Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Escuela de Química Biológica
Departamento de Bioquímica
Lab. No. 01
Lab. Día: Martes 10:00 – 12:00
Instructora: Mercy Pérez
Nombre: Nora Rivera Fuentes
Carne: 200310126

Introducción

La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identificar y

purificar moléculas o fragmentos de DNA y RNA. En los tampones habitualmente
utilizados, los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo.
Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la
relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas,
independientemente de su tamaño (un nucleótido tendrá la misma movilidad que un
fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb).

La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos

soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes
fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño), migran en función de su tamaño
y/o conformación (tabla II).
• Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos
pequeños de DNA (5-500pb), así como para la mayoría de los RNA.
• Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de
DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de
reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico
constante; para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb se utiliza la
electroforesis de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia
periódicamente.

Electroforesis en geles de agarosa.

Se trata del método más común para el análisis, purificación y obtención de DNA. Las
agarosas disponibles comercialmente presentan una amplia gama de grados de pureza y
especificaciones. La presencia de polisacáridos sulfatados, contaminantes en algunas
agarosas, puede ser perjudicial, ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a
tratarse el DNA purificado en la electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de
restricción, etc.).

Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. La agarosa estándar gelifica a

35°C y funde a 80-90°C, aunque las hay modificadas por adición de grupos hidroxietilo,
que gelifican a menos de 30°C y funden a 65°C. Estos datos son importantes, ya que
finalizada la electroforesis, el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusión y
así separar el DNA en disolución.

También es importante tener en cuenta la fragilidad del gel. Su resistencia mecánica se

expresa en gr/cm2, que representa el peso que puede soportar 1 cm2 de un gel de
agarosa al 1%. La agarosa estándar tiene una resistencia de 1000-2000gr/cm2, las de
bajo punto de fusión alrededor de 200gr/cm2 y las de alta resistencia llegan hasta
6000gr/cm2.
Hay agarosas de gran reticulado para fragmentos de pequeño tamaño molecular;
utilizadas a concentraciones de 2.0-4.5% (y mantenidas a 4°C) separan eficazmente
fragmentos de DNA de 700-3000pb. Además, algunas son transparentes lo que facilita
enormemente el proceso de detección.

Proceso de electroforesis

Como adelantamos en el punto anterior, la electroforesis es un método de separación de

mezclas de moléculas biológicas. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con
carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga opuesta.

1)Preparación de los geles y formación de las cavidades para las siembras.

2)Sembrado del marcador de tamaño
3)Sembrado de las muestras a separar
4)Conexión de la fuente y aplicación del campo eléctrico
5)Avance de la corrida
6)Fin de la corrida y comparación de tamaño con el marcador

Factores que afectan a la movilidad electroforética del ADN.

El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución requerida y del
tamaño de los fragmentos a separar. Entre 1-10V/cm (los cm se refieren a la distancia
entre los electrodos), la movilidad electroforética de los fragmentos lineales de dsDNA
es proporcional al voltaje aplicado; sin embargo, si se incrementa el voltaje, los
fragmentos grandes cambian su movilidad electroforética, sin que ésta guarde relación
con su tamaño.
En general, la separación de fragmentos grandes de DNA es mejor a bajos voltajes
(aunque esto incrementa el tiempo de electroforesis). Sin embargo, elevados voltajes
producen bandas estrechas y bastante bien resueltas cuando se trata de fragmentos
pequeños.
Un dsDNA lineal se mueve en un gel de agarosa a una velocidad que es dependiente del
tamaño del poro del gel. A mayor concentración de agarosa, menor diámetro de poro y
menor movilidad. La movilidad electroforética de los fragmentos de DNA es
inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño, expresado en pares de bases.

