Vida - Til Listeria 2 - Edici-N 21-09-2012

Documentos Tcnicos de Higiene y Seguridad Alimentaria n 6
Gua de estudios de vida til para

Listeria monocytogenes
en alimentos listos para el consumo
ComunidaddeMadrid
www.madrid.org
Gua de estudios de vida til para
Listeria monocytogenes
en alimentos listos para consumo
ComunidaddeMadrid
www.madrid.org
Edita:
Direccin General de Ordenacin e Inspeccin.
Consejera de Sanidad de la Comunidad de Madrid
El presente documento se ha redactado nicamente con fines informativos.

La Direccin General de Ordenacin e Inspeccin no garantiza la exactitud de los
datos e informaciones ofrecidos, ni asume la responsabilidad en relacin con cualquier
uso que de ellos pudiere hacerse. Por consiguiente, es aconsejable que los usuarios
consulten la legislacin en la que est basada antes de usar, bajo su exclusiva
responsabilidad, esta gua
Redactado por:
Silvia Iigo Nuez. Referente del Programa de Vigilancia y Control de

Contaminantes y Residuos en Alimentos, ao 2010 (Subdireccin General de
Higiene y Seguridad Alimentaria)
Alicia Jimnez Manso. Responsable del Subprograma de Control de

Contaminantes Biolgicos, ao 2010 (Subdireccin General de Higiene y
Seguridad Alimentaria)
Comisin del Subprograma de Control de Contaminantes Biolgicos, ao 2010:
M Silvia Garca (Servicio de Salud Pblica del rea I)

Concepcin Fernndez (Servicio de Salud Pblica del rea II)
Pedro Carbonero (Servicio de Salud Pblica del rea III)
Berta Fernndez (Servicio de Salud Pblica del rea V)
Paloma Estrada (Servicio de Salud Pblica del rea V I)
Concepcin Otero (Servicio de Salud Pblica del rea VIII)
ngeles Ferrer (Servicio de Salud Pblica del rea IX)
Montserrat Daza (Servicio de Salud Pblica del rea IX)
M Marta Fernndez (Servicio de Salud Pblica del rea X)
M ngeles Pearanda(Servicio de Salud Pblica del rea XI)
Nuria Gmez (Servicio de Salud Pblica del rea XI)
Montserrat Alonso (Servicio de Gestin de la Seguridad Alimentaria)
Javier Castro (Laboratorio Regional de Salud Pblica)
Mercedes Sotodosos (Seccin de Evaluacin y Vigilancia de Riesgos
Alimentarios)
Revisado por:
Micaela Garca Tejedor. Subdirectora General de Higiene y Seguridad Alimentaria
Fecha de finalizacin de la redaccin: 4 de abril de 2011
Edicin: Segunda, agosto 2012

(Correccin de terminologa de Edicin: Primera, octubre 2011)
Presentacin
Es un placer para m presentar la Gua de estudios de vida til para Listeria
monocytogenes en alimentos listos para consumo.
Para el Gobierno de la Comunidad de Madrid garantizar la salud de los
madrileos resulta prioritario. Por ello, al igual que ocurre en otros mbitos, en materia
de seguridad alimentaria la prevencin tambin resulta indispensable. En este
contexto es donde el control de la bacteria Listeria monocytogenes que puede
encontrarse en determinados alimentos, se convierte en un factor clave. En este
sentido, la propia Unin Europea ha puesto en marcha diversas iniciativas con objeto
de que las empresas alimentarias puedan demostrar que los alimentos que elaboran
son seguros.
Con el presente documento tratamos de difundir entre las empresas
alimentarias de la regin y los laboratorios que realizan las pruebas analticas que
correspondan, las recomendaciones tcnicas europeas en esta materia.
Tengo el pleno convencimiento de que esta gua, fruto del esfuerzo de un
equipo humano de profesionales de gran vala, va a constituir una herramienta
prctica muy eficaz e interesante que facilitar sin lugar a dudas la consecucin de un
claro objetivo: garantizar la salud de los madrileos.
Paloma Martn Martn

Directora General de Ordenacin e Inspeccin
A quin se dirige esta Gua

La gua est dirigida primordialmente a las empresas alimentarias que fabrican
alimentos listos para el consumo, con el objetivo de facilitarles las recomendaciones
europeas para realizar los estudios de vida til preceptivos en relacin con Listeria
monocytogenes.
En los anexos tambin se han incluido protocolos de trabajo destinados a los
laboratorios de ensayo que colaboran con las empresas en la realizacin de estos
estudios.
En qu bibliografa se basa
Esta Gua se ha redactado recopilando las recomendaciones tcnicas para realizar
estudios de vida til que se detallan en los siguientes documentos comunitarios:
Documento Gua de la Comisin Europea (CE, 2008 a), dirigido a las empresas
alimentarias.
Documento Gua tcnica del Laboratorio Comunitario de Referencia para
Listeria monocytogenes (CE, 2008 b), dirigido a los laboratorios.
En las descripciones de los estudios complementarios, dirigidas a las empresas, se han
aadido opiniones de la Agencia Francesa de Seguridad Sanitaria de los Alimentos
(AFSSA, 2005). En la BIBLIOGRAFA se resean las citas completas de estos documentos
y se facilitan las direcciones de Internet donde estn disponibles para su acceso
directo y gratuito. La terminologa de esta Gua se ha adaptado a la utilizada por el
Comit Cientfico de la Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y Nutricin
(AESAN, 2011).
Qu contiene y cmo se utiliza

La Gua comienza con unas CONSIDERACIONES PREVIAS para recordar el marco legal
de los estudios de vida til y su inclusin dentro de los sistemas de autocontrol, resaltar
la necesidad frecuente de combinar varios, clarificar la colaboracin entre empresas
e insistir en la importancia de la documentacin como evidencia objetiva.
A continuacin se describen los estudios obligatorios sobre las CARACTERISTICAS DEL
PRODUCTO Y LA BIBILIOGRAFA CIENTFICA para empezar a establecer la vida til, y
que, en algunos casos, pueden ser suficientes.
Se termina relacionando los ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS posibles, destacando sus
aplicaciones prcticas, ventajas y limitaciones.
Los ANEXOS se han reservado para la informacin ms aplicativa y prctica. Los
Anexos 1 y 2, con rboles de decisiones y ejemplos de su uso, orientan a las empresas
alimentarias para comenzar a abordar los estudios de vida til a realizar. En el Anexo 3
se ilustra el uso de los modelos matemticos de microbiologa predictiva. Los Anexos 4,
5 y 6 contienen los protocolos de trabajo recomendados para los laboratorios de
ensayo que practican las pruebas analticas.
El Anexo 7 contiene un listado de verificacin que hemos elaborado para tratar de
resumir todas las directrices tcnicas comunitarias descritas a lo largo de la Gua. En el
Anexo 8 hemos recopilado algunos valores publicados de pH y actividad de agua de
distintos alimentos listos para consumo, a modo de ejemplo y orientacin. Y en el
Anexo 9 hemos incluido los criterios microbiolgicos vigentes para L. monocytogenes,
las definiciones ms relevantes y los acrnimos utilizados en la redaccin de la Gua.
4
ndice
CONSIDERACIONES PREVIAS ............................................................................................................ 6
1. Evaluacin de la vida til combinando diferentes herramientas ........................... 9
2. Colaboracin entre empresas alimentarias ............................................................. 10
3. Documentacin de los estudios de vida til ............................................................ 11
CARACTERSTICAS DEL PRODUCTO Y BIBLIOGRAFA CIENTFICA............................................................. 12
1. Caractersticas fsico-qumicas ................................................................................... 13
2. Bibliografa cientfica ................................................................................................... 14
ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS ........................................................................................................ 15
1. Histrico de datos ........................................................................................................ 16
2. Microbiologa predictiva (Modelos matemticos).................................................. 17
3. Pruebas de laboratorio especficas........................................................................... 19
3.1. Estudios de durabilidad ........................................................................................ 20
3.2. Ensayos de desafo ............................................................................................... 21
3.2.1. Ensayos de desafo para el potencial de crecimiento .................... 22
3.2.2. Ensayos de desafo para la velocidad mxima de crecimiento.... 24
BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................... 25
ANEXOS ................................................................................................................................... 26
ANEXO 1. RBOL DE DECISIONES PARA REALIZAR ESTUDIOS DE VIDA TIL ............................................... 27
ANEXO 2. RBOL DE DECISIONES PARA VALORAR LA VIDA TIL ............................................................ 31
ANEXO 3. EJEMPLO DEL USO DE MICROBIOLOGA PREDICTIVA ............................................................. 37
ANEXO 4. PROTOCOLO DE ESTUDIOS DE DURABILIDAD........................................................................ 38
ANEXO 5. PROTOCOLO DE LOS ENSAYOS DE DESAFO PARA EL POTENCIAL DE CRECIMIENTO ..................... 42
ANEXO 6. PROTOCOLO DE ENSAYOS DE DESAFO PARA LA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO ............ 50
ANEXO 7. LISTADO DE VERIFICACIN DE DIRECTRICES TCNICAS.......................................................... 57
ANEXO 8. EJEMPLOS DE CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS ............................................................. 63
ANEXO 9. CRITERIOS, DEFINICIONES Y ACRNIMOS .......................................................................... 65
Consideraciones previas
La obligacin legal de que los fabricantes de alimentos listos para el consumo realicen
estudios de vida til para Listeria monocytogenes est establecida en el Artculo 3,
apartado 2 del Reglamento CE N 2073/2005 (DOCE, 2005): Cuando sea necesario, los
explotadores de las empresas alimentarias responsables de la fabricacin del
producto realizarn estudios conforme a lo dispuesto en el anexo II para investigar el
cumplimiento de los criterios a lo largo de toda la vida til. Esto es aplicable
especialmente a los alimentos listos para el consumo que puedan permitir el desarrollo
de Listeria monocytogenes y puedan suponer un riesgo para la salud pblica en
relacin con dicha bacteria.
En la tabla 1 se recogen los estudios mencionados en el citado Reglamento, aunque
hay que tener en cuenta que, en general, la duracin de la vida til de los alimentos
se suele establecer combinando las informaciones procedentes de las distintas fuentes.
Tabla 1. Estudios para investigar el cumplimiento de los criterios (Anexo II del Reglamento CE n 2073/2005)
Caractersticas del producto y bibliografa cientfica.
Especificaciones de las caractersticas fisicoqumicas del producto, como pH, aw, contenido de
sal, concentracin de conservantes y tipo de sistema de envasado, teniendo en cuenta las
condiciones de almacenamiento y transformacin, las posibilidades de contaminacin y la vida
til prevista.
Consulta de la bibliografa cientfica y de los datos de investigacin disponibles acerca de los
aspectos que caracterizan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos en cuestin.
Estudios complementarios: tendrn en cuenta la variabilidad inherente al producto, los microorganismos en

cuestin y las condiciones de transformacin y almacenamiento
Modelos matemticos de pronstico establecidos para el alimento de que se trate, utilizando

factores crticos de crecimiento o supervivencia aplicables a los microorganismos en cuestin
presentes en el producto.
Pruebas para investigar la capacidad que tiene el microorganismo en cuestin, adecuadamente
inoculado, para crecer o sobrevivir en el producto en diferentes condiciones de almacenamiento
razonablemente previsibles.
Estudios para evaluar el crecimiento o supervivencia de los microorganismos en cuestin que
puedan estar presentes en el producto durante su vida til en condiciones razonablemente
previsibles de distribucin, almacenamiento y utilizacin.
La determinacin de la duracin de la vida til es muy importante para la seguridad

microbiolgica de los alimentos listos para el consumo (ALC), en especial en aquellos
alimentos en los que puede producirse crecimiento de L. monocytogenes.
Las empresas fabricantes de ALC debern llevar a cabo estudios de vida til y la
revisin de sus planes APPCC en las siguientes circunstancias:
Desarrollo de alimentos nuevos o modificados.
Desarrollo de procesos nuevos o modificados.
Desarrollo de nuevos envasados.
Cualquier cambio significativo en los ingredientes y/o el envasado de los
alimentos existentes.
Cambios en las instalaciones o en el equipo de produccin.
Cuando previamente no hayan realizado estudios de vida til.
La empresa alimentaria es responsable de establecer la vida til en unas condiciones
definidas, las cuales deberan tener en cuenta las condiciones razonablemente
previsibles de distribucin, almacenamiento y uso.
Una parte importante de estas condiciones previsibles es la temperatura de
almacenamiento durante toda la vida til, y en consecuencia, se debe(n) justificar
la(s) temperatura(s) elegida(s) para el estudio de vida til.
Como norma, el uso de temperaturas de almacn demasiado bajas para establecer
la vida til, en comparacin con las temperaturas reales de la distribucin y uso,
puede conducir a una subestimacin del crecimiento microbiano, incluida L.
monocytogenes, y a una consecuente sobreestimacin de la duracin de la vida til.
Si la empresa desconoce las temperaturas reales de almacenamiento del producto en
cuestin, puede aplicar, p.e. 8-12 C como temperatura de almacn en los estudios
de vida til. No obstante, las empresas alimentarias deben justificar qu temperaturas
utilizan para establecer la vida til, teniendo en cuenta datos de temperaturas durante
la distribucin y el almacenamiento por los consumidores.
En la prctica, el establecimiento de la vida til se considera parte del sistema
APPCC del fabricante, y tiene en cuenta:
los controles sobre los proveedores que garanticen la calidad de las

materias primas y la tendencia de los resultados de los controles de
materias primas,
la confianza en los controles de las Prcticas Correctas de Higiene

aplicados en el ambiente de fabricacin, reflejados en los resultados del
muestreo de superficies y equipos de procesado,
la experiencia del fabricante con productos similares,
la velocidad de deterioro microbiolgico y el mantenimiento de la calidad
La duracin de la vida til es parte integral de la seguridad del producto, y para

valorar si sta es segura, resulta crtica la identificacin de patgenos relevantes,
incluida L. monocytogenes, en las materias primas y en el ambiente de produccin.
Es importante recordar que las desviaciones de las condiciones normales, tales como
un elevado nivel de contaminacin inicial de las materias primas, temperaturas
demasiado elevadas durante el almacenamiento y el transporte, o una vida til
demasiado larga, podran tener un impacto negativo significativo sobre la seguridad
del producto.
El objetivo de los estudios de vida til para L. monocytogenes es demostrar que el

ALC cumple con el lmite del criterio de seguridad alimentaria establecido para
este patgeno a lo largo de toda su vida til.
La determinacin de la vida til microbiolgica de los productos alimenticios siempre
debe incluir la consideracin de diferentes factores, tales como: sector alimentario,
tipo de producto y tipo de proceso. La variabilidad inherente de los lotes fabricados y
la variabilidad ligada a las especies de L. monocytogenes tambin debe tenerse en
cuenta, as como todas las condiciones razonablemente previsibles durante la
distribucin, el almacenamiento y el uso, incluidas aquellas aplicadas por los
consumidores.
La demostracin del cumplimiento y los estudios de vida til pueden realizarse de
diversas maneras, comenzando por comparar las caractersticas del producto con la
bibliografa cientfica disponible.
Se necesitan estudios complementarios cuando la comparacin de las caractersticas
del producto con la bibliografa cientfica disponible u otros datos no permite
proporcionar suficiente informacin para apoyar la evaluacin de la vida til. Estos
estudios pueden incluir microbiologa predictiva, el uso del histrico de datos
adecuado o la realizacin de pruebas laboratoriales especficas, como los estudios de
durabilidad y los ensayos de desafo. Cada una de estas herramientas tiene ventajas e
inconvenientes, y pueden combinarse entre s cuando sea necesario.
El Anexo 1 contiene un rbol de decisiones que muestra un planteamiento
esquemtico de los pasos a seguir para aplicar los estudios de vida til. El rbol
tambin indica a las empresas alimentarias cuando son necesarios estudios
complementarios especficos (p.e. estudios de durabilidad o ensayos de desafo) con
el fin de investigar el crecimiento (potencial) de L. monocytogenes en el alimento.
Para confirmar el mantenimiento de la vida til definida para cada producto, es
necesaria la vigilancia continua y la verificacin de la misma.
1. Evaluacin de la vida til combinando

