Nombre de la prctica:

Biologa Molecular
Manejo y calibracin de micropipetas
Realiz:

Revis:

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

Prctica
1

Pginas

Autoriz:

Pgina 1

I INTRODUCCIN
Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volmenes pequeos y su
manejo nos ayuda en las distintas tcnicas cientficas. Los volmenes captables por
estos instrumentos varan segn el modelo: los ms habituales, denominados p20,
p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l, respectivamente.
En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de
valores determinado. Para absorber el lquido, el pistn es presionado hasta una
primera posicin, la punta es puesta en contacto con el lquido y luego, lentamente, se
permite que el pistn vuelva a su posicin original. Este paso permite el llenado de la
punta con el volumen correspondiente. La punta de plstico generalmente no se seca
por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe lquido.
TIPOS DE MICROPIPETAS
Los tipos: P1000, P200, y P20.
P1000 es til para volmenes de 200 hasta 1000
L
P200 es til para volmenes de 20 hasta 200 L.
P20 es til para volmenes de 0.5 hasta 20 L.
Asegurarse que est usando la micropipeta
correcta para el volumen que necesita. Tambin,
asegrese que la micropipeta est realmente lista
para el volumen que necesita revisando la
ventana de volumen, si es necesario, cambiando
el volumen mediante el dispositivo del control o
mando del volumen hasta que la micropipeta
corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente;
varias personas usarn las pipetas, no siempre se
encontrar como usted la necesita).
No Trate de colocar la micropipeta para volmenes
mayores que el mximo, o para volmenes
menores del cero, esto descalibrar y daar la
micropipeta.
Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no
utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer
esto contaminar la micropipeta y la puede daar).
No utilizar la micropipeta con lquidos que atacan
el polipropileno.
No utilizar lquidos que estn emitiendo vapores.
La temperatura de los lquidos debe estar entre 15 y 40 C.
Al poner la punta, asegrese que la punta sea del tipo correcto y que est
correctamente ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200
son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o blancas.

Por calibracin de micropipetas se entiende la comparacin de volumen real y volumen

terico. El volumen real se determina por va gravimtrica.

II CONOCIMIENTOS PREVIOS
1.-De qu depende el tipo de micropipeta que utilizar?
2.- Cul es la diferencia entre calibracin, verificacin y ajuste?
3.- Cuidados que se deben de tener al manejar una micropipeta:
III OBJETIVO:
Conocer las partes y el funcionamiento adecuado de las micropipetas; para optimizar los
resultados al momento de utilizarla.
IV METODOLOGIA
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P20
Agua destilada
Glicerol
Balanza analtica
vidrios de reloj de 5 cm de dimetro
Puntas para las micropipetas.

PROCEDIMIENTO
Para el uso adecuado de la micropipeta hay que asegrese que est usando la
micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. Tambin que la micropipeta
est realmente lista para el volumen que necesita revisando la ventana de volumen. Si
es necesario, cambiar el volumen mediante el dispositivo del control o mando del
volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente;
varias personas usarn las pipetas, no siempre se encontrar como usted la necesita).
1) Partes de la micropipeta
Identificar las partes de la micropipeta ayudndose de la imagen en la Figura.

2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta segn corresponda.
b) Colocar el pulgar sobre el mando o mbolo de pipeteado.
c) Oprimir el mbolo hasta el primer un punto de resistencia alto o "tope". Si contina
presionando encontrar un punto donde el mbolo ya no se mueve hacia abajo, este
corresponde al segundo punto de resistencia alto o "tope".
d) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del lquido hasta una
profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presin del
mbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el mbolo abruptamente,
al permitirlo causar que el lquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo
volmenes inexactos y generando contaminacin de la pipeta. Una vez el mbolo se
haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el lquido durante un
segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.
3) Expulsin de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.
b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este
procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rpido har que queden gotas
4

de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notar que al oprimir

hasta el segundo alto se expele todo el lquido de la punta.
d) Lo anterior es cierto para la mayora de soluciones acuosas, excepto para las
soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferir volmenes inexactos.
4) Calibracin de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibracin. Comprobar la calibracin de la pipeta es un
procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energa, y reactivos. En
esta prctica aprender a usar la micropipeta de tamaos diversos medir su exactitud,
precisin y calibracin.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de
variacin (CV%) en todo el rango usando al menos dos volmenes diferentes; por
ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volmenes de 300 L y 1000 L. Para
P200 revisar los volmenes de 60 y 200 L. Para P10 revisar 3 y 10 L.
a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.
b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispnselo en la tapa
de la caja de petri. Registre el peso del agua aadido. La densidad del agua es 1
g/mL a 25C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a
una masa de 1 g, 300 L a 0.3 g, 200 L a 0.2 g, 60 L a 0.06 g, 10 L a 0.01 g y
3 L a 0.003 g.
d) Repita el procedimiento de 5 a 10 veces para cada volumen.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen
V Resultados:
Clculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variacin (CV%)
Valor medio
X = Xi /n
donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medio
V=X.Z
donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valore del control a 21,5 C (Z = 1,0032)

Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

Desviacin estndar
S = Z . (Xi X)2
n1

Coeficiente de Variacin
5

CV= (S*100)/V

Lmites de tolerancia para micropipetas:

VI Discusiones:
VII Conclusiones:
VIII Bibliografa:

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Extraccin de DNA
Realiz:

Prctica
2
Revis:

Pginas

Pgina 1

Autoriz:

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

I.

INTRODUCCIN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de los

estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso,
los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas
fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son
dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar
mtodos de extraccin adecuados.
La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que
confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la
retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR.
Etapas en la extraccin de ADN
Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un
procedimiento qumico son:
1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotr-picas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su
desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para
eliminar las membranas.
2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de
una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el
acetato de amonio o el acetato sdico.
3. Purificacin. Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol fro o isopropanol y recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante
se llevar las sales aadidas previamente.
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse
Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser secado
completamente.
La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de
agarosa y posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o directamente al
espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de 200 a 350 nm. El ADN purificado se
puede cuantificar con un espectrofluormetro mediante el uso de fluorforos especficos
(Picogreen, Molecular Probes).
El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una membrana de
slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que
acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido

I.

CONOCIMIENTOS PREVIOS
8

1. Qu es el fenol-cloroformo y para qu es til en la extraccin de DNA?

2. Qu es y para qu sirve el Tris-HCL?
3. Qu es y para qu sirve el SDS?
4. Por qu utilizamos isopropanol y Etanol en la extraccin de DNA?
5.

II.

Uso de la proteinasa K en la eliminacin de protenas.

OBJETIVO

Adquirir conocimiento de extraccin de ADN por el mtodo de fenol cloroformo de tejidos,

identificar el propsito de cada reactivo durante la extraccin del ADN de la muestra.

III.

METODOLOGA

1. Materiales y equipo:
-Micro pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul.
-Bao de Mara.
-Plato caliente.
-Termmetro.
-Incubadora.
-recipiente.
-Campana de extraccin.
-Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm.
-Cmara de electroforesis horizontal.
-Tubos de 1,5ml.
-Guantes de ltex sin polvo.
-Micro centrifugadora.
-Matraz aforado de 5mL y 25mL.

2. Reactivos
-Tris-HCL.
-EDTA.
-SDS.
-NaCl.
-Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (25:24:1).
-Isopropanol.
-Etanol.
-H20 estril.
-RNasa.
-Hielo.

3. Preparacin de soluciones

A) Buffer de extraccin

Nota: Mezcle los ingredientes, complete al volumen deseado y autoclave. Este Buffer se puede
almacenar por meses en la nevera, a 4C.
Protocolo:
Nota: Debern ser 3 muestras por equipo, cada equipo deber traer una muestra diferente.
1) Precalentar el buffer de extraccin a 55C por 10min.
2) En un tubo de 1,5mL introducir .5-1g de los tejidos utilizable.
3) Picar el tejido hasta tener trozos pequeos.
4) Agregar 500uL del buffer de extraccin precalentado.
5) Seguir picando/moliendo el tejido.
6) Incubar a 55C por 10 minutos.
7) Agregar 300uL de Fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Re suspender por agitacin
cuidadosamente hasta que se forme una emulsin. Elfenol:cloroformo es sumamente txico y
todo el trabajo con este reactivo debe hacerse en
campana de extraccin.
8) Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
9) Transferir la fase acuosa (la de arriba) con una pipeta a un tubo nuevo de 1,5mL.
Nota: No transferir el fenol cloroformo con la fase acuosa.
10) Repetir la limpieza con fenol:cloroformo:isoamilalcohol (pasos 7-8-9) por 2-3 veces.
11) Agregar un volumen de NaCl (5M) 5mL correspondiente al 10% de la muestra, y mezclar
bien.
12) Agregar un volumen de isopropanol frio correspondiente al volumen de la muestra
resultante del punto 10.
13) Centrifugar a temperatura ambiente, a 12000rpm durante 5min y descartar lquido por
inversin del tubo.
14) Agregar 400uL de etanol frio al 70%.
15) Centrifugar a temperatura ambiente a 12000rpm durante 3 min y descartar el lquido por

10

inversin del tubo.

