onde:
b: Volume de HCl gasto na prova em branco;
a: Volume de HCl gasto na amostra;
E: Equivalente do carbono;
N: Normalidade do HCl;
g: massa de solo seco; e,
h: horas de incubao.
4. Resultados
Tabela 13. Respirao microbiana do solo (mg C-CO2 kg-1 h-1) acumulada em funo da adio de resduos orgnicos.
Tratamento
1. Solo testemunha (ST)
2. ST + palha de aveia
3. ST + palha de milho
4. ST + palha de alfafa
5. ST + palha de soja
6. ST + p de serragem
7. ST + celulose
8. ST + esterco bovino
9. ST + hmus de minhoca
Repeties
I
II
III
IV
Mdia
78
CAPTULO XIII
BIOMASSA MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
A biomassa microbiana do solo (BMS), tambm conhecida como carbono
da biomassa microbiana (C-BMS), definida como a parte viva da matria orgnica
do solo e inclui bactrias, fungos, actinobactrias, algas e microfauna, excluindo-se
as razes e os animais maiores que 5 x 10 mm3, sendo considerada o compartimento
central do ciclo do carbono (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Esse reservatrio contm, em mdia, de 2,0 a 5,0 % do C orgnico do solo (JENKINSON; LADD, 1981) e
de 1,0 a 5,0 % do N total do solo (SMITH; PAUL, 1990).
O estudo do C-BMS foi apresentado inicialmente por Jenkinson e Powlson
(1976) e tem crescido nos ltimos anos. De acordo com Siqueira e Franco (1988), a
sua importncia se justifica por trs aspectos:
1) formada por clulas vegetativas vivas, capazes de promover mudanas
importantes no solo;
2) Devido grande quantidade e ao fato de ser o maior componente lbil
da matria orgnica do solo, torna-se um importante reservatrio de
nutrientes; e,
3) Representa um indicador de grande sensibilidade para avaliar mudanas
no solo.
Dessa forma, o C-BMS pode ser utilizado como indicador de qualidade
do solo, pois grandemente influenciado pelo manejo, considerando que qualquer
estresse no sistema afetar a densidade, a diversidade e a atividade das populaes
microbianas (PANKHURST et al., 1995). Assim, o monitoramento dos nveis do
C-BMS uma medida adequada para se determinar se um conjunto de prticas
sustentvel (TTOLOA; CHAER, 2002).
Conforme Rodrigues (1997), os valores do C-BMS indicam o potencial de
reserva de carbono no solo, que participa do processo de humificao. Portanto,
79
80
81
PROTOCOLO XI
MTODO DE RESPIRAO INDUZIDA (RIS) PELO
SUBSTRATO (ANDERSON; DOMSCH, 1978 DESCRITO
POR HOPPER, 2006)
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Capitulo II, glicose anidra;
b) Vidraria: pipetas de 10 mL, bureta automtica de 10,0 mL, frascos de
vidro escuros (1.000 mL) com tampa, tubos de ensaio de 15,0 mL, Erlenmeyer de 125 mL e dessecador;
c)
d)
e)
f)
2. Metodologia
Esse mtodo, proposto por Anderson e Domsch (1978), baseado no aumento inicial da taxa de respirao da populao microbiana, at o mximo, quando
uma fonte de carbono, prontamente decomponvel, adicionada em excesso ao solo.
a) Pesar 10,0 g de solo mido, em duplicata, para determinar a massa de
solo seco (item 3);
b) Determinar a capacidade de reteno de gua (CRA) e a partir desse
valor calcular a quantidade de gua necessria para atingir 60 % da CRA
(Anexo 3);
c)
Pesar 20,0 g de solo seco e transferi-lo para frascos de vidro (250 mL)
com, no mnimo, trs repeties;
82
e)
Homogeneizar o solo e a glicose com um basto de vidro, fechar hermeticamente e pr-incubar em estufa a 22 C por 2 h;
f)
j)
3. Clculo
Calcular a biomassa microbiana do solo conforme Anderson e Domsch
(1978) descrito por Hoper (2006).
BMS (g C g-1) = 30(b-a)x{(Kx22x1.000)/(1,8295 x PAx4)}
Onde:
BMS: carbono da biomassa microbiana (g C g-1);
30: constante (mg Cmic h mL CO2-1);
b: mdia do volume (mL) de HCl gasto para titular as provas em branco;
83
4. Resultados
Tabela 14. Carbono da biomassa microbiana do solo (g C g-1) em diferentes solos.
Solo
Repeties
I
II
III
IV
Mdia
A
B
C
D
E
Repeties
I
II
III
IV
Mdia
A
B
C
D
E
Repeties
I
A
B
C
D
E
*COT: carbono orgnico total do solo.
II
III
IV
Mdia
84
CAPTULO XIV
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
O termo decomposio utilizado para descrever um grande nmero de
processos inter-relacionados nos quais a matria orgnica desintegrada em partculas menores e formas solveis de nutrientes, que so absorvidos pelas plantas,
formando o hmus.
