MEDIOS DE CULTIVO

1.- CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Es el desarrollo activo de microorganismos en medios adecuados.
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las
condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que
puedan multiplicarse de forma controlada.
Toda clula viva requiere consumir nutrientes que le permitan
realizar los procesos metablicos necesarios para su
supervivencia.
MEDIOS DE CULTIVO
Es la mezcla adecuada de nutrientes que, permiten el
crecimiento de los microorganismos.
Es un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir que en condiciones favorables de pH y
temperatura, se produzca el crecimiento de microorganismos,
clulas o plantas.

2.- REQUERIMIENTOS QUIMICOS

El medio de cultivo debe tener una composicin tal que provea al
microorganismo los nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares.
Principales componentes:
Carbono (sntesis de componentes celulares)
Nitrgeno (sntesis de DNA, RNA, protenas y ATP)
Azufre
Fosforo
Oligoelementos (Fe Cu, Mo, Zn, etc)
Oxgeno
Los componentes qumicos de las clulas son: carbono, alrededor
del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo
(3%), azufre ( 1%) y elementos traza como: Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb,
Cu y Zn.
Dichos elementos deben estar en forma asimilable. As, el C debe
estar en forma de carbono orgnico para los heterotrofos y como CO2 para los
autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3- o de NO2- o en forma de
aminocidos; el P en forma de PO43-; el S como aminocidos sulfurados o de
SO42-, etc.

Disponibilidad de los componentes

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar
disponibles para ser usados por la clula.
As, el C debe estar en forma de carbono orgnico para los heterotrofos y
como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3- o de NO2- o en
forma de aminocidos; el P en forma de PO43-; el S como aminocidos
sulfurados o de SO42-, etc.
La disponibilidad de los iones metlicos es modificada por quelacin, ya que
muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como
agentes complejantes o precipitantes, _por ejemplo aminocidos,
hidroxicidos, hidrxidos, y los aniones P04 y C03-2 .
Con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los
iones metlicos, puede ser necesario quelar el ion mediante algn agente
quelante como el EDTA.

En medios complejos de uso industrial, pueden haber sustancias orgnicas,

que pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la
concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos estan: aminocidos,
protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales

FUENTES DE MACRONUTRIENTES
Fuente de
carbono

- CO 2
Carbohidratos,
- Compuestos azcares, protenas,
orgnicos aminocidos, lpidos,
cidos grasos,
glicerol

Fuente de
nitrgeno

- Inorgnica
- Orgnica

Fuente de
fsforo

- Inorgnica
- Orgnica

Fuente de
azufre

- Inorgnica
- Orgnica

NH,4 NO- 3 , N 2
Protenas, peptonas, aa,
bases pricas y
pirimdicas, urea
Fosfatos
Esteres del cido
fosfrico

Sulfuros y sulfatos
Aminocidos sulfurados,
vitaminas

OXIGENO
Segn los requerimientos de oxigeno, los microorganismos son:
Aerobios

obligados: requieren oxgeno (21%). Ej. Bacillus, hongos,

Acetobacter aceti, etc.
microaeroflicos: requieren a niveles menores (5-10%). Ej.
Azospirillum
Anaerobios
obligados: no toleran O2, muere en su presencia. Ej.
Methanobacterium, Clostridium
facultativos: no requieren O2, pero el desarrollo es mejor con O2.
Ej. E. coli.
aerotolerantes: no son sensibles al oxgeno (crecen en ausencia o
presencia de oxgeno de hasta 8%). Ej. Enterococcus faecalis.

MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
ANAEROBIOS ESTRICTOS Y ANAEROBIOS AEROTOLERANTES
Estrictos (2): crecen en atmsferas con
una tensin de oxgeno inferior al 0,5%.
Mueren en presencia de cantidades
mayores.
Aerotolerantes (5): pueden sobrevivir
en presencia de oxgeno (hasta un 8%),
pero son incapaces de utilizarlo para su
metabolismo.
La tolerancia viene determinada por la
presencia de enzimas: superoxido
dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa
que catalizan la conversin de radicales
superxido a perxido de hidrgeno,
menos txico, y a oxgeno molecular.