diferentes herramientas
Se pueden distinguir dos tipos de planteamientos: el planteamiento del caso nico y el
planteamiento basado en el riesgo. En el Anexo 2 se recoge un rbol de decisiones
con ambos enfoques y ejemplos de su uso.
El planteamiento del caso nico considera que, en el caso de contaminarse, el
alimento contiene inicialmente un nmero dado de clulas bacterianas, que este
alimento tiene unas caractersticas fijas y que se almacena en condiciones estticas.
En general, este enfoque proporciona informacin limitada e inadecuada, ya que
estas condiciones no tienen en cuenta la variabilidad natural de los parmetros que
pueden tener un impacto en la contaminacin al final de la vida til.
De hecho, la contaminacin por L. monocytogenes puede tener distintas evoluciones
de acuerdo con:
El nivel de contaminacin inicial (concentracin inicial alta o baja).
El estado fisiolgico de las clulas contaminantes (estrs bacteriolgico
resultante en un mayor o menor periodo de latencia).
La capacidad de crecimiento de la cepa bacteriana contaminante del
alimento
Las caractersticas del alimento (variabilidad de pH y actividad de agua
dentro de un mismo lote y entre lotes diferentes), y
Las condiciones de almacenamiento desde la distribucin hasta el frigorfico
domstico.
Este planteamiento puede conducir a establecer una vida til:
Demasiado corta en el peor escenario posible, es decir, cuando las hiptesis
del estudio son excesivamente cautelosas (contaminaciones muy elevadas,
cepas de crecimiento ms rpido, ausencia de fase de latencia, alimento
que ms favorece el crecimiento, temperaturas de conservacin muy altas), o
Por el contrario, demasiado larga e insegura, p.e. cuando no se tienen en
cuenta las condiciones razonablemente previsibles de distribucin,
almacenamiento y uso.
En cualquier caso, este enfoque puede ser suficiente para demostrar que, en el peor
escenario posible, el alimento cumplir con el lmite al final de su vida til. Por tanto,
la empresa puede estimar la contaminacin final mxima al final de la vida til,
cuando la contaminacin inicial es mxima, con un mximo potencial de crecimiento
y en las peores condiciones de almacenamiento.
Si la contaminacin mxima estimada no excede el lmite, la vida til se puede
considerar segura. Por el contrario, si la contaminacin mxima estimada excede el
lmite, se debe acortar la vida til, o la empresa debe valorar la probabilidad de que
esta vida til supere el lmite y valorar si esta probabilidad es o no aceptable. En este
caso, se debe usar el planteamiento basado en el riesgo para estimar la distribucin
de la contaminacin al final de la vida til para todas las condiciones razonablemente
previsibles. La empresa tambin debera considerar mejorar las condiciones higinicas
de las instalaciones y/o el estado microbiolgico de los ingredientes, junto con la reevaluacin de la vida til.
2. Colaboracin entre empresas

alimentarias
Las empresas alimentarias pueden colaborar entre ellas y buscar el asesoramiento de
diversos laboratorios alimentarios (p.e. instituciones de investigacin o laboratorios de
referencia) cuando lleven a cabo estos estudios de vida til.
Con independencia de esta colaboracin, es importante que la empresa tenga en
cuenta el ambiente de cada planta individual de fabricacin. Las empresas que
elaboren productos similares en condiciones similares pueden usar los resultados de los
mismos estudios.
No obstante, el uso de un mismo estudio para productos obtenidos en diferentes
plantas requiere considerar los siguientes aspectos:
Los productos deben tener las mismas caractersticas (pH, aw, contenido en
sal, concentracin de conservantes, tipo de envasado, microflora asociada o
cualquier otra caracterstica importante para la supervivencia y el crecimiento
de L. monocytogenes). Si una o varias caractersticas difieren, los estudios no
pueden usarse sin evaluar el efecto de las diversas caractersticas en la
supervivencia y el crecimiento de L. monocytogenes.
La formulacin del producto debe ser la misma, y en caso contrario, debe

evaluarse los efectos de los ingredientes sobre el crecimiento de L.
monocytogenes.
El proceso de produccin debe ser similar. Las etapas del proceso se debe
comparar con detalle y debe evaluarse el efecto de cualquier diferencia
encontrada sobre la supervivencia y el crecimiento. Los estudios deben tener
en cuenta la variabilidad inherente ligada al producto.
Las condiciones de conservacin y la vida til deben ser similares, y en caso

contrario, hay que evaluar el efecto de las diferencias sobre el crecimiento de
L. monocytogenes, y
La microflora asociada (iniciadores) debe ser idntica, y en caso negativo,

tener el mismo efecto sobre L. monocytogenes.
La empresa debe demostrar a la autoridad competente que los productos y los

procesos de produccin son similares, y si los productos no son similares, la empresa
debe demostrar cuales son las diferencias y qu efectos tienen sobre la supervivencia
y el crecimiento de L. monocytogenes. La empresa puede emplear la bibliografa
cientfica disponible y datos de investigacin como consulta.
10
3. Documentacin de los estudios de vida

til
La empresa debe conservar la documentacin de los estudios de vida til y sus
verificaciones como parte de las PCH y procedimientos APPCC.
La documentacin debe incluir todos los datos necesarios que se hayan empleado
para determinar la vida til (caractersticas del producto, bibliografa cientfica usada,
tipos y resultados de otros estudios de vida til).
Es esencial que esta documentacin est disponible de forma inmediata, con el fin
de que la empresa pueda demostrar, a satisfaccin de la autoridad competente,
que sus alimentos listos para el consumo cumplen con el Reglamento comunitario
hasta el final de su vida til.
La empresa puede decidir el formato de esta documentacin.
11
Caractersticas del producto y

bibliografa cientfica
Dependiendo de cada situacin, estos estudios pueden ser suficientes para evaluar el
riesgo de los microorganismos patgenos; p.e., si el pH o la actividad de agua de un
alimento no permiten el crecimiento de un patgeno, la duracin de la vida
microbiolgica concernir a la higiene y no a seguridad de los alimentos.
Se contemplan dos tipos de estudios obligatorios iniciales:
1. Caractersticas fsico-qumicas
2. Bibliografa cientfica
12
Caractersticas del producto y bibliografa cientfica
1. Caractersticas fsico-qumicas
Para determinar la vida til de un ALC, es importante considerar si el alimento puede
favorecer la supervivencia o el crecimiento de L. monocytogenes, lo que depender
de las propiedades intrnsecas y extrnsecas del alimento:
1. Propiedades intrnsecas:
Caractersticas fsico-qumicas:
pH
aw
contenido en sal
concentracin de conservantes
humedad
estructura (slido, lquido)
Microflora habitual asociada (recuento total) o especfica (bacterias cidolcticas, Pseudomonas)
2. Propiedades extrnsecas:
Vida til prevista: tiempo y temperatura de conservacin
Sistema de envasado: aire, vaco, atmsfera modificada.
Condiciones razonablemente previsibles de almacn, transformacin y
consumo, incluidas las posibilidades de contaminacin
Las caractersticas ms importantes son el pH, la actividad de agua (aw) y el
tiempo/temperatura de conservacin, por lo que se deben describir y ser
representativas de la variabilidad del alimento. Adems, tambin pueden tener un
impacto importante los aditivos conservantes y la microflora protectora, incluyendo los
posibles cultivos iniciadores.
Conociendo estas caractersticas, la empresa alimentaria puede determinar si es
posible la supervivencia o el crecimiento de L. monocytogenes en un ALC concreto.
Esta informacin tambin podra ayudar a la empresa a reformular sus productos para
prevenir o minimizar la supervivencia o el crecimiento de L. monocytogenes.
La legislacin clasifica automticamente un ALC en la categora de alimentos que
NO pueden favorecer el crecimiento de L. monocytogenes cuando se cumple
alguna de las siguientes caractersticas:
con pH < 4,4

con aw < 0,92
con pH < 5,0 y aw < 0,94
con una vida til inferior a 5 das.
En el Anexo 8 se recopilan los valores de actividad de agua y de pH publicados para

distintos tipos de alimentos, a modo de ejemplos orientativos.
13
Caractersticas del producto y bibliografa cientfica
2. Bibliografa cientfica
Se dispone de una amplia fuente de datos sobre L. monocytogenes y vida til en libros,
revistas cientficas y publicaciones de universidades e instituciones tcnicas. Muchas
entidades nacionales, europeas (p.e. EFSA) e internacionales tambin disponen de
datos al respecto.
Cuando una empresa alimentaria ha establecido las caractersticas de su ALC y las
condiciones en las que se produce, envasa y almacena, puede comparar esta
informacin con los datos existentes en la bibliografa cientfica.
En la tabla 2 se recogen algunos lmites para la supervivencia y el crecimiento de L.
monocytogenes, basados en investigaciones llevadas a cabo principalmente en
laboratorio bajo condiciones ptimas, por lo que slo deben usarse como
estimaciones del impacto en los alimentos. Otros factores, o combinaciones de los
mismos, tambin podran ser relevantes, siempre que tengan justificacin cientfica.
Tabla 2. Algunos factores que afectan a la supervivencia y crecimiento de L. monocytogenes
Factores
Temperatura ( C)
pH **
Actividad de agua
(aw)
Concentracin de
sal (%) ***
Lmite inferior
-1.5 a +3.0
4.2 a 4.3
Puede crecer
ptimo (ms rpido)
30.0 a 37.0
7.0
Lmite superior
45.0
9.4 a 9.5
Puede sobrevivir *
(pero no crecer)
-18.0
3.3 a 4.2
0.90 a 0.93
0.99
> 0.99
< 0.90
< 0.5
0.7
12-16
> 20
Anaerobio facultativo (puede crecer en presencia y ausencia de oxgeno, p.e. en

envases al vaco o en atmsfera modificada)
Se requiere una combinacin de temperatura/tiempo de 70 C durante 2 minutos
Tratamiento trmico
para una reduccin D-6 (es decir, 106 o de 6 decimales) del nmero de clulas de L.
durante la
monocytogenes. Otras combinaciones tiempo/temperatura tambin podran lograr
elaboracin
la misma reduccin.
* El periodo de supervivencia variar dependiendo de la naturaleza del alimento y de otros factores.
** La inhibicin de L. monocytogenes depender del tipo de cido presente.
*** Basada en el porcentaje de cloruro sdico, fase acuosa.
Atmsfera
L. monocytogenes tiene unas caractersticas que aumentan su importancia como

microorganismo causante de enfermedades de origen alimentario. Es capaz de crecer
a 0 C, por lo que se reproduce bien en los alimentos refrigerados. Tambin puede
sobrevivir en ambientes hostiles, como desecados y salados. Adems, es capaz de
crecer con bajas concentraciones de oxgeno, e incluso sin oxgeno disponible, lo que
le supone una ventaja en los envases al vaco.
14
Estudios complementarios
Se realizarn tomando como base las caractersticas del producto y la bibliografa
cientfica, y tendrn en cuenta la variabilidad inherente al producto, los
microorganismos en cuestin y las condiciones de transformacin y almacenamiento.
Se contemplan tres tipos de estudios:
1. Histrico de datos
2. Microbiologa predictiva (modelos matemticos)
3. Pruebas de laboratorio especficas:
3.1.
Estudios de durabilidad
3.2.
Ensayos de desafo
De forma general, las pruebas realizadas en laboratorio pueden no ser totalmente
representativas del alimento real. Por tanto, con frecuencia en la prctica resulta de
inters utilizar estas fuentes asociadas, dadas las limitaciones de cada una de ellas.
15
1. Histrico de datos
El histrico de datos forma parte de los registros que deben guardar las empresas
alimentarias. Algunos de estos datos se registran como parte de las obligaciones
legales de las empresas en el marco de la legislacin sobre seguridad alimentaria,
como la trazabilidad, los sistemas APPCC y los planes de autocontroles, incluyendo la
calidad de las materias primas, el muestro de superficies y reas de procesado (para
demostrar la eficacia del plan de limpieza y desinfeccin de la fbrica) y el anlisis de
alimentos, en particular en el da de fabricacin y al final de su vida til (para verificar
el funcionamiento eficaz del sistema APPCC y para verificar la duracin de la vida til,
respectivamente).
El histrico de datos es til para determinar la vida til de los ALC por las siguientes
razones:
El histrico de datos indica los niveles de L. monocytogenes que se

encuentran en el ambiente de produccin, las materias primas y los ALC
existentes, bajo las prcticas correctas de higiene y sistemas APPCC vigentes
en las empresas.
El histrico de datos sobre los niveles de L. monocytogenes existentes en los

ALC al principio y al final de la vida til pueden emplearse para valorar su
potencial de crecimiento en ALC similares, con caractersticas intrnsecas
comparables (pH, aw, microflora, etc.), producidos bajo condiciones
prcticamente idnticas.
El histrico de datos sobre los niveles de L. monocytogenes existentes en los

ALC al principio y al final de la vida til tambin se emplean mucho en la
prctica para verificar la duracin del alimento y confirmar que la vida til
establecida es apropiada cuando se almacena, manipula y utiliza de forma
razonablemente previsible, y
El histrico de datos generado durante un periodo de tiempo para ALC

comparables y que continan generndose con una frecuencia regular
puede usarse para un anlisis de tendencias. Cuando los niveles de L.
monocytogenes en ALC al final de la vida til son consistentemente bajos o
ausentes, y no se han obtenido resultados superiores a 100 ufc/g, estos datos
pueden usarse en combinacin con datos de muestreo de superficies y de
calidad de materias primas para proporcionar un nivel suficiente de confianza
en que dichos ALC no poseen un riesgo para la salud pblica. El nivel de
confianza aumenta con la cantidad de datos disponible. Cuantas ms
unidades del alimento se hayan analizado, ms fiable ser el histrico de
datos.
Las empresas alimentarias deben garantizar, a satisfaccin de las autoridades

competentes, que su histrico de datos es suficiente para demostrar que los ALC no
excedern el lmite de 100 ufc/g durante la vida til. Las autoridades competentes
pueden requerir que estos datos se completen con otros estudios complementarios.
16
2. Microbiologa predictiva (Modelos

matemticos)
La microbiologa predictiva (modelos matemticos) tiene como objetivo predecir el
comportamiento de los microorganismos en los alimentos durante su fabricacin o
almacenamiento. Se basa en el desarrollo de ecuaciones matemticas que permiten
simular y prever el comportamiento de la flora alterante y de los patgenos en los
productos alimenticios. En aos recientes ha habido avances significativos en este
campo, en especial para estimar el crecimiento de L. monocytogenes en los
alimentos.
Los parmetros de las ecuaciones matemticas se pueden haber determinado a partir
de pruebas realizadas con los alimentos, o a partir de curvas de crecimiento en medios
lquidos, o lo ms frecuente, a partir de ambas fuentes:
Los modelos obtenidos en medios microbiolgicos lquidos se usan para

describir el posible impacto de varios factores; algunos pueden no describir
con precisin el comportamiento microbiano en el alimento, ya que, en un
medio lquido, las bacterias ocupan la totalidad del volumen, mientras que en
el interior de un alimento slido, forman unas colonias de volumen limitado; los
modelos ms robustos han sido validados en alimentos.
Los modelos desarrollados en alimentos pueden describir eficazmente el

impacto de las condiciones de conservacin en un alimento especfico, pero
es cuestionable su capacidad para describir el impacto de la variabilidad de
las caractersticas fsico-qumicas del alimento o para hacer predicciones en
otros alimentos.
Tambin se han desarrollado algunos modelos intermedios, para tratar de

superar las limitaciones de estos dos acercamientos principales.
Los datos y modelos disponibles en la bibliografa se han incorporado a programas

informticos de uso amigable, algunos de los ampliamente utilizados y gratuitos son:
Growth Predictor, del Instituto de Investigacin en Alimentos del Reino Unido.
Pathogen Modelling Programme, del Departamento de Agricultura de Estados

Unidos
ComBase Predictor, resultado de la colaboracin entre Reino Unido, Estados

Unidos y Australia.
Algunos de estos modelos se han desarrollado para predecir el comportamiento del

microorganismo cuando se conocen las caractersticas fsico-qumicas del alimento
(p.e. pH, actividad de agua, concentraciones de cidos orgnicos) y la temperatura
de conservacin. Otros modelos se han desarrollado para predecir el comportamiento
de los microorganismos en alimentos particulares, cualquiera que sean sus condiciones
de conservacin. El Anexo 3 muestra un ejemplo del uso de la microbiologa
predictiva.
17
Siempre que se conozcan sus limitaciones y sea usados con precaucin por personal
experto, los modelos predictivos son una valiosa herramienta para estimar el
crecimiento de L. monocytogenes en los alimentos:
Los modelos crecimiento/no crecimiento, que predicen la probabilidad de

crecimiento de L. monocytogenes en alimentos, pueden ayudar a las
empresas alimentarias a categorizar sus ALC.
Los modelos que predicen los tiempos de latencia y la velocidad de

crecimiento en alimentos pueden ayudar a las empresas alimentarias a
evaluar el crecimiento de L. monocytogenes en los alimentos durante su
conservacin, teniendo en cuenta la variabilidad de las cepas, el procesado
inherente y la variabilidad del alimento y de las condiciones de conservacin.
En la prctica, la microbiologa predictiva puede ser til para las siguientes

aplicaciones:
Predecir en crecimiento bacteriano en distintas condiciones.