O estudo da produo e decomposio da serapilheira, com a consequente
transferncia de nutrientes para o ambiente, essencial para caracterizar os padres de ciclagem, pois representa a principal via de retorno desses e da matria
orgnica superfcie do solo (AIDAR et al., 2003).
Resduos vegetais sob a superfcie do solo ou incorporados a ele, em condies aerbias, sofrem rpido ataque de micro-organismos heterotrficos em busca de carbono, energia e nutrientes, sendo os fungos e as bactrias os seres mais
ativos na decomposio da matria orgnica do solo.
A decomposio, usualmente, no contnua, apresentando fases ativas e
perodos de inibio, intercalados. Assim, os nutrientes minerais so liberados pela
desintegrao fsica dos tecidos e aumento da rea superficial pela ao da fauna
edfica, para:
A maioria dos fatores ambientais que interferem na decomposio de resduos orgnicos est relacionada atividade dos micro-organismos decompositores. So eles:
85
Temperatura;
Umidade;
pH;
Presena de adubos verdes, fertilizantes, araes, gradagens, manejo do solo e uso de herbicidas.
Tambm exercem influncia na decomposio do resduo, as caractersticas intrnsecas do material, tais como (CERETTA et al., 2002):
Carbono/nitrognio (C/N);
Carbono/fsforo (C/P);
Nitrognio/fsforo;
Lignina; e,
Polifenis.
O grau de maturao das plantas tambm regula a permanncia dos resduos no solo, j que o aumento na relao C/N dificulta a sua decomposio.
A estimativa do tempo necessrio para a quase completa decomposio
dos resduos vegetais importante. A permanncia da palha na superfcie do solo
de fundamental importncia para a manuteno do sistema plantio direto. Isso
refora a preocupao de produzir resduos vegetais de decomposio mais lenta,
para manter o resduo sobre o solo por maior perodo de tempo (KLIEMANN et al.,
2006). Deve-se, pois, planejar rotaes de culturas mais adequadas e compatveis
com os sistemas de manejo conservacionistas do solo, ou seja, planejar e adotar, de
acordo com as possibilidades, rotaes de culturas cujos resduos persistam o maior
tempo possvel (BERTOL et al., 2004).
Kliemann et al. (2006) estabeleceram a hierarquia de decomposio para
algumas espcies vegetais em ordem decrescente de decomposio: gramneas
sorgo (80 %) > capim Mombaa (64 %) > milheto (58 %) > braquiria em cultivo solteiro (56 %) e em cultivo consorciado (48 %); e leguminosas estilosantes (72 %) >
guandu (65 %).
86
87
PROTOCOLO XII
DETERMINAO DA TAXA DE DECOMPOSIO DE
RESDUOS ORGNICOS
1. Material
a) Equipamentos: estufa e balana de preciso centesimal; e,
b)
Outros: serapilheira de diferentes reas, sacola plstica para coleta, sacolas de nilon (malhas de 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 mm), p de corte, bquer de
200 mL, pina, pincel fino e luva de proteo (nitrlica descartvel).
2. Metodologia
a)
b)
c)
f)
3. Clculo
a)
88
b)
Onde:
Wt: fitomassa remanescente (%);
WO: massa inicial do material (utilizado sempre como 100 %);
e: exponencial;
k: taxa de decomposio; e,
t: tempo em que o material ficou no campo (dias).
4. Resultados
Tabela 17. Porcentagem de biomassa residual com diversas coberturas vegetais em funo
da malha das sacolas de decomposio (litter bags) e do tempo.
Tratamento (mm)
Repeties (%)
I
II
III
IV
Mdia
1. Malha 0,2
2. Malha 0,5
3. Malha 1,0
4. Malha 2,0
Repeties (%)
I
II
III
IV
Mdia
89
CAPTULO XV
PROTOZORIOS
Jair Alves Dionsio
Ana Luiza Mattana
Diana Signor
Os protozorios representam uma das formas mais primitivas de vida que
ocorre no solo, so protistas superiores, unicelulares, sem parede celular, aerbios,
assimtricos e possuem capacidade de regenerao, cujo tamanho pode variar de
alguns micrmetros at um ou mais centmetros (RUPPERT et al., 2005). Reproduzem-se predominantemente de forma assexuada, por fisso binria e, sexualmente,
porm raramente, pela unio dos gametas (BRANDO, 1992).
O ciclo de vida dos protozorios dividido em duas fases: ativa (trofozoto) e de repouso (dormncia ou estgio de cisto). A fase ativa ocorre quando o
protozorio encontra condies nutricionais e ambientais favorveis sua alimentao e a reproduo, enquanto a fase cstica ocorre em condies adversas sua
sobrevivncia, na qual poder persistir por vrios anos (RUPPERT et al., 2005).
De acordo a estrutura de locomoo, os protozorios so classificados em:
90
91
1991). Geralmente, em solos com altos teores de argila, predominam os protozorios menores: flagelados e amebas no testceas, porm em solos com textura
mdia a arenosa h predomnio de flagelados maiores, como amebas e ciliatas
(USDA, 1999).