TIPOS DE MEDIOS
A.- Segn la naturaleza de sus constituyentes.
Definidos cuando su composicin qumica se conoce
totalmente. Se usan en laboratorio para trabajos de
investigacin.
Complejos No se conocen los componentes ni las
cantidades exactas presentes, y estn compuestos por
mezclas de extractos de materiales complejos
(extracto de levadura, extracto de carne, etc.).

.Tipos de medios
B.- Segn la consistencia del medio.
Medios Lquidos, si no se aaden agentes
gelificantes. Son tiles para promover el
crecimiento celular (Caldo de cultivo)
Ejm. caldo lactosado para coliformes.
Medios semislidos (agar al 0.7%) para poner
de manifiesto la movilidad de la bacteria
Siembra con aguja, y se observa si la bacteria
presenta turbidez mvil en el tubo.
Ejplo. Agar SIM. Agar MIA, agar PCA.
Medios slidos. si se aade algn agente
solidificante que no sea consumible por los
microorganismos (normalmente agar). Se usan
para obtener colonias aisladas del m.o. de
inters.
El crecimiento se observa en la superficie de
placa o pico de flauta. Agar al 1-2%

.Tipos de medios
c.- Segn el uso
Medios de laboratorio.
Pueden ser medios definidos o complejos.
Se usan para:
Desarrollo de m.o. (reproduccin)
Conservar m.o.
Aislar m.o.

Medios industriales.
Generalmente son medios complejos y se desarrollan
a partir de subproductos industriales como; melazas de
caa o remolacha, suero de leche, licor del maz. Etc.
Se usan para:
Produccin de biomasa.
Produccin de metabolitos

.Tipos de medios
d.- Segn la funcin.

Generales, Es un medio altamente enriquecido que permite el

crecimiento de todo tipo de microorganismos. Ejemplo: Agar nutritivo,
caldo nutritivo
Selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos mientras suprimen el de otros. Un medio selectivo
puede usar un medio rico en un antibitico, como la ampicilina, para
permitir nicamente el crecimiento de las bacterias resistentes a ste
Diferenciales. Capaz de distinguir dos m.o por su crecimiento
diferencial en el mismo, usando las propiedades metablicas de ambos
en presencia de un determinado nutriente y de un indicador que
evidencia por ejemplo, un pH cido en su entorno. (Agar TSI: Triple
Sugar Iron (hierro tres azcares), LIA: Lisine iron agar (lisina hierro)
Selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersticas
anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar
Escherichia coli
Medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado
de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran
tamao. Ejplo: Agar sangre.

MEDIOS DE LABORATORIO
Pueden ser sintticos o complejos, y sus constituyentes
tienen las siguientes caractersticas:

a. Fuentes de carbono
1.1. Carbohidratos.
Monosacridos. Dextrosa. Presente en jugos de frutas.
Hidrlisis de lactosa, sacarosa, almidn.
Oligosacridos. Lactosa (suero de leche), Sacarosa. Dextrina.
Polisacridos. Almidn. agar
1.2. alcoholes.
Glicerol. Etanol. Metanol
1.3. Lpidos
1.4. Hicrocarburos

b. Fuentes de nitrgeno
Nitratos, Sales de amonio
Hidrolizados. Peptonas. Digeridos, extractos.
1) Peptonas. Obtenidas por hidrlisis cida o enzimtica de fuentes
proteicas como carne, pescado, casena, gelatina, harina de soja,
algodn, girasol, etc. Muy usada por que representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los
microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas
naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona
2) Extracto. Se obtiene por extraccin acuosa y concentracin
posterior de una fuente rica en nutrientes: Extracto de carne,
extracto de levadura, etc. (mezcla de aminocidos, pptidos,
vitaminas solubles en H2O y carbohidratos).
4) "Cornsteep", Agua de maceracin de la industria del maz.

Debe considerarse costos, disponibilidad e impurezas de las materias

primas utilizadas.

c. Micronutrientes
Macronutrientes. En cantidades de gr/l. C, O2, H2, N2,
P, S, K, Na, Ca, Mg
Micronutrientes.oligoelementos, en mg/l o g/l
Son activadores enzimticos. Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, B.
Sales: NaCl, KH2PO4, NH4(SO4), MnSO4, ZnSO4, CaCl2.
El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento de
algunos m.o. y favorece a otros.
Ejplo. Agar manitol salado (7.5% de ClNa) se usa para el
crecimiento de Staphilococcus.
Agar streptococcus KF (6.5% ClNa) para crecimiento de
streptococcus