Predecir la probabilidad de crecimiento del microorganismo en el
alimento.
Estimar el nivel de contaminacin en un da dado de la vida til.
Probar la variabilidad entre dos lotes.
Optimizar la formulacin (aditivos, pH, sal) para garantizar una mejor
estabilidadEvaluar el impacto de las roturas de la cadena del fro, y probar diferentes
escenarios de conservacin.
Ayudar a identificar Puntos de Control Crticos de un proceso.
18
3. Pruebas de laboratorio especficas

Las empresas alimentarias deben escoger las pruebas microbiolgicas a realizar, en
colaboracin con el laboratorio que las llevar a cabo. La eleccin debe estar guiada
por la informacin a obtener, segn se ilustra en la figura 1.
Algunas reglas bsicas para la eleccin son:
Es probable que los ensayos de desafo para valorar el potencial de

crecimiento sean la primera opcin en la mayora de los casos, en especial
para diferenciar entre alimentos que pueden o no favorecer el crecimiento
de L. monocytogenes.
Los ensayos de desafo para valorar la velocidad mxima de crecimiento

deberan considerarse en su mayora como la segunda opcin, en casos
especficos en los que es de esperar que sea til la informacin que facilitan.
Se requieren conocimientos bsicos de microbiologa predictiva para
interpretar sus resultados.
Los estudios de durabilidad son particularmente apropiados cuando la

prevalencia de L. monocytogenes es elevada.
Estudios de durabilidad
(contaminacin natural)
Ensayos de desafo
(contaminacin artificial)
ALC que no
favorece el
crecimiento
de L.m
Concentracin
final de L.m
Proporcin de
unidades > 100
ufc/g al final de
la vida til
ALC que
favorece el
crecimiento de
(potencial de
crecimiento)
Concentracin
inicial de L.m
Concentracin
final de L.m
Ensayos de desafo max

(contaminacin artificial)
max (velocidad mxima de

crecimiento)
Crecimiento de L.m durante vida

til
Concentracin inicial
de L.m
Concentracin
inicial de L.m
para cumplir el
lmite de 100
ufc/g al final de la
vida til
Concentracin
de L.m en un
da dado
Figura 1. Datos obtenidos de los ensayos de desafo y los estudios de durabilidad
19
Concentracin
de L.m en un
da dado
Concentracin
final de L.m
3.1. Estudios de durabilidad

Los estudios de durabilidad permiten evaluar el crecimiento de L. monocytogenes en
un alimento contaminado de forma natural durante su conservacin en condiciones
razonablemente previsibles. Consisten en someter al alimento a las condiciones de
tiempo y temperatura que correspondan con las razonablemente previsibles de
transporte, de distribucin y de empleo por el consumidor final. Al final de la vida
microbiolgica, se verifica que los microorganismos de inters no sobrepasan los lmites
reglamentarios.
Los estudios de durabilidad pueden considerarse ms realistas que los ensayos de
desafo para los alimentos individuales, ya que se trata de una contaminacin
presente de forma natural. Cuando se realizan en el marco de los autocontroles, son
tiles para vigilar la calidad sanitaria del conjunto de la cadena de produccin.
No obstante, los estudios de durabilidad tienen las siguientes limitaciones:
Si en el alimento contaminado de forma natural la distribucin de los
microorganismos es heterognea, no se puede cuantificar con precisin la
evolucin (positiva o negativa) de su nmero. La comparacin de los
recuentos obtenidos al principio y al final de la vida del alimento solo permiten
una aproximacin global a la evolucin de las poblaciones en el curso de la
duracin de la vida til. Esta limitacin puede compensarse mediante la
acumulacin de resultados.
Si el porcentaje de productos contaminados de forma natural por el
microorganismo de inters es escaso, o si el nivel de contaminacin inicial es
escaso en la gran mayora de los productos, pero mucho ms elevado en
algn producto en raras ocasiones, sera necesario un gran nmero de
pruebas (quizs un nmero irrealizable) para obtener una informacin
utilizable.
Es difcil probar el conjunto de las condiciones previsibles (todos los perfiles
trmicos, todas las formulaciones...), as como tener en cuenta la variabilidad
de los productos de un lote a otro, e incluso dentro de un mismo lote.
La interpretacin de los resultados puede ser difcil debido a la baja probabilidad de
analizar una unidad contaminada, el muy escaso nmero de L. monocytogenes
presente inicialmente y a la distribucin heterognea en el alimento.
En consecuencia, los estudios de durabilidad pueden usarse cuando L.
monocytogenes se detecta de forma rutinaria en el alimento analizado al final de
proceso de fabricacin (estudios de durabilidad con cuantificacin inicial).
En otros casos, esta verificacin no permite saber si el cumplimiento de los lmites se
debe a la ausencia inicial del microorganismo, a su presencia en una fase de
crecimiento lento, a una falta de crecimiento, o incluso hasta a una mortalidad. Por
ello, podra ser necesario un ensayo de desafo para recoger la informacin necesaria
para establecer la vida til y asegurar el cumplimiento del lmite de 100 ufc/g al final
de la vida til del alimento.
Para realizar un estudio de durabilidad se tienen que considerar el mtodo de
muestreo, las condiciones de almacenamiento y el mtodo de recuento para L.
monocytogenes. El protocolo para realizarlo se describe en el Anexo 4.
20
3.2. Ensayos de desafo

Estas pruebas permiten conocer la evolucin cuantitativa, en el transcurso del tiempo,
de un inculo de la especie bacteriana estudiada, aadido voluntariamente al
alimento. Por tanto, estas pruebas permiten cuantificar el crecimiento bacteriano en
sentido estricto.
Los ensayos de desafo pueden aportar informacin sobre el comportamiento de L.
monocytogenes cuando se incorpora de forma artificial en un alimento, bajo unas
condiciones de conservacin dadas. Pueden tener en cuenta la variabilidad de los
alimentos (usando diferentes lotes) y las contaminacin especfica del alimento
(inoculando cepas aisladas del alimento).
Los ensayos de desafo pueden realizarse con dos objetivos diferentes: valorar el
potencial de crecimiento (es decir, la capacidad de L. monocytogenes para crecer
en el alimento), o bien estimar parmetros de este crecimiento (p.e. velocidad
mxima de crecimiento).
No obstante, en estas pruebas resulta difcil imitar el nivel de contaminacin y su
distribucin heterognea, y el estado fisiolgico de las bacterias. En concreto, tienen
las siguientes limitaciones:
Resulta complicado reproducir las peculiaridades de una contaminacin

natural de forma artificial: puede suceder que el inculo no tenga ningn
competidor, por ejemplo cuando se inoculan cepas bacterianas purificadas
en un producto que ha sido sometido a tratamiento trmico; en general, se
requiere una concentracin bacteriana ms elevada que en la
contaminacin natural; y la inoculacin no permite siempre reproducir la
distribucin espacial ni el estado fisiolgico de las clulas (p.e. como
consecuencia de un estrs) en el alimento contaminado de forma natural.
Es difcil reproducir los cambios que tienen lugar en los productos alimenticios
que evolucionan a lo largo de su vida microbiolgica.
Como en los estudios de durabilidad, es difcil probar el conjunto de las

condiciones previsibles (todos los perfiles trmicos posibles, todas las
formulaciones...), as como tener en cuenta la variabilidad de los productos
de un lote a otro, e incluso dentro de un mismo lote.
21
3.2.1. Ensayos de desafo para el potencial de crecimiento
Un ensayo de desafo microbiolgico para valorar el potencial de crecimiento () es
un estudio laboratorial que mide el crecimiento de L. monocytogenes en un alimento
contaminado artificialmente, conservado en las condiciones previsibles de transporte,
distribucin y almacenamiento.
Un ensayo de desafo microbiolgico debe reflejar las condiciones reales esperables a
lo largo de la cadena del fro, incluyendo las condiciones de conservacin desde la
produccin hasta el consumo.
El potencial de crecimiento () es la diferencia entre el log10 ufc/g al final de la prueba
y el log10 ufc/g al principio de la misma. Los resultados experimentales pueden mostrar
una amplia dispersin, sobre todo porque se incluye la fase de latencia.
El potencial de crecimiento depende de muchos factores, entre los cuales la
temperatura es el que ms influye sobre el crecimiento de L. monocytogenes en un
alimento dado:
La(s) cepa(s) inoculada(s)
el estado fisiolgico de las cepas inoculadas
las propiedades intrnsecas del alimento (p.e. pH, contenido de NaCl, aw,
contenido nutricional, microflora asociada, constituyentes antimicrobianos)
las propiedades extrnsecas (p.e. perfil tiempo/ temperatura, atmsfera).
En el marco del Reglamento (CE) n 2073/2005, el potencial de crecimiento puede
utilizarse para:
Clasificar un alimento:
o Cuando > 0.5 log10 ufc/g, el alimento se clasifica como Alimento
listo para el consumo que puede favorecer el crecimiento de L.
monocytogenes, distinto de alimentos destinados a lactantes y a
usos mdicos especiales (categora 1.2).
o Cuando < 0.5 log10 ufc/g, el alimento se clasifica como Alimento
listo para el consumo que NO puede favorecer el crecimiento de L.
monocytogenes, distinto de alimentos destinados a lactantes y a
usos mdicos especiales (categora 1.3).
Cuantificar el comportamiento de L. monocytogenes en un alimento de la

categora 1.2, de acuerdo con las condiciones definidas como
razonablemente previsibles entre la produccin y el consumo.
Calcular la concentracin de L. monocytogenes en el punto de

produccin, que no conducira a superar el nivel de 100 ufc/g al final de la
vida til (es decir, fijar un lmite intermedio entre ausencia en 25 g y 100
ufc/g)
Las ventajas principales de este mtodo son su relativa facilidad de ejecucin y que
los resultados se pueden aplicar directamente (ver arriba).
22
Su inconveniente es la falta de flexibilidad en la interpretacin: los resultados solo son
vlidos para el alimento estudiado en las condiciones estudiadas, por lo que hay que
realizar nuevas pruebas cada vez que haya un cambio (p.e. modificacin de la
receta, uso de diferentes perfiles tiempo/temperatura.). Adems, el potencial de
crecimiento cubre en general un largo periodo de tiempo (p.e. toda la vida til) y por
lo tanto no puede usarse para predecir el crecimiento durante un periodo de tiempo
limitado.
Para realizar un ensayo de desafo que valore el potencial de crecimiento, se deben
considerar como mnimo los siguientes factores:
Caractersticas del alimento, incluida la vida til
Nmero de lotes
Eleccin de cepa(s)
Preparacin del inculo
Preparacin e inoculacin de las unidades de prueba
Condiciones de conservacin
Medicin de caractersticas fsico-qumicas
Anlisis microbiolgicos
Clculo del potencial de crecimiento
El protocolo de trabajo para los laboratorios se describe en el Anexo 5, junto con
algunos ejemplos.
23
3.2.2. Ensayos de desafo para la velocidad mxima de crecimiento
Un ensayo de desafo microbiolgico para valorar la velocidad mxima de
crecimiento es un estudio laboratorial que mide la velocidad de crecimiento de L.
monocytogenes en un alimento inoculado artificialmente, conservado a una
temperatura apropiada. La temperatura usada en la prueba no tiene que ser
(necesariamente) la misma usada para las predicciones, ya que el posible predecir el
crecimiento a otra temperatura distinta de la probada, o a lo largo de un perfil
tiempo-temperatura elegido para ser representativo de las condiciones previsibles de
transporte, distribucin y almacenamiento.
Una vez realizada la prueba, la velocidad mxima de crecimiento de la cepa de L.
monocytogenes estudiada a la temperatura estudiada se calcula a partir de la curva
de crecimiento. En la fase de crecimiento exponencial, el trazado del logaritmo
natural del nmero de clulas en funcin del tiempo produce una lnea recta. La
pendiente de esta lnea es la max.
La velocidad mxima de crecimiento es un parmetro importante de la curva de
crecimiento, que depende de:
La(s) cepa(s) inoculada(s)
las propiedades intrnsecas del alimento (p.e. pH, contenido de NaCl, aw,
contenido nutricional, microflora asociada, constituyentes antimicrobianos)
las propiedades extrnsecas (p.e. perfil tiempo/ temperatura, atmsfera).
Por lo tanto, usando la ecuacin sugerida en este documento, es posible extrapolar
esta max a una temperatura para predecir otros valores max a distintas temperaturas
en el mismo alimento.
Los ensayos de desafo para calcular la velocidad mxima de crecimiento
permiten:
Estimar la concentracin de L. monocytogenes en un da determinado de

la vida til, si se conoce la concentracin inicial.
Estimar la mxima concentracin permisible de L. monocytogenes en un

alimento que puede estar presente el da de la produccin, con el fin de
cumplir con el lmite de 100 ufc/g al final de la vida til (es decir, fijar lmites
Estas pruebas son ms caras y requieren ms tiempo, por lo que se limitarn a los casos
en que sea de utilidad aplicar microbiologa predictiva obtener las estimaciones arriba
descritas, y se llevarn a cabo preferentemente por laboratorios con experiencia en
microbiologa predictiva.
Los inconvenientes de las pruebas para valorar el potencial de crecimiento se pueden
solventar combinando modelos microbiolgicos predictivos y ensayos de desafo para
valorar la velocidad mxima de crecimiento (max).
En el Anexo 6 se describe el protocolo para realizar estas pruebas y ejemplos de las
mismas.
24
Bibliografa
AESAN, 2011. Informe del Comit Cientfico de la AESAN en relacin a los estudios de vida til
para Listeria monocytogenes en determinados productos alimenticios.
http://www.aesan.msssi.gob.es/AESAN/docs/docs/evaluacion_riesgos/comite_cientifico/LISTERIA
_M.VIDA_UTIL.pdf
AFSSA, 2005. Avis n 2003-SA-0362 de lAgence franaise de scurit sanitaire des aliments sur la
rvision de lavis 2000-SA-0094 sur la classification des aliments au regard du risque reprsent par
Listeria monocytogenes et les protocoles de tests de croissance. Disponible en francs en:
http://www.anses.fr/Documents/MIC2003sa0362.pdf
DOCE, 2005. Reglamento (CE) n 2073/2005 de la Comisin, de 15 de noviembre de 2005, relativo
a los criterios microbiolgicos aplicables a los productos alimenticios. DOCE L 338 de 22.12.2005.
Modificado por:
Reglamento (CE) no 1441/2007 de la Comisin de 5 de diciembre de 2007 (DOCE L 322
de 7.12.2007)
Reglamento (UE) no 365/2010 de la Comisin de 28 de abril de 2010 (DOCE L 107 de
29.4.2010)
Versin consolidada disponible en castellano en: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2005R2073:20100519:ES:PDF
CausasCientia. Calculadora disponible en ingls en:
http://www.causascientia.org/math_stat/ProportionCI.html
CE, 2008 a. Commission Staff Working Document.- Guidance Document on Listeria
monocytogenes shelf-life studies for ready-to-eat foods, under Regulation (EC) N 2073/2005 of 15
November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs. Disponible en ingles en:
http://ec.europa.eu/food/food/biosafety/salmonella/docs/guidoc_listeria_monocytogenes_en.p
df
CE, 2008 b. Technical Guidance Document On shelf-life studies for Listeria monocytogenes in
ready-to-eat foods. Working Document. Version 2 November 2008. Disponible en ingls en:
http://ec.europa.eu/food/food/biosafety/salmonella/docs/shelflife_listeria_monocytogenes_en.
pdf
Codex Alimentarius, 2004. Directrices generales sobre muestreo. CAC/GL 50-2004. Disponible en
castellano en: http://www.codexalimentarius.net/download/standards/10141/CXG_050s.pdf
ComBase Predictor. Agencia de Estndares de Alimentos (FSA), Reino Unido; Instituto de
Investigacin en Alimentos (IFR), Reino Unido; Servicio de Investigacin Agrcola del
Departamento de Agricultura (USDA ARS) y su Centro Regional del Oriente (ERRC), Estados
Unidos; y Centro Australiano de Excelencia en Inocuidad Alimentaria, Australia.
Disponible en castellano en: http://www.combase.cc/predictor.html
Growth Predictor. Instituto de Investigacin en Alimentos (IFR- Institute of Food Research), Reino
Unido. Disponible en ingls en: http://www.ifr.ac.uk/safety/growthpredictor/)
MicroFit. Disponible en ingls en: http://www.ifr.ac.uk/microfit/
Pathogen Modelling Programme. Departamento de Agricultura (USDA), Estados Unidos.
Disponible en ingls en: http://ars.usda.gov/Services/docs.htm?docid=11550)
Ratkowsky et al., 1982. Relationship Between Temperature and Growth Rate of Bacterial Cultures.
Journal of Bacteriology, Jan. 1982, p. 1-5
Zwietering et al., 1996. Model for the Combined Effects of Temperature, pH, and Sodium Lactate
on Growth Rates of Listeria innocua in Broth and Bologna-Type Sausages. Applied and
Environmental Microbiology, May 1996, p. 16161622
25
Anexos
26
Anexo 1. rbol de decisiones para realizar estudios de vida til

1. El productor o el fabricante destina el alimento para su
consumo directo sin necesidad de cocinado u otro procesado
eficaz para eliminar o reducir L. monocytogenes a un nivel
aceptable?
NO
S (o dudoso)
El alimento no es un ALC, por lo que no se

le aplican los criterios de L.
monocytogenes.
La seguridad del alimento se gestiona
mediante PCH y procedimientos basados
en APPCC.
2. El ALC pertenece a la categora de alimentos en la cual es bastante

probable la ausencia de L. monocytogenes o su crecimiento limitado? En
circunstancias normales, esto se aplica a:
Productos que hayan recibido tratamiento trmico u otro procesado

eficaz para eliminar L. monocytogenes, cuando la recontaminacin no
sea posible tras este tratamiento (p.e. productos tratados trmicamente
en su envase final).
Frutas y hortalizas frescas, enteras y no transformadas, excluidas las

semillas germinadas.
Pan, galletas y productos similares.
Aguas embotelladas o envasadas, bebidas refrescantes sin alcohol,

cerveza, sidra, vino, bebidas espirituosas y productos similares.
Azcar, miel y golosinas, incluidos productos de cacao y chocolate.
Moluscos bivalvos vivos.
Sal de cocina.
NO (o dudoso)
3. El producto est destinado a lactantes o a usos mdicos especiales?
NO
4. Comparando las caractersticas del producto con la
bibliografa cientfica hay evidencias de que L. monocytogenes no
crece en el producto? Esto incluye, p.e.:
Productos con pH < 4.4 aw < 0.92
Productos con pH < 5.0 y aw < 0.94
Productos con vida til inferior a 5 das
Productos congelados
Otras categoras de productos tambin pueden pertenecer a esta
categora, siempre que se justifique cientficamente.
NO
5. Se ha realizado una microbiologa
predictiva (modelos) adecuada?
NO
6. Hay un histrico de datos
apropiado sobre el crecimiento de L.
monocytogenes en el producto y/o se
han realizado pruebas de durabilidad
segn se describe en la Gua?
NO
7. Se ha realizado un ensayo de
desafo segn se describe en la Gua?
Hay evidencias de que

podran superarse las 100
ufc/g antes del fin de la vida
til si se presenta inicialmente
en el alimento.
Hay evidencias de que no se
superarn las 100 ufc/g antes
del fin de la vida til si se
presenta en el alimento.
No hay potencial de
crecimiento o es limitado.
Hay potencial de crecimiento.
NO
La valoracin de la vida til es insuficiente y el productor no puede
demostrar que no se superarn las 100 ufc/g al final de la misma. Si no se
sabe si los productos son seguros, no se deberan comercializar. El productor
debe asegurar que no hay contaminacin por L. monocytogenes a partir de
las materias primas o el ambiente de produccin. Revisin y mejora del
proceso de produccin, de acuerdo con los principios APPCC. Sin perjuicio
de las posibles medidas a tomar con los productos comercializados, el
alimento debe cumplir con el lmite de ausencia en 25 g antes de que haya
salido del productor.
27
En circunstancias normales, no
se exige realizar pruebas
regulares con respecto a los
criterios de L. monocytogenes.
La seguridad del alimento se
gestiona con la vigilancia del
proceso de produccin
mediante PCH y
procedimientos basados en
APPCC
Ver criterio especfico en