Os protozorios so os maiores controladores da densidade populacional
de bactrias introduzidas no solo, tais como Rhizobium e Bacillus thuringiensis (CASIDA JUNIOR, 1989). Os microporos do solo, com dimetro entre 2 e 6 mm, so
micro-habitat favorveis s bactrias, pois servem de proteo contra a predao
por protozorios. Heijnen e Van Venn (1991) demonstraram que a sobrevivncia de
rizbio introduzido no solo aumentou com a adio da argila bentonita, devido ao
aumento de microporos que servem de micro-habitat para essa bactria.
92
PROTOCOLO XIII
MTODO CULTURAL PARA CONTAGEM DE
PROTOZORIOS DO SOLO, ADAPTADO
DE SINGH (1946)
1. Material
a)
Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, microscpio tico, gs
butano e agitador de tubos;
d)
Solues: soluo salina (NaCl 0,85 %), safranina 0,5 % (Anexo 1) e meio
de cultura gar nutriente (Tabela 19); e,
Caldo nutritivo*
1.000,0 mL
gar
15,0 g
Caldo nutritivo
Reagente
Quantidade (g L-1)
Extrato de carne
3,0
Peptona
10,0
1.000,0
93
2. Metodologia
2.1. Cultivo bacteriano
a)
f)
g)
Pesar 10,0 g de solo mido, obtifdo conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm) em
duplicata, sendo uma parte destinada contagem de protozorios e a
outra para determinao da massa de solo seco (item 3);
b)
c)
d)
94
g)
Inocular de cada diluio (10-1; 10-2; 10-3, 10-4 e 10-5) uma gota (@ 0,05 mL)
no centro do anel, realizando-se quatro repeties/diluio;
Realizar as contagens, com uma lupa, considerando-se como casos positivos os anis que apresentam clareamento do cultivo bacteriano;
j)
k)
Dos casos positivos, transferir com ala de platina uma poro do crescimento para uma lmina de vidro, contendo gua deionizada, homogeneizar e realizar a identificao das classes de protozorios por microscopia
tica, com auxlio das ilustraes (Figura 4).
95
3. Clculo
(N de protozorios) g-1 = diluio x n cdigo (NMP)* x 10 g-1*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
4. Resultados
Estimar a densidade de protozorios pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) (Anexo 5) e completar a Tabela 20.
Tabela 20. Densidade populacional de protozorios g-1 em diferentes solos.
Solo
A
B
C
D
E
Classes*
Sarcodina
Mastigofora
Ciliata
Total
96
CAPTULO XVI
NEMATOIDES
Arlei Maceda
Nematoides, Filo Nemata (=Nematoda) Cobb, 1919, so vermes de corpo cilndrico, geralmente esguios e alongados, afilando-se de modo gradual ou
abrupto nas extremidades anterior e posterior. Podem variar de tamanho, de
acordo com o meio onde vivem. Nematoides de vida livre e fitoparasitos medem
de 0,3 a 3,0 mm de comprimento, j os parasitas de animais so maiores, cerca
de 15,0 cm, para Ascaris lumbricoides ou 8,0 m para Placentonema gigantissima,
parasito da baleia de espermacete (FERRAZ, 2007).
A populao de nematoides a mais expressiva da fauna do solo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006) e, segundo Jastrow e Miller (1991), localiza-se entre os
micro e os macroagregados. composta por diferentes grupos trficos, que podem atingir valores de 106 m-2 a 107 m-2 e biomassa de 2 a 100 kg ha-1 (SIQUEIRA,
1988). Distinguem-se, pelo menos cinco grupos, pelo hbito alimentar (YEATES
et al., 1993):
Bacterifagos;
Fitfagos;
Micfagos;
Onvoros; e,
Predadores.
Em solo de cerrado nativo, Huang (1996) observou que nematoides representaram, aproximadamente:
Fitonematoides: 40 %;
Onvoros: 30 %;
Bacterifagos: 20 %;
Micfagos: 7 %; e,
Predadores: 3 %.
97
98
A distribuio horizontal dos nematoides no solo afetada pela movimentao de animais, mquinas, implementos agrcolas e enxurradas, enquanto a
distribuio vertical sofre efeitos dos fatores climticos, profundidade de razes e
estdio de desenvolvimento das plantas (DIAS-ARIEIRA, 2003). O manejo da rea
tambm um fator importante, pois segundo Sereia et al. (2007), a monocultura
de soja em plantio convencional por oito anos exerceu efeito significativo sobre a
populao de Rotylenchulus reniformis. Por outro lado, em sistemas com maior diversificao de culturas (plantio direto e integrao lavoura-pecuria), a populao
de nematoides foi significativamente semelhante ao que ocorreu na mata primria.
A no deteco de R. reniformis em sistema de pastagem contnua reflete a resistncia da braquiria, utilizada como pastagem, a esta espcie de nematoide.
Mattos et al. (2006) observaram predomnio de nematoides micfagos em
sistemas perenes e de bacterifagos em reas sob cultivo anual. No cultivo convencional, a distribuio da populao de bacterifagos mais homognea, enquanto no
cultivo mnimo, h concentrao na regio da rizosfera. Assim, destacaram-se entre
outros grupos de animais e passaram a ser estudados como indicadores de impacto
ambiental, podendo diferenciar diversos sistemas de uso do solo (MATTOS, 2002).