16) Dejar secar el ADN a temperatura ambiente, con el tubo abierto.
17) Re suspender en 50uL de H2O estril y agregar 1uL de RNasa (10mg/mL).

IV.

Resultados

Clculos.5 equipos (3 muestras por equipo)= 15 muestras.

Buffer:

-SDS1%
1
(25) = 0.25
100
-EDTA de sodio (50mM), PM= 372.2 g/mol.
(. 05 )(372.2/)(. 025) = 0.465
-NaCl (500mM), PM=58.442g/mol.
(. 5)(58.442 /)(0.025) = 0.730
-Tris-HCl (100mM), PM= 121.14g/mol.
(. 1)(121.14/)(. 025) = 0.30285

Otros reactivos a utilizar:

-400L etanol 70% (15 muestras) = 6mL.
-NaCl (5M) en 5mL
(5)(58.442/)(. 005) = 1.461

V.

Conclusiones

VI.

Bibliografa

Puerta C., Uruea C., 2009,Practicas de biologa molecular, pontificia universidad javeriana,
Bogot, Colombia.

11

Voet D., 2006, bioqumica,3era edicin, editorial medica panamericana, Buenos Aires,
Argentina.

www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Protocolos%20de%20extracci%C3%B3n%20de%20ADN%20de%
20mariposas%20fenol%20cloroformo.pdf

http://campodocs.com/articulos-para-saber-mas/article_49691.html

Rdstrm, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to generate PCR-compatible

samples. Mol. Biotechnol. 26, 133 46.

http://bitesizebio.com/2839/dna-precipitation-ethanol-vs-isopropanol/

12

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Extraccin de RNA
Realiz:

Prctica
3
Revis:

Pginas

Pgina 1

Autoriz:

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

13

I. INTRODUCCIN:
En los organismos celulares el ARN es la molcula encargada de dirigir la sntesis de
protenas, pues aunque el ADN es el que contiene la informacin que determina la
estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta
informacin y producir las protenas necesarias para el desarrollo y actividades de la
clula.
La mayor dificultad en la extraccin del ARN es evitar la contaminacin con RNAsas,
enzimas muy estables que no requieren cofactores para su funcin. Por lo tanto, se
deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual
inactiva las ribonucleasas por modificacin covalente.
En una tcnica sencilla de extraccin de ARN, las clulas son homogenizadas en
tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido.
El rendimiento del ARN total extrado depende del tipo de muestra y generalmente esta
en un intervalo de 4-7 g/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106clulas.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Cules son las precauciones que deben tomarse para evitar la contaminacin
con ARNsas exgenas?
2. Cul es la funcin del PBS en la extraccin de RNA?
3. Cules son las diferencias entre los mtodos de extraccin de ADN y de ARN?
4. Para qu es utilizado el Trizol?

III. OBJETIVO

Extraer ARN de diferentes muestras por mtodos fsico-qumicos as como

conocer la metodologa bsica para extraccin de ARN.

IV. MATERIAL Y EQUIPO

PBS 1X
Trizol
Cloroformo
Isopropanol
Etanol 70%
14

Agua para PCR o buffer TE (estril)

1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo

Gradillas
Campana de extraccin
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex

Material biolgico: insectos (por ejemplo moscas Drosophila melanogaster)

V. METODOLOGA

Extraccin de ARN
1. Colectar aproximadamente 10 moscas y colocarlas en un tubo eppendorf y
enjuagar con PBS 1X para eliminar residuos (4 veces) y mantener en hielo.
2. Macerar las moscas con 200 ul de PBS 1X , adicionar 250 ul de Trizol y mezclar
para homogenizar.
3. Incubar 5 min a temperatura ambiente y adicionar 50 ul de cloroformo.
4. Agitar vigorosamente por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
5. Centrifugar a velocidd mxima por 15 min y transferir el sobrenadante a un tubo
limpio.
6. Repetir los pasos 3 al 5 una vez ms
7. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y adicionar 750 ul de isopropanol,
mexclar e incubar 15 min a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a mxima velocidad por 10 min y decantar para eliminar el
sobrenadante.
9. Enjuagar con etanol al 70%, centrifugar a 6500 rpm por 5 min y remover el
sobrenadante.
15

10. Secar el pellet y resuspender en 20 ul de agua para PCR.

11. Guardar a -20C para su posterior cuantificacin y analisis en electroforesis.

Requerimientos de seguridad
Bata blanca de manga larga, pantaln largo, zapato cerrado y guantes de ltexo
vinilo.

VI. Resultados
VII.

Clculos

VIII.

Conclusiones

IX. Bibliografa

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3

ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344
pgs.