Reglamento (CE) n 2073/2005
Lmite de 100 ufc/g en productos

comercializados durante vida til.
De acuerdo con los procedimientos
basados en APPCC, la vigilancia
debera centrarse en los PCC fijados
(p.e. factores intrnsecos del producto,
nivel de contaminacin de
ingredientes, condiciones de
procesado especficas). Verificacin
de acuerdo con PCH y APPCC.
El proceso de produccin o la
valoracin de la vida til no estn
bajo control. El productor debe
asegurar que no hay contaminacin
por L. monocytogenes a partir de las
materias primas o del ambiente de
produccin. Si no se sabe si los
productos son seguros, no deberan
comercializarse. Revisin y mejora
del proceso de produccin, de
acuerdo con los principios APPCC y
revisin de la vida til.
Lmite de 100 ufc/g para los
productos comercializados durante
su vida til. Verificacin de acuerdo
con PCH y principios APPCC
El productor debe asegurar que no
hay contaminacin por L.
monocytogenes a partir de las
materias primas o el ambiente de
produccin. Adems, la duracin de
la vida til debe ajustarse para no
superar las 100 ugc/g al final. La vida
til de los productos depende del
factor de crecimiento y del nivel
posible de contaminacin por L.
monocytogenes en el producto
Anexo 1
EJEMPLO DE APLICACIN DEL RBOL
Pregunta 1:
La primera pregunta a responder por la empresa es si hay evidencias de que el
alimento ser cocinado o procesado de forma eficaz para eliminar o reducir L.
monocytogenes a un nivel aceptable antes del consumo. En este caso, al alimento no
le es de aplicacin ningn criterio especfico en relacin con L. monocytogenes, ya
que no se considera un ALC. La seguridad alimentaria debera gestionarse aplicando
PCH y procedimientos basados en el APPCC, lo cuales deberan incluir el control del
estado microbiolgico de las materias primas, minimizar la contaminacin inicial a nivel
de fabricacin, control del proceso de produccin, etc.
Pregunta 2:
La segunda pregunta a responder por la empresa es si hay evidencias de la probable
ausencia de L. monocytogenes en el alimento o de su crecimiento limitado.
En circunstancias normales, de acuerdo con la nota al pie 4 del Anexo I del
Reglamento CE n 2073/2005, los siguientes ALC se incluyen en este grupo:
Productos que hayan recibido tratamiento trmico u otro procesado eficaz
para eliminar L. monocytogenes, cuando la recontaminacin no sea posible
tras este tratamiento (p.e. productos tratados trmicamente en su envase
final).
Frutas y hortalizas frescas, enteras y no transformadas, excluidas las semillas
germinadas.
Pan, galletas y productos similares.
Aguas embotelladas o envasadas, bebidas refrescantes sin alcohol, cerveza,
sidra, vino, bebidas espirituosas y productos similares.
Azcar, miel y golosinas, incluidos productos de cacao y chocolate.
Moluscos bivalvos vivos.
Sal de cocina.
Para estos productos, no se exige realizar pruebas regulares de L. monocytogenes. La
seguridad alimentaria se gestiona vigilando los PCC del proceso de produccin (p.e.
tratamiento trmico). Las pruebas de L. monocytogenes al final de la vida til pueden
usarse para verificar la eficacia del plan APPCC.
Pregunta 3:
Cuando se producen o manipulan productos destinados a lactantes o a usos mdicos
especiales, se debe aplicar un criterio especfico para L. monocytogenes (ausencia en
25 g, n = 10, c = 0).
28
Anexo 1
Pregunta 4:
Si la empresa tiene evidencias cientficas de que L. monocytogenes no crece en el
producto, se debe aplicar el lmite de 100 ufc/g cuando el producto est
comercializado.
De acuerdo con la nota al pie 8 del Anexo I del Reglamento (CE) n 2073/2005, los
siguientes productos se podran incluir directamente en este grupo:
Productos con pH < 4.4 aw < 0.92
Productos con pH < 5.0 y aw < 0.94
Productos con vida til inferior a 5 das
Otros productos cientficamente justificados, como los productos congelados
Tambin se considera que no son capaces de favorecer el crecimiento de L.
monocytogenes los productos mencionados en la nota al pie 4 del Reglamento (ver
pregunta 2).
Otras categoras de productos tambin pueden pertenecer a esta categora, siempre
que se justifique cientficamente.
De acuerdo con los procedimientos APPCC, la seguridad alimentaria se debera
gestionar mediante la vigilancia de los PCCs fijados (p.e. vigilancia de los factores
intrnsecos del producto, como aw y pH). El control del nivel de contaminacin inicial
de materias primas e ingredientes, y las PCH (contaminacin cruzada, etc.) tienen que
garantizar que el nivel de L. monocytogenes no exceder las 100 ufc/g durante la vida
til del producto.
Preguntas 5 y 6:
Cuando no pueda excluirse el crecimiento de L. monocytogenes en el producto en
base a justificaciones cientficas o segn lo establecido en las notas al pie 4 y 8 del
Reglamento, la empresa debe realizar estudios complementarios para investigar el
cumplimiento de los criterios a lo largo de toda la vida til, usando el histrico de
datos, microbiologa predictiva, estudios de durabilidad o ensayos de desafo.
Cuando estos estudios se hayan realizado segn lo descrito en la Gua y haya datos
adecuados de que el alimento no superar las 100 ufc/g de L. monocytogenes al final
de su vida til, la empresa habr sido capaz de demostrar el cumplimiento de este
lmite. La seguridad alimentaria debera gestionarse aplicando PCH e implantando y
vigilando PCCs apropiados, y controlando el nivel de contaminacin inicial de
materias primas e ingredientes. Las pruebas de L. monocytogenes se deberan usar
para verificar las PCH y los procedimientos basados en el APPCC.
Cuando los datos indiquen que es probable exceder el lmite de 100 ufc/g al final de la
vida til, la empresa no puede demostrar que cumple el Reglamento y, de acuerdo
con los principios APPCC, el proceso de produccin y la determinacin de la vida til
inicial deben revisarse y mejorarse. Esto debe incluir el control de la calidad
microbiolgica de materias primas e ingredientes, la reduccin del potencial de
crecimiento de L. monocytogenes, el ajuste de factores intrnsecos del producto final,
tratamiento trmico adicional, etc.
29
Anexo 1
Pregunta 7:
Cuando se haya realizado un ensayo de desafo segn se describe en la Gua y no se
haya encontrado ningn potencial de crecimiento durante la vida til estimada, se
debe aplicar un lmite de 100 ufc/g a este producto. La seguridad alimentaria debera
gestionarse aplicando PCH y procedimientos basados en el APPCC. Las pruebas de L.
monocytogenes con respecto a este criterio deben usarse como verificacin de las
PCH y los procedimientos basados en APPCC.
Cuando el ensayo de desafo evidencie que hay un potencial de crecimiento de L.
monocytogenes, la empresa debe ajustar la vida til para garantizar el cumplimiento
del lmite de 100 ufc/g durante toda la vida til. Las pruebas de L. monocytogenes con
respecto a este criterio deben usarse como verificacin de las PCH y los
procedimientos basados en los principios del APPCC.
Cuando no se disponga de informacin sobre el producto y el posible crecimiento de
L. monocytogenes en el mismo, no se puede garantizar el cumplimiento del criterio de
L. monocytogenes, y por tanto, la seguridad del producto. En este caso, se tiene que
revisar y mejorar el proceso de produccin, incluyendo las especificaciones de
materias primas, ingredientes, etc., de acuerdo con los principios APPCC. La empresa
debe cumplir con el lmite de ausencia en 25 g antes de que el producto salga del
productor.
30
Anexo 2. rbol de decisiones para valorar la vida til

1. Cul es la mxima contaminacin por L. monocytogenes al final de la vida til en un planteamiento de caso
nico en las peores condiciones?
Acercamiento de caso nico en las peores condiciones
Contaminacin inicial mxima

o
Deducida a partir de:
- Histrico de datos Y/O datos de estudios
Peores condiciones de conservacin

o
Deducidas a partir de:
- Datos de estudios
Mximo potencial de crecimiento (mnima fase de latencia y mxima velocidad de crecimiento)

o
Deducido a partir de:
- Caractersticas del producto ms favorables al crecimiento Y
- Bibliografa cientfica O microbiologa predictiva O ensayos desafo.
2. La mxima contaminacin por L.

monocytogenes al final de la vida til est por
debajo del lmite?
3. Esta estimacin se confirma con histrico de datos

(sin resultados superiores al lmite en estudios de
durabilidad)?
S
NO
NO
Revisar el acercamiento
del peor caso
La vida til es
segura
4. Cul es la distribucin de la contaminacin por L. monocytogenes al final de la vida til?

Acercamiento basado en el riesgo
Distribucin de la contaminacin inicial

o
Deducida a partir de:
- Histrico de datos Y/O datos de estudios
Distribucin de las condiciones de conservacin

o
Deducidas a partir de:
- Datos de estudios
Distribucin del potencial de crecimiento (distribucin de fase de latencia y velocidad de crecimiento)

o
Deducido a partir de:
- Caractersticas del producto Y
- Bibliografa cientfica O microbiologa predictiva O ensayos desafo
5. La probabilidad de que la contaminacin por L. monocytogenes al final de la vida til supere el lmite se
confirma con el histrico de datos y/o estudios de durabilidad?
S
NO
Revisar el acercamiento
basado en el riesgo
6. La probabilidad de superar el lmite es

aceptable?
S
NO
La vida til es
segura
Hay que acortar la

vida til
31
Anexo 2
EJEMPLOS DE VALORACIN DE VIDA TIL COMBINANDO DIFERENTES HERRAMIENTAS
A continuacin se describen las caractersticas del producto usado en los ejemplos 1-3:
pH medio = 5.97 + 0.05
aw media = 0.960 + 0.012
Contaminacin inicial mxima (*) = 1 ufc/g
Velocidad de crecimiento mxima (max) y periodo de latencia para un
producto idntico con pH = 6.03 y aw = 0.959 a 10 C (datos extrados de la
bibliografa, modelos predictivos o ensayos de desafo):
o max = 0.3 log10 ufc/g por da
o Latencia = 4.4 das
(*) mximo o mnimo = en este caso, muy baja probabilidad (< 5%) de superar este valor
Ejemplo 1. Vida til de 10 das a 6 C (planteamiento de caso nico)

Este ejemplo describe un enfoque de caso nico para una vida til de 10 das a una
temperatura de conservacin de 6 C.
Para una temperatura mxima de conservacin de 6 C, el periodo medio de latencia
ser de 14 das y la velocidad media de crecimiento ser de 0.12 log10 ufc/g por da.
Teniendo en cuenta las caractersticas fsico-qumicas del producto y el
comportamiento de las cepas de L. monocytogenes, podemos evaluar:
Perodo de latencia mnimo* = 5.4 das
Velocidad mxima de crecimiento* = 0.20 log10 ufc/g por da
Para una concentracin inicial de mxima de 1 ufc/g (es decir, 0 log10 ufc/g), la
concentracin final ser:
0 + (10 5.4) x 0.20 = 0.92 log10 ufc/g, es decir, 8 ufc/g
Incluso para un tiempo de latencia igual a cero, la concentracin final sera:
0 + 10 x 0.20 = 2 log10 ufc/g, es decir, 100 ufc/g
En este caso, el enfoque del caso nico es suficiente para demostrar que no se
exceder el lmite de 100 ufc/g al final de la vida til.
32
Anexo 2
Ejemplo 2. Vida til de 28 das, con 10 das a 4 C y 18 das a 8 C
Planteamiento del caso nico
Perodo de latencia mnimo* = 11 das a 4 C, y 0.4 das a 8 C (despus de 10

das a 4 C)
Velocidad mxima de crecimiento * = 0.10 a 4 C y 0.33 a 8 C (log10 ufc/g por
da)
Concentracin final:
0 + (18 0.4) x 0.33 = 5.8 log10 ufc/g, es decir, 6.4 x 105 ufc/g
En esta situacin, el enfoque de caso nico muestra que el lmite de 100 ufc/g se
exceder con mucho al final de la vida til. Es necesario emplear un enfoque basado
en el riesgo para tener en cuenta la variabilidad inherente al producto y evaluar la
probabilidad de exceder el lmite.
Planteamiento basado en el riesgo
Unidades de venta = 200 g
La contaminacin inicial se evala en base al histrico de anlisis microbiolgicos: 2%
de resultados positivos en muestras de 25 g. Si asumimos una distribucin homognea
de la contaminacin del producto, el 27% de las unidades de venta de 200 g estarn
contaminadas con al menos 1 ufc/g en cada unidad.
Figura 2. Evaluacin de la distribucin de la contaminacin inicial de los productos alimenticios
Se incluyen las velocidades mximas de crecimiento (en el 95% de los casos):

A 4 C, entre 0 y 0.10 log10 ufc/g por da, con una media de 0.04
A 8 C, entre 0 y 0.33 log10 ufc/g por da, con una media de 0.20
33
Anexo 2
Figura 3. Variabilidad de la velocidad mxima de crecimiento (log10 ufc/h) a 4 C (a la izquierda) y a 8 C (a

la derecha).
El periodo de latencia est entre 11 y ms de 200 das a 4 C, con una media de 45

das. El periodo de latencia residual a 8 C estar comprendido entre 0.4 y ms de 1000
das, con una media de 6.6 das.
La concentracin final de las unidades de 200 g contaminadas despus de 10 das a
4 C seguidos de 18 das a 8 C estar comprendida entre 0.005 ufc/g y 3.103 ufc/g,
con una media de 5 ufc/g.
Figura 4. Simulacin de crecimiento con banda de confianza (curva superior y lneas rectas inferiores)
incluyendo la variabilidad inherente al microorganismo, a los factores fsico-qumicos y a la contaminacin
inicial.
34
Anexo 2
Figura 5. Distribucin de la poblacin a los 28 das, incluyendo la variabilidad inherente al microorganismo, a

los factores fsico-qumicos y a la contaminacin inicial.
Estos datos permiten calcular que el 23,4% de las unidades de 200 g contaminadas
superarn el lmite de 100 ufc/g, es decir, el 6,4% del total de unidades fabricadas.
35
Anexo 2
Ejemplo 3. Vida til de 21 das, con 7 das a 4 C y 14 das a 8 C
Planteamiento de caso nico
Temperatura de conservacin mxima: 7 das a 4 C seguidos de 14 das a 8 C.
A 4 C:
o Velocidad mxima de crecimiento * = 0.10 log10 por da
o Periodo de latencia mnimo* = 11 das
A 8 C:
o Velocidad mxima de crecimiento * = 0.33 log10 por da
o Periodo de latencia mnimo* = 1.4 das
Concentracin final:
0 + (14-1.4) x 0.33 = 4.2 log10 ufc/g, es decir, 1.6 x 104 ufc/g
Planteamiento basado en el riesgo

La contaminacin inicial se evala a partir del histrico de datos de los anlisis
microbiolgicos: 2% de resultados positivos en muestras de 25 g. Solo el 27.5% de las
unidades de venta de 200 g estarn contaminadas con una media de 1 ufc/g.
Figura 6. Distribucin de la poblacin a los 21 das, incluyendo variabilidad inherente al microorganismo, a

los factores fsico-qumicos y a la contaminacin inicial.
La aplicacin de un enfoque basado en el riesgo permite calcular que el 4.4% de las

unidades de 200 g contaminadas superarn el lmite de 100 ufc/g, es decir, el 1,2% de
todas las unidades elaboradas.
36
Anexo 3. Ejemplo del uso de microbiologa predictiva

A partir de los parmetros de crecimiento de L. monocytogenes observados en un
alimento a una temperatura de conservacin dada, se pueden predecir los
parmetros de crecimiento a otras temperaturas de conservacin.
Por ejemplo, a partir de una velocidad mxima de crecimiento de 0.17 log10 ufc/g por
da y un periodo de latencia de 3.1 das obtenidos en un alimento a 8 C, podemos
predecir los parmetros de crecimiento en el mismo alimento a temperaturas de 4, 6 y
10 C:
A 4 C, la velocidad mxima de crecimiento ser de 0.06 log10 ufc/g por da y

el periodo de latencia ser de 8.8 das.
A 6 C, la velocidad mxima de crecimiento ser de 0.11 log10 ufc/g por da y

el periodo de latencia ser de 48 das.
A 10 C, la velocidad mxima de crecimiento ser de 0.25 log10 ufc/g por da

y el periodo de latencia ser de 2.1 das.
Figura 7. Ejemplo de microbiologa predictiva
37
Anexo 4. Protocolo de estudios de durabilidad