Cuanto mayor es el fragmento de DNA, más se retarda a lo largo del recorrido por el
gel. Así, los fragmentos se van ordenando hacia el ánodo en relación a su tamaño. Por
encima de 50kb, son tan largos que avanzan prácticamente con la misma velocidad y no
se separan.
Los extremos del fragmento de DNA tienen más facilidad para moverse y cambiar de
dirección que la parte central, de modo que la estructura lineal puede combarse,
adoptando forma de horquilla, por lo que puede “engancharse” en las fibras del gel,
dificultando su migración. Este fenómeno es muy acusado en fragmentos de tamaño
intermedio, y es la causa del fenómeno conocido como inversión de banda, por la cual
estructuras de tamaño intermedio migran más lentamente que otras mayores. Este
fenómeno es más acusado a elevadas concentraciones de agarosa y bajos voltajes.
Si se incrementa el voltaje para intentar acelerar la separación, las estructuras pueden
perder flexibilidad, deformarse y estirarse en la dirección del campo eléctrico adoptando
forma de varilla rígida, por lo que no se apreciarían diferencias de tamaño y no habría
separación.

Cuando se trata de estructuras circulares, la movilidad electroforética aumenta con el

grado de enrollamiento, es decir, cuanto más “retorcido” este el DNA circular, más
compacto es, atraviesa mejor el gel y tiene mayor movilidad, por lo que avanza más.
Las estructuras circulares superenrrolladas de DNA se mueven con una velocidad que
depende del grado de superenrrollamiento (Lk). Aquellas moléculas con grado de
superenrrollamiento nulo se mueven más lentamente que las de valores mayores de
grado de superenrrollamiento (positivo o negativo, es decir, en un sentido o en otro), y
estructuras superenrrolladas con distinto grado de superenrrollamiento e idéntico
tamaño, pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa. En la siguiente
figura se muestra la movilidad electroforética de distintas formas de DNA circular en
relación a al de un fragmento lineal del mismo tamaño.
Visualización

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al

ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para
hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el [[bromuro de etidio]], para los ácidos
nucleicos, o la plata, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para
visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz
[[radiación ultravioleta|UV]], se puede simplemente hacer una fotografía de la placa
bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos [[radiactividad|radiactivos]]
se puede efectuar una autorradiografía.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán

separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a
cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un
solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.

Las bandas en diferentes separaciones paralelas que están a la misma distancia del
principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma
velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de
tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla
desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las
obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se
encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al
[[logaritmo]] del tamaño de la molécula.

Nomenclatura

Para entender de forma más sencilla el análisis realizado y la solución planteada, se

utilizó la siguiente nomenclatura:
Recorte

Para comenzar con el análisis y desarrollo en MatLab, se llevó a cabo el recorte de la

imagen en varios fragmentos, cada uno delimitando una zona característica de la misma.

En primer lugar, se recortó la imagen en la zona de las hendiduras. Para ello, se estimó
la zona de corte teniendo en cuenta el tamaño de la imagen y el patrón repetitivo de
ubicación de las hendiduras en el gel (generalmente se encuentran dentro de una celda
de ancho igual a un séptimo del ancho total).

En segundo lugar, era necesario distinguir las muestras del patrón por lo cual se recortó
la imagen de forma tal que la imagen resultante abarcara todas las marcas del patrón. En
este caso particular, se tuvo en cuenta el perfil de la imagen para obtener el lugar de la
primera muestra del patrón y consecuentemente poder recortar.

Por último, se recortaron las zonas de todas las muestras, obteniendo imagenes de igual
tamaño que la imagen resultante del recorte del patrón.

Detección de hendiduras

Para la detección de hendiduras en el gel, se realizaró el siguiente procedimiento:

• Recorte de la imagen (discutida en el punto anterior) en la zona de

las hendiduras
• Binarización de la imagen resultante (recortada)
• Filtro Sobel (detección de bordes)
• Apertura de la imagen filtrada (eliminación de gran parte del
ruido)
• Etiquetado de las zonas obtenidas
• Cálculo del área máxima (de los objetos encontrados,
consecuencia del paso anterior)
• Eliminación de áreas pequeñas (referentes al área máxima
calculada)
• Cálculo de los centros de las hendiduras halladas
• Estimación de los centros de las hendiduras no halladas (NOTA:
Para este punto fue necesario conocer de antemano el número de
hendiduras existentes en el gel. Este requerimiento fue resultado de un
árduo análisis, y luego de haber considerado el cálculo de los perfiles
como una estimación de la cantidad de hendiduras)
a)Mejor caso encontrado luego de la detección de hendiduras propuesta:

b) Peor caso encontrado luego de la detección de hendiduras propuesta:

Detección de marcas en las muestras

Para la detección de las marcas en cada muestra del gel, partimos de la imagen recortada
(ver Recorte) por muestra. Para cada imagen se calculó el perfil vertical, y
consiguientemente la detección de picos (teniendo en cuenta un cierto umbral).