99
PROTOCOLO XIV
MTODO DE AVALIAO DA DENSIDADE DE
NEMATOIDES NO SOLO
H uma variao muito grande nos mtodos de extrao de nematoides
de solos ou de tecidos/rgos vegetais. O mtodo flotao centrfuga em soluo
de sacarose internacionalmente aceito e utilizado, pois relativamente fcil e de
rpida execuo (JENKINS, 1964).
Para se estimar a populao de nematoides no solo com mais preciso,
aconselha-se fazer, no mnimo, trs repeties do mtodo por amostra.
AMOSTRAGEM E ACONDICIONAMENTO DE
AMOSTRAS
Coletar o solo com os mesmos princpios da amostragem para fins de fertilidade, ou seja, amostras compostas, representativas e de reas homogneas, nas
camadas de 0 a 30 cm, descartando-se a camada de 0 a 5 cm.
Acondicionar as amostras (aproximadamente 1 L) em sacos plsticos e
identific-las externamente. Coletar solos com a umidade prxima capacidade de
campo, evitando-se solos muito secos ou excessivamente encharcados. Durante o
procedimento de coleta da amostra, no exp-la a altas temperaturas, caso seja
necessrio, mant-la em caixa de isopor. Enviar o mais rapidamente possvel ao
laboratrio, no sendo vivel mant-la em refrigerador a temperaturas de 4 a 8 C.
O ideal ter uma amostra por hectare, entretanto, em grandes reas, uma amostra
pode representar at 20 hectares.
Amostra de solo;
100
d)
e)
2. Metodologia
2.1. Peneiramento
Fundamentao da fase: separar fisicamente os nematoides (tamanhos
diferentes) dos componentes do solo, utilizando diferentes aberturas de peneiras.
a) Misturar bem e, utilizando um bquer, tomar 100 cm (ou 100 mL) de
solo (no necessrio compact-lo);
b) Transferir o solo para um recipiente de 2.000 a 3000 mL, acrescentar
gua ( 500 mL) e homogeneizar, de tal maneira a destorro-lo totalmente; acrescentar mais gua ( 1.000 mL) e aguardar 15 segundos para
a sedimentao da argila;
c)
d) Tamisar a suspenso obtida no item c em peneira nmero 400 (abertura de 0,037 mm), com jatos fracos de gua de torneira, concentrar o
contedo em um dos lados da peneira, com batidas leves na lateral ou
dedilhamento no fundo externo da peneira; e,
e) Recolher o sobrenadante da peneira de nmero 400, com uma pisseta,
em um bquer de 100 mL.
101
a)
b)
f)
g)
Recolher o contedo da peneira em um bquer de 100 mL, com uma pisseta (40 mL);
j)
k)
l)
Aps esse perodo, retirar a gua alm dos 4 mL, com uma pipeta; e,
Aps a extrao dos nematoides, concentr-los em gua deionizada (verificar em esteromicroscpio a presena de nematoides);
b)
102
Passar o contedo do bquer para um frasco, rotular e armazenar temperatura ambiente ou sob refrigerao.
3. Clculo
Estimativa da densidade final de nematoides.
N/100 cm3 de solo
Onde:
N: nmero de nematoides/1,0 mL da lmina de Peters; e,
4: volume final do lquido concentrado na extrao.
4. Resultados
Realizar a identificao dos nematoides em grupos trficos e preencher a
Tabela 21.
Tabela 21. Grupos trficos e ndice de frequncia (IF %) de nematoides do solo.
Grupos trficos
Solo
1
2
3
4
5
Bacterifagos
Fitoparasitas
Total
Total
IF
IF
Micfagos
Total
IF
Predadores
Total
IF
Onvoros
Total
IF
103
CAPTULO XVII
MESOFAUNA
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
A biota edfica representada por uma gama de organismos com diferentes tamanhos e metabolismos, aos quais se atribuem inmeras funes no solo. A
diversidade quantitativa, qualitativa, gentica e funcional so suas caractersticas
marcantes (LAVELLE et al., 1994).
Inmeros so os grupos taxonmicos que compem a fauna de invertebrados do solo. Algumas classificaes, baseadas no tamanho do corpo e na sua
mobilidade, so bastante difundidas entre os pedobilogos tropicais (DUCATTI,
2002), porm algumas apresentam diferenas no limite das classes.
Lavelle et al. (1994) propuseram uma subdiviso da fauna edfica de invertebrados apoiada no tamanho e na mobilidade dos organismos:
104
Arthropoda Aranae;
Pseudoescorpione;
Acari;
Diplura;
Protura;
Collembola;
Coleoptera;
Diptera;
Hymenoptera; e,
Annelidae Oligochaeta.
Agricultura;
Sade;
Produtos armazenados;
Controle biolgico; e,
Esttica.
105
pH;
Umidade;
Temperatura do solo;
Textura;
Porosidade;
Matria orgnica;
Cobertura vegetal;
Interferncia do homem;
Clima;
Regio geogrfica; e,
Eventos naturais.