1) Muestreo
El procedimiento de muestreo, bajo la responsabilidad de la empresa y en
colaboracin con el laboratorio que realizar la prueba, debe ser representativo de la
poblacin (para tener en cuenta la diversidad de la poblacin) y debe tener una
buena precisin, la cual depender del tamao de la sub-poblacin muestreada. El
captulo 3.1 del Anexo I del Reglamento 2073/2005 se refiere a los estndares ISO y
Guas del Codex Alimentarius relevantes (2004) como mtodos de referencia, en
ausencia de normas ms especficas sobre muestreo y preparacin de las muestras.
Cuando no se disponga de informacin sobre la estructura de la poblacin, la forma
ms objetiva de seleccionar las unidades a analizar es dar a todas las unidades de la
poblacin la misma oportunidad de ser elegidas, por lo que se recomienda el
muestreo aleatorio simple para estimar la proporcin de unidades por encima del
lmite de 100 ufc/g. Este mtodo est basado en el principio de la misma probabilidad.
Este principio garantiza que cada unidad de la poblacin tiene las mismas
oportunidades de ser elegida. Para satisfacer este principio, se asume que el tamao
del lote (N) debe ser lo suficientemente grande en comparacin con el tamao de la
subpoblacin muestreada (n): n/N < 10%. Una forma de lograr el muestreo aleatorio
simple es numerar las unidades o el tiempo en que se producen, y entonces usar
nmeros aleatorios para seleccionar la subpoblacin a muestrear; p.e. se pueden
obtener nmeros aleatorios con un Libro de clculo Excel y la frmula matemtica
=ALEATORIO(). Este mtodo de muestreo debera repetirse para diferentes lotes o das
de produccin (mismo producto, elaborado en condiciones similares) para obtener
datos representativos.
Figura 8. Ejemplo de un muestreo aleatorio a partir de un libro de clculo Excel
38
Anexo 4
2) Condiciones de conservacin
Las condiciones de conservacin (incubacin) deben cumplir con las condiciones ms
probables a las que est sometido el alimento en condiciones normales de uso, hasta
su consumo final. Se debe incluir el rango de temperatura tpico al que se transporta,
distribuye y almacena. Se trata de una parte crtica de cualquier estudio de
durabilidad. Es responsabilidad de la empresa y del laboratorio trabajar juntos para
asegurar que las condiciones de conservacin (incubacin) utilizadas son realistas,
comprendiendo el hecho de que las temperaturas adecuadas no se mantienen
siempre a lo largo de toda la cadena del fro (desde la produccin hasta el consumo).
La temperatura y duracin se deben seleccionar dependiendo de la informacin
disponible, segn la siguiente tabla:
Tabla 3. Temperatura y duracin segn la etapa de la cadena alimentaria
Duracin de incubacin
Etapa de la
cadena
T de incubacin
Vida til
< 21
das
Vida til >

21 das
Desde la fbrica
hasta la llegada
al expositor de
venta
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
8
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
7 das
Minorista:
expositor de
venta
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
12
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
(vida til
7 das)
Conservacin
por el
consumidor
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
12
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
(vida til
7 das)
(*) Temperatura justificada por informacin detallada: el percentil 75 de las observaciones del pas donde se
localiza la etapa de la cadena del fro en consideracin.
3) Anlisis microbiolgico
Al final del periodo de almacenamiento, se analizarn todas las unidades con el
mtodo de recuento con el fin de cuantificar si se excede o no el nivel de 100 Listeria
monocytogenes/g. De acuerdo con el Anexo I del Reglamento 2073/2005, el mtodo
de referencia es la norma EN ISO 11290-2, modificada. Segn el artculo 5 del mismo
reglamento, se acepta el uso de mtodos alternativos cuando est validados con
respecto al de referencia, y si se utiliza un mtodo registrado, certificado por terceros
conforme al protocolo de la norma EN/ISO 16140 u otros protocolos
internacionalmente aceptados. Los mtodos distintos a los descritos debern validarse
conforme a protocolos internacionalmente aceptados y su uso deber ser autorizado
por la autoridad competente.
El lmite del recuento deber ser de 10 ufc/g, con el fin de ser capaz de cuantificar con
precisin el nivel de contaminacin por L. monocytogenes al final de periodo de
conservacin.
39
Anexo 4
4) Clculos
En la prctica de un control rutinario (p.e. aceptacin de un lote), el criterio definido
en el Reglamento N 2073/2005 es n=5, c=0; m=M= 100 ufc/g en el momento del
consumo. No obstante, estos controles no entran en el alcance de esta Gua.
La interpretacin de los estudios de durabilidad, los cuales consisten en validar que el
lmite de 100 ufc/g no se excede en el momento del consumo, es un caso diferente.
Como se describe abajo, se sugiere que esta interpretacin puede facilitarse
mediante la comprobacin de la proporcin (la cual est asociada a un intervalo de
confianza) de las unidades que excedern las 100 ufc/g al final de la vida til, despus
de un periodo de conservacin que refleje las condiciones previsibles de distribucin y
almacenamiento.
De la subpoblacin muestreada (de un tamao n) tomada de forma aleatoria de un
lote (de tamao N), hay que deducir simplemente la proporcin estimada de
unidades que superarn las 100 ufc/g al final de la vida til como la proporcin
observada p = r/n (donde r es el nmero de unidades por encima de 100 ufc/g, y n es
el tamao de la subpoblacin muestreada).
Para calcular el intervalo de confianza asociado a la proporcin estimada, se usa una
calculadora. En Internet existen numerosas calculadoras de acceso libre, p.e.
CausasCientia. Esta calculadora propone dos mtodos de clculo, el intervalo de
confianza central o el intervalo de confianza ms corto. Los intervalos de confianza
obtenidos por cada mtodo puede diferir ligeramente, pero son del una magnitud del
mismo orden.
En la subpoblacin muestreada, despus del periodo de almacenamiento, la tabla 4
indica las proporciones estimadas (p) con sus intervalos de confianza para tres valores r
(nmero de unidades > 100 L. monocytogenes/g); esta tabla destaca la importancia
real de tomar de la lnea de produccin un nmero suficiente de unidades y/o
recopilar los resultados previamente obtenidos, para estimar la proporcin de
unidades superiores a 100 ufc/g con un intervalo de confianza reducido:
Tabla 4. Ejemplo de estimacin de la proporcin de unidades > 100 ufc/g despus del periodo de
almacenamiento.
n
Nmero de unidades
analizadas
20
100
20
100
20
100
r
Nmero de unidades >
100 ufc/g
p
Proporcin estimada
0%
0%
5%
1%
10%
2%
0
1
2
IC
Intervalo de confianza al
95%
[0%- 16%]
[0%- 4%]
[1%- 24%]
[0.2%- 5%]
[3%- 30%]
[0.6%- 7%]
Cuantas ms unidades se analicen, ms estrecho ser el intervalo de confianza; p.e.,

de esta tabla se puede concluir que el lmite mayor del intervalo de confianza para 2
de 100 unidades que superen las 100 ufc/g es ms bajo que el obtenido para 0 de
20 unidades que superen las 100 ufc/g. Para conseguir un nmero mayor de unidades
analizadas, es posible recopilar resultados de pruebas repetidas, realizadas en un
alimento listo para el consumo obtenido mediante el mismo proceso
40
Anexo 4
5) Informe del estudio
Deber incluir al menos la siguiente informacin:
- Nmero de informe
- Identificacin completa del alimento:
- Identificacin de lotes analizados y fecha de fabricacin
- Caractersticas del alimento (pH, aw, microflora asociada,)
- Vida til prevista para el alimento
- Justificacin de las condiciones de conservacin (tiempo y temperatura)
- Prueba de durabilidad:
- Nmero de lotes por producto
- Nmero de unidades analizadas
- Das de muestreo
- Fecha de almacenamiento (comienzo)
- Condiciones de conservacin (tiempo-temperatura) de las unidades
analizadas
- Mtodo microbiolgico de recuento y lmite del mismo
- Proporcin estimada de unidades por encima del lmite de 100 ufc/g al final
del estudio de durabilidad con su intervalo de confianza asociado.
41
Anexo 5. Protocolo de los ensayos de desafo para el potencial de

crecimiento
1) Caractersticas del alimento
Se deben describir y ser representativas de la variabilidad del producto. Se deben
incluir propiedades intrnsecas y extrnsecas:
- Caractersticas fsico-qumicas como pH, aw, contenido en sal, concentracin
de aditivos conservantes, etc.
- Microflora asociada (recuento total) o microflora especfica (p.e. bacterias
cido-lcticas, Pseudomonas)
- Condiciones del envasado (aire, vaco, atmsfera modificada)
2) Nmero de lotes
Se deben probar al menos tres lotes de un mismo producto
3) Eleccin de la cepa a inocular
Hay que utilizar una mezcla de al menos tres cepas para tener en cuenta la
variabilidad de crecimiento de las mismas. Entre las cepas seleccionadas, una debe
ser una cepa de referencia (ATCC, NCTC, CIP, CECT o equivalente), y las otras dos
cepas deben haber sido aisladas del mismo alimento o de uno similar.
4) Preparacin del inculo
Hay que realizar ensayos previos para determinar el tiempo necesario para alcanzar la
fase estacionaria.
Primero, se subcultiva cada cepa en un medio (p.e. Caldo de soja y triptona (TSB) o
infusin de corazn y cerebro (BHI) a una temperatura (37 C) favorable para el
crecimiento ptimo de L. monocytogenes, durante el tiempo suficiente para que el
organismo alcance el comienzo de la fase estacionaria; este primer subcultivo tiene
por objeto conseguir que todas las clulas alcancen el mismo estado fisiolgico.
Despus se prepara un segundo subcultivo y se incuba una temperatura cercana a la
de conservacin del producto con el fin de que la cepa se adapte a estas
condiciones de conservacin; la incubacin se lleva a cabo durante el tiempo
suficiente para permitir el crecimiento de las cepas hasta la fase exponencial tarda o
fase estacionaria temprana. Se combinan cantidades iguales de cultivos de cada una
de las 3 cepas a la misma concentracin. Se prepararan diluciones sucesivas del
cultivo mezclado en suero fisiolgico, para obtener una concentracin en el alimento
similar a la que sera realista esperar de forma natural.
Finalmente, se comprueba el nivel del inculo en agar de soja y triptona (TSA)
42
Anexo 5
5) Preparacin e inoculacin de las unidades de prueba
Se debe preparar al menos el nmero de unidades recogido en la tabla 5. Aunque
slo se consideran el da 0 y el da final, es muy recomendable aadir puntos de
anlisis intermedios.
Tabla 5. Nmero de unidades a preparar
Da cero
(inmediatamente
despus de la
inoculacin)
Da final (fin
de vida til)
Concentracin de L. monocytogenes
Deteccin y/o recuento de L. monocytogenes en unidades NO

inoculadas (opcional)
Caractersticas fsico-qumicas
3 (*)
3 (*)
Concentracin de microflora
Determinacin
(*) solo 1 si la empresa puede demostrar que el producto es homogneo
6) Preparacin de unidades no inoculadas

Se pueden analizar unidades para detectar y/o enumerar L. monocytogenes presente
de forma natural en el alimento: estas muestras blancas no se inoculan. Los
resultados del ensayo de desafo siguen siendo vlidos, incluso si existe L.
monocytogenes en las muestras blancas. Aportan informacin adicional sobre la
ocurrencia natural de cepas a niveles realistas, al margen de la mezcla de cepas
inoculada.
Para determinar las caractersticas fsico-qumicas y la concentracin de microflora,
hay que inocular las unidades a analizar con suero estril fisiolgico en lugar de con L.
monocytogenes.
La determinacin de las caractersticas fsico-qumicas y la microflora asociada son
necesarias para comparar los productos sometidos al ensayo de desafo con los
alimentos producidos rutinariamente en la empresa. An ms, la determinacin de la
concentracin de la microflora asociada puede aportar alguna informacin sobre
posibles interacciones con L. monocytogenes, que pueden influir en su crecimiento.
7) Preparacin e inoculacin de las unidades de anlisis para determinar la
concentracin de L. monocytogenes
a) Alimento. La prueba puede realizarse sobre una parte o en toda la unidad
comercial del alimento. Si el alimento consta de varias partes, se debe contaminar
artificialmente aquella que sea ms probable de contaminarse con Listeria (p.e. el
relleno de un sndwich). La distribucin del inculo debe imitar la posible distribucin
de Listeria en el alimento, que puede o no ser uniforme.
b) Procedimiento de inoculacin. La inoculacin debe ser tan efectiva como sea
posible, simulando las condiciones de la contaminacin natural y manteniendo las
propiedades intrnsecas del alimento. Para minimizar los cambios en las propiedades
fsico-qumicas, el inculo no debe exceder el 1% del volumen de la unidad a analizar,
ya que en caso contrario, puede afectar gravemente a las propiedades intrnsecas del
alimento y, por tanto, a las caractersticas de crecimiento del inculo.
43
Anexo 5
Hay que asegurarse de que el mtodo de inoculacin no cambie la composicin
gaseosa dentro del envase, y que la composicin de gases dentro del envase
inoculado sea idntica a la de un envase no inoculado.
Se inocula el alimento o la parte especfica sospechosa de estar contaminada, de
forma que se imite tanto como sea posible la contaminacin natural esperada:
en profundidad: para alimentos considerados homogneos (p.e. alimentos
picados) o preparados a base de mezcla de varios ingredientes (p.e.
ensaladas mixtas).
en superficie: para imitar la contaminacin de una parte especfica durante el
procesado (p.e. salmn ahumado contaminado durante el loncheado)
c) Nivel de contaminacin. El nivel de contaminacin diana es de 50 ufc/g, y no debe
exceder las 100 ucf/g.
8) Condiciones de conservacin del alimento inoculado
Las condiciones de conservacin (incubacin) deben cumplir con las condiciones ms
probables a las que est sometido el alimento en condiciones normales de uso, hasta
su consumo final. Se debe incluir el rango de temperatura tpico al que se transporta,
distribuye y almacena. Se trata de una parte crtica de cualquier ensayo de desafo. Es
responsabilidad de la empresa y del laboratorio trabajar juntos para asegurar que las
condiciones de conservacin (incubacin) utilizadas sean realistas, comprendiendo el
hecho de que las temperaturas adecuadas no se mantienen siempre a lo largo de
toda la cadena del fro (desde la produccin hasta el consumo). En consecuencia, los
ensayos de desafo deben considerar el empleo de abusos de temperatura.
La temperatura y la duracin se deben seleccionar dependiendo de la informacin
disponible, segn la siguiente tabla:
Tabla 6. Temperatura y duracin segn la etapa de la cadena alimentaria
Duracin de incubacin
Etapa de la
cadena
T de incubacin
Vida til
< 21
das
Vida til >