En este punto, se presentó el inconveniente de la tonalidad de las marcas en los

diferentes geles, provocando que la detección de picos pordujera marcas falsas. Para
solucionar el problema, se decidió incluir otro requisito de entrada al programa: la
tonalidad de las marcas, distinguiendo únicamente entre Claro y Oscuro.

Los resultados fueron óptimos, logrando un porcentaje de aciertos del 73%.

El siguiente caso corresponde a uno de los peores:

Asignación de valores

Como ya conocemos, luego de aplicar la técnica de electroforesis, las marcas obtenidas

se han desplazado logarítmicamente. Para poder determinar el valor respectivo de cada
marca, debemos relacionarlo con algo conocido a priori: el patrón.

Recordemos que a este nivel de procesamiento, ya le hemos solicitado al usuario el

valor, en pares de bases, de cuatro marcas del patrón (que sabemos que es de
conocimiento para el técnico).

Cuatro valores solicitados son producto del mejor ajuste de los valores reales (otorgados
por técnicos especializados), dada una cantidad mínima de parámetros requeridos.

La asignación de valores, de la forma planteada, es calculada a partir de los valores de

entrada (dados por el usuario) y el valor de los pixeles seleccionados respectivos.

Visualización de resultados: Excel

Una forma sencilla de visualizar los resultados es a través de una planilla en Excel,
programa con el que el tipo de usuario de nuestro sistema está ampliamente
familiarizado.

El programa desarrollado guarda en una planilla, determinada por el usuario (en el caso
de que lo desee), el nombre de la imagen procesada, los parámetros ingresados por el
usuario (cantidad de hendiduras, ubicación del patrón y tonalidad de las marcas), la
fecha y la hora del procesamiento, y los datos obtenidos a partir del análisis realizado
(programa principal). Al mismo tiempo, existen celdas destinadas al valor real de la
marca detectada, en el caso de que el usuario desee archivar el valor por él leído.

A su vez, se abrirá una hoja nueva cada vez que se ejecute el programa, cuyo nombre
será el de la imagen procesada.

donde las imagenes obtenidas en cada detección (para cada muestra) fueron las
siguientes:
Se observa en la primera muestra la detección de una marca falsa. La ventaja de la
visualización en una planilla Excel es la de permitir al usuario la corrección o el
agregado de parámetros que le facilite a la hora de analizar resultados.

Aplicación en Matlab

Luego de realizado el análisis y de construido el programa, nos concentramos en

desarrollar una interfaz gráfica que le permita al usuario ingresar de forma sencilla los
parámetros que son requeridos para el buen funcionamiento del programa.

Resultados y Conclusiones

• El programa desarrollado en MatLab permite resolver el problema

planteado con un porcentaje de aciertos del 73% (referente a 23
imagenes evaluadas)
• Se detectan satisfactoriamente las hendiduras y la mayoría de las
marcas
• Encontramos una fuerte dependencia entre la elección de las
marcas en el patrón y el resultado final. Es decir que, si deseamos
evaluar una marca en particular de una muestra, es preferible seleccionar
las marcas en el patrón que estén más cercanas a la misma, de forma de
minimizar el error producido por la asignación de valores.
• Para los casos en que las marcas están unidas y las hendiduras
desparejas y torcidas, es preferible medir "a ojo" o realizar nuevamente
el experimento.
• No se logró la automatización, aunque no fue predicha en el
inicio.

Bibliografía

• Gel Electrophoresis of DNA – Libro concedido por

investigadores del Clemente Estable.
• Universidad de Cultek - www.cultek.com - Técnicas y Protocolos
Electroforesis
• Wikipedia - Electroforesis
• Proyecto didáctico: Electroforesis - Ludovico,M. & Lozano,I. -
Realizado en Laboratorio de Química de Proteoglicanos y Matriz
Extracelular, Dr. Juan Carlos Calvo – Departamento de Química
Biológica – FCEyN - UBA