Requerimientos especficos.
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de
los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los
requerimientos especficos del proceso considerado.
Un ejemplo es el caso de precursores que constituyen la base de una molcula
que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil actico para
la penicilina.
Otro ejemplo es el agregado de ciclo dextrinas en procesos de produccin de
Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibidores de
crecimiento celular.
El agregado de sulfato, en el proceso de fermentacin alcohlica, que favorece la
formacin de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especfico.
El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y
evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso
caracterizado por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de
amonio como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn
agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del
control de pH del mismo.
Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas
de fosfatos o de carbonato de calcio o con agregados peridicos de soluciones
alcalinas.
El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento de algunos m.o y favorece a
otros.

d. Suplementos
Compuestos que inhiben o favorecen el crecimiento de determinados
microorganismos.
D.1. inhibidores.
Antibiticos: penicilina, estreptomicina, cloranfenicol. Ejm. Agar
saboraoud. (Contiene cloranfenicol).
Fungicidas: fungizona, amphotericina (mohos y levaduras).
Metales pesados: Agar sulfito-bismuto. Contiene Bi y colorante verde
brillante e inhiben a bacterias Gram (+) y mayora de Gram (-), excepto a
salmonella.
Compuestos orgnicos inhibidores: Agar salmonella-shigella. Contiene
altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio que inhibe a las
Gram (+) y mayora de gram(-) incluyendo coliformes, excepto
salmonella y shigella.

D.2.- factores de crecimiento.

Compuestos orgnicos que se suministran en bajas concentraciones.
No son sintetizados por los m.o. que se desea favorecer, pero son
necesarios para su desarrollo. Vitaminas, aminocidos, cidos grasos.

.Suplementos
d.3.

Colorantes e
indicadores.

Indicadores de la reaccin del

medio.
Verde malaquita:
pH muy cido: amarillo
pH =2 : verde
pH = 11.5: azl
pH = 14: incoloro
Rojo-fenol.
pH = 7.8: azl
pH =7.8: prpura.
pH = 7.4: rojo
oH = 7.0: naranja
pH =6.5: amarillo.
Para indicar produccin de
acidos; lctico, ctrico, actico

Indicadores de pH
ROJO NEUTRO
Rango de pH: 6.8-8.0 (rojo a
amarillo)
AZUL DE BROMOTIMOL
Rango de pH: 6-7.6 (amarillo a
azul).
ROJO DE FENOL Rango de pH:
6.8-8.2 (amarillo a rojo)
AZUL DE TIMOL
Rango de pH: 1.2-2.8 ( rojo a
amarillo) y 8.0-9.6: ( amarillo a
azul).
PURPURA DE BROMOCRESOL
Rango de pH: 5.2-6.8 (amarillo
a prpura)
ROJO DE CRESOL
Rango de pH: 7.2-8.8 (amarillo
a rojo).

.Suplementos
Algunos colorantes que actan como indica dores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento
de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador
ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayora de las bacterias Gram-positivas)
Indicadores del potencial de oxido-reduccin.
Azul de metileno: Medio oxidante: azul, Medio reductor: incoloro
Indicadores selectivos.
Verde malaquita, cristal violeta: inhiben bacterias gram(+)
Colorantes bsicos: inhiben bacterias.

Ejplo. Agar Mc-Conkey. Contiene sales biliares y cristal violeta que

inhibe a las gram(+)
Agar EMB. Para determinacin de coliformes fecales. Contiene
eosina y azul de metileno que inhiben gram(+) y facilita el
desarrollo de enterobacterias.

PARTICULARIDADES DE LOS MEDIOS DE LABORATORIO.

Para la preparacin de medios solidos, el agar es el agente
solidificante mas empleado. Se lica completamente al hervir el agua
y se solidifica a 40C .Con algunas excepciones no tiene efecto sobre
el crecimiento de las bacterias y no es atacado las que crecen en l.
Otro agente solidificante es la Gelatina, pero es poco usado por que
muchas bacterias provocan su licuacin
La fuente de nitrgeno se usa como: infusiones de carne, extractos
de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de
estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban
la prdida de los factores nutritivos lbiles. Por ello, la forma ms
extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona.
En el caso de medios sintticos hay concentraciones definidas como:
Agar McConkey . 50 g/l
Agar nutritivo . 20 g/l
Agar LIA . 32 g/l
Agar TSI . 65 g/l
Agar EMB . 36 g/l

EJEMPLOS: MEDIOS GENERALES

Agar nutritivo
Caldo nutritivo
Es utilizado para el desarrollo
de microorganismos con
escasos requerimientos
nutricionales.
Contiene pluripeptona (una
mezcla de partes iguales de
peptona de carne y de casena)
y extracto de carne.