As mudanas no ambiente influenciam o nmero e as espcies remanescentes da mesofauna edfica. Portanto, a avaliao do impacto de aes humanas
no solo pode ser realizada por meio da avaliao da populao de microartrpodos
(SOCARRS, 1998; MORSELLI, 2004).
Estima-se que 95,0 % dos microartrpodos do solo sejam constitudos
por Acari e Collembola (SEASTEDT; CROSSLEY JUNIOR, 1984) e so considerados
bastante sensveis a alteraes do ambiente. Em decorrncia dessas caractersticas,
a mesofauna tem sido utilizada como indicadora de impactos ambientais em agroecossistemas (MELLO; LIGO, 1999).
Os colmbolos so amplamente distribudos no solo e na serapilheira,
e tm como principal atividade promover a decomposio de resduos orgnicos.
Isso ocorre diretamente pela alimentao de resduos orgnicos em decomposio
e hifas fngicas e, indiretamente, pelo estmulo no aumento dos micro-organismos
envolvidos na decomposio (AQUINO et al., 2006). Em alguns ecossistemas terrestres, os colmbolos podem atingir densidades de 104 a 105 indivduos m-2 (PETTERSON; LUXTON, 1982).
O equilbrio ambiental dos solos pode ser medido pela observao das
caractersticas populacionais de grupos de organismos especficos, considerados
bioindicadores do grau de alterao ou fragmentao de um local (WINK et al.,
106
2005). Morselli (2004) afirma que um dos bioindicadores utilizados o monitoramento da mesofauna e sua avaliao na decomposio dos resduos a serem adicionados no solo.
O mtodo dinmico de extrao de artrpodes mais indicado para o
estudo da mesofauna edfica o do funil de Berlese-Tullgren (AQUINO et al.,
2006). Maral (2009), utilizando o mtodo anteriormente citado, avaliou durante um ano, bimestralmente, a mesofauna em rea de cultivo de cana-de-acar,
submetida aos tratamentos:
Palha + vinhaa;
Mata nativa.
107
PROTOCOLO XV
EXTRAO DA MESOFAUNA EDFICA PELO MTODO
DO FUNIL DE BERLESE-TULLGREN MODIFICADO
1. Material
a)
d) Outros: funil de Berlese-Tullgren, modelo da UFPR: dimenses: dimetro (7,5 cm), profundidade (4,5 cm), comprimento (28,0 cm) e abertura (malha de 2,0 mm), lmpadas de 25 W, estilete entomolgico, pina
cirrgica, elstico de borracha, caixa plstica vazada e luva de proteo
(nitrlica descartvel).
Tabela 22. Soluo preservativa para artrpodos do solo.
Reagente
lcool 70 %
700,0
Glicerina
20,0
gua q.s.p.
1.000,0
2. Metodologia
a)
b) Realizar a amostragem, com o funil de Berlese-Tullgren, de forma representativa para a rea em estudo;
c)
Separar serapilheira do solo e coletar a amostra de solo na camada superficial (0,0 a 5,0 cm);
108
e)
f)
g)
j)
k) Fechar o local onde ser realizada a extrao para evitar que insetos sejam atrados pela luz durante o perodo noturno e prejudiquem o bom
andamento da extrao;
l)
1. Arthropoda
Filo
Subfilo
Hexapoda
Chelicerata
Subfilo
Identificao da amostra:
Leitura:
Coleta:
Amostra n.:
Arachnida
Classe
Subclasse
Acari
Pseudoscorpiones
Aranae
Ordem
Acariforme
Parasitiforme
Superordem
Data
Continua.
Indivduos/
funil
109
2. Annelidae
Classe
Clitellata
Subfilo
Myriapoda
Symphyla
Pauropoda
Chilopoda
Classe
Classe
Insecta
Classe
Entognatha
Hymenoptera
Diptera
Coleoptera
Ordem
Collembola
Protura
Diplura
Ordem
Formicidae
Famlia
Arthropleona
Symphypelona
Subordem
Continua.
110
Total
Outros
Ordem
Haplotaxida
Subordem
Tubificina
Famlia
Enchytraeidae
111
112
3. Clculo
O clculo para estimativa da densidade da mesofauna feito com base na
rea do crculo do funil de Berlese-Tullgren.
S = (.d2)/4
Onde:
: 3,14...;
d: dimetro do crculo 7,5 cm;
S: rea do crculo 44,18 cm2;
1 m2 = 10.000 cm2; e,
Fator de transformao: 10.000 cm2/44,18 cm2 = 262,35.
4. Resultados
Expressar os termos absolutos (indivduos/funil) e evitar extrapolar os
dados para nmero de organismo por hectare ou m2.
113
CAPTULO XVIII
MACROFAUNA
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
A macrofauna edfica compreende os maiores invertebrados. Segundo
Lavelle et al. (1994), so organismos com dimetro corporal de 4,0 mm a 20,0 cm,
como minhocas, colepteros em estado larval e adultos, centopeias, cupins, formigas, piolhos de cobra, tatuzinhos e aracndeos.