21 das
Desde la fbrica
hasta la llegada
al expositor de
venta
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
8
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
7 das
Minorista:
expositor de
venta
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
12
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
(vida til
7 das)
Conservacin
por el
consumidor
Justificada
por
informacin
detallada*
si no se
conoce
12
C
Justificada por
informacin
detallada
si no
se
conoce
1/3 de
la vida
til total
(vida til
7 das)
(*) Temperatura justificada por informacin detallada: el percentil 75 de las observaciones del pas donde se
localiza la etapa de la cadena del fro en consideracin.
44
Anexo 5
9) Medicin de caractersticas fsico- qumicas
Las caractersticas fsico-qumicas se miden de acuerdo con mtodos estndar (al
menos: pH; (contenido en sal; humedad); aw)
10) Mtodos analticos:
a) Deteccin de L. monocytogenes. El mtodo de referencia es la norma EN ISO 112901, de acuerdo con el Reglamento 2073/2005. Segn el artculo 5, se acepta el uso de
mtodos alternativos cuando est validados con respecto al de referencia, y si se
utiliza un mtodo registrado, certificado por terceros conforme al protocolo de la
norma EN/ISO 16140 u otros protocolos internacionalmente aceptados. Los mtodos
distintos a los descritos debern validarse conforme a protocolos internacionalmente
aceptados y su uso deber ser autorizado por la autoridad competente.
b) Recuento de L. monocytogenes. El mtodo de referencia es la norma EN ISO 112902, de acuerdo con el Reglamento 2073/2005. Segn el artculo 5, se acepta el uso de
mtodos alternativos cuando est validados con respecto al de referencia, y si se
utiliza un mtodo registrado, certificado por terceros conforme al protocolo de la
norma EN/ISO 16140 u otros protocolos internacionalmente aceptados. Los mtodos
distintos a los descritos debern validarse conforme a protocolos internacionalmente
aceptados y su uso deber ser autorizado por la autoridad competente.
Puesto que el nivel diana de contaminacin es de 50 ufc/g, el lmite del recuento
debe ser bajo, no mayor de 10 ufc/g, es decir, de acuerdo con la norma EN/ISO 112902, usando 1 ml de la suspensin inicial sembrado en 3 placas de 90 mm de ;
sembrando 1 plato grande de 140 mm de , , si est validado, volcndolo en 1 plato
de 90 mm de .
Para conseguir una menor incertidumbre, es muy recomendable elegir un mtodo
cuyo lmite permita recuentos an menores, p.e. de 5 ufc/g, es decir, con 2 ml de la
suspensin inicial sembrados en 6 platos de 90 mm de , sembrado 2 platos grandes
de 140 mm de , si est validado, volcndolo en 2 platos de 90 mm de .
Probablemente, el da 0 no es necesario emplatar 1 ml de la dilucin 10-2 ( 0,1 ml de
la suspensin inicial).
Tambin se puede lograr un lmite bajo de recuento usando filtracin u otro mtodo
que est validado.
Segn la norma EN/ISO 7218:2007, los resultados basado en el recuento de 4 colonias o
menos se expresan cuantitativamente (p.e. el resultado asociado al recuento de 3
colonias tras emplatar 2 ml de la suspensin inicial sera 1,5 ufc/g), aunque stos no
sern frecuentes en el da 0 (dado un nivel de contaminacin diana de 50 ufc/g y un
lmite de recuento inferior a 10 ufc/g).
Por las mismas razones, los resultados por debajo del umbral (0 colonias contadas)
deberan ser raros en el da 0. Si son una mayora (p.e. 2 3 resultados de 3), el
ensayo (para ese lote) no es aceptable.
45
Anexo 5
Una vez el lote ha sido inoculado y se ha practicado el recuento en el da 0, se
recomienda calcular inmediatamente la desviacin estndar entre los tres logresultados del da 0 (o entre 2 log-resultados si uno de ellos es inferior al lmite). Si esta
desviacin estndar (debido a la incertidumbre la medicin y la contaminacin
heterognea) es igual o mayor que 0.3 log ufc/g, el ensayo de desafo no es
aceptable.
Cuando un ensayo de desafo no es aceptable, hay que repetir de nuevo el
experimento para ese lote (o para uno similar), prestando gran atencin a la
homogeneidad de la contaminacin y a la precisin del mtodo de recuento
(aumentar el nmero de placas si es necesario).
c) Microflora asociada. Se puede tratar de aerobios mesfilos, o una microflora
especfica del alimento (p.e. bacterias cido-lcticas, Pseudomonas). Los mtodos
para su recuento deben seguir los correspondientes estndares CEN, ISO o nacionales,
para el microorganismo y alimento implicados.
11) Clculo del potencial de crecimiento:
El potencial de crecimiento () es la diferencia entre el log10 ufc/g despus del
crecimiento y el log10 ufc/g de la concentracin inicial.
Para cada lote, se calcula la diferencia entre la mediana del log10 de la
concentracin del da final y la mediana del log10 de la concentracin del da 0
(log10 ufc/g). La mediana es el resultado intermedio de los tres. Si uno de los tres
resultados se expresa como < lmite de recuento, esto no impide el clculo de la
mediana, que ser el menor valor de los otros dos resultados.
Por ltimo, se elige como la diferencia mxima entre el da final y el da 0 entre
los tres lotes.
12) Interpretacin de resultados
El potencial de crecimiento indica la capacidad del alimento para soportar el
crecimiento de L. monocytogenes:
Si es igual o menor que 0.5 log10, se asumen que el alimento no puede

favorecer el crecimiento de L. monocytogenes.
Si es mayor que 0.5 log10, se asumen que el alimento s puede favorecer el
crecimiento de L. monocytogenes.
En los casos en que se asumen que el alimento s puede favorecer el crecimiento de L.

monocytogenes ( mayor que 0.5 log10,), el potencial de crecimiento puede utilizarse
para predicciones de crecimiento, por ejemplo:
concentracin final = concentracin inicial + (la concentracin final
obtenida mediante este clculo puede usarse para determinar, para un
producto dado, con una concentracin conocida en el da 0 si la
concentracin prevista para el da final exceder el lmite de 100 ufc/g)
concentracin inicial = concentracin final (la concentracin inicial
obtenida mediante este clculo puede usarse para determinar un lmite al
final de la produccin, lo suficientemente bajo como para garantizar que no
se superar el lmite de 100 ufc/g al final de la vida til).
46
Anexo 5
13) Informe de la prueba
- Nmero de informe
- Justificacin de las condiciones de conservacin (tiempo y temperatura)
- Cepas consideradas:
- Origen de las cepas
- Condiciones de preparacin del inculo
- Concentracin del inculo
- Ensayo de desafo:
- Da de la inoculacin
- Masa o volumen inoculado a las unidades a analizar
- Volumen del inculo y mtodo de contaminacin.
- Condiciones de conservacin (tiempo/ temperatura) de las unidades a
analizar.
- Referencia a los mtodos microbiolgicos (recuento y deteccin)
- Lmite del mtodo de recuento.
- Caractersticas fsico-qumicas del alimento al principio y al final de la prueba.
- Nivel de microflora asociada al principio y al final de la prueba.
- Datos obtenidos y clculos realizados.
- Potencial de crecimiento e interpretacin.
47
Anexo 5
EJEMPLOS DE CLCULO DEL POTENCIAL DE CRECIMIENTO
A continuacin se muestran dos ejemplos del clculo del potencial de crecimiento a
partir de ensayos de desafo, en los cuales se asume que los resultados de los
recuentos se obtienen en las siguientes condiciones:
el da 0 se emplatan 2 ml de la suspensin inicial (10-1) (tanto sembrados en

6 placas de 90 mm de , en 2 placas grandes de 140 mm de vertidos
en 2 placas de 90 mm de ), de forma que el lmite del recuento es de 5
ufc/g.
el da final se emplatan 2 ml de la suspensin inicial (tanto sembrados en 6

placas de 90 mm de , en 2 placas grandes de 140 mm de vertidos en
2 placas de 90 mm de ), y 0.1 ml de la suspensin inicial de 10-1 en una placa
de 90 mm de ( 1 ml de la dilucin 10-2 en una placa de 90 mm de )
Tabla 7. Primer ejemplo de resultados obtenidos en una prueba de potencial de crecimiento.
Lotes
Da
da 0
1
da final
da 0
2
da final
da 0
3
da final
Concentracin
(ufc/g)
Concentracin
(log10 ufc/g)
Mediana en
negrita
30
50
20
43
24
29
45
30
30
29
43
14
<5
25
20
52
38
81
1.48
1.70
1.30
1.63
1.38
1.46
1.65
1.48
1.48
1.46
1.63
1.15
< 0.70
1.40
1.30
1.72
1.58
1.91
Diferencia entre la
concentracin mediana
en el da final y la
en el da 0 (log10 ufc/g)
Potencial de
crecimiento () =
mximo de las
diferencias
1.46 1.48 = -0.02
1.46 1.48 = -0.02
0.42
1.72 1.30 = 0.42
En este primer ejemplo, las desviaciones estndar para los 3 resultados del da 0 son
0.20 log10 ufc/g para el lote 1; 0.10 log10 ufc/g para el lote 2, y 0.07 log10 ufc/g para el
lote 3, sin tener en cuenta el resultado por debajo del lmite del recuento. Por lo tanto,
pueden usarse todos los resultados. La diferencia mxima entre la concentracin
mediana en el da final y la concentracin mediana en el da 0 (log10 ufc/g) para
cada lote es = 0.42 (log10 ufc/g).
48
Anexo 5
Tabla 8. Segundo ejemplo de resultados obtenidos en una prueba de potencial de crecimiento.
Lotes
Da
da 0
1
da final
da 0
2
da final
da 0
3
da final
Concentracin
(ufc/g)
Concentracin
(log10 ufc/g)
Mediana en
negrita
25
20
55
100
210
190
60
30
50
250
350
390
20
25
20
43
52
76
1.40
1.30
1.74
2.00
2.33
2.28
1.78
1.48
1.70
2.40
2.54
2.59
1.30
1.40
1.30
1.63
1.72
1.88
Diferencia entre la
en el da final y la
en el da 0 (log10 ufc/g)
Potencial de
crecimiento () =
mximo de las
diferencias
2.28 1.40 = 0.88
2.54 1.70 = 0.84
0.88
1.72 1.30 = 0.42
En este segundo ejemplo, las desviaciones estndar para los 3 resultados del da 0
son 0.23 log10 ufc/g para el lote 1; 0.16 log10 ufc/g para el lote 2, y 0.06 log10 ufc/g para
el lote 3. Por lo tanto, pueden usarse todos los resultados. La diferencia mxima entre la
concentracin mediana en el da final y la concentracin mediana en el da 0
(log10 ufc/g) para cada lote es = 0.88 (log10 ufc/g).
49
Anexo 6. Protocolo de ensayos de desafo para la velocidad mxima de

crecimiento
1) Caractersticas del producto
Se deben describir y ser representativas de la variabilidad del producto. Se deben
incluir propiedades intrnsecas y extrnsecas:
- Caractersticas fsico-qumicas como pH, aw, contenido en sal, concentracin
de aditivos conservantes, etc.
- Microflora asociada (recuento total) o microflora especfica (p.e. bacterias
cido-lcticas, Pseudomonas)
- Condiciones del envasado (aire, vaco, atmsfera modificada)
2) Nmero de lotes
Hay que probar al menos tres lotes de un mismo producto
3) Eleccin de cepa(s)
Hay que probar cada lote con dos cepas por separado: una cepa procedente de la
misma matriz alimentaria o una similar, y una cepa de referencia (ATCC, NCTC, CIP,
CECT o equivalente). Antes de realizar la inoculacin, se usan curvas de crecimiento
en caldo para seleccionar las dos cepas ms rpidas.
4) Preparacin del inculo
En este caso, la concentracin inicial de L. monocytogenes podra ser mayor que la
concentracin esperada en el alimento, que en general es baja. Antes de realizar el
ensayo de desafo, hay que realizar ensayos previos para determinar el tiempo
necesario para alcanzar la fase estacionaria.
Primero se subcultiva la cepa en un medio (p.e. Caldo de soja tripotona (TSB) o infusin
corazn-cerebro (BHI) y a una temperatura (37 C) favorable para el crecimiento
ptimo de L. monocytogenes, durante el tiempo suficiente para que alcance el
principio de la fase estacionaria.
Despus se realiza un segundo subcultivo en condiciones idnticas.
5) Preparacin de las unidades de prueba
Las pruebas requieren un muestreo destructivo. Se deben preparar al menos el nmero
de unidades recogido en la siguiente tabla:
Tabla 9. Nmero de unidades a preparar por cada curva
Determinacin
Unidades a analizar
Determinacin de max (curva de crecimiento)
10 a 15
Deteccin de L. monocytogenes en el alimento antes del ensayo de

desafo (da 0) y recuento al final (da final)
Determinacin de caractersticas fsico-qumicas al inicio (da 0) y al final
(da final)
3+3
3* + 3*
2
10 15
* una unidad es suficiente si la empresa puede demostrar que el producto es homogneo.
Recuento de microflora asociada o especfica
50
Anexo 6
6) Preparacin e inoculacin de las unidades de prueba para determinar max
a) Alimento. La prueba se puede realizar sobre una parte o en toda la unidad
comercial del alimento. Si el alimento consta de varias partes, se debe contaminar
artificialmente aquella que sea ms probable de contaminarse con Listeria (p.e. el
relleno de un sndwich). La distribucin del inculo debe imitar la posible distribucin
de Listeria en el alimento, que puede o no ser uniforme.
b) Procedimiento de inoculacin. Para cada curva, se inoculan las unidades de
prueba solo con una nica cepa (no con una mezcla).
La inoculacin debe ser tan efectiva como sea posible, simulando las condiciones de
la contaminacin natural y manteniendo las propiedades intrnsecas del alimento.
Para minimizar los cambios en las propiedades fsico-qumicas, el inculo no debe
exceder el 1% del volumen de la unidad a analizar, ya que en caso contrario, puede
afectar gravemente a las propiedades intrnsecas del alimento y, por tanto, a las
caractersticas de crecimiento del inculo.
Hay que asegurarse de que el mtodo de inoculacin no cambie la composicin
gaseosa dentro del envase, y que la composicin de gases dentro del envase
inoculado sea idntica a la de un envase no inoculado.
Se inocula el alimento o la parte especfica sospechosa de estar contaminada, de
forma que se imite tanto como sea posible la contaminacin natural esperada:
en profundidad: para alimentos considerados homogneos (p.e. alimentos
picados) o preparados a base de mezcla de varios ingredientes (p.e.
ensaladas mixtas).
en superficie: para imitar la contaminacin de una parte especfica durante el
procesado (p.e. salmn ahumado contaminado durante el loncheado)
c) Nivel de contaminacin. El nivel de contaminacin diana debera ser de unas 100
ufc/g.
7) Deteccin de L. monocytogenes en el alimento antes del ensayo de desafo (da
0) y recuento al final (da final)
Se preparan 6 unidades de prueba para verificar la ausencia de L. monocytogenes en
el alimento, las as llamadas muestras blancas no son inoculadas.
Si L. monocytogenes se detecta en las muestras blancas en el da 0, el ensayo de
desafo no sera vlido, ya que no se conoceran los nmeros exactos al principio y no
se podra calcular una velocidad de crecimiento correcta. Los recuentos resultantes
en las muestras blancas en el da final tienen que ser interpretados por el
laboratorio.
51
Anexo 6
8) Determinacin de las caractersticas fsico-qumica iniciales (da 0) y finales (da
final)
Se preparan 6 unidades de prueba para determinar las caractersticas fsico-qumicas:
estas no se inoculan con L. monocytogenes, si no que en su lugar se les inyecta una
solucin salina fisiolgica estril.
Las caractersticas fsico-qumicas se miden de acuerdo con mtodos estndar (al
menos: pH; (contenido en sal; humedad); aw)
9) Recuento de la microflora asociada
Se realiza el recuento de la microflora asociada en las unidades de prueba no
inoculadas, bien en el momento del muestreo en el da 0 y da final.
La microflora asociada a tener en cuenta pueden ser aerobios mesfilos o microflora
especfica del alimento (p.e. bacterias cido-lcticas, Pseudomonas). Para el
recuento de esta flora, se usan mtodos de acuerdo con el Reglamento (CE) n
2073/2005. Los mtodos utilizados deben seguir las normas relevantes CEN, ISO o
nacionales para el microorganismo y alimento implicados.
10) Condiciones de conservacin del alimento inoculado
El ensayo de desafo se realiza en este caso a una temperatura fija, preferiblemente
cercana a la temperatura elegida para la prediccin.
11) Mtodos analticos para L. monocytogenes:
a) Deteccin. El mtodo de referencia es la norma EN ISO 11290-1, de acuerdo con el
Reglamento 2073/2005. Segn el artculo 5, se acepta el uso de mtodos alternativos
cuando est validados con respecto al de referencia, y si se utiliza un mtodo
registrado, certificado por terceros conforme al protocolo de la norma EN/ISO 16140 u
otros protocolos internacionalmente aceptados. Los mtodos distintos a los descritos
debern validarse conforme a protocolos internacionalmente aceptados y su uso
deber ser autorizado por la autoridad competente.
b) Recuento. El mtodo de referencia es la norma EN ISO 11290-2, de acuerdo con el
Reglamento 2073/2005. Segn el artculo 5, se acepta el uso de mtodos alternativos
cuando est validados con respecto al de referencia, y si se utiliza un mtodo
registrado, certificado por terceros conforme al protocolo de la norma EN/ISO 16140 u
otros protocolos internacionalmente aceptados. Los mtodos distintos a los descritos
debern validarse conforme a protocolos internacionalmente aceptados y su uso
deber ser autorizado por la autoridad competente.
52
Anexo 6
12) Clculo de la velocidad mxima de crecimiento
Se necesitan conocimientos bsicos de microbiologa predictiva para interpretar los
resultados, usando un acercamiento simplificado como se sugiere en los siguientes
prrafos. Un mayor conocimiento es til para emplear otros modelos.
Se calculan los resultados del recuento de acuerdo con la norma EN SIO 7218 y se
transforman en el logaritmo en base 10 de ufc/g (log10 ufc/g).
La velocidad de crecimiento de cada curva (es decir, todos los puntos experimentales
de un nico lote) se pueden estimar fcilmente mediante regresin no lineal. Para este
fin pueden utilizarse programas gratuitos como MicroFit, que est basado en el modelo
Baranyi como modelo primario. Este programa facilita una carta con los puntos
experimentales y la curva ajustada mediante regresin, usando el modelo Baranyi.
Tambin extrae los parmetros de crecimiento de la curva: N0 (logaritmo de la
concentracin bacteriana inicial), Nmax (logaritmo de la concentracin bacteriana
final), max (velocidad mxima de crecimiento), t-lag (tiempo de latencia), t-d (tiempo
de generacin o tiempo de duplicacin).
Este tiempo de generacin est relacionado con la velocidad mxima de crecimiento
mediante la ecuacin t-d = ln2/ max (donde ln representa el logaritmo natural).
El tiempo de latencia y el tiempo de generacin estn expresados en unidad de
tiempo (p.e. das) y la velocidad mxima de crecimiento est expresada por lo tanto
en das-1. Los valores de los parmetros se presentan con su intervalo de confianza. El
programa tambin presenta la suma residual de los cuadrados (RSS) y la raz de la
media cuadrada (RMS). RSS y RMS dan una indicacin de la calidad del ajuste de la
curva. Hay que escoger el valor mximo entre las 6 max obtenidas de cada una de las
6 curvas de crecimiento para realizar los siguientes clculos.
Figura 9. Uso del programa Microfit para ajustar una curva de crecimiento
53
Anexo 6
13) Interpretacin de resultados
Conociendo el valor de max a una temperatura (Tref) es posible calcular otra max a
otra temperatura (T). Por lo tanto, a partir de una curva de crecimiento a la Tref, la max
estimada usando Microfit se representa como maxref. Despus, el clculo de la max en
el mismo alimento (con las mismas caractersticas fsico-qumicas) a otra temperatura T
se obtendra usando el modelo secundario de raz cuadrada (Ratkowsky et al., 1982;
Zwietering et al., 1996). Si T y Tref son ambas inferiores a 25 C, se sugiere utilizar la
siguiente frmula simplificada:
max =
maxref .
(T Tmin)2
(Tref Tmin)2
(con Tmin = temperatura mnima de crecimiento de L. monocytogenes - 2 C)
Las velocidades maxref y max pueden expresarse en log10 ufc/g por da mediante la
divisin de sus valores entre 2.3 [= ln(10)]. Pueden usarse otros modelos secundarios.
En consecuencia, asumiendo un modelo primario muy simple (sin fase de latencia ni
fase estacionaria, lo cual puede conducir a resultados sin utilidad):
El crecimiento (en log10) obtenido a la Tref durante un tiempo de

almacenamiento d1 (en das) es igual a maxref (expresada en log10 ufc/g por
da) x d1.
El crecimiento (en log10) obtenido a una temperatura T durante un tiempo de

almacenamiento d2 (en das) es igual a max (expresada en log10 ufc/g por da)
x d2.
Se pueden usar otros modelos primarios.

