TCNICAS DE AISLAMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA

HONGOS
Introduccin
Un hongo es en general, un organismo eucarionte hetertrofo unicelular,
pluricelular o multicelular cuyas clulas se distinguen por tener una pared
celular con el polisacrido quitina. Los hongos constituyen un grupo muy
amplio de organismos y suelen clasificarse en 2 reinos. Los llamados hongos
verdaderos son aquellos que constituyen el reino Fungi y que tienen las
caractersticas antes descritas, otros hongos se clasifican entre los protoctistas
y tienen caractersticas especiales. Entre los hongos verdaderos podemos
distinguir tres grandes grupos segn su morfologa; a saber:
-Hongos filamentosos -Levaduras -Setas

Aunque esta clasificacin no tiene valor taxonmico resulta prctica para

agrupar distintos tipos de hongos por sus caractersticas afines. Los hongos
filamentosos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se caracterizan
por presentar como unidad estructural unos filamentos formados por una o
ms clulas llamados hifas, que al reunirse dan lugar a un conglomerado de
nombre micelio.
Por su parte las levaduras son hongos unicelulares de clulas ovales o
cilndricas normalmente. Tanto los hongos filamentosos como las levaduras son
microscpicos, pero al formar colonias grandes (las cuales en un cultivo
descienden de una sola clula) pueden apreciarse la simple vista.
Las setas por su parte son hongos filamentosos que forman cuerpos fructferos
macroscpicos. Los hongos filamentosos, setas incluidas, se consideran
organismos talofticos porque tienen un nivel de organizacin ms sencillo que
los tejidos, pero ms complejo que las colonias, en la que sus clulas se
agrupan sin diferenciarse, pero algunas de ellas si se diferencian,
especializndose para la reproduccin, otros organismos talofticos son las
algas. Los hongos revisten gran inters cientfico puesto que muchos de ellos
producen o participan en la produccin de muchas substancias y bienes tiles
al hombre, aunque muchos son tambin importantes agentes infecciosos del
hombre.

Aislamiento de hongos filamentosos y levaduras:

Medios de cultivo
Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento de los hongos.
En general su pH oscila alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez
que se ha aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios deben
utilizarse medios de cultivo con un pH menor para favorecer el crecimiento de
los hongos por sobre el de las bacterias, un pH de 3,5 resulta en general
adecuado. Algunos medios propicios para el desarrollo de hongos son:

Las muestras:
Para los estudios de hongos se toman muestras que se preparan para su
estudio segn diversos mtodos por lo general el material blando se agita de
forma continua, durante 2 minutos, o ms, en un matraz con perlas de vidrio, o
en una licuadora durante 30 segundos, o en un homogeneizador durante 1
minuto, empleando como diluyente una solucin de peptona al 0,1% p/v. El
material duro se muele en un molinillo de granos u otros dispositivos
adecuados; es comn usar solucin fisiolgica, solucin reguladora de fosfatos
o agua destilada para permitir la homogenizacin de la muestra.
En los productos secos, o concentrados, debe evitarse el choque osmtico.
Para lo cual fin, se diluyen con una solucin de sacarosa o glucosa al 20% p/v.
Si se trata de productos salados se emplea un diluyente con 5% p/v de NaCl.
Cuando la muestra tiene gran cantidad de azcares y es muy cida, debe
diluirse (1+1) con solucin de peptona al 0,1% p/v y ajustar el pH a 3,5 - 4,0,
aunque el tratamiento especfico de la muestra depender nicamente de los
ensayos a realizar.

Aislamiento:
Cuando lo que se busca es aislar hongos filamentosos, el pH de los medios
comerciales (5,4) se puede reducir adicionando cido tartrico al 10% (1 mL
por cada 100 mL de medio de cultivo ya estril y a 50 C). Los medios no
deben calentarse luego de esta acidificacin pues provocara la hidrlisis del
agar y por lo tanto la prdida de su capacidad para gelificar.
Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH
ptimo mediante adicin de cido clorhdrico o cido fosfrico, no con cidos
orgnicos pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de
igual forma a como se explic para los hongos filamentosos.
Sea cual sea el microorganismo que se desea cultivar se suelen hacer
diluciones decimales en agua (a veces en otros agentes como solucin salina)
de la muestra de inters para luego tomar un mL. de la dilucin
correspondiente y mezclarlo con el medio de cultivo elegido. Para luego
incubarlo a 28 C durante 5 das. Aunque tales condiciones de incubacin son
las ms comnmente sugeridas, de acuerdo a las condiciones del medio, a las
caractersticas ambientales del lugar de origen del hongo y la tcnica utilizada,

