Universit Libre de Bruxelles

Ecole Interfacultaire de Bioingnieurs

Anne acadmique 2010-2011

CHIM-F317 : Complments de chimie analytique

Mthode de dosage des protines dans le lait et autres
produits alimentaires

Baudoux Lewis
Marotte Milan
Polak Nicolas
Tarelkin Yegor
Van Leeckwyck Robin
1

Introduction
Aprs la premire manipulation, qui consistait en un dosage complexomtrique du fer(III), la
deuxime manipulation tait un peu plus inhabituelle. Une liste de manipulations possibles nous
tait prsente, et chaque groupe dtudiants devait choisir parmi cette liste celle quil dsirait
effectuer. Nous avons donc opt pour un dosage de protines dans plusieurs produits laitiers.
Comme aucun mode opratoire nous tait fourni, la premire partie de cette deuxime manipulation
fut la recherche du mode opratoire. Aprs quelques consultations sur le net, notre choix se porta
sur la mthode de Kjeldahl. Les assistants approuvrent la mthode, et le dispositif requis pour la
manipulation fut mis en place.
Le dosage des protines par cette mthode se fait en une srie dtapes. Tout dabord, une certaine
masse de la substance dont on veut connatre le contenu en protines est pese et chauffe en
prsence dacide sulfurique et du sulfate de potassium. Ensuite, lajout progressif dune base forte
fait virer le pH, et lammonium sous phase gazeuse qui schappe de la solution est refroidi et
rcupr sous phase liquide dans une solution dacide borique qui sera titr. A laide de tableaux de
conversion, il est possible de connatre la quantit initiale en protines.
Cependant, cette mthode connat quelques inconvnients. La manipulation requiert une certaine
habitude avant dobtenir des rendements de rcupration dammonium levs. De plus, le montage
du dispositif dans lequel a lieu la distillation est consquent et donc peu maniable. Enfin, cette
mthode ncessite des acides forts et des bases fortes, ainsi que des tempratures leves, ce qui
nest pas sans risque.

Matriel et mthode
Plusieurs mthodes existent pour doser les protines au sein d'un chantillon mais la mthode
utilise au laboratoire sera celle de Kjeldahl (1). Il faut savoir que les protines sont composes
d'acides amins et que ces acides amins sont eux-mmes composs d'atomes. Ces atomes sont
surtout du carbone, de l'oxygne, de l'hydrogne et de l'azote (il y en a d'autres mais en plus petites
proportions). On peut dfinir la proportion de chaque atome au sein de chaque acide amin et la
proportion de chaque acide amin au sein d'une certaine protine. De cette manire, en connaissant
le type de protine prsente dans le lait (ou autre produit organique), la proportion de tel ou tel
atome sera connue dans l'ensemble des protines. Par souci de facilit, l'atome qui sera dos dans
cette mthode est l'azote. Elle va tre prcisment dcrite par la suite ce qui permettra d'noncer
plus clairement le matriel adquat. Cette mthode peut se diviser en trois parties : une premire de
minralisation, une seconde de distillation et enfin une troisime de dosage, par titrage, de la
solution.
1 Minralisation de l'azote organique
Cette partie permet de transformer l'azote organique en azote minral. A l'aide d'une pipette, une
certaine quantit de lait (ou autre produit organique) sera prleve et ajoute dans un ballon de
distillation (voir figure 1). On y ajoute ensuite 25ml d'acide sulfurique haute concentration (H2SO4
2

,18M). La raction sera de transformer l'azote sous forme amine (NH2) en azote sous forme
d'ammonium (NH4+) car le milieu est fortement acide. Le milieu acide permet l'azote de rester sous
forme d'ammonium (donc soluble) et non sous forme ammoniaque (NH3), qui s'chapperait sous
forme de gaz hors du ballon. A cette solution sera ajout du sulfate de potassium (K2SO4). Ce ractif
permet une lvation de temprature consquente durant la phase de chauffage. La proportion de
sulfate de potassium ajouter est d'un gramme par ml d'acide sulfurique. Cette solution est ensuite
chauffe (entre une heure et demi et deux heures) par un bec bunzen pour permettre tout l'azote
de se minraliser. Il faudra veiller ce que la solution reste bien liquide pendant le chauffage car
certains chantillons (comme le pt) sont fort secs, l'azote minralis colle au paroi et le rendement
est alors moins bon. La solution, noire, deviendra plus translucide (tout en gardant cette coloration
noire-brune).