El agar nutritivo es un medio de

cultivo usado normalmente como
rutina para todo tipo de bacteria.
El agar nutritivo contiene
normalmente (p/v):

0,5 % de peptona;
0,3 % de extracto de
carne/extracto de levadura;
1,5 % de agar;
0,5 % de cloruro de sodio;
agua destilada;
pH casi neutro (6,8) a 25 C.
El caldo nutritivo se hace
exactamente igual, excepto por la
omisin del agar.

Ejemplo: medio selectivo-diferencial

Agar Mac Conkey.

Este medio es selectivo contra Gram (+) debido al violeta cristal ,debido a
las sales biliares (agentes tensoactivos que desorganizan muchas
membranas externas).
En cambio las enterobacterias, estn evolutivamente adaptadas a
soportar las sales biliares en su habitat natural (el intestino de vertebrados
superiores) y pueden crecer en este medio.
Accin diferencial. Los microorganismos capaces de fermentar lactosa
producen una cada de pH, junto con una absorcin del colorante,
apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de m.o. que no
fermentan lactosa permanecen incoloras.

McConkey
Las bacterias Gram-positivas son inhibidas con excepcin de los
enterococos que crecen colonias pequeas traslcidas y
ligeramente rosadas. El grupo de los Gram-negativos, dan
colonias de acuerdo con el comportamiento de las bacterias
frente al disacrido lactosa, es as que las lactosas positivas dan
colonias rojizas. La bacteria degrada la lactosa y produce cido
virando el indicador del medio rojo neutro) a un color rojizo. El
Escherichia coli da colonias rojizas con un precipitado de cidos
biliares, La Klebsiella desarrolla colonias mucosas presentando
la parte central un color amarillento.
Los Proteus y otras bacterias no fermentadoras de lactosa
forman colonias incoloras.
La Pseudomona aeruginosa tambin forma colonias incoloras,
pero a medida que transcurren las horas tiende a tomar un
color vede azulado debido a la produccin de pigmento.
Otras bacterias no fermentadoras diferentes a enterobacterias
tambin pueden crecer en este medio, las colonias pueden ser
de un tono, ligeramente rosado, es el caso de la mima
polimorfa, alkalgenes etc.

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

La presencia de los colorantes eosina y
azul de metileno inhibe el crecimiento de
la flora Gram positiva; y permiten la
diferenciacin de los Gram negativos e
indican los grmenes que fermentan la
lactosa de aquellos que no lo hacen.
Las bacterias fermentadores de lactosa
dan colonias de un color violeta. Las
colonias de Escherichia coli se distinguen
por ser regulares con un brillo metlico
verde, observado por refringencia. Las
colonias de Enterobacter presentan un
color violeta sin brillo metlico, una
caracterstica la presencia de las colonias
en forma de ojo de buey.
Las colonias de Klebsiella son siempre
mucosas, grandes y ligeramente rosadas.
Los no fermentadores de lactosa dan
colonias incoloras sin producir mayor
modificacin en el medio a simple vista

Es un medio que nos permite evidenciar la

habilidad de los bacilos Gram negativos, para
fermentar glucosa o lactosa, as como su habilidad
de producir hidrgeno sulfurado.
La degradacin de lactosa se lee en la parte
inclinada, lo cual se manifiesta por viraje del
indicador rojo de fenol al color amarillo, la
degradacin del disacrido lactosa es un proceso de
oxidacin.
La fermentacin de glucosa, se lee en la parte
columnar (profundo) del medio y se evidencia
por el color amarillo del rojo de fenol en medio
cido.