David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular

biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986

Catlogos de TRIzol casa comercial GIBCO.

16

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Electroforesis en gel de agarosa y
cuantificacin de DNA y RNA
Realiz:
Revis:

Prctica
4

Pginas

Pgina 1

Autoriz:

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

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I.

INTRODUCCION.

La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas en

funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El trmino
electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de un
campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego phoros,
significa trasladar. As pues, la electroforesis en gel es una tcnica consistente en
aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una placa de gel. La
fuerza motriz de la electroforesis es la tensin elctrica aplicada a los electrodos en
ambos extremos del gel. Las propiedades de una molcula determinan la velocidad con
que un campo elctrico puede desplazarla a travs de un medio gelatinoso.
Muchas macromolculas biolgicas importantes (por ejemplo, los aminocidos, los
pptidos, las protenas, los nucletidos y los cidos nucleicos) poseen grupos ionizables
y, a un pH determinado, existen en solucin como especies cargadas elctricamente,
sean cationes (+) o aniones (-). Segn la naturaleza de la carga neta, las partculas
cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo. As, por ejemplo, cuando se aplica
un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados
negativamente lo harn migrar hacia el nodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN y RNA. Se trata de una tcnica
sencilla y rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en
el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que es un agente
intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.
Los geles de poliacrilamida tambin constituyen un excelente medio de soporte para
separaciones electroforeticas , dado que reunen una serie de propiedades idoneas
:
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad
de compuestos quimicos . La poliacrilamida se forma por copolimerizacion de dos
compuestos, la acrilamida y la bis -acrilamida (N,N'-metilen-bis-acrilamida), en una
reaccion iniciada por la tetrametiletilendiamina (TEMED) y el persulfato de amonio.
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa:
Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacrido lineal (con un
peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de la unidad bsica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.
La agarosa es muy frgil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los
geles de agarosa poseen grandes poros y se emplean fundamentalmente para
separar las molculas grandes con un peso molecular de ms de 200 kDa.Los geles de
agarosa se obtienen por suspensin de agarosa seca en polvo en un tampn acuoso,
tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en
una solucin transparente. A continuacin, se vierte esta solucin en un molde para gel
y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rgido. Al
endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su
concentracin.
18

Tampn de electroforesis:
Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo
bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 7,8). Los
tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradasy se
conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una
concentracin de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No
obstante, una solucin de trabajo de 0,5x proporciona un poder ms que suficiente y en
la actualidad prcticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se practican
utilizando esta concentracin.
Concentracin de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamao determinado migra a diferentes velocidades a
travs de los geles segn la concentracin de agarosa. En funcin de la concentracin
de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a
50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en
concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (vase el cuadro 1).
Cuadro 1: concentracin recomendada de gel de agarosa para separar
molculas lineales de ADN
% Agarosa

Gamas de tamaos de
ADN (pb)

0,75
1,0
1,25
1,5
2,0
2,5

10 000 15 000
500 10 000
300 5 000
200 4 000
100 2 500
50 1 000

Marcador de peso molecular de DNA o RNA.

Para una tensin, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampn determinadas,
la distancia de migracin depende del peso molecular del material inicial. As pues,
debe cargarse un ADN marcador de tamao conocido en las ranuras situadas en los
extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un nmero
determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el
tamao de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsin
sistemtica del gel durante la electroforesis.
Tampn de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer
lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un
colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol,
19

etc.).El tampn de carga se emplea con tres fines:

Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo
Aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga
Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace
hacia el nodo a una velocidad previsible.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Qu reactivos a utilizar se deben de manipular con especial cuidado debido a
su toxicidad?
2. Para que sirve el tampon de carga?
3. Cul es la carga neta del DNA y RNA, y a que se debe dicha carga?
4. Cul es el principio fisico de la electroforesis?
5. Cmo se realiza la cuantificacin de cidos nuclicos?

II.

OBJETIVO

Lograr la separacin de fragmentos de DNA y RNA previamente extrados, para su

posible identificacin.
Cuantificar DNA y RNA de las prcticas anteriores

IV. METODOLOGIA
IV.1. Material y equipo

Unidad de electroforesis horizontal con alimentacin elctrica

Horno microondas o incubador-agitador
Micropipetas
Tubos de reaccin de 1,5 ml
Balanza que pueda pesar 0,01 g
Esptulas
Soporte para tubos de reaccin
Material de vidrio
Transiluminador (radiacin UV, 312 nm)
Instrumentos para documentacin (por ejemplo, cmara
magnetoscopio).
Peines
Puntas amarillas y azules para micropipeta

Polaroid

20

IV. 2. Reactivos y soluciones

Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutgena/carcingena
potente y moderadamente txica. Se debern llevar siempre guantes cuando se
manipulen soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.
Agua desionizada
Agarosa grado biologa molecular
Bromuro de etidio, CAS 1239-45-8, (0,5 g/mL)
Agua estril o buffer TE.
Tampn de TBE50x
Tampn de carga
IV. 3. Requerimientos de seguridad
Bata blanca larga y de mangas largas. Necesario guantes, lentes o mascarilla porque
solamente se trabaja con agua .