La prediccin puede por lo tanto aplicarse a cualquier perfil tiempo-temperatura, y en
particular, a las condiciones a las que el producto es ms probable que est sujeto en
su uso normal hasta su consumo final.
54
Anexo 6
14) Informe de la prueba
- Nmero de informe
- Cepas consideradas:
- Condiciones de preparacin del inculo
- Ensayo de desafo:
- Nmero de lotes por alimento
- Nmero de unidades de prueba analizadas
- Masa o volumen de las unidades de prueba que se inoculan
- Volumen del inculo y mtodo de contaminacin.
- Condiciones de conservacin (tiempo/ temperatura) de las unidades a
analizar.
- Mtodos microbiolgicos (recuento y deteccin)
- Caractersticas fsico-qumicas del alimento al principio y al final de la prueba.
- Datos obtenidos y clculos realizados.
- Velocidad mxima de crecimiento e interpretacin.
55
Anexo 6
EJEMPLO DEL CLCULO DE LA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO
Datos:
- Vida til = 9 das
- Condiciones de conservacin: 4 C durante 3 das (d1) y 8 C durante 6 das (d2)
El ensayo de desafo se realiz a una Tref = 8 C y permiti estimar una maxref = 0.78 ln
ufc/g por da, convertida en 0.34 log10 ufc/g por da.
El modelo secundario permite predecir la max a una T = 4 C, con su intervalo de
confianza.
maxref .
(T Tmin)2
max =
(Tref Tmin)2
El punto estimado es:
max = 0.78 (4 ( -2))2
(8 ( -2))2
= 0.28 ln ufc/g por da, convertida en 0.12 log10 ufc/g por

da
En consecuencia, la velocidad de crecimiento prevista a 4 C es de 0.12 log10 ufc/g

por da.
Pregunta 1: cul ser el crecimiento de L. monocytogenes previsto durante

la vida til?
Crecimiento durante la vida til =

[(max1 en log10 ufc/g por da) x d1] + [(max2 en log10 ufc/g por da) x d2], donde
Crecimiento = (0.12 x 3) + (0.34 x 6) = 2.40 log10 ufc/g
Este clculo no incluye la fase de latencia ni la fase estacionaria (es decir, asume que
todo el comportamiento simulado tiene un crecimiento exponencial) y en
consecuencia, los resultados pueden ser (muy) inseguros o incluso intiles.
Pregunta 2: cul ser la concentracin al inicio de la vida til con el fin de

respetar el lmite de 100 ufc/g?
Concentracin inicial = Concentracin final crecimiento durante la vida til

La concentracin final es el lmite de 100 ufc/g (2 log10 ufc/g):
2 2.40 = -0.40 log10 ufc/g = 0.4 ufc/g
Pregunta 3: cul ser la concentracin de L. monocytogenes al final de la

vida til si el nivel de L. monocytogenes en el da 7 es igual a 1.65 log10 ufc/g?
El nivel de L. monocytogenes en el da final ser 1.65 + 0.34 x 2 = 3.33 log10 ufc/g. El

lmite de 100 ufc/g se superar en este producto.
56
Anexo 7. Listado de verificacin de directrices tcnicas

ESTUDIOS DE VIDA TIL:
Alimento (denominacin):
Categora:
1.1 Lactantes y usos mdicos
1.2. Favorecen
Procesado: Elaboracin
Envasado (describir):
Vida til (tiempo y temperatura):
1.3. No favorecen
Los tems y apartados marcados con un asterisco son Recomendaciones de la Comisin Europea.
I. CARACTERSTICAS DEL PRODUCTO Y BIBLIOGRAFA CIENTFICA
NO
NO
NO
Se especifican las caractersticas fsico-qumicas del alimento (pH, aw, contenido de sal,
concentracin de conservantes, tipo de envasado)
Se describe la microflora habitual asociada o especfica*
Se analizan de acuerdo con mtodos estndar (normas CEN, ISO o nacionales)*
Son representativas de la variabilidad del alimento (se analizan al menos 3 lotes, o solo 1 si se
demuestra que es homogneo*)
Se tienen en cuenta las condiciones de almacenamiento, las condiciones de transformacin, las
posibilidades de contaminacin, y la vida til prevista.
Las caractersticas del ALC se comparan con la bibliografa cientfica para determinar si es posible
la supervivencia o el crecimiento de L. monocytogenes en alimentos con caractersticas similares.
II. ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS
Toman como base las caractersticas del producto y la bibliografa cientfica
Tienen en cuenta la variabilidad inherente al producto (lotes)
Tienen en cuenta la variabilidad inherente al microorganismo
Tienen en cuenta las condiciones
almacenamiento, distribucin y utilizacin
razonablemente
previsibles
de
transformacin,
A. Se aporta el histrico de datos*

B. Se realiza microbiologa predictiva
C. Se realizan estudios de durabilidad
D. Se realizan ensayos de desafo para calcular el potencial de crecimiento
E. Se realizan ensayos de desafo para calcular la velocidad mxima de crecimiento
A) HISTRICO DE DATOS *
Los datos histricos se han obtenido siguiendo el plan de muestreo reglamentario
Los datos histricos se han analizado usando los mtodos de referencia o alternativos
El nmero de anlisis realizados se considera suficiente para dar fiabilidad al histrico
Los datos histricos evidencian que no se superarn las 100 ufc/g al final de la vida til, en el caso
de que L. monocytogenes est presente inicialmente en el ALC:
- Los niveles de L. monocytogenes en los ALC al final de su vida til son consistentemente bajos o
ausentes, verificando la duracin de esta vida.
- Los niveles de L. monocytogenes en los ALC en el da de fabricacin son consistentemente bajos
o ausentes, verificando la eficacia del sistema APPCC.
- Los resultados de los muestreos de superficies demuestran la eficacia del sistema de limpieza y
desinfeccin.
- Los resultados de los controles de las materias primas demuestran su calidad.
57
Anexo 7
B) MICROBIOLOGA PREDICTIVA
NO
NO
Se usa un modelo predictivo adecuado para el ALC en estudio.

Se utilizan factores crticos de crecimiento o supervivencia aplicables a los microorganismos en
cuestin presentes en el producto.
Se usan modelos de crecimiento/ no crecimiento para categorizar los ALC.*
Se usan modelos para predecir tiempo de latencia y velocidad de crecimiento para evaluar el
crecimiento de L. monocytogenes, considerando variabilidad de las cepas, del procesado, del
alimento y de las condiciones de conservacin.*
Los resultados evidencian que no se superarn las 100 ufc/g al final de la vida til, en el caso de
que L. monocytogenes est presente inicialmente en el alimento.
C) ESTUDIOS DE DURABILIDAD
1. Mtodo de muestreo
Se realiza un muestreo aleatorio simple*
El nmero de unidades analizadas permite una buena precisin (n/N < 10%) *
El muestreo se repite para diferentes lotes a fin de tener en cuenta su variabilidad
2. Condiciones de conservacin (incubacin) del alimento
El alimento se conserva en condiciones normales de uso hasta su consumo final, incluyendo
abusos de temperatura.
Se justifican las condiciones de conservacin.
3. Mtodo analtico para recuento de L. monocytogenes
Se utiliza el mtodo de referencia, o uno alternativo validado o registrado.
El lmite del recuento no excede de 10 ufc/g
4. Clculos*
Se calcula la proporcin observada (p = r/n) de unidades que superan las 100 ufc/g
Se calcula el intervalo de confianza asociado a esta proporcin
5. Informe del estudio *
Nmero de informe
Identificacin completa del alimento:
- Identificacin de lotes probados y fecha de fabricacin
- Caractersticas (pH, aw, microflora asociada,)
- Justificacin de las condiciones de conservacin (tiempo y T)
Estudio de durabilidad:
- Das de muestreo
- Fecha de conservacin (comienzo)
- Condiciones del conservacin (tiempo-temperatura) de las unidades analizadas
- Mtodo microbiolgico de recuento y lmite
- Proporcin estimada de unidades > de 100 ufc/g e intervalo de confianza asociado.
58
Anexo 7
D) ENSAYOS DE DESAFO PARA POTENCIAL DE CRECIMIENTO

1. Nmero mnimo de lotes probados*
Se prueban al menos tres lotes de un mismo alimento
2. Nmero mnimo de unidades de prueba por lote (da 0 + da final)*
Concentracin de L. monocytogenes en unidades inoculadas: 3 + 3
Deteccin y/o recuento de L. monocytogenes en unidades NO inoculadas (OPCIONAL): 3 + 3
Caractersticas fsico-qumicas en unidades inyectadas con suero: 3 + 3 (1 + 1 si se demuestra
homogeneidad)
Recuento de microflora en unidades inyectadas con suero: 3 + 3
3. Preparacin de unidades no inoculadas *
Se inocula suero fisiolgico estril a las unidades en las que se determinan caractersticas fsicoqumicas y microflora asociada.
4. Cepas a inocular *
Se utiliza una mezcla de al menos 3 cepas: una cepa de referencia y otras dos cepas aisladas del
mismo alimento o de uno similar.
5. Preparacin del inculo*
Se realizan dos subcultivos previos de cada cepa, durante el tiempo necesario para alcanzar la fase
de crecimiento estacionaria:
- Primer subcultivo en Caldo de soja y triptona (TSB) o Infusin de corazn y cerebro (BHI) a T de 37
C hasta el comienzo de la fase estacionaria.
- Segundo subcultivo a T prxima a la de conservacin del alimento, hasta la fase exponencial
tarda o la fase estacionaria temprana.
Se combinan cantidades iguales de cultivos de cada una de las 3 cepas a la misma concentracin.
Se preparan diluciones sucesivas del cultivo en suero fisiolgico para obtener una concentracin
similar a la natural.
Se comprueba la concentracin del inculo en agar de soja y triptona (TSA).
6. Procedimiento de inoculacin*
El inculo no excede el 1% del volumen de la unidad de prueba.
Los gases del envase inoculado son idnticos a los de un envase no inoculado.
La distribucin del inculo (uniforme o no) imita a la esperable de forma natural.
La inoculacin imita a la contaminacin esperable de forma natural (todo el alimento o solo la parte
sospechosa; en profundidad o en superficie).
El nivel de contaminacin diana es de 50 ufc/g, y el logrado no excede de 100 ucf/g.
7. Condiciones de conservacin (incubacin) del alimento inoculado
Se conserva en las condiciones ms probables normales de uso a lo largo de toda su vida til,
incluyendo abusos de temperatura.
Se justifican las condiciones de conservacin
8. Mtodos analticos para L. monocytogenes
Deteccin: (ANLISIS OPCIONAL) Se utiliza el mtodo de referencia (EN ISO 11290-1) o uno alternativo
validado o registrado.
Recuento: Se utiliza el mtodo de referencia (EN ISO 11290-2) o uno alternativo validado o registrado.
El lmite del recuento no excede de 10 ufc/g , (o preferiblemente 5 ufc/g*).
El lmite del recuento se logra segn la metodologa descrita en la gua. *
Se expresan cuantitativamente los resultados del recuento de 4 colonias o menos (p.e. 3 colonias tras
emplatar 2 ml iniciales sera 1,5 ufc/g). *
Los resultados por debajo del umbral (0 colonias contadas) son raros en el da 0, y si son una
mayora (p.e. 2 3 resultados de 3), la prueba no se acepta. *
La desviacin estndar entre los tres log-resultados del da 0 (o entre 2 log-resultados si uno es
inferior al lmite) es menor que 0.3 log ufc/g. *
59
NO
Anexo 7
D) ENSAYOS DE DESAFO PARA POTENCIAL DE CRECIMIENTO (continuacin)

9. Clculo del potencial de crecimiento*
El potencial de crecimiento () se define como la diferencia entre el log10 ufc/g despus del crecimiento
y el log10 ufc/g de la concentracin inicial:
- Para cada uno de los tres lotes, se calcula la diferencia entre la mediana de la concentracin del
da final y la mediana de la concentracin del da 0 (expresadas en log10 ufc/g). Si uno de los
tres resultados es < lmite de recuento, la mediana ser el menor valor de los otros dos resultados.
- Se elige como la diferencia mxima entre el da final y el da 0 entre los tres lotes.
10. Interpretacin de resultados*
- Si < 0.5 log10: el alimento no puede favorecer el crecimiento.
- Si > 0.5 log10: el alimento s puede favorecer el crecimiento.
El se usa para predicciones de crecimiento en alimentos que s pueden favorecerlo (concentracin
final y/o concentracin inicial)
11. Informe de la prueba *
Nmero de informe
- Justificacin de las condiciones de conservacin (tiempo y T)
Cepas inoculadas:
- Preparacin del inculo
Ensayo de desafo:
- Nmero de unidades de prueba
- Masa o volumen de las unidades que se inoculan.
- Volumen del inculo.
- Mtodo de contaminacin
- Condiciones de conservacin (tiempo/ T) de las unidades inoculadas.
- Mtodos microbiolgicos empleados (recuento y deteccin)
- Caractersticas fsico-qumicas al principio y al final de la prueba.
- Resultados brutos y clculos realizados.
- Potencial de crecimiento e interpretacin.
60
NO
Anexo 7
E) ENSAYOS DE DESAFO PARA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO

1. Nmero de lotes probados*
Se prueban al menos tres lotes de un mismo alimento
2. Nmero mnimo de unidades de prueba por lote*
Curva de crecimiento (max) en unidades inoculadas: de 10 a 15
Deteccin de L. monocytogenes el da 0 y recuento el da final en unidades NO inoculadas
(muestras blancas): 3 + 3
Caractersticas fsico-qumicas en unidades inyectadas con suero: 3 + 3 (1 + 1 si se demuestra
homogeneidad)
Recuento de microflora en unidades no inoculadas: 2 10 15
3. Preparacin y procesado de las unidades no inoculadas *
La prueba se invalida si se detecta L. monocytogenes en muestras blancas el da 0
En su caso, el laboratorio interpreta el recuento de L. monocytogenes obtenido en muestras
blancas el da final
Se inocula suero fisiolgico estril a las unidades en las que se determinan caractersticas fsicoqumicas.
Se realiza el recuento de la microflora asociada (aerobios msofilos o microflora especfica) bien
en cada punto/momento de muestreo o bien en el da 0 y el da final
4. Cepas a inocular *
Se utilizan 2 cepas por separado: una cepa de referencia y otra aislada del mismo alimento o de
uno similar.
5. Preparacin del inculo *
Se realizan dos subcultivos previos de cada cepa, durante el tiempo necesario para alcanzar la
fase de crecimiento estacionaria:
- Primer subcultivo en Caldo de soja y triptona (TSB) o Infusin de corazn y cerebro (BHI) a T de
37 C hasta el comienzo de la fase estacionaria.
- Segundo subcultivo en idnticas condiciones.
6. Procedimiento de inoculacin *
Para cada curva, las unidades de prueba se inoculan solo con una cepa (no con una mezcla)
El inculo no excede el 1% del volumen de la unidad de prueba.
Los gases del envase inoculado son idnticos a los de un envase no inoculado.
La distribucin del inculo (uniforme o no) imita a la esperable de forma natural.
La inoculacin imita a la contaminacin esperable de forma natural (todo el alimento o solo la
parte sospechosa; en profundidad o en superficie).
El nivel de contaminacin diana es de 100 ufc/g aproximadamente.
7. Condiciones de conservacin (incubacin) del alimento inoculado *
Las unidades inoculadas se incuban a una temperatura fija, cercana a la elegida para
prediccin
8. Mtodos analticos para L. monocytogenes
Deteccin: Se utiliza el mtodo de referencia (EN ISO 11290-1) o uno alternativo validado o
registrado.
Recuento: Se utiliza el mtodo de referencia (EN ISO 11290-2) o uno alternativo validado o
registrado.
El lmite del recuento no excede de 10 ufc/g (o preferiblemente 5 ufc/g*).
9. Clculo de la velocidad de crecimiento mxima *
Se calcula segn se describe en la gua.
10. Interpretacin de resultados
A partir de la velocidad de crecimiento mxima a la T de referencia, se calculan velocidades
para los perfiles tiempo/temperatura ms probables para el alimento hasta su consumo final.
61
NO
Anexo 7
E) ENSAYOS DE DESAFO PARA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO (continuacin)