De acordo com Gassen (1992), a fauna do solo pode ser classificada em
funo do habitat e dos hbitos alimentares em dois grupos:
1. Fauna do solo subterrnea: habita o horizonte A e raramente vem
superfcie. Apresenta um conjunto de hbitos e caractersticas comuns,
como movimentao e viso restritas, sensibilidades qumica e mecnica
muito desenvolvidas, fotofobia, corpo despigmentado, defesa pela produo de toxinas, resistncia ao gs carbnico, corpo coberto por estrutura cuticular hidrofbica, formando um plastro que permite a respirao e a osmose durante perodos de chuva. pouco afetada pelos eventos
climticos da atmosfera e pelo manejo da superfcie do solo, destacando-se nesse grupo os cors ou Diloboderus abderus (Coleoptera: Melonthidae), os cupins (Isoptera: Termitidae) e as minhocas (Oligochaeta), que
desempenham importante funo na decomposio de compostos orgnicos (LAMPARSKI; LAMPARSKI, 1987); e,
2.
114
115
116
PROTOCOLO XVI
MTODO DE EXTRAO DA MACROFAUNA EDFICA
(ANDERSON; INGRAM, 1993)
1. Material
a)
b)
c)
d) Outros: p de corte, saco plstico, bandeja, pina cirrgica e luva de proteo (nitrlica descartvel).
2. Metodologia
2.1. Etapa de campo
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Colocar o solo de cada camada em saco plstico (50 L), previamente identificado, preserv-lo na sombra e encaminh-lo ao laboratrio para triagem. Se houver tempo e condies locais apropriadas, pode ser feita a
triagem no campo.
117
Lavar bem os animais, numa bandeja plstica, com uma pisseta contendo
gua deionizada;
c)
Data:
Coleta:
Leitura:
Coletor:
Grupo
Nome comum
Grupo funcional
1. Coleoptera
Besouros, larvas,
cors
Rizfagos, predadores,
detritvoros
2. Oligoqueta
Minhocas
Gefagos, detritvoros,
onvoros
3. Isoptera
Trmitas, cupins
Gefagos, detritvoros,
rizfagos
4. Formicidae
Formigas
Fitfagos, predadores,
detritvoros, onvoros
5. Chilopoda
Centopeias
Predadores
6. Diplopoda
Milipeias, piolho
de cobra
Detritvoros
7. Symphylla
Simflidos
Detritvoros, predadores
8. Aranae
Aranhas
Predadores
9. Hemiptera
Percevejos
Rizfagos
Indivduo
(nmero m-2)
Continua.
118
Cigarras, outros
Rizfagos, detritvoros
11. Orthoptera
Grilos
Rizfagos
12. Lepidoptera
Borboletas,
mariposas
Fitfagos
13. Diptera
Moscas
Detritvoros, predadores,
parasitos
14. Blattaria
Baratas
Detritvoros, fitfagos,
onvoros
15. Isopoda
Tatuzinhos
Detritvoros
16. Dermaptera
Tesourinha
Detritvoros
17. Gasteropoda
Caracis
Fitfagos, detritvoros
18. Pseudoscorpionidae
Pseudoescorpies
Detritvoros, predadores
3. Resultados
Apresentar os dados obtidos em forma de tabela, conforme a Ficha de
Avaliao (Tabela 24), calculando a quantidade e, dentro do possvel, realizar a
identificao dos organismos da macrofauna edfica encontrados nas amostras,
conforme literatura especializada.
Expressar os resultados de densidade populacional (indivduo m-2) em
termos absolutos e relativos. Evitar extrapolar os dados para nmero de organismos por hectare ou m2.
119
CAPTULO XIX
MINHOCAS
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
No mundo, so conhecidas em torno de 8.800 espcies de minhocas, embora seja estimada uma diversidade ainda maior (REYNOLDS; WETZEL, 2007).
Existem registros da presena de, aproximadamente, 310 espcies/subespcies de
minhocas catalogadas no Brasil (BROWN; JAMES, 2007).
As minhocas tm funo pedoecolgica essencial. De acordo com Edwards
e Bohlen (1996), realizam atividades que beneficiam as propriedades fsicas, qumicas e biolgicas do solo, aumentando a aerao, a estabilidade de agregados, a
infiltrao de gua, a mistura de materiais orgnico e mineral e a decomposio
dos resduos das plantas. Dessa forma, elevam a disponibilidade dos nutrientes, orgnicos e inorgnicos que, direta ou indiretamente, melhoram a produtividade do
solo. Esses efeitos frequentemente (superior a 70 % dos casos) levam a aumentos
no crescimento vegetal e na produtividade agrcola (BROWN et al., 2000). Tambm
no aspecto biolgico, trazem benefcios, pois dipersam micro-organismos na forma
de clulas e/ou esporos, pelo deslocamento na superfcie do solo e na construo
de galerias, como tambm pelos excrementos coprlitos, que podem ser liberados
dentro ou na superfcie do solo.
