UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA DE MEDICIA HUMANA

GUA PRCTICA:

CETOACIDOSIS
DIABTICA
ALUMNO:
MENDOZA LOVERA LEONEL
CICLO:
III - MA
CURSO:
BIOQUMICA Y NUTRICIN
PROFESOR:
GARCA CALDERON, JACK SLIM

ICA PER
2016

OBJETIVOS
1. Reconocer el adecuado funcionamiento del espectrofotmetro.

2. Calcular la concentracin de una solucin problema con el empleo de un

Espectrofotmetro.
3. Analizar los datos obtenidos en las pruebas de precisin y exactitud.
4. Comprender el funcionamiento del espectrofotmetro en calidad del tiempo.

MARCO TERICO
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las
investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite
comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida
de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que
parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que
pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del
infrarrojo.
La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la
energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de
onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbida.

MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS

1.

NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA

La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se
propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo

completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en
nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.
b) Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la
longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo
o hertzios.
c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes
discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la
longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x n = h x c/n (h =
Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se
mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es
inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y
viceversa.
d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante,
desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de
longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms
interesantes para nosotros son:

Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm

Regin Visible: l = 380-780 nm

Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca
contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una
molcula puede ser dispersada o absorbida.

2.

FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENMENO DE ABSORCIN
Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado
fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma

en una partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la

onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de
la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h.n). La partcula en
estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de
reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.
Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el
nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El
espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas
la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la
espectrofotometra de absorcin.
Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia
estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz,
mayor cantidad de sustancia).
B. FENMENO DE EMISIN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado
fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso,
lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la
fotometra de llama o la fluorescencia.

3.

LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta
prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia.
Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la
luz transmitida:
T = Is / I0 ;

%T = (Is / I0) x 100.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el

solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una
solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles
compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a
esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la
medida del blanco.
La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A)
porque la relacin entre A y la concentracin de una solucin es
directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

- Si el %T = 100

A = 2-log T = 2-log 100 = 0

- Si el %T = 0

A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias,

pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a
absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un
cuerpo depende de la concentracin en la solucin.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar
disuelta y en otro vaso tenemos la misma cantidad de agua pero
con mayor cantidad de azcar en solucin. El detector es una
celda fotoelctrica, y lo que se mide es la concentracin de la
solucin de azcar.

Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara

el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado sera
mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en este
ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor
nmero de tomoso/y molculas y son absorbidos por estos.1

3.2. LEY DE LAMBERT

La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un

objeto depende de la distancia recorrida por la luz.
Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pensemos que
ambos tienen la misma cantidad de agua y la misma
concentracin de azcar; pero el segundo tiene un dimetro
mayor que el otro.

Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz

atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro
lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que
en este ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un
mayor nmero detomos o/y molculas y son absorbidos por
estos, tal como se explic en la ley de Beer.

3.3. LEY DE BOUGUER-BEER-LAMBERT

Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (tambin

conocida como ley de Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo
una combinacin de las citadas anteriormente.

TRANSMITANCIA Y ABSORCIN DE LAS RADIACIONES

Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una

cantidad de fotones o de radiaciones hay una prdida que se
expresa con la ecuacin:
It/Io=T-kdc''

donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a

llegar a la celda fotoelctrica (llamada radiacin o intensidad
transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la
celda (radiacin intensidad incidente), y la relacin entre ambas
(T) es la transmitancia.
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa
radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. El
superndice k es la capacidad de la muestra para la captacin del
haz del campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de
espectrofotometra que

recorre

la

radiacin,

es

la

concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert
A = .d.c
comprende la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c),
la absorbencia de la muestra (A), el espesor recorrido por la
radiacin (d) y el factor de calibracin (). El factor de calibracin
relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares.
La absorcin (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo
recproco de la transmitancia:2
A= log 1/T
lo que es igual a:
A= -log T
Las ecuaciones mencionadas de las leyes son vlidas solo y solo
si:2

la radiacin incidente es monocromtica;

las especies actan independientemente unas de otras

durante la absorcin;

la absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal

uniforme.

4. ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos:

Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que

solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.

Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz
de luz monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los
monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de

difraccin.
Monocromador de Prisma

4.1. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz
visible o no visible.

Tipos de lmparas:

Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para

longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta

prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa
radiante entre 360-950 nm.
- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de
mayor

duracin

intensidad.

emiten

energa

radiante

de

mayor

Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro

continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm.

-

Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro

discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para

calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para
espectrofotmetros y cromatografa HPLC.

Precauciones:

Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen

sufrimiento de la lmpara y cambios en las lecturas de la

Absorbancia.
- La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para
que funcione bien el aparato.
2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz
difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin
de longitud de onda.
3. Monocromadores. Pueden ser:
-

Prismas: son fragmentos con forma de cua de un

material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para

trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el
ultravioleta lejano.
-

Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas

paralelas situadas a distancias iguales entre s y son

hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada
una de estas hendiduras se comporta como un pequeo
prisma.

4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa

atraviese la cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a
la Ley de Beer.
5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la
medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas,
rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando
cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se
deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma
posicin. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico.
6. Detector. Puede ser de dos tipos:
o Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:
Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa
de Selenio o de xido de Cobre. A sto se le conoce como
semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de
metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide
sobre el Selenio y ste desprende electrones, que pasan a
la placa de Cobre originando una diferencia de potencial
por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el
Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que
seala el paso de corriente.
Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles
desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de
onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la
corriente producida es directamente proporcional a la
Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que
presentan una subida inicial de corriente, que luego
decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay
que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.
o Fototubesmultiplicadores

Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un

ctodo que emite electrones de forma proporcional a la
Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los
electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar
los electrones sobre sucesivos nodos que van teniendo un
voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en
cientos o miles de veces.
Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no
tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y son muy
sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que
recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una
clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en
el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos
incorporan

lectura

digital

clculos

automticos

de

concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

4.2 TIPOS DE APARATOS

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la

descripcin dada para el espectrofotmetro en general. Consta
de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para determinar
bilirrubina directa en capilar).

ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO:

todos los componentes estn duplicados, menos la lmpara y
el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los
distintos

componentes

separados

en

el

espacio.

Esto

compensa las variaciones de intensidad de luz y de

absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO:

utilizan los mismos componentes que el espectrofotmetro de
haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos

componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un Chopper

consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso
colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de
espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a
travs de una cubeta de referencia y de ah al detector comn.
El detector lee alternativamente el haz procedente de la
muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la
variacin de energa radiante.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Se prepar la siguiente batera de tubos:

Bicromato de
potasio
Agua destilada
Concentracin
(mg%)
Muestra X

Tubo I

Tubo II

Tubo III

Tubo IV

Tubo X

0.8 ml

1 ml

1.3 ml

1.5 ml

9.2 ml

9 ml

8.7 ml

8.5 ml

9 ml

1 ml

Solucin stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.

Calculamos la concentracin en mg% de bicromato de K en cada uno de
los tubos Standard (I-II-III-IV).
Leemos las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de
onda ( )en el espectrofotmetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).
2. Con los datos obtenidos construimos en un papel milimetrado la grfica de
absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentracin de bicromato de K en
el eje de las Abscisas.

3. Una vez obtenida la curva de calibracin, medimos la absorbancia de la

muestra problema (Problema X).

4. Obtenemos el factor de calibracin (Fc) promedio con las soluciones

standard y sus Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibracin
ajustadas.
5. Calculamos la concentracin de la muestra problema por los siguientes
mtodos:

- A.- Grficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibracin.

- B.- Usando Factor de Calibracin, multiplicando su absorbancia por el factor

de calibracin del standard.
Fc = [ Standard ] / A

Donde:
Fc = factor de calibracin.
A = absorbancia del tubo standard.
[Standard] = concentracin del standard.

CONCLUSIONES

El conocer el adecuado uso del espectrofotmetro permiti obtener en el

laboratorio resultados con alta calidad analtica en las mediciones que son
emitidas por ste.

Se calcul la concentracin de una solucin problema con el empleo de un

Espectrofotmetro dando como resultado

Se identific que el equipo presenta una adecuada precisin y exactitud

determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.
Se conocieron algunas aplicaciones (medicin de fosfatos en aguadeterminacin de bilirrubina en sueros) que tiene la espectrofotometra en el
campo de estudio de la microbiologa tanto industrial-ambiental como en el
bioanlisis.

CUESTIONARIO:
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro.
Los espectrofotmetros de reflectancia miden la cantidad proporcional
de luz reflejada por una superficie como una funcin de las longitudes de
onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de
reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la funcin del
observador estndar CIE y la distribucin relativa de energa espectral
de un iluminante para calcular los valores triestmulos CIE XYZ para esa
muestra bajo ese iluminante.

El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en

iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que
refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda.
Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes
de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se
consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo monocromtico
que fracciona la luz en distintos intrvalos de longitudes de onda. El
instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia
en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con
una superficie de reflexin difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y
1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de
que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para
muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad
de la luz usada para iluminar la muestra. As, aunque los factores de
reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es
perfectamente correcto calcular los valores colorimtricos para cualquier
iluminante conocido.
2.- Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?

La diferencia fundamental entre un espectrofotmetro y un fotmetro o

fotocolormetro, consiste en que el fotocolormetro trabaja nicamente en
el espectro de luz visible y selecciona una longitud de onda determinada
mediante filtros fijos.
En cambio, un Espectrofotmetro es capaz de trabajar, no solo con la luz
visible sino que en otras regiones del espectro electromagntico
(ultravioleta e infrarroja). Adems posee un monocromador para
seleccionar la longitud de onda deseada.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.

4.- Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia?

Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada cantidad de luz,

la intensidad de la luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el
aumento del nmero de molculas que se interpongan entre la fuente luminosa
y el observador. Este nmero vara de acuerdo con la concentracin del soluto
y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos factores estn
considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rige los principios de la
Espectrofotometra y cuyas formas de expresin son:

Log (Io/I) = E. b. c = A = D.O.

Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extincin molar, valor constante dependiendo de la
naturaleza de la Sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentracin de la solucin.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y
la relacin entre ambas es logartmica.
5.- Construya una curva de calibracin con los siguientes valores:
Standard

Standard

Standard

Standard

Standard

Concentracin

5 mg/dl

10 mg/dl

20 mg/dl

30 mg/dl

40 mg/dl

Absorbancia

0.025

0.050

0.100

0.150

0.200

Con la curva obtenida hallar la concentracin de las siguientes muestras,

sabiendo que sus absorbancia fueron:
Muestra A........................0.015

Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

BIBLIOGRAFIA
1. BARNARD, J.A. y CHAYEN, R. Mtodos modernos de anlisis qumico,
capitulo 3 (pg. 57, 62, 68, 69, 70, 75) Espaa, 1970, ediciones urmo
2. ATKINS, P. Qumica fsica, capitulo 13 (pg. 432 434) China, 2008,
Editorial panamericana
3. DOUGLAS, A. Qumica analtica, capitulo 23 (pg. 614 620) 3ra
edicin, Mxico, 2005, international Thompson editores S.A