Fijadores

Existen multitud de fijadores en los manuales de tcnicas histolgicas. Aqu slo

trataremos aquellos que consideramos de uso ms comn para la observacin de tejidos al
microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los fijadores
qumicos son los ms frecuentemente empleados, bien compuestos por un solo tipo de
sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas.
Los fijadores se pueden clasificar en dos grandes grupos segn su accin sobre el tejido:
los coagulantes y los que establecen enlaces cruzados. Los primeros, al extraer agua de los
tejidos producen coagulacin y desnaturalizacin de las protenas, sobre todo las de la matriz
extracelular, mientras que los segundos establecen enlaces qumicos entre molculas del
tejido. Los fijadores que tienen como base al alcohol son desnaturalizantes, tales como el Bouin
o el Carnoy, mientras que el formaldehdo o el glutaraldehdo establecen enlaces. Tambin se
preparan soluciones mixtas de ambos tipos de fijadores.
Otra clasificacin de los fijadores es la de que sean aditivos o no aditivos. Los primeros
tienen molculas o iones se que se combinan con las molculas del tejido y formarn parte de
l en los pasos sucesivos del procesamiento. Estos son sobre todo los que establecen enlaces y
algunos coaguladores. Los no aditivos son aquellos que tras llevar a cabo su funcin son
eliminados en pasos posteriores, como es el caso del alcohol o el cido actico.
Atencin! La mayora de las sustancias fijadoras son txicas por inhalacin o por
contacto, algunas de ellas cancergenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su
manejo y utilizacin.
Fijadores simples

Etanol: CH3-CH2-OH

Etanol, metanol, acetona. Fijan por deshidratacin y coagulacin de las protenas, sobre
todo las citoslicas. Extraen los lpidos de los tejidos, pero no afectan a los carbohidratos. El
metanol es mejor fijador que el etanol puesto que no causa tanto endurecimiento del tejido y
aporta una mejor preservacin. En general, son buenos fijadores de muestras de pequeo
tamao, y para preservar protenas, como enzimas, glucgeno, pigmentos. Se usan
frecuentemente para para fijar las extensiones citolgicas o secciones de criostato obtenidas
de tejido no fijado. Debido a que deshidratan, a la vez que fijan, se puede usar tambin como
un conservante de las muestras. Tienen algunos inconvenientes como producir endurecimiento
y la retraccin de los tejidos, muy evidentes en bloques de tejido muy grandes. Carecen de
efecto mordiente.

cido actico: CH3COOH

cido actico. No fija protenas sino que su proceso de fijacin consiste en cambiar el
estado coloidal de las protenas. Se utiliza a una concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es
el fijador ideal para cidos nucleicos y nucleoprotenas. Como inconvenientes cabe destacar la
destruccin de las mitocondrias y mala fijacin de membranas y citoplasma. Se suele usar en
combinacin con otros fijadores. Ejemplos: BOUIN, FFA . En las mezclas tambin es capaz
de contrarrestar los artefactos que pueden introducir el etanol o el cido pcrico.
Cloruro o sulfato de zinc. El cloruro de zinc se utiliz inicialmente como fijador pero ms
tarde pas a ser un componente de mezclas fijadoras. Se emplea normalmente en combinacin
con el paraformaldehdo. El cloruro de zinc ayuda a la fijacin y preserva la antigenicidad si se
necesita el tejido para pruebas inmunocitoquicas, ya que contrarresta el enmascarmiento de
antgenos que se atribuye al paraformaldehdo. Las sales de zinc han sustituido
progresivamente a las sales de mercurio usadas tradicionalmente en las mezclas fijadoras. Es
importante sealar que el fijador no se prepara en sales de fostato, como es habitual, y tras la
fijacin ha de eliminarse el zinc mediante lavados en agua destilada.