De acordo com a classificao ecolgica de Bouch (1977), as minhocas
edficas so classificadas em:
120
Idade;
Tamanho;
Estrutura da populao;
poca do ano;
Temperatura;
Disponibilidade de gua; e,
Textura do solo.
121
Umidade;
Aerao;
Temperatura;
Material alimentar; e,
pH.
Condies edficas: tipo de solo, mineralogia, teor de matria orgnica, textura, estrutura, temperatura, umidade e valor de pH;
122
123
PROTOCOLO XVII
MTODO DE EXTRAO DE MINHOCAS DO SOLO
COM EXTRATO DE CEBOLA (STEFFEN et al., 2010)
1. Material
a) Equipamentos: microscpio estereoscpio (lupa), microscpio fotnico,
relgio, anel metlico (modelo da UFPR: 0,108 m de altura, 0,407 m de
dimetro e 0,1301 m2 de rea) e balana de preciso centesimal;
b)
c)
2. Metodologia
2.1. Etapas de campo
a) Realizar o reconhecimento da rea;
b)
c)
g)
h) Com uma pina metlica, coletar as minhocas que foram expulsas das
galerias e transferi-las para um bquer contendo lcool 70 % e transport-las para o laboratrio.
b)
124
c)
Sec-las em papel toalha por um minuto e, em seguida, realizar a contagem e a pesagem em balana de preciso centesimal.
3. Clculo
N ou biomassa fresca m-2 = mdia dos cinco anis (Rep.1+ ...+ Rep.5)/5 *fc1
1
4. Resultados
Estimar a densidade populacional (Tabela 25) e a biomassa fresca (Tabela
26). De acordo com o Anexo 8, possvel realizar a identificao de algumas famlias de minhocas.
Tabela 25. Estimativa da densidade populacional de minhocas em diferentes solos.
Solo
Densidades (N m-2)
I
II
III
IV
Mdia
A
B
C
D
E
Biomassas (g m-2)
I
II
III
IV
Mdia
125
REFERNCIAS
AIDAR, M. P. M. et al. Dinmica da produo e decomposio da serapilheira do
ararib (Centrolobium tomentosum Guill. ex Benth Fabaceae) em uma mata ciliar,
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126
127
128
129
130
131
132
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133
134
135
136
137
138
139
140
141
175,00 g em gua
50 mL em gua
7,00 g de farinha de trigo em gua
40,60 mL HCl concentrado em gua
0,25 M
17,50
0,10 %
50,00 %
7,00 %
0,50 N
10,00 %
5,00 %
3,00 %
1,00 M
0,50 M
Extrato de cebola3
Fenolftalena
Glicerol
HCl5
Hidrxido de potssio
Hipoclorito de sdio
KOH
NaCl
NaOH
Goma caseira
26,27 g
20,00 %
Dimetilsulfxido DMSO
EDTA Sdico
20,00 g
50,00 %
BaCl2.2H2O
20,00 g em gua
58,50 g em gua
3,00 g em gua
5,00 g em gua
10,00 g
122,23 g em gua
0,05 g em gua
0,05 %
Azul de Bromotimol
Dissolver1
70,00 %
Concentrao
lcool etlico
Soluo
ANEXO 1
ANEXOS
1.000
1.000
100
100
100
1.000
100
100
100
1.000
250
100
1.000
100
1.000
Continua.
Completar (mL)
142
116,00 %
60,00 %
0,50 %
0,85 %
5,0 %
Sacarose
Sacarose
Safranina
Salina (NaCl)
0,500 g em gua
600,00 g em gua
116 g em gua
Dissolver1
100
1.000
100
1.000
100
Completar (mL)
Usar gua deionizada; 2Dissolver em gua deionizada aquecida a 30 C; 3Pesar 175,00 g de cebola branca sem casca, bater no liquidificador com 500 mL de gua, durante um
minuto e completar com gua deionizada para um litro; 4Diluir a farinha de trigo em gua de torneira e aquecer a mistura at a fervura. Deixar esfriar e guardar em geladeira
at o uso; 5HCl concentrado (36,50 %; d = 1,19). Caso as especificaes sejam diferentes, corrigir o volume de cido a ser utilizado.
Concentrao
Soluo
Anexo 1. Continuao.
143
144
ANEXO 2
Teste de Gram em solubilidade com KOH (RYU, 1940)
a) Selecionar colnias bacterianas puras (isoladas) das placas de Petri em
meio de cultivo com no mximo 24 h;
b)
c)
f)
145
ANEXO 3
Determinao da capacidade de reteno de gua do solo
conforme Monteiro e Frighuetto (2000)
Dentre os fatores limitantes da atividade dos micro-organismos no solo,
tem-se a capacidade de reteno de gua, que extremamente varivel entre os
solos, em funo principalmente dos teores de argila e matria orgnica. Dessa forma, a determinao desse atributo fundamental para interpretao das anlises
microbiolgicas, porm, para que seja aplicado corretamente, necessrio que os
solos estejam nas mesmas condies de umidade, ou seja, na mesma capacidade
de reteno de gua. Os valores de capacidade de reteno de gua so variveis de
acordo com a metodologia, podendo ser superiores a 100 %.