La produccin del H2S a partir del tiosulfato y en

algunos casos a partir de la cistina, se manifiesta al
reaccionar el H2S producido, con los iones Fe2+
presentes en el medio y formacin de un precipitado
de color negro.
Cuando la glucosa se degrada hasta la produccin
de cidos, los que finalmente se descomponen en
CO2 o H2, estos se manifiestan por la presencia de
burbujas en la zona columnar del medio

Agar KIA Kliger

Iron Agar

PREPARACION DE MEDIOS
Se pueden preparar:
A partir de sus constituyentes bsicos por rehidratacin de
medios.
PASOS:
1. Rehidratacin: Usar agua destilada.
Se aade el agar al agua a T ambiente, se deja embeber
unos minutos, se agita y se calienta a 98-100 C hasta
disolucin total.
En medios con azcares un excesivo calentamiento lleva a
caramelizacin.
Los medios agarizados con pH<5 son muy delicados porque
la acidez sumada al calor hidroliza las molculas de agar,
hacindose el medio friable y quebradizo.

Preparacin ..
2. Secado de las placas.
Para obtener colonias bien aisladas sembrar sobre placas cuya
superficie no est hmeda.
Poner la placa boca abajo (con el medio colgando), se coloca la
tapa de la placa abajo.
Todo medio preparado debe almacenarse en la oscuridad, para
evitar la formacin de perxidos bacteriostticos o bactericidas.

Preparacin .
3- Esterilizacin (121 C, 15 min.)
En autoclave, controlar (no es lo mismo 15' a 121 C que
14'a 121 C).
El tiempo de esterilizacin (tiempo a 120 C) requerido,
para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y para
tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2 L.
de 30-35 min, para 125 ml es de 12-14 min.
Un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y
una botella de suero de 9000 ml 50-55 min.
Medios con componentes grasos, enfriar en agitacin para
no formar grumos.
Los medios con azcares se esterilizan mejor por debajo de
118 C (116 C, 30), para evitar caramelizacin.

Preparacin
4. Almacenamiento de medios deshidratados
Almacenados bajo condiciones ptimas tienen caducidad
de 3 a 5 aos.
Una vez abierto el bote no usar mas de 6 meses.
Deben permanecer en armario cerrado, sin luz, humedad
o calor (lmparas, estufas).
Conviene lugar fresco, pero no refrigerador, porque
condensara agua.
Una vez preparado y esterilizado se debe almacenar entre
2 y 8 C, a menos que el medio requiera alguna condicin
diferente.

Preparacin de medios
Agar Sabouraud
Medio para la deteccin
y aislamiento de hongos.
Composicin por Litro:
Digesto pancretico de
casena- 5g
Peptona de tejido
digestivo -5 g
Dextrosa -40g
Agar- 15g
cloranfenicol

Agar papa-dextrosa
Para cultivo y
enumeracin de
levaduras y mohos a
partir de alimentos y
otros materiales.
Los hidratos de carbono
y la infusin de papa
favorecen el crecimiento
de levaduras y hongos,
en tanto que por el bajo
rango de pH, la flora
acompaante se reduce.
Composicin por Litro:

Agar -15g
Dextrosa - 20g
Infusin papa - 4g

MEDIOS INDUSTRIALES
Se usan siempre medios complejos.
Es conveniente considerar:
diseo
formulacin y
optimizacin de los mismos.
En una fermentacin uno de los mayores costos es la fuente de carbono, que
representa el 50% de la economa del proceso.
Para obtener un medio de cultivo industrial, se requiere que los componentes
del mismo sean econmicos y los rendimientos de productos se incrementen.
Se pueden emplear algunos subproductos de procesos industriales como
fuentes de nutrientes para el crecimiento microbiano, buscando disminuir
costos de produccion.
As para la produccin de renina a partir de Mucor miehei, se utiliza
subproductos como; el suero de leche, debido a su alto contenido de lactosa y
diversas protenas que lo hacen una buena fuente de carbono y nitrgeno;

la melaza, constituye una fuente rica de carbono; la cscara de papa y la harina

de maz, son posibles fuentes de nitrgeno.

a. Diseo del medio

Consiste en la eleccin de los componentes necesarios para
lograr el crecimiento y la formacin de productos deseados.

Se debe tener en cuenta; los requerimientos nutricionales

del microorganismo y algunos especficos del proceso, la
disponibilidad real de los componentes y consideraciones
sobre las materias primas.

Tener en cuenta:
Requerimientos nutricionales del mo.
Aspectos especficos del proceso
Disponibilidad de las materias primas.

