Aislamiento e identificacin de

microorganismos en una muestra

Muestra: suspensin que contiene
una mezcla de microorganismos

Siembra y aislamiento - BSQUEDA

SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La
siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, ansa,
hisopo o pipeta estril.
Cultivo en medio lquido
Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar
por aparicin de turbidez, formacin de velo o pelcula, o sedimento.
Cultivo en medio slido
Puede ser en tubos o placas.
En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra
en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino adems para
contar y aislar.
Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede
ser necesario diluir la muestra con un diluyente estril como suero fisiolgico.

AISLAMIENTO
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias,
donde podremos ver la morfologa, color y otras caractersticas de los distintos tipos de
microorganismos presentes en la muestra. Se llevarn a cabo inoculaciones en placas
de medios slidos y en medio lquido
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
a) aislamiento por estras.
b) aislamiento por dilucin
Aislamiento en placa por estras
Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias
aisladas.
Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras
paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se
quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a
estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y
cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el
ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar.
Aislamiento por dilucin en medio slido
Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de siembra en superficie.
Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiolgico o algn otro diluyente.

BUSQUEDA
Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja
proporcin en una muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda, que
involucra una primera etapa de aumento del nmero del tipo de microorganismo que
se desea aislar. Luego se asla por el mtodo de estras o por dilucin y se identifica.
Una bsqueda implica los siguientes pasos:
1) enriquecimiento
2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales)
3) reaislamiento (medio no selectivo)
4) identificacin
Etapa de enriquecimiento: su objetivo es aumentar el nmero del microorganismo
que se desea determinar
Puede dividirse en dos: -preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo (se
usan medios nutrientes lquidos) para organismos daados. - enriquecimiento
selectivo se realiza incubando la muestra en medios lquidos selectivos (permiten
crecer el organismo buscado)
Etapa de aislamiento: empleando la tcnica de estras en superficie en medios slidos
selectivos y diferenciales. Examinar las colonias tpicas para el microorganismo buscado

Reaislamiento: si se usaron medios selectivos las colonias deben aislarse

nuevamente en medios no selectivos por el mtodo de las estras.
Es necesario para asegurar la obtencin de un CULTIVO PURO del microorganismo
de inters.
El examen microscpico de una colonia de un cultivo puro de un microorganismo debe
mostrar clulas razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfologa.

Informe de bsqueda: se expresa PRESENCIA o AUSENCIA en los gramos o mL de

muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento).

Identificacin de una cepa bacteriana

desde el punto de vista bioqumico
1) Obtener un cultivo puro
2) Examen microscpico
En general se realiza de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se
determina as la forma y la tincin Gram. Tambin es importante determinar la
agrupacin y la presencia de esporas u otras caractersticas morfolgicas de inters.
3) Determinar las caractersticas nutricionales
En general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo
anteriores realizados: fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos,
quimiohetertrofos.
4) Realizacin de pruebas primarias
Con pruebas primarias, se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn
caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram,
morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, presencia de esporas,
crecimiento en aerobiosis /anaerobiosis y movilidad.

5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias

A efectos de llegar a especie es necesario la mayora de las veces realizar pruebas
suplementarias. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin
de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, etc.)
Serotipo
A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas
bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos
(anticuerpos contra determinados antgenos bacterianos).
Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al
lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se
identifican con esas letras y el nmero o letra del antgeno correspondiente.
En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin
serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en
el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli,
Haemophilus, etc.
Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:
Yersinia enterocoltica 4
03
gnero especie
biotipo serotipo

Ensayos bioqumicos
Determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones
qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer transforma o no.
Pruebas simples que se han desarrollado para demostrar una determinada
caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada
actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica,
crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores.
Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos
obtenidos en los aislamientos en placa.
Se pueden usar kit comerciales, o pruebas bioqumicas tradicionales
Kit comerciales: utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas
convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro
impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios prontos
para sembrar.

BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema pronto para

usar para la identificacin de Enterobacterias, definidas como bastones
Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-).
Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en
compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa
y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas.

OXI/FERM TUBE II, (Becton

Dickinson). Es un sistema listo para
usar para la identificacin de
bastones Gram (-), aerobios o
anaerobios facultativos, oxidasa (+).
Consiste en un tubo de plstico de
12 medios de cultivo que permite la
realizacin simultnea de 14 pruebas
bioqumicas.

Batera de pruebas API20E (BioMerieux) Es un sistema estandarizado

para la identificacin de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con
microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se
reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la
realizacin de 23 pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia
bacteriana.

Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras

Sistema para la identificacin de Enterobacterias que consta de nueve

pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E)
Este sistema identifica las 23 especies ms frecuentemente aisladas de
muestras clnicas.
Est integrado por las siguientes pruebas:
produccin de H2S (TSI),
fenilalanina desaminasa,
produccin de indol,
descarboxilacin de lisina y ornitina,
crecimiento en citrato,
fermentacin de arabinosa,
fermentacin de sorbitol
produccin de acetona.