cido pcrico: C6H2OH(NO2)3

cido pcrico. La fijacin la produce porque las sales del tipo picrato coagulan las
protenas de los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una solucin saturada de cido pcrico.
Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es
ptimo, preserva bien glucgeno y lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto
que tiene efecto mordiente y favorece la unin de los colorantes. Hay que eliminarlo
completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la parafina puesto que dificulta
la penetracin de la parafina. Se suele usar combinado con otros fijadores. Ejemplos: BOUIN
Formaldehdo.
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El formaldehido es un gas (Pequea molecula HCHO, -CHO grupo aldehdo)

Fijador ampliamente usado por la buena preservacin del tejido, acta como
conservante, produce poca retraccin tisular, es compatible con la mayora de las
tinciones histolgicas, incluidas las de inmunocitoqumica e hibridacin de cidos
ribonucleicos, penetra rpido pero fija lento.
En solucin acuosa el formaldehido forma hidrato de metileno (Metilen-glicol) el cual
genera pequeos polmeros, en el caso del paraformaldehido, que se vende como un
polvo blanco, son una mayor cantidad de polmeros.
Para que el formaldehido sea efectivo como fijador tiene que contener formaldehido
monomrico (Hidrato de metileno).
En agua la despolimerizacin se demora un par de das, por lo cual se le agrega una
solucin buffer a ph fisiolgico, donde la hidrolisis de los polmeros es catalizada por
los iones hidrxidos presente en la solucin ligeramente alcalina.
Para el caso del paraformaldehido es necesario un tratamiento mas energico por el
cual se calienta (60), siendo una fuente adicional de iones hidrxidos. Adems no
contiene metileno inicialmente por lo cual es utilizado para microscopia electrnica.
La formalina contiene un 10% de metanol, adicionado para disminuir la polimerizacin
que por consiguiente generara la precipitacin del parafomaldehido. Por lo que el for
aldehdo al 4% contiene 1% de metanol y iones formato generados por la reaccin de
canizzaro.

La reaccin de Canizzaro se produce cuando dos molculas de formaldehido

reaccionan siendo una reducida a metanol y siendo la otra oxidada a acido formico.
Por lo que la concentracin de metanol y acido formico aumenta en la solucin de
formaldehido por el almacenamiento prolongado, el cual precipita y genera pigmento
formalinico (Birrefringente). (2 HCHO + H2O
HCOOH + CH3OH)

Reaccin de formaldehido con protenas

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En la fijacin con formaldehido, el metilen glicol es aquel que posee una buena
penetracin del tejido, pero una fijacin lenta (Carbonil formaldehido)
El formaldehido es un reactivo electrofilico
Se une a protenas, glicoprotenas, acidos nucleicos y polisacridos. (aminas primarias
y secundarias, amidas, hidroxilos, sulfidrilos y atomo de hidrogeno reactivos de
aminocidos aromticos. Teoricamente reacciona con grupos carboxilos pero es
improbable debido a los rangos de pH)
Los sitios mas reactivos son aminas primarias (Lisina) y grupos tiol (Cisteina).
Y el entrecruzamiento subsecuente se produce en grupos menos reactivos como las
amidas primarias (Glutamina, Asparragina) grupos guanidinos (Arginina y grupos
carbono de tirosina.
1) Se genera la Adicin, donde el formaldehido reacciona con casi todos los grupos
terminales de las molculas biolgicas generando varios grupos hidroximetilenos
Esta unin hace que muchos enzimas queden inactivas lo que ayuda a evitar la
degradacin del tejido por las enzimas hidrolticas.
La unin a uno de estos grupos produce un grupo hidroximetileno.
2) Se produce el Cross-linking o entrecruzamiento donde es el hidroximetileno el que
reacciona con grupos de otra, o de la misma protena para la formacin de puentes
metilenicos (-CH2-).
La fijacin normalmente es de 24 a 50 h, aunque puede ser de 1 a 2 semanas. Si el
tejido va destinado a histoqumica es suficiente con 12-24 h a 4C.
Fijaciones muy prolongadas endurecen el tejido y pueden prolongar inestabilidad de
los cidos nucleicos.
Parte del fijador del tejido se puede eliminar mediante lavados prolongados.
Normalmente se usa en solucin tamponada e isotnica.
La denaturacion no termina con la fijacin ya que los alcoholes utilizados en el
procesamiento del tejido son utilizados para remover el agua libre de los tejidos,
generando iminas reactivas y con esto la inversin hidrofobica

Formaldehdo: CH2=O.