Requerimientos nutricionales
Estn determinados por
Macronutrientes:
Heterotrofos, autotrofos.
Aerobio o anaerobio. En la ausencia del O2 , el NO3 o SO4
son utilizados como aceptores de electrones por algunas
bacterias.
Tipos de fuentes de N: inorgnico u orgnico.
P y el S: Suministrados en P04 y S04 (aminocidos
azufrados).
K y Mg. El primero suele unirse al RNA, de manera que
sus requerimientos aumentan la velocidad de crecimiento.
micronutrientes son 2 categoras:
a) Los frecuentemente esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu y
Zn.
b) los raramente esenciales: B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As,
Se, Mo, Sn.
Factores de crecimiento; ciertos aminocidos y vitaminas
del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico,
niacina, etc.

Otros agregados
Requeridos por los m.o. de manera especfica segn el
proceso considerado.
Ejplo:
Los precursores, constituyen la base de una molcula
a sintetizar. Ejplo. cido fenil actico para la penicilina.
El sulfato, en fermentacin alcohlica, favorece la
formacin de glicerol.
La produccin de cido ctrico debe considerar la
influencia negativa que para el proceso tiene un
exceso de hierro en su composicin.

Costo
El costo de los nutrientes representa del 10 al 60% del
total.
Las fuentes de carbono pueden ser:

1) Hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa,

almidn, dextrina)
2) Alcoholes: glicerol y manitol
3) Hidrocarburos: hexadecano, octadecano y otros.
Otras materias primas que contienen hidratos de
carbono como granos, melazas, celulosas, suero de
queso, etc

b. Formulacin
Debe establecer las concentraciones de cada
componente.
Una primera aproximacin de las cantidades a utilizar
lo da la composicin del m.o. a ser empleado.
Una composicin elemental y tpica de la biomasa es
(% peso seco):
Carbono, 46-48;
Nitrgeno, 7-12;
Fsforo, 1-3;
Azufre, 0.5-1.0;
Mg, 0.5-1%.

c. Optimizacin
Situacin en que es necesaria.
1) No existencia de informacin respecto a coeficientes
de rendimiento de macro y micro elementos.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas,
(microelementos y factores de crecimiento).
3) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formacin del producto.
4) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
Realizar experimentos, variando la concentracin del
componente a ensayar.

d. Esterilizacin
Se hace para evitar el desarrollo de microorganismos competidores, y
permitir as que el cultivo del microorganismo deseado. (OEA, 2006)
Adems de esterilizar los medios, se debe conservar al mximo su calidad
nutriente.
En medios definidos puede haber prdida importante de Mg, K, amonio, Na y
fosfatos por precipitacin de sales poco solubles como MgNH4PO4, MgKP04 y
MgNaPO4.
Autoclavar, sales de Ca y Mg aparte de PO4.
Los aminocidos(triptofano, glutamina, asparragina) y factores de crecimiento
(tiamina, riboflavina y piridoxina) son muy lbiles al calor.
Es aconsejable disolverlas separadamente en pequeos volmenes de H2O y
luego esterilizarlas por filtracin.

Caso aplicativo: Cultivo de Levadura panera

Antes se usaba la levadura de cerveza.
Primera planta de produccin. Holanda, 1780 (proceso
Dutch) era anaerobio con rendimiento del 4 al 6% con
respecto a la materia prima usada.
Mejor el rendimiento, al 12-22% (proceso Vienna) con
proceso anaerobio 1846.
Con aireacin (1879), se aumenta rendimiento, a 50-60%
del terico.
Con melazas de remolacha o de caa pueden alcanzarse
rendimientos cercanos al 100% del terico.

Caso aplicativo: Requerimientos nutricionales

Fuentes de carbono y energa: Glucosa y sacarosa.
El N: NH4, urea, sales de amonio, mezclas de aminocidos.
(Nitrato o nitrito no pueden ser asimilados).
Macroelementos indispensables: P(cido fosfrico), Mg como
MgSO4.
S. cerevisiae requiere 200 ug de Zn, 75 ug de Fe y 12-15 ug de Cu
por litro de medio para crecimiento ptimo.
Requerimientos de la biotina: 100 ug de biotina por 100 g de
azcar.
El cido pantotnico, que es un componente de la coenzima A,
es tambin requerido por muchas especies.
La tiamina aumenta la actividad fermentativa de la levadura.
El Mg, S, y Zn se agregan como sulfatos
El MgS04 se suele incorporar a razn de 1 g de la sal
heptahidratada y el Zn como 10 mg del sulfato tetrahidratado por
Kg de melaza.