Figure 1 : Ballon de distillation (2)

2 Distillation
Une fois tout l'azote minralis, le ballon de distillation est ajout au montage de distillation. Le
principe est alors bien simple. Une photo aurait du tre ajoute au rapport mais un incident nous
obligea ranger le matriel plus tt que prvu sans avoir pu faire de photos. La figure 2 illustre le
montage permettant la distillation. Il faut dans un premier temps veiller ce que le montage soit
tanche pour optimiser le rendement (le gaz produit ne doit pas s'chapper). Du ct gauche, un
ballon rempli d'eau sera maintenu en bullition pendant toute l'opration. L'eau vapore poussera
alors le gaz form dans le ballon du milieu vers le ct droit et non vers le haut de la colonne
centrale. Encore une fois, cela permet de rcolter tout l'azote libr sous forme d'ammoniaque.

Figure 2 : Montage de distillation (3)

Au centre se trouve le ballon dans lequel se trouve l'azote minralis. Tout en haut de cette colonne
centrale, nous pouvons observer un rservoir contenant de l'hydroxyde de sodium (NaOH) fort
concentr (dilu 50%, donc 500g par litre d'eau). Une fois l'eau entr en bullition, ce petit
rservoir peut tre ouvert au goutte goutte. Le NaOH tombe alors dans la solution d'acide
sulfurique. Le pH de cette solution va peu peu augmenter. Cette augmentation de pH permet la
transformation du NH4+ en NH3 gazeux qui va se diriger vers la droite du montage. On ajoute la NaOH
goutte goutte car la raction acide fort - base forte est fort ractive. Il faut le rajouter en excs pour
tre sr de transformer tout l'ammonium en ammoniaque. Une prcaution devra tre prise. En effet,
il faut veiller laisser un fond de NaOH dans le rservoir car si celui-ci se vide, le montage n'est plus
tanche et le NH3 peut s'chapper par ce petit trou.
A droite du montage se trouve un erlenmeyer contenant une solution d'acide borique 4% (donc
40g par litre d'eau). Cet acide est donc prsent en excs. Le conduit menant le gaz dans l'erlenmeyer
est double paroi, de l'eau passant entre la premire et la deuxime paroi pour refroidir le gaz dans
ce conduit et donc permettre sa condensation. L'erlenmeyer ne contient que 50ml de cette solution
ainsi que quelque gouttes d'indicateur color (judicieusement choisi en fonction de sa zone de
virage). Le tube conduisant le NH3 plonge dans cet erlenmeyer et une raction se passe :
NH3 + H3BO3 --> NH4+ + H2BO3Le bout doit bien plonger dans la solution sous peine de perdre du NH3 dans l'air ambiant. Cette
quation permet de lier le nombre de moles d'ammoniaque au nombre de moles d'acide borique.
Petit petit, l'indicateur color va virer vers une autre couleur. Le pouvoir tampon de l'acide borique
n'est pas trs fort.
3 Titrage
Une fois la distillation termine, un titrage est fait au chlorure d'hydrogne (HCl, 0,1M). On ajoute
alors un certain volume de cette solution. Ce volume correspond au volume d'acide ncessaire pour
que la solution reprenne sa couleur initiale.

Par calcul stoechiomtrique, on peut dire que le nombre de moles ajout pour que la solution
reprenne sa coloration initiale est gal au nombre de moles de NH3 pig dans cette solution. Ce
nombre de moles de NH3 tant lui-mme gal au nombre de moles de NH2 prsent dans la solution
initiale.
Le matriel requis est donc le suivant :

pipette
erlenmeyer
matras
montage de distillation
bec bunzen
burette
balance

Rsultats
Une premire manipulation a t faite avec de l'ure (CO(NH2)2) afin de nous habituer cette
mthode (qui peut s'avrer dangereuse). La quantit d'ure prleve est de 15ml provenant d'une
solution o 4g d'ure a t dilue dans un litre d'eau. La masse molaire de l'ure est de
60,0553g/mol. En utilisant les formules : n(mole)=m(kg)/M(g/mol), on obtient un nombre de moles
d'ure de 0,00199 moles. Le volume d'HCl (0,1M) ncessaire pour le titrage est de 22,9ml ce qui, par
la formule C(mol/L)=n(mole)/V(L), donne un nombre de mole de NH3 quivalent 0,00229mole. On
sait que deux moles de NH3 proviennent d'une mole d'ure. On obtient donc, d'aprs notre mthode,
que le nombre initial de moles d'ure est de (0,00229/2)=0,001145moles.
En comparant les deux rsultats, nous obtenons un rendement de 57,54% (0,001145/0,00199), ce
qui n'est vraiment pas mauvais pour une premire exprimentation. Il est noter que l'ure est bien
plus facile dcomposer en NH4+ que d'extraire l'azote contenu dans les protines de produits
alimentaires.
Des analyses ont ensuite t faites sur du lait normal et du lait de soja. Leur contenu en protines est
respectivement de 33g par litre et de 30g par litre.
Produit
Lait
Lait
Lait de soja
Lait de soja

Quantit
prleve (ml)
10
10
10
10

Volume titrant
(ml)
6,4
12,9
12,6
13,8

Facteur
de Quantit de
conversion
protine (g/L)
6,38
5,7
6,38
11,5
6,25
11,0
6,25
12,1