11. Informe de la prueba *
Nmero de informe
Cepas inoculadas:
- Preparacin del inculo
Ensayo de desafo:
- Nmero de unidades de prueba analizadas
- Masa o volumen de las unidades que se inoculan.
- Volumen del inculo.
- Mtodo de contaminacin
- Condiciones de conservacin (tiempo/ T) de las unidades inoculadas.
- Mtodos microbiolgicos empleados (recuento y deteccin)
- Caractersticas fsico-qumicas al principio y al final de la prueba.
- Resultados brutos y clculos realizados.
- Velocidad de crecimiento mxima e interpretacin.
62
NO
Anexo 8. Ejemplos de caractersticas fsico-qumicas

Tabla 10. Valores orientativos de actividad de agua (aw) y pH para distintos alimentos
Sector
Carnes
Alimentos
aw
Picada cruda pollo
0,98
Picada cruda vacuno
0,98
Picada cruda cerdo
0,98
6,36,4
5,45,8
5,66,0
4,76,2
6,36,5
Alimentos
aw
pH
Bacalao hervido
5,36,1
Crema de esprragos
6,1
Judas blancas
guisadas
Judas blancas
guisadas con cerdo
Pat
5,9
Patatas en ensalada
Salchicha cocida tipo

Frankfurt
6,2
Pollo guisado con

tallarines
Arenque curado
5,76,2
Postre de gelatina
2,6
Arenque en
escabeche (cocido)
4,0
Salsa de arndanos
2,3
Embutidos
fermentados
Jamn serrano, cecina
Atn crudo
0,98
Bacalao crudo
0,98
Caballa cruda
0,98
Caviar americano
Pescado ligeramente
salado
Pescado muy salado
0,98
Langosta cocida
Almejas crudas
0,98
Ostras
0,98
Moluscos
Clara de huevo
Huevos
Mayonesa
Leche entera
0,98
Leche condensada
azucarada
0,850,93
5,96,1
6,06,1
5,96,2
5,76,0
Salsa de curry
Comidas
Sopa de alubias
Sopa de fideos
5,6
Sopa de verduras y
hortalizas
5,76,2
6,56,9
5,05,7
5,56,5
6,36,7
5,56,5
4,25,2
4,75,6
Tofu (soja)
7,20
Sopa de guisantes
Sopa de ostras
6,57,0
6,87,0
7,17,4
5,97,1
6,36,7
9,39,6
3,04,1
6,46,8
Sopa de pato
Sopa de pollo y fideos
Sopa de setas
Sopa de pollo y fideos
Sopa de tomate
Leche acidfila
Lcteos
4,5
0,930,98
0,600,85
0,850,93
6,0
5,75,8
6,06,2
Sopa de carne
4,14,8
Queso crema
Queso fresco
(cottage)
Quesos de
maduracin corta
Quesos muy
madurados
Queso tipo Cheddar
curado
Merluza asada
0,930,98
0,600,85
Carne de cangrejo
Gambas crudas
Lenguado hervido
0,850,93
Pescados
Lcteos
Sector
4,85,5
5,15,8
6,16,9
6,76,8
3,94,6
6,26,7
Jamn cocido
Crustceos
pH
4,0
Queso tipo Camembert
7,4
Queso tipo Gouda
Queso tipo Parmesano

Queso tipo Roquefort
63
Kefir, koumis, yakult,

miru-miru
Queso tipo Gruyere
5,9
0,98
0,930,98
5,66,6
5,25,3
4,74,8
Anexo 8
Sector
Alimentos
aw
pH
Frutas desecadas
0.90
4,5
Frutas secas
0,600,85
Macedonias
0,98
Frutas
Mermeladas
Mermeladas y
confituras
Frutas
ctricas
0,98
Ctricos
0,98
Limones
0,98
Pomelo en trozos,
pulpa, zumo
0,98
Zumo de lima
0,98
Zumo de limones
0,98
Zumo de naranja
0,98
Albaricoques
Frutas de
hueso
Frutas de
pepita
Frutas
pequeas
0,98
Ciruelas pasas
Melocotn
0,98
Zumo de cerezas
0,98
Manzanas
0,98
Manzana asada
con azcar
Zumo de
manzana
0,98
Frambuesas
0,98
Fresas
0,98
Uvas
0,98
Zarzamoras
0,98
Zumo de
arndanos
0,98
Zumo de grosellas
0,98
Aceitunas negras
Aguacates
Otras frutas
Dtiles
Pia triturada, en
rodajas
0,98
Zumo de pia
0,98
Alimentos
Brcol
aw
0,98
Brcoli cocido
3,64,0
3,54,0
Hortalizas
Brassica
Col fermentada
Coliflor cocida
0,600,85
Zumos
Ciruelas
Sector
Repollo
3,55,5
3,03,5
2,22,4
2,93,5
2,22,4
2,22,6
3,04,0
3,34,8
2,83,0
3,74,3
3,44,2
3,43,6
3,43,5
3,23,5
3,33,5
2,93,7
3,03,9
3,54,5
3,04,2
2,52,7
Calabacn
Calabacn cocido
Hortalizas
Cucurbitceas
Calabaza
Meln
Pepinillos en
vinagre (actico)
Escarola
Hortalizas
de hoja
Espinaca
0,98
Espinaca cocida
Hortalizas
Leguminosas
Judas verdes
0,98
Patatas cocidas y
peladas
Patatas en pur
Patatas fritas
5,1
<0,60
Remolacha
Hortalizas
Races y
tubrculos
Hortalizas
Setas
3,0
5,97,3
6,2 6,5
6,26,4
3,24,1
3,43,7
0,98
Hortalizas
Solanceas
Hortalizas
Tallos
64
Remolacha
cocida
Zanahorias
rodajas
Zanahorias
cocidas
Zanahorias en
pur
Zanahorias en
zumo
Setas
0,98
0,98
0,98
Setas cocidas
Pimientos
0,98
Tomates
0,98
Tomate
concentrado
0,930,98
Tomate en zumo
0,98
Puerros
0,98
Puerro cocido
pH
5,26,0
6,36,5
3,13,7
6,46,8
5,2 6,8
5,05,3
5,76,1
5,25,5
6,136,58
4,07,0
5,76,0
4,85,8
6,67,1
4,95,5
5,45,9
4,95,8
5,26,5
5,35,6
5,56,0
4,55,8
5,25,8
6,06,5
6,06,2
4,34,9
4,14,4
4,14,4
3,94,4
5,45,6
5,56,1
Anexo 9. Criterios, definiciones y acrnimos

CRITERIOS MICROBIOLGICOS PARA LISTERIA MONOCYTOGENES
Tabla 11. Criterios microbiolgicos de seguridad alimentaria para Listeria monocytogenes (Captulo 1 del
Anexo I del Reglamento CE n 2073/2005)
Categoras de alimentos
1.1. ALC destinados a los

lactantes, y ALC destinados
a usos mdicos especiales
(4)
Plan de
muestreo (1)
n
10
1.2. ALC que pueden

favorecer
el desarrollo de L.
monocytogenes, que no
sean los destinados a los
lactantes ni para usos
mdicos especiales
1.3. ALC que no pueden

favorecer el desarrollo de L.
monocytogenes, que
no sean los destinados a los
lactantes ni para usos
mdicos especiales (4), (8)
Limites (2)
Mtodo analtico
de referencia (3)
Fase en la que se aplica

el criterio
Ausencia en
25 g
EN/ISO 11290-1
Productos
comercializados durante
su vida til
100 ufc/g (5)
EN/ISO 11290-2 (6)
Productos
su vida til
Ausencia en
25 g (7)
EN/ISO 11290-1
Antes de que el alimento

haya dejado
el control inmediato del
explotador de
la empresa alimentaria
que lo ha producido
100 ufc/g
EN/ISO 11290-2 (6)
Productos
su vida til
(1) n = nmero de unidades que componen la muestra; c = nmero de muestras que dan valores entre m y
M.
(2) Para los puntos 1.1-1.25 m = M.
(3) Se utilizar la ltima versin de la norma.
(4) En circunstancias normales, no se exige realizar pruebas regulares con respecto a este criterio para los
siguientes productos alimenticios listos para el consumo:
los que hayan recibido tratamiento trmico u otro proceso eficaz para eliminar L. monocytogenes,
cuando la recontaminacin no sea posible tras este tratamiento (por ejemplo, productos tratados
trmicamente en su envase final),
frutas y hortalizas frescas, enteras y no transformadas, excluidas las semillas germinadas,
pan, galletas y productos similares,
aguas embotelladas o envasadas, bebidas refrescantes sin alcohol, cerveza, sidra, vino, bebidas
espirituosas y productos similares,
azcar, miel y golosinas, incluidos productos de cacao y chocolate,
moluscos bivalvos vivos,
sal de cocina.
(5) Este criterio se aplica si el fabricante puede demostrar, a satisfaccin de la autoridad competente, que el
producto no superar el lmite de 100 ufc/g durante su vida til. El explotador podr fijar lmites intermedios
durante el proceso que deberan ser lo suficientemente bajos para garantizar que no se supere el lmite de
100 ufc/g al final de la vida til.
(6) Sobre una placa de Petri de 140 mm de dimetro o tres placas de Petri de 90 mm de dimetro se siembra
1 ml de inculo.
(7) Este criterio se aplica a los productos antes de que hayan abandonado el control inmediato del
explotador de la empresa alimentaria cuando este no pueda demostrar, a satisfaccin de la autoridad
competente, que el producto no superar el lmite de 100 ufc/g durante su vida til.
(8) Se considera automticamente que pertenecen a esta categora los productos con pH 4,4 o aw 0,92,
productos con pH 5,0 y aw 0,94, y los productos con una vida til inferior a 5 das. Otras categoras de
productos tambin pueden pertenecer a esta categora, siempre que se justifique cientficamente.
65
Anexo 9
DEFINICIONES
Abuso de temperatura: temperatura mayor que la fijada para el procesado y
almacenamiento al por menor, segn las temperaturas establecidas en las normas
nacionales o en los reglamentos comunitarios, incluyendo las condiciones de
conservacin domsticas razonablemente previsibles. El abuso de temperatura cubre
toda la cadena alimentaria, tomando en consideracin las desviaciones de
temperatura de los expositores refrigeradores de los minoristas, as como la
conservacin en los hogares.
Actividad de agua (aw): el trmino se refiere al agua no ligada disponible en el
alimento, y no es lo mismo que el contenido en agua. El agua del alimento que no
est unida a otras molculas puede favorecer el crecimiento microbiano. La escala de
la actividad de agua se extiende desde 0 a 1.0 (agua pura), aunque en la mayora de
los alimentos vara desde 0.2 para los muy secos hasta 0.99 para los alimentos frescos
ms acuosos.
Alimento listo para el consumo (ALC): alimento destinado por el productor o el
fabricante al consumo humano directo, sin necesidad de cocinado u otro tipo de
transformacin eficaz para eliminar o reducir a un nivel aceptable los microorganismos
peligrosos.
Cadena del fro: sistema continuo que proporciona conservacin en fro a los alimentos
perecederos, desde la produccin hasta el consumo.
Cepa de referencia (ISO 11133-1:2000): microorganismos definidos por lo menos, al
nivel de gnero y especie, catalogados y descritos segn sus caractersticas, y
preferiblemente de origen conocido, normalmente obtenidos de una coleccin
nacional o internacional reconocida.
Lote: grupo o conjunto de productos identificables, obtenidos por un proceso dado
bajo circunstancias prcticamente idnticas y producido en un lugar dado dentro de
un periodo de produccin definido.
Muestreo: procedimiento utilizado para seleccionar una o ms unidades.
pH: medicin de la acidez o alcalinidad de un alimento; el pH 7 se considera neutro,
por lo que valores menores de 7 se consideran cidos, y los superiores son bsicos o
alcalinos.
Poblacin: grupo o conjunto de unidades que son objeto de una investigacin,
relacionado con un proceso y una receta dada. En la prctica, el lote estudiado.
Subpoblacin muestreada: la(s)
representativas de la poblacin.
unidad(es)
seleccionada(s), que
se
suponen
Unidad de prueba: alcuota de una unidad comercial, destinada a ser analizada.

Vida til: periodo de tiempo anterior a la fecha de caducidad o de consumo
preferente, segn se define respectivamente en los artculos 9 y 10 de la Directiva
2000/13/CE.
66
Anexo 9
ACRNIMOS
ALC: alimentos listos para el consumo
APPCC: anlisis de peligros y puntos de control crticos
ATCC: American Type Culture Collection- Estados Unidos
CE: Comisin Europea
CEN: Centro Europeo de Normalizacin
CECT: Colleccin Espaola de Cultivos Tipo- Espaa
CIP: Collection de lInstitut Pasteur- Francia
EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority)
ISO: Organizacin
Standardization)
Internacional
de
Estandarizacin
NCTC: National Collection of Types Cultures- Reino Unido

PCCs: puntos de control crticos
PCH: prcticas correctas de higiene
67
(International
Organization
for
COLECCIN DOCUMENTOS TCNICOS DE HIGIENE Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
N 1
Reacciones de hipersensibilidad a los alimentos. Normativa de aplicacin en el
control oficial de los alrgenos presentes en alimentos.
N 2
Protocolo de verificacin de etiquetado de alimentos.
N 3
Directrices de diseo, implantacin y mantenimiento de un sistema APPCC y
unas prcticas correctas de higiene en el sector de comidas preparadas.
N 4
Cuestionario para comprobar el grado de implantacin del control de
alrgenos en el sistema APPCC y GPCH de las industrias elaboradoras.
N 5
Nuevos alimentos e ingredientes alimentarios.

Vida - Til Listeria 2 - Edici-N 21-09-2012

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Documentos Tcnicos de Higiene y Seguridad Alimentaria n 6

Gua de estudios de vida til para

Gua de estudios de vida til para

El presente documento se ha redactado nicamente con fines informativos.

Silvia Iigo Nuez. Referente del Programa de Vigilancia y Control de

Alicia Jimnez Manso. Responsable del Subprograma de Control de

Comisin del Subprograma de Control de Contaminantes Biolgicos, ao 2010:

M Silvia Garca (Servicio de Salud Pblica del rea I)

Edicin: Segunda, agosto 2012

Paloma Martn Martn

A quin se dirige esta Gua

Qu contiene y cmo se utiliza

Estudios complementarios: tendrn en cuenta la variabilidad inherente al producto, los microorganismos en

Modelos matemticos de pronstico establecidos para el alimento de que se trate, utilizando

La determinacin de la duracin de la vida til es muy importante para la seguridad

los controles sobre los proveedores que garanticen la calidad de las

la confianza en los controles de las Prcticas Correctas de Higiene

la experiencia del fabricante con productos similares,

la velocidad de deterioro microbiolgico y el mantenimiento de la calidad

La duracin de la vida til es parte integral de la seguridad del producto, y para

El objetivo de los estudios de vida til para L. monocytogenes es demostrar que el

1. Evaluacin de la vida til combinando

2. Colaboracin entre empresas

La formulacin del producto debe ser la misma, y en caso contrario, debe

Las condiciones de conservacin y la vida til deben ser similares, y en caso

La microflora asociada (iniciadores) debe ser idntica, y en caso negativo,

La empresa debe demostrar a la autoridad competente que los productos y los

3. Documentacin de los estudios de vida

Caractersticas del producto y

Caractersticas del producto y bibliografa cientfica

con pH < 4,4

En el Anexo 8 se recopilan los valores de actividad de agua y de pH publicados para

Caractersticas del producto y bibliografa cientfica

Anaerobio facultativo (puede crecer en presencia y ausencia de oxgeno, p.e. en

L. monocytogenes tiene unas caractersticas que aumentan su importancia como

El histrico de datos indica los niveles de L. monocytogenes que se

El histrico de datos sobre los niveles de L. monocytogenes existentes en los

El histrico de datos sobre los niveles de L. monocytogenes existentes en los

El histrico de datos generado durante un periodo de tiempo para ALC

Las empresas alimentarias deben garantizar, a satisfaccin de las autoridades

2. Microbiologa predictiva (Modelos

Los modelos obtenidos en medios microbiolgicos lquidos se usan para

Los modelos desarrollados en alimentos pueden describir eficazmente el

Tambin se han desarrollado algunos modelos intermedios, para tratar de

Los datos y modelos disponibles en la bibliografa se han incorporado a programas

Growth Predictor, del Instituto de Investigacin en Alimentos del Reino Unido.

Pathogen Modelling Programme, del Departamento de Agricultura de Estados

ComBase Predictor, resultado de la colaboracin entre Reino Unido, Estados

Algunos de estos modelos se han desarrollado para predecir el comportamiento del

Los modelos crecimiento/no crecimiento, que predicen la probabilidad de

Los modelos que predicen los tiempos de latencia y la velocidad de

En la prctica, la microbiologa predictiva puede ser til para las siguientes

Predecir en crecimiento bacteriano en distintas condiciones.

3. Pruebas de laboratorio especficas

Es probable que los ensayos de desafo para valorar el potencial de

Los ensayos de desafo para valorar la velocidad mxima de crecimiento

Los estudios de durabilidad son particularmente apropiados cuando la

Ensayos de desafo max

max (velocidad mxima de

Crecimiento de L.m durante vida

Figura 1. Datos obtenidos de los ensayos de desafo y los estudios de durabilidad

3.1. Estudios de durabilidad

3.2. Ensayos de desafo