IV.4 Disposicin de residuos

Segn indique el responsable del laboratorio.

IV. 5. Procedimiento

Sellar los bordes de un molde de plstico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos
completos al aadir la solucin de agarosa.
Diluir tampn de TBE 50x y preparar la cantidad adecuada de tampn de TBE 0,5x
para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.
Pesar la agarosa en polvo segn lo indicado para obtener la concentracin
requerida (0.8-1 % para DNA genmico, )y aadirla a una cantidad apropiada de
tampn de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con tapa suelta (normalmente
150 ml de solucin de gel para un molde de 15 x 15 cm y 100 ml de gel para un
molde de 15 x 10 cm).
Calentar la mezcla en un horno microondas o en plato caliente hasta que se
disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solucin tras haberla
calentado).
Enfriar la mezcla a 50 - 60C y aadir bromuro de etidio (de una solucin madre de
10 mg/ml) hasta lograr una concentracin final de 0,2 g/ml y mezclar bien.
Verter la solucin en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de
gelempleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.
21

 Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y lacinta

adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.
Aadir tampn de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gelquede
cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.

Preparacin de la muestra
Tampn de carga
Muestra

3 l
7 l

Cargar 10 l de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador

adecuado en las calles primera y ltima.
Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables elctricos para que el
ADN migre hacia el nodo y aplicar una tensin de 5 - 10 V/cm.
Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia
adecuada a travs del gel (~ 40 - 60 minutos).
Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el gel
en un transiluminador UV (320 nm) y fotografiarlo.
Tirar el gel en el recipiente para residuos slidos destinado al bromuro de etidio
previsto a tal fin.
Cuantificacin de cidos nucleicos
(lo investigar el estudiante)
V. RESULTADOS
V.1. Clculos

VI. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFIA

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Gel electroforesis of DNA en:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA,
captulo 6.
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and Applications
of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
22

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Realiz:
Digestin de fago lambda
Fecha:

Prctica
5
Revis:

Pginas

Pgina 1

Autoriz:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

23

I.

INTRODUCCIN.

FABRICACIN DEL DNA RECOMBINANTE.

El desarrollo de las tcnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades
para la investigacin, ya que simplifica la obtencin de grandes cantidades de DNA
que codifican genes especficos, y facilita las investigaciones de la organizacin,
estructura y expresin gnicas.
Esta metodologa tambin ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria
biotecnolgica, que est suministrando un nmero creciente de productos al
mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de
segmentos de DNA especficos, incluyendo genes.
La tecnologa del DNA recombinante tiene sus races en el descubrimiento de las
enzimas de restriccin, una clase especial de enzimas capaces de cortar el DNA
en muchas bacterias. Dichas enzimas fueron aisladas por primera vez en 1970, sin
embargo, dichas enzimas haban sido observadas antes en la naturaleza cuando se
descubri que ciertos bacterifagos tenan un espectro limitado de huspedes.
Cuando el bacterifago infectaba las clulas del husped, ste tena enzimas
capaces de destruir el DNA del fago. Las enzimas de restriccin protegen a las
clulas bacterianas porque causan la hidrlisis del fago. El DNA bacteriano est
protegido de la destruccin porque la clula metila (inserta grupos metilo) algunas
de sus citosinas en el DNA.
Lo importante de las tcnicas con rDNA, es que la enzima reconozca y corte un sitio
en especifico (digiera) en el DNA y que corte esa secuencia en el DNA cada vez. En
experimentos de clonacin, se emplean enzimas que reconocen cuatro, seis u ocho
bases. En ocasiones algunas enzimas cortan la molcula de DNA de manera
alterna, es decir, que cortan la doble cadena en sitios que no son directamente
opuestos entre s.
Las enzimas de restriccin escinden el DNA en sitios muy especficos. Existen
diferentes tipos de enzimas:

Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posicin
aleatoria a cierta distancia del sitio de restriccin. No se utilizan normalmente en
la investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia especfica y cortan las dos
cadenas de la molcula de DNA con absoluta precisin dentro de la secuencia
reconocida. Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto
que cortan en sitios especficos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de
Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leda en direccin 5'-->3' es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leda tambin en direccin 5'--> 3'

Las enzimas de restriccin pueden diferir en la forma de cortar la molcula de DNA.