La realizacin de una prueba bioqumica implica:

Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado
sustrato
luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo
revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su
degradacin.
La prueba bioqumica tambin puede consistir en demostrar el crecimiento
en presencia de determinado inhibidor.
Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el
sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la
actividad enzimtica.
Se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en
que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica,
atmsfera y temperatura adecuados.

Pruebas individuales:: Prueba de la oxidasa, Test de la Catalasa, Prueba de

Kligler y Manita-movilidad.

1) Enzimas vinculadas a la respiracin

1.1 Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo
posee citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgnico que
puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en
presencia de oxgeno molecular, originando un producto coloreado
fcilmente apreciable.
1-naftol + dimetilparafenilendiamina OXIDASA azul de indofenol
Resultado: Si la tira se pone de color azul
oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo.
Este ensayo es til para sospechar la presencia de los
gneros de bacterias que dan el ensayo positivo como
Neisseria, Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y
Pseudomonas y para excluir las Enterobacterias que dan
reacciones negativas.

1.2. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima

capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos
metablicos. Esta enzima est presente en la mayora de las bacterias que
contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias
2 H 2O2

CATALASA

2 H 2O + O 2

Resultado: La aparicin de burbujas indica que el microorganismo es

catalasa positivo

Controles
Staplylococcus aureus: positivo
Streptococcus spp.: negativo

2) Requerimientos de oxgeno
2.1 PRUEBA DE XIDO-FERMENTACIN (OF) La prueba de xidofermentacin es importante en las primeras etapas de identificacin de un
cultivo. Permite diferenciar las bacterias segn el rol del oxgeno atmosfrico
en la utilizacin de carbohidratos.
El medio de cultivo ms utilizado es slido y contiene una baja concentracin
de peptonas (0,2 %). La baja concentracin de peptona del medio HughLeifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos
frente a la glucosa.
El medio se coloca en tubos y se inocula por picadura
Interpretacin
La produccin de cido se detecta en el medio por la aparicin de color
amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos, este aparece en la
superficie. Cuando el microorganismo es fermentador se observa el viraje
en todo el tubo.
Si el medio no cambia de color o vira al color azul (pH bsico) con respecto a
un tubo del mismo lote sin sembrar, se considera que el microorganismo es
inactivo frente a la glucosa
La figura de la izquierda muestra el cultivo de tres
bacterias: dos fermentadoras (izquierda y centro) y
otra no fermentadora (derecha).

Controles
Fermentador de glucosa: Escherichia coli
Oxidativo de glucosa: Pseudomonas aeruginosa
No reacciona: Micrococcus spp

FERMENTACIN DE GLUCOSA

La determinacin de la capacidad de fermentacin de la glucosa es importante

en las primeras etapas de identificacin de bacterias quimitrofas.
Se utiliza un caldo que contiene glucosa (azcar del cual la mayora de las
bacterias quimiotrofas pueden obtener energa, ya sea por fermentacin o
respiracin), peptona y un indicador de pH que permite detectar la produccin
de cidos (caracterstica de la fermentacin de la glucosa).
Adems en la fermentacin se produce gas, ya sea CO 2 solo o una mezcla de
H2 y CO2.
El H2 es insoluble y se detecta por la formacin de una burbuja en una
campana de Durham presente en el medio.

Interpretacin
Las bacterias fermentadoras de glucosa producen un viraje del indicador al
cido (color amarillo). Si se produce gas puede observarse en la campanita
invertida. Las bacterias no fermentadoras no producen viraje o producen un
viraje hacia el pH alcalino (prpura a violeta).

2.1 Caldo tioglicolato

Para determinar las relaciones con el oxgeno se utiliza el caldo tioglicolato.
Este medio permite el crecimiento de muchas de las bacterias hetertrofas
no exigentes, pero no de todas, y de acuerdo al tipo de crecimiento se
determinar si el microorganismo puede respirar y/o fermentar.
No se puede determinar si el microorganismo puede crecer
anaerbicamente con aceptores electrnicos alternativos (NO 3-) o con luz..
El tioglicolato de sodio, baja el potencial redox del medio y la resazurina es
un indicador de oxidacin (aerobiosis) del tubo.
Se inocula los tubos por picadura.
Interpretacin
Aquellos microorganismos que son indiferentes al oxgeno y tienen un
metabolismo estrictamente fermentativo, crecern a lo largo de todo el tubo
(anaerobios aerotolerantes). (crecen en presencia y ausencia de oxgeno)
Los anaerobios facultativos crecern a lo largo de todo el tubo pero habr
mayor crecimiento en la superficie del tubo. (crecen en presencia y ausencia de
oxgeno). Fermentar, Respirar aerbicamente o anaerbicamente
Los aerobios estrictos crecern slo en la superficie del tubo (no fermentan).
Los microaeroflicos no crecern en la superficie pero s en la zona aerobia
donde haya una concentracin de oxgeno inferior a la atmosfrica. Los
anaerobios estrictos crecern solo en el fondo del tubo.(Fermentan o Resp

3) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros

Produccin de cido, o cido y gas

Deteccin de enzimas y vas metablicas (RM-VP , O.N.P.G. -orto nitro -Dgalactopiransido-, esculina)
4) Fuente nica de carbono: citrato, malonato
5) Utilizacin de compuestos nitrogenados asimilacin de nitrato (reduccin a
amonio)
desnitrificacin (utilizacin de nitrato como aceptor de electrones)
descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros (indol, fenilalanina,
urea, descarboxilacin de lisina, etc)
6) Ensayos combinados : TSI (Triple azcar hierro). LIA (Agar hierro lisina)
7) Deteccin de exoenzimas (lecitinasa, proteasas, coagulasa, celulasas, etc)
8) Test de crecimiento o inhibicin (temperatura, cloruro de sodio en alta
concentracin, antibiticos)
9) Otros (solubilidad en bilis, produccin de pigmentos).

2.3. Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar
Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiolgicos importantes
para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa,
produce gas o cido sulfhdrico. Es un medio que requiere un
procedimiento de inoculacin especial.
Medio KIA
1- Produccin de cidos de la glucosa
Extracto de carne 3 g/l
(no de la lactosa) En la superficie del
Extracto de levadura 3 g/l
medio las enterobacterias respiran
Peptonas 15 g/l
consumiendo la glucosa: Cuando la agotan
Lactosa 10 g/l
(solo tiene 0.1%) consumen los pptidos y
Glucosa 1 g/l
se alcaliniza el medio (superficie rosa).
Tiosulfato sdico 0,3 g/l
En el fondo las enterobacterias fermentan
la glucosa produciendo cidos (fondo
Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l
amarillo).
Rojo de fenol 0,024 g/l
ClNa 5 g/l
2- Produccin de cidos de la lactosa (y
Agar 12 g/l
de la glucosa): En la superficie del medio
las enterobacterias respiran utilizando la
pH 7,4
glucosa y luego la lactosa. En el
fondo producen una elevada cantidad
de cidos y difunden hasta la superficie
(todo el medio amarillo).

b) Produccin de gas. La produccin de gas se detecta por la formacin

en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el
medio. El gas se origina mediante la reaccin catalizada por la formiato
liasa a partir de cido frmico.
Por tanto, son gas (+) aquellos microorganismos que produzcan esta
enzima.
c) Produccin de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo
la siguiente reaccin a partir del tiosulfato aadido al medio:
2 S2O3 2+ + 4 e- + 4 H+ tiosulfato reductasa

2 SO3 2+ + 2 SH2

El cido sulfhdrico se detecta porque reacciona con las sales de

metales pesados (Fe2+) presentes en el medio. Esto da lugar a la
formacin de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo,
sobre todo en el La
fondo,
oscureciendo
medio. a derecha):
imagen
muestra (de el
izquierda
1-cultivo lactosa -, SH2 +
2-cultivo lactosa +
3-cultivo lactosa
4- cultivo lactosa -

Produccin de cidos de :

Lactosa

Glucosa

Todo el cultivo amarillo

Amarillo en el fondo y rosa en el pico de

flauta

Todo el cultivo rojo o rosa

Precipitado negro

Produccin de SH2

Fractura o desplazamiento del medio

Produccin de gases

2.4. Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semislido para detectar la

movilidad de las bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de
carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce
una acidificacin del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH
de rojo a amarillo
Medio MM
Peptona de casena 10 g/l
Nitrato potsico 1 g/l
Manitol 7,5 g/l
Rojo fenol 0,04 g/l
Agar 3,5 g/l
pH 7.6
Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento
del microorganismo. Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura,
el microorganismo no es mvil. Si el crecimiento se produce por todo el
medio, el microorganismo es mvil.

Gneros

Gas

SH2

Lactosa

ManitaMovilidad

Escherichia

Shigella

Salmonella

Citrobacter

Klebsiella

Enterobacter

Serratia

Proteus

Tincin Gram
(cultivo fresco)
Forma
Agrupacin

coco

coco

coco

coco

bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn

racimo racimos cadena ttradas

s
s

coco
pares

Crecimiento
aerobio

Crecimiento
anaerobio

Esporas

Movilidad

+o

+o

+o

+o

+o

+o-

Catalasa

Oxidasa
Fermentacin
(glucosa)

+o

Oxidacin
Fermentacin

O
Inactiv
o

F
Inactivo

Micrococcus

Staphylococcus

Streptococcus

Lactococcus

Enterococcus

Leuconostoc

Pediococcus

Aerococcus
Lactobacillus
Clostridium

X
X
X
X

inactivo inactivo

Referencias

Tcnicas bsicas en el laboratorio de microbiologa. Siembra y aislamiento de

bacterias http://youtu.be/-TnHCd4sY24

Siembra en estria II http://youtu.be/rxtGsn3b-1g

Morfologa de colonias bacterianas http://youtu.be/PYFT3QT_y7Q
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm
http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-kligler.htm