Rendement
(%)
17,7
34,8
36,66
40,3

Pour obtenir le nombre de moles de NH3 titr, nous utilisons la mme formule que prcdemment,
en multipliant le volume par la concentration d'HCl (0,1M). Pour obtenir la quantit d'azote contenu
initialement, on multiplie le nombre de moles par la masse molaire (qui est de 14g/mol). Ceci nous
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donne la quantit d'azote dans l'chantillon initiale. On multiplie cette valeur par 100 pour obtenir la
quantit d'azote dans un litre de lait et non 10ml.
Des moyennes ont t faites et il s'avre que la quantit d'azote au sein d'une protine avoisine les
16% (d'o le facteur 6,25, inverse de 16%). (4)

Conclusion
Aprs plusieurs expriences, force est de constater que les rendements de nos expriences sont trs
mdiocres. En effet, il suffit de comparer le rendement d'extraction de l'ure celui d'extraction des
produits alimentaires pour s'apercevoir que les rendements sont plus faibles. Il est donc important
de prciser quil nest pas ais dextraire lazote contenu dans les protines de produits alimentaires.
La partie de la mthode qui n'est pas entirement sous notre contrle est celle de minralisation. Il
n'est pas facile de voir si tout l'azote a t minralis. Malgr ces faibles rendements, il est noter
qu'au fur et mesure de l'avance des expriences, nos rendements sont croissants. Certes, le
dernier rendement obtenu (de 40%) n'est pas un grand rendement, mais cela signifie que la
manipulation est de mieux en mieux matrise par les tudiants. Il est donc certain que si un
malheureux accident n'avait pas interrompu notre manipulation, un rendement suprieur 50%
n'aurait pas t impossible.
Il semble aussi important de signaler que cette mthode n'est pas la seule pour quantifier les
protines au sein d'un chantillon. Car sans l'tiquette nous disant la relle quantit de protine, il
nous aurait t impossible de connatre le rendement de nos manipulations. En laboratoire, les
scientifiques doivent veiller ce que chacune des trois tapes soit la plus optimale possible. Une
minralisation complte doit tre faite. Le montage de distillation doit tre parfaitement tanche et
tout le NH4+ contenu dans le ballon doit tre transform en NH3 gazeux. Le titrage doit tre des plus
prcis possible. Une dernire chose est importante. Le facteur qui permet de convertir la quantit
d'azote la quantit de protine n'est qu'une approximation. L'idal aurait t de qualifier chaque
protine au sein de l'chantillon, de les quantifier et ainsi obtenir une quantit de protinique la plus
proche de la ralit.
Nanmoins, cette exprience nous a permis de travailler presquentirement par nous-mmes. Une
seule question tait pose, nous d'y rpondre en trouvant un protocole d'exprience et de
l'appliquer. La mthode de Kjeldahl nous est maintenant familire et le travail de chercheur a dj
moins de secrets pour nous.

Discussion
Les sources derreurs potentielles taient nombreuses et diverses. Le montage de distillation tait
trs difficile manipuler et pouvait causer beaucoup de fuites ce qui faussait tout fait notre
mesure. Il nous est aussi arriv de vider le contenu de NaOH dans le ballon crant ainsi un trou par
lequel le NH3 pouvait s'chapper. Un peu en aval de lexprience, on a vu galement que tout NH4+
ntait pas transform facilement en NH3 et quil fallait chauffer le mlange ractionnel tout en
prenant le risque que le rcipient explose.
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L'accident, mme si peu intressant au niveau de ce rapport, nous a appris qu'il fallait tre trs
prudent vis--vis des manipulations faites en laboratoire. Le dbit d'eau a t augment au sein du
tuyau de refroidissement, il s'est donc dtach du montage et a asperg le ballon contenant l'acide
sulfurique. Pour viter de salir notre table de travail, l'un de nous a essay de rcuprer ce tuyau.
Malheureusement, le contact entre l'eau froide et le ballon chaud a cr un choc thermique. Le
ballon s'est bris et une partie de son contenu sest rpandu sur la main de l'tudiant, causant de
graves brlures. Cet accident aurait pu tre vit mais il semble que le ballon de distillation ait t
fragilis lors d'une manipulation prcdente. Nous ne savions pas que mme si le ballon ne
prsentait aucune marque d'usure, il fallait le jeter.

Bibliographie
(1) http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9thode_de_Kjeldahl
(2) http://www.verrerie-laboratoire.com/Ballons_Kjeldahl.asp
(2) http://witraze-katani.com/kjeldahl-distillation-assembly&page=6
(4) Mariotti F, Tom D, Mirand PP. Converting nitrogen into protein--beyond 6.25 and Jones factors.
Crit Rev Food Sci Nutr. 2008, 48, 177-84.