Algunas cortan en medio de la secuencia de reconocimiento lo que produce un flush o
24

un extremo roto (blunt end). Otras enzimas escinden de forma escalonada, dando
como resultado cadenas cortas de una sola cadena sobrepuesta (generalmente de 2 o
4 nucleotidos) a cada lado, se les denomina extremos cohesivos (cohesive ends) ya
que pueden unirse de nuevo por complementariedad de bases.
N-N-A-G-C-T-N-N

----------> N-N-A-G C-T-N-N

N-N-T-C-G-A-N-N

N-N-T-C G-A-N-N
Alu I
Romos

N-N-G-A-A-T-T-C-N-N

-------- N-N-G

N-N-C-T-T-A-A-G-N-N

A-A-T-T-C-N-N

N-N-C-T-T-A-A G-N-N
Eco RI
Cohesivos

Figura 1. El sitio de corte de una enzima de restriccin es especfico y lo hace en una secuencia
palndrome en el DNA, el corte puede generar extremos romos o extremos cohesivos (en escalera).
COMO CONFIGURAR UNA REACCIN CON ENZIMA DE RESTRICCIN
Una reaccin con una enzima de restriccin contiene el DNA a analizar, una enzima de restriccin, y un
buffer mixto para enzima de restriccin. Cada enzima prefiere un buffer en particular. Este buffer mixto,
generalmente a una concentracin de 10X, contiene un agente buffer (comnmente Tris) para mantener
el pH constante, sal (NaCl o KCl) para proveer una fuente ionica fuerte para la digestin, y Mg++ (MgCl2)
como un cofactor de actividad enzimtica.
Existen en el mercado enzimas de restriccin que suelen tener actividad a 10-20 unidades/ul. Una
unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 ug de DNA virus lambda
bacteriano en 1 hr en una reaccin de 50 ul. Generalmente se usan 10-20 unidades (1 ul) de enzima de
restriccin por reaccin. Es ms del necesario, pero este exceso asegura que la digestin sea completa.
El tiempo de la digestin toma 1.5 hrs, pero puede ser ms lenta.
Despus de la reaccin, las muestras son almacenadas bajo refrigeracin hasta el momento en el que se
necesite. El colorante de carga es aadido al DNA digerido y las muestras son cargadas en un gel.

25

Figura 2. Mecanismo de accin de una enzima de restriccin. La enzima corta

en secuencias especficas del DNA generando extremos cohesivos, este fragmento
permite el apareamiento de bases para ser unido a un vector.

II.

CONOCIMIENTOS PREVIOS.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Explique los fundamentos de la tecnologa de DNA recombinante.

Qu son las enzimas de restriccin? Cmo funcionan?
Cules son los sitios de corte para las enzimas EcoRI, HindIII y PstI?
Cules son las propiedades generales de las endonucleasas de restriccn?
(prop. bioqumicas).
Definir una unidad de endonuclesa de restriccin.
A qu se le llaman vectores? Qu tipo de vectores existen?
Describe la funcin de un bacterifago.
Cules son las caractersticas del fago lambda y por qu se utiliza para este
estudio?
26

III.

OBJETIVOS.

III.1 Objetivo general.

Comprender el uso de las enzimas de restriccin como herramientas

biotecnolgicas.

III.2 Objetivos particulares

Realizar la digestin del fago lambda usando tres enzimas de restriccin.

Separar por electroforesis los fragmentos generados en la digestin.
Realizar una grfica para determinar el peso de cada uno de los fragmentos,
usando un marcador de pesos moleculares conocido.
Realizar un anlisis de restriccin usando herramientas bioinformticas para
comparar con los resultados obtenidos experimentalmente.

IV. METODOLOGA
IV.1. Material y equipo
Micropipetas y puntas para micropipeta
Horno de microondas o plato caliente
Tubos Eppendorf
Bao Maria a 37C
Camara de electroforsisi horizontal.
Fuente de poder
Matraz Erlenmeyer 250 ml.
Termmetro.
Transiluminador o fotodocumentador.
Probeta 100 ml.
Esptula.
IV. 2. Reactivos y soluciones
DNA fago lambda sin digerir
DNA fago lambda digerido conHind IIII 0.2 g/l
Enzimas de restriccin PstI, EcoRI, HindIII
Buffer de restriccin 2x
Agarosa
Buffer TAE 1x y 0.25x
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
IV. 3. Requerimientos de seguridad