Composicin de la melaza de caa y remolacha

Caso aplicativo: Medio de produccin

La materia prima elemental es la melaza de remolacha o de caa
o ambas en conjunto. (Sacarosa es el azcar predominante en
ambas)
La materia orgnica no azcares en la melaza de caa son:
gomas solubles y cidos orgnicos sobre todo acontico y
compuestos nitrogenados.
En melaza de remolacha los orgnicos no azcares son: betana,
cido glutmico y algunos cidos orgnicos como lctico, mlico,
actico y oxlico.
En las cenizas predomina en ambas melazas el K
Mayor % de fsforo y biotina en melaza de caa que en
remolacha.
El contenido de pantotenato de Ca, y compuestos nitrogenados
asimilables en la remolacha.
Los fabricantes prefieren, si tienen disponibilidad, utilizar
mezclas de ambas.
Las melazas se utilizan generalmente diludas al 50%.
Componentes extraos (que pueden afectar el rendimiento):
algunos pesticidas, como lindane, aldrin, heptaclor, dieldrin, etc.
Si se utiliza melaza de remolacha es indispensable agregar
biotina

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS

La mayora de bacterias anaerobias requieren
para su crecimiento vitamina K y hemina.
Para su aislamiento e identificacin presuntiva
se aconseja utilizar una combinacin de medios
enriquecidos, como: Un medio de agar sangre
para anaerobios como agar Brucella o agar
Schaedler con un 5% de sangre de carnero, a los
que se aaden vitamina K1 (1 g/ml) y hemina
(5 g/ml).
Sistemas de incubacin en anaerobiosis.
Su eleccin es determinada por el costo, y
limitaciones de espacio.
Los ms comunes son las cmaras, cajas y
bolsas de anaerobiosis.
Eliminacin del oxigeno: se puede conseguir
por: reacciones de formacin de H2, o por
remocin mecnica del oxigeno.

Sistema de alimentacin de N2

Sistemas de incubacin en anaerobiosis.

El oxigeno se elimina
promoviendo su reaccin
con el Hidrgeno, para lo
cual hay catalizador,
Paladio. Luego el hidrgeno
se combina con el oxigeno
para dar agua
Se coloca un sobre
conteniendo sustancias
qumicas que en presencia
de agua liberan H2 y CO2
(contiene borohidrato
sdico, bicarbonato sdico
y cido ctrico).
Se monitorea el ambiente
anaerobio con papel
indicador de azul de
metileno o de resarzurina.
El azul de metileno pierde
color en presencia de
oxigeno.

Sistemas de laboratorio

Los microaerfilos necesitan

cierta concentracin de CO2 y
O2 en la atmsfera.
Esto se consigue en las
"jarras de anaerobios"
utilizando sobres
generadores especiales para
atmsferas microaerfilas.
Existen medios
microaerobios como,
MICROAEROBAC, que
cuando se activa produce
dentro de la jarra de 2,5 l una
atmsfera de 5 a 15% de O2
(microaerofilia) y de 5 a 10%
de CO2.
Tambin se puede crear esa
atmosfera con el encendido
de una vela.

CONSERVACION DE CULTIVOS MICROBIANOS

Mtodos Alternativos
1.- Se debe transferir peridicamente,
ya que los nutrientes se consumen, y
el agar se seca. (repicado) El proceso
es repetido a intervalos que
garanticen la obtencin de un cultivo
fresco antes de la prdida del viejo.
- Se debe cubrir con parafina, esto
demora la transferencia, disminuye
el metabolismo y tardan en
envejecer.

Mtodo de conservacin a largo

plazo
3.- Se disminuye la temperatura,
congelando las clulas. Para proteger
las clulas de la formacin de cristales
que las daen se usa el glicerol
4.- La liofilizacin es la sublimacin a
alto vaco de las muestras congeladas
con rapidez.

Conservacin de microorganismos por congelacin

La crioconservacin consiste en la conservacin de los microorganismos a
temperaturas inferiores a cero grados centgrados. Se basa en la paralizacin del
metabolismo celular por la disminucin del agua disponible.
Hielo
Hielo
Hielo
H2O
H2O

BACTERIA
H2O

Hielo

Hielo

Hielo
H2O

Hielo

Hielo

Se usan crioprotectores: Minimizar daos durante la congelacin.