Enlaces entre protenas formadas por el formaldehdo.

Glutaraldehdo.
Glutaraldehdo. Forma puentes entre las molculas de los tejidos. Se usa a una
proporcin de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura
celular, por lo que es el fijador de referencia para observacin de ultraestructuras celulares con
el microscopio electrnico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede
producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotnicas.

Tetrxido de osmio. OsO4.

Enlaces producidos por el OsO4 en los enlaces insaturados de los cidos grasos.
Tetrxido de osmio. Es uno de los fijadores ms antiguos, se usa desde al menos 1865.
Tiene poca penetracin en los bloques de tejido, entre 0.5 y 1 mm, y se pude usar tanto en
solucin como en vapor. No produce artefactos pero hace a las muestras de tejido frgiles.
Forma puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de cidos grasos de los lpidos de
las membranas celulares. Las hace insolubles, oscuras y opaca a los electrones. Por eso se
emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrnico, ya que preserva
y oscurece las membranas celulares. Pero tambin en microscopa ptico se usa para estudiar
las grasas insaturadas, para observar los tractos de mielina, y es necesario para las
impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi. Por su fuerte carcter oxidante no se usa
para tinciones convencionales puesto que impide la unin al tejido de los colorantes aninicos.
Actualmente se usa mucho tras la fijacin de las muestras con formaldehdo o glutaraldehdo y
antes de deshidratar las muestras para su observacin al microscopio electrnico.
Mezclas fijadoras
La mayor parte de los procesos de fijacin usan varias sustancias fijadoras, bien mezcladas
en la solucin acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las
ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de
formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de
stos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido queremos fijar y
qu queremos ver de dicho tejido. A continuacin vamos a mencionar algunas combinaciones
usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace apropiadas
para las observacin de una gran variedad de tejidos y para el uso diversas de tcnicas de
tincin.

Lquido de Bouin. Est formado por cido pcrico, formaldehdo y cido actico glacial.
Es una solucin muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirn en parafina (ver
captulo de inclusin) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones.
Es muy til para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno. Hay que
tener cuidado con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones
por inmersin. Tras la fijacin las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70. No
est recomendado para el rin ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en
parafina es conveniente eliminar el cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70 porque
impedir una buena inclusin o que las tinciones no sean adecuadas.
Carnoy. Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de carbono simples y
para las protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los cidos nucleicos, aunque no la
morfologa nuclear, y para los granulos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir
retracciones tisulares. Est formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y cido actico
glacial 10 %.
Mezclas con formaldehdo. El formaldehdo es quiz el fijador ms usado hoy en da,
tanto para tcnicas histolgicas rutinarias como para otras como la inmunocitoqumica o la
hibridacin de cidos nucleicos. Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con
otros fijadores. Se suele disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar
a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa
electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y glutaraldehdo.
La funcin del formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su mayo capacidad de
penetracin, mientras que el glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa, pero ms
lenta que no afectar a la estructura tisular puesto que el formaldehdo ya ha realizado una
fijacin previa.
Glutaraldehdo-tetrxido de osmio. Los fijadores en combinacin no tienen
necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a
microscopa electrnica sean inicialmente fijados en glutaraldehdo (1 al 3 %) y
paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 %
en solucin tamponada. Este ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre
todo membranas, en cooperacin con los aldhedos. Esto es importante porque el proceso para
microscopa electrnica supone incubar el tejido en solventes orgnicos y polimerizacin de
resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.