27

Bata de seguridad
Guantes de ltex
IV.4 Disposicin de residuos
El gel de agarosa ser depositado en un contenedor especial para desechos con
bromuro de etidio.
El buffer TAE puede guardarse para otra corrida de electroforesis.
IV. 5. Procedimiento
Digestion de DNA
1. Los tubos eppendorf sern marcados de la siguiente manera:
L = DNA lambda sin cortar
P = DNA lambda digerido con PstI
E = DNA lambda digerido con Eco RI
H = DNA lambda digerido con HindIII
2. A cada tubo se le agregarn 4 L del DNA de fago lambda sin cortar, 5 L del
buffer de restriccin, y 1 l de enzima, de acuerdo con el siguiente esquema.
Completa el esqema. (Nota: primero adicionar el DNA, luego el buffer de
restriccin y finalmente la enzima. Usar una punta limpia para el buffer y cada
enzima)
Tubo

DNA lambda

L
P
E
H

4 L
4 L
4 L
4 L

Buffer de
restriccin
6 L
6 L
6 L
6 L

PstI

EcoRI

HindIII

--1 L
-----

----1 L
---

------1 L

3. Cerrar cada tubo y mezclar de la siguiente manera: tomar el tubo entre el dedo
indice y el pulgar de una mano y dar pequeos golpes al fondo del tubo con el
dedo ndice de la otra mano.
4. incubar a 37C por 30 min.
5. Despus de la incubacin, las muestras se pueden guardar en el refrigerador
hasta el siguiente periodo de laboratorio (si se desea, si no, puede continuar).

Mientras se espera el tiempo de incubacin preparar el gel de agarosa para la

realizacin de la electroforesis

28

La concentracin recomendada para el anlisis de los fragmentos es agarosa al

1%. Esta concentracin da una buena resolucin de los fragmentos. Se recomienda
que el grosor del gel sea de 0.75 a 1 cm para facilitar su manejo.
6. Despus de la incubacin, se le agrega a cada uno de los tubos 2 L de buffer
de carga, el cual contiene dos colorantes para poder monitorear la electroforesis.
Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta
manera se evita la contaminacin cruzada.
7. Los tubos se mezclan bien.
8. Opcional: se pueden incubar las muestras de DNA a 65C por 5 minutos y al
terminar, ponerlas en hielo.
9. Se retiran los peines y se coloca la bandeja dentro de la cmara de electroforesis
(los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el catodo: electrodo con
carga negativa).
10. La cmara de electroforesis se llena TAE 0.25x hasta que se cubran los pozos.
11. Cargar 10l de cada muestra en pozos separados en la cmara con el siguiente
orden.

Pozo

1
M

2
L

3
P

4
E

5
H

M = Marcador de peso conocido

12. Una vez cargadas las muestras se coloca la tapa con los electrodos y se conecta
a la corriente (fuente de poder). Aplicar 200V por 20 min. Verificar que las
muestras corran hacia el lado positivo de la cmara.
13. Cuando termine la electroforesis, desconectar el equipo y observar el gel en el
transiluminador.
14. Fotografiar el gel para su anlisis.
V. RESULTADOS
o Organizacin de datos
Uno de los primeros pasos para analizar los datos es determinar los tamaos
aproximados de cada uno de los fragmentos de restriccin. Esto se puede hacer
comparando los fragmentos de DNA de restriccin con fragmentos de DNA de tamaos
conocidos o estandarizados.
Se usarn dos mtodos: El primero est basado en una valoracin visual, la cual
no es tan precisa. El segundo mtodo involucra la creacin de una curva estndar. El
marcador que se utilizar para ambos mtodos es el DNA digerido por HindIII lambda.
1. Usando una regla, mide la distancia (en mm) que cada uno de los fragmentos o
bandas que han migrado desde el pocillo. Mide la distancia desde la parte baja
29

del pozo a la lnea baja de cada banda de DNA y registra los datos en la
siguiente tabla.
2. Valora los tamaos de cada banda en pares de bases. Compara la distancia
recorrida de las bandas conocidas (lamda, pstI, EcoRI) con las bandas de
HindIII. Escribe los datos estimados en la tabla.

3. Una forma ms exacta para conocer el tamao de fragmentos de DNA utiliza la

construccin de una curva estndar en base a las medidas obtenidas de las
bandas de HindIII. Despus, se construye una curva estndar con las medidas
de los otros fragmentos y se determinar con precisin el tamao de cada
fragmento.