Limitar la formacin de hielo (tasa de congelacin).
Criprotectores mas comunes: Glicerol, Dimetilfulfxido (DMSO), cido glutmico,
Glucosa, Sacarosa , Meso inositol , Lactosa, Leche Descremada

Conservacin por liofilizacin

Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo plazo.
Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por falta de agua:
congelacin y sublimacin
VENTAJAS

-Reduccin de la variabilidad del

microorganismo.
-Largo tiempo de conservacin.
-Aplicabilidad para la produccin y
distribucin de los lotes

DESVENTAJAS

-El alto coste inicial del equipo.

-La preparacin de forma
incorrecta de los distintos lotes
puede desembocar en un
estancamiento de la viabilidad
y/o en prdidas en la estabilidad
de los caracteres de los
microorganismos

MEDIOS DE CULTIVO DE CLULAS ANIMALES

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de
tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas 'in
vitro', manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas,
bioqumicas y genticas .
Se distinguen varios tipos de cultivos celulares.
El suero fetal de ternera es la mayora de las veces aplicable.
El suero contiene diversos factores esenciales para el
metabolismo y proliferacin celular, incluyendo factores de
iniciacin, protenas ligadoras, factores de unin y compuestos
de peso molecular bajo.
Es conocido como BME (medio basal de Eagle), ampliamente
utilizado en el cultivo de clulas de mamferos.

MEDIOS DE CULTIVO PARA CLULAS VEGETALES

Las plantas jvenes o en desarrollo con tejidos meristemticos y crecimiento
vegetativo vigoroso son la mejor fuente de explantes. Aunque en una misma
planta se puede encontrar tanto crecimiento juvenil como adulto, el primero se
caracteriza por ser activo y por la ausencia de estructuras reproductoras, mientras
que el adulto es ms lento y presenta estructuras sexuales para la reproduccin
de la planta. Adems, las plantas adultas pueden haber acumulado mayor
cantidad de microorganismos en sus tejidos y contener menos clulas
meristemticas, necesarias para establecer los cultivos in vitro (Calva y Ros 1999,
Seabrook 1980, Street 1977).
La desinfestacin del tejido a usar como fuente de explantes se realiza con
agentes desinfestantes como hipoclorito de sodio o calcio y cloruro mercuroso. La
penetracin del agente desinfestante en superficies rugosas o vellosas del tejido
vegetal se puede incrementar con la adicin de agentes tensoactivos como el
Tween 20 (Webster 1966).
Las fuentes de carbono ms utilizadas son: sacarosa, glucosa, fructosa, maltosa y
lactosa.
La fuente ms importante de nitrgeno, son los nitratos, a veces se suplementa
con sales amnicas.
Algunas especies de clulas necesitan nitrgeno orgnico en forma de
aminocidos.
En la mayora de los cultivos de clulas vegetales son necesarias hormonas
vegetales: auxinas, y citoquininas.

MEDIOS DE CULTIVO PARA CLULAS VEGETALES

Si los cultivos in vitro se incuban o someten a condiciones de
estrs fisiolgico, pueden expresar caractersticas de
adaptacin y resistencia que en condiciones naturales nunca
manifestaron, creciendo selectivamente slo aquellas clulas
capaces de adaptarse a sus nuevas condiciones.
Esta variacin gentica tambin se puede inducir por tcnicas
de mutacin, ingeniera gentica, fusin de protoplastos y
transformacin gentica por inclusin de DNA forneo de
manera similar a las aplicadas comnmente en
microorganismos (Yeoman et al 1980, Rhodes et al 1987,
Crozier et al 2000).
En este ltimo caso se obtienen cultivos o plantas
transgnicas en donde el DNA forneo debe integrarse al
genoma vegetal para garantizar una expresin estable en su
progenie

Figura . Agalla de la
corona o tumor
inducido por infeccin
con Agrobacterium
tumefasciens en un
planta de tabaco (A);
callos embriognicos
(B), brotes (C), e
induccin de races (D),
de Vanilla planifolia;
cultivos de races
transfomadas de
Trigonella
foenumgraecum (E); y
clulas en suspensin de
Capsicum crecidas en
biorreactores (F)
(Calva y Ros 1999,
Peraza et al 2001,
Martnez et al 2004).