1. Material
a)
2. Metodologia
a)
Pesar 20,0 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado em peneira no 10 (abertura de 2,00 mm) e transferi-lo
com auxlio de uma esptula para o funil;
d) Em um bquer, pesar em balana analtica 100 g de gua destilada e adicion-la ao solo em pequenos volumes. Cobrir o funil com filme plstico
e deixar temperatura ambiente;
146
e)
No dia seguinte, retirar a gua retida na haste do funil, com batidas suaves no suporte de madeira e pesar o frasco coletor contendo a gua percolada; e,
f)
3. Clculo
Determinao da capacidade de reteno (CR) de gua do solo (%)
CR (%) = [(100 - AP) + AS)]/SS x 100
Onde:
AP: gua percolada (g);
AS: gua existente no solo (g); e,
SS*: massa do solo seco (g), obtido aps a secagem do solo mido (20 g)
em estufa (105 C) at massa constante.
147
ANEXO 4
Padronizao de soluo de hidrxido de sdio 0,5 N
1. Introduo
O NaOH no padro primrio, porque higroscpio e sempre contm
uma quantidade indeterminada de gua e carbonato de sdio adsorvida no slido.
Isso significa que as solues de NaOH devem ser padronizadas com um reagente
padro primrio. O padro primrio mais utilizado nessa determinao o ftalato
cido de potssio ou biftalato de potssio HKC6H4(COO)2. Pela estequiometria, um
mol de biftalato neutraliza um mol de hidrxido de sdio.
As solues de hidrxido de sdio atacam o vidro e dissolvem a slica com
formao de silicatos solveis. A presena de silicatos solveis causa erros e as solues de hidrxidos devem ser conservadas em frascos de polietileno.
2. Material
a)
3. Metodologia
3.1 Preparo da soluo de NaOH 0,5 M
Pesar aproximadamente 20,0 g de hidrxido de sdio em um bquer plstico de 500 mL e dissolver em gua destilada fervida (livre de CO2); transferir para
um balo volumtrico de 1.000 mL com auxlio de um funil e completar com gua
destilada e armazenar em um recipiente com tampa. Separar 100 mL em um bquer
de 250 mL, para a padronizao, ou seja, determinao da molaridade real.
148
b)
Transferir, com auxlio de um funil, para um Erlenmeyer de 125 mL e adicionar duas gotas do indicador fenolftalena (1 %).
3.3 Titulao
A soluo de biftalato de potssio, aps adio do indicador, ser posicionada no sistema como titulado e o NaOH como titulante, a titulao terminar com
a mudana de cor de incolor para rosa avermelhada.
4. Clculo
Molaridade real do NaOH
m = (g/M)*v
Onde:
m: molaridade real do NaOH;
g: massa do biftalato de potssio (g);
M: massa molar do biftalato de potssio (g); e,
v: volume de NaOH gasto na titulao (L).
Anexo 4. Determinao da molaridade exata de uma soluo de NaOH.
Massa do HKC6H4(COO)2 (g)
1.
2.
3.
Molaridade real (mdia de trs repeties)
Molaridade real
149
ANEXO 5
Soluo DESS (250 mL)
a) Pesar 26,23 g de EDTA sdico (com peso molecular de 372, 24 g mol-1,
certificar-se de que o EDTA seja dissdico, a massa pode variar, dependendo do peso molecular), passar para um bquer e acrescentar gua
deionizada at completar 50 mL;
b) Ajustar o pH da soluo com NaOH (hidrxido de sdio) 1 molar (o pH
inicial da soluo est em torno de 3 a 4), adicionar a soluo at atingir
pH 7,5 (consumir aproximadamente 50 mL, o EDTA comear a dissolver lentamente, pode-se aquecer a 30 C para facilitar a dissoluo);
c) Depois de dissolvido todo o EDTA, acrescentar gua deionizada at
200 mL;
d) Acrescentar 50 mL de soluo DMSO a 20 % (Anexo 1);
e)
f)
g)
Passar a soluo para um frasco, tomando o cuidado de no verter os cristais precipitados no fundo, identificar e armazenar em lugar adequado.
150
ANEXO 6
Chave pictria para identificao de famlias (Collembola,
Entognatha) (GISIN, 1960)
1.
Corpo comprido. Os segmentos do trax e abdmen visivelmente divididos (no mximo, os 2-3 fundidos) (Subordem Arthropleona)..................2
-
2.
3.
Com pseudoceles (geralmente poros na pele, nos vrios segmentos do corpo). Maioria sem pigmentao, brancos. Sempre sem ocelos....................................................................................Onychiuridae
5.
Corpo com escamas, ou, quando sem, pelo menos pelos em forma de
clava, principalmente na regio dorsal do trax. Abd. IV geralmente
mais longo que Abd. III. Frcula bem desenvolvida...Entomobryidae
151
ANEXO 7
Chave pictria para identificao de famlias
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)
152
ANEXO 8
Chave para identificao de algumas famlias de
Oligochaeta (TALAVERA, 1990)
1.
3.
4.
PARCERIA