se pueden seguir otras recomendaciones, como el colocar las placas dentro de

una bolsa de plstico acompaada de un recipiente con agua para evitar la
desecacin, durante 3 a 7 das a 28 C en las regiones subtropicales; a 30 C
en las tropicales, y a 22 C en las templadas.

EN TUBO O EN PLACA
Las placas de medio de cultivo con hongos, a diferencia de aquellas donde se
siembran bacterias, no se invierten (salvo en contadas excepciones).
Tras el tiempo de incubacin las placas se observan y se analizan los hongos y
levaduras que han crecido en las mismas para luego tomar muestras aisladas
de una sola colonia que pueden resembrarse en nuevas placas con medio de
cultivo. Se deben de descartar para su estudio aquellas placas que tengan ms
de 200 colonias, puesto que de estas placas el aislamiento se hace muy difcil y
poco certero.
Tras incubar las placas con las diluciones de hongos y habiendo contado el
nmero de colonias en estas se puede proceder a establecer cultivos puros
como se seal ya resembrndolas en nuevas placas con medios de cultivo. Un
cultivo puro de levaduras se obtiene dispersando el material tomado de la
colonia a estudiar, mediante estras sucesivas sobre la placa de medio. En
cambio, un cultivo puro de hongos filamentosos se obtiene por repique de un
pequeo manojo de hifas o grumo de esporas en varios puntos de una placa de
medio selectivo. En algunos casos esta tcnica no es satisfactoria y entonces
conviene hacer una dispersin de esporas sobre la superficie de agar estril. Se
toman las esporas del hongo en el cultivo primario y luego se ponen sobre la
placa de agar estril. Por lo general es necesario resembrar sucesivamente los
hongos de un cultivo puro, para garantizar que efectivamente solo haya un tipo
de hongos en este.

Tcnicas de enriquecimiento:
En ocasiones es preciso potenciar, o amplificar, la presencia de hongos en una
muestra, previo a su aislamiento. En esos casos resultan adecuadas las
tcnicas de enriquecimiento. El primer paso consiste en incorporar la muestra
en un medio lquido que contenga extracto de carne o extracto de levadura y
su pH sea 3,7. A continuacin se incuba de 24 a 72 horas a temperaturas entre
25 y 30 C, y del crecimiento obtenido se hacen siembras en medios slidos.
Este mtodo sin embargo no permite a diferencia de la siembra directa en
medios slidos, conocer la proporcin real en que se encuentra lo buscado en
la muestra.
Si se desea aislar levaduras, a partir de muestras muy contaminadas con
hongos filamentosos, el desarrollo de estos ltimos se puede restringir por
varios mtodos como la exclusin de aire que se logra aadiendo una capa de
parafina lquida estril sobre la superficie del medio de cultivo, una vez

realizada la adicin de la muestra. Esta capa debe tener un grosor de 1 cm. Se

incuba como se explic previamente, hasta obtener un crecimiento adecuado.
Tambin puede aadirse la muestra al medio en un matraz Erlenmeyer de 250
mL. (ej. 10 g de muestra en 90 mL. de medio). Tras lo cual, los matraces se
agitan durante un tiempo adecuado (24-72 horas) a las temperaturas ya
sealadas. Los hongos filamentosos, en estas condiciones, no generan esporas,
sus micelios se agregan en forma de esferas y se ven superados en
multiplicacin por las levaduras presentes, que se distribuyen de forma
homognea en el medio de cultivo.
En general se prefieren los medios de cultivos slidos ya que posibilitan la
observacin de las colonias (caracteres macroscpicos). Sin embargo, para el
estudio de hongos acuticos el aislamiento debe iniciarse en medios lquidos
para lograr una aproximacin a su hbitat.