*Tabla de datos: Mide la distancia en mm que cada fragmento migr, compara el

tamao con el nmero de pares de bases de HindIII.
nlisis de los fragmentos de DNA
Los datos que escribiste en HindIII fueron las posiciones relativas de las bandas
de DNA de tamao conocido. Como el tamao y la posicin exacta de estos fragmentos
es conocida, pueden ser usados como un punto de referencia para valorar el tamao de
los fragmentos de DNA desconocidos.
La otra forma de determinar el nmero de pares de bases en los fragmentos de
DNA de tu gel, es usando una grfica del tamao de los fragmentos conocidos del DNA
estndar contra la distancia recorrida de cada banda de DNA para generar una curva
estndar. Se hace mejor en papel semilogaritmico
30

Ya hecha la curva de HindIII, ubicar en la grfica las distancias recorridas de una

banda de DNA desconocida y hacer la relacin con los pares de bases: con ayuda de
una regla perpendicular al eje x, sigue la distancia de banda hasta que intercepte con la
curva que trazaste. En ese punto, girar la regla para que quede paralela al eje x y traza
una lnea hacia el eje y. Determinar el tamao en pares de bases de ese fragmento.
Utiliza una grfica diferente para cada DNA (EcoRI, PstI, lambda).

Contestar:
1. Qu evidencia tienes de que cada enzima corta el DNA en diferente
localizacin?
2. Qu bandas coinciden con el mapa del fago lambda?
3. Qu factores afectan la digestin de las enzimas de restriccin?
4. Una vez que la tabla de resultados ha sido llenada, describe lo que se ha hecho
para determinar el tamao de los fragmentos en esta practica
5. Compara los dos mtodos examinacin directa y grfica semilogritmicapara
determinar el tamao de los fragmentos en pares de bases. Qu mtodo es
ms exacto? Explica porque.
6. Compare sus resultados experimentales con el anlisis de restriccin hecho
computacionalmente.
VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA
31

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Prctica
Pginas
Transformacin bacteriana con el plsmido 6
PGLO
Realiz:
Revis:
Autoriz:

Pgina 1

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

32

I. Introduccin
Un gen es un fragmento de DNA que provee la informacin necesaria para sintetizar una protena
particular, las cuales determinan las caractersticas fsicas y qumicas de la clula.
Las bacterias poseen plsmidos que contiene genes para una o ms caractersticas que pueden ser
beneficiosas para su sobrevivencia, y en la naturaleza pueden transferirlos entre s, permitiendo su
adaptacin a nuevos ambientes.
La transformacin es el proceso por el cual una clula incorpora DNA exgeno tal que esta nueva
informacin provee al organismo de una nueva caracterstica, alterando su fenotipo y el de sus
descendientes.
La transformacin gentica es un proceso utilizad en muchas reas de la biotecnologa, para la insercin
de uno o ms genes con caractersticas deseables en un organismo: en la agricultura genes que
codifican para caractersticas como la resistencia contra descomposicin, congelacin y alimaas; en la
biorremediacin, bacterias con genes que le permiten digerir sustancias contaminantes; en la medicina el
desarrollo de la terapia gentica; entre otras.
Los genes pueden ser aislados del genoma. El 1960 Osamu Shimomura, Marty
Chalfie y Roger Tsien identificaron y aislaron la protena responsable de la
fluorescencia presente en Aequorea victoria, denominada GFP (Green
Fluorescent protein) por su caracterstica emisin de fluorescencia verdosa al ser
iluminada por luz ultravioleta. En 1992 se demostr que su expresin en
organismos distintos de la medusa produce fluorescencia sin requerir cofactor
alguno. En 2008 les fue otorgado el Premio Nobel de Qumica por su
descubrimiento y desarrollo de la GFP.
La GFP se utiliza en disciplinas biolgicas con fines principalmente de marcaje de
protenas, cuyo anlisis ha redefinido la comprensin de muchos procesos
biolgicos incluyendo el plegamiento de protenas, el transporte de protenas, la
dinmica de RNA, y regiones del DNA. De igual forma puede expresarse en
diferentes estructuras que permitan su distincin morfolgica.

II. Conocimientos previos

1.
2.
3.
4.

Cules son los principales mtodos de transformacin?

Cmo se realiza una clula competente?
Cules son las caractersticas del plsmido pGLO?
Qu sistema de regulacin gnica implica el sistema pGLO?

III. Objetivo

Aprender los pasos del mtodo de transformacin bacteriana y sus aplicaciones en la biologa.
Analizar e interpretar los resultados para calcular la eficacia de transformacin.
Comprender la regulacin de la expresin gnica por el opern de arabinosa.

IV. Metodologa
33

Material
Tubos eppendorf estriles
Puntas para micropipeta estriles
Asa para sembrar
Mechero bunsen
Hielera
Reloj
Reactivos:
Clulas competentes de E. Coli
Plsmido pGLO
Solucin de transformacin
Medio LB/amp (2 cajas)
Medio LB/amp/ara (1 caja)
Medio LB (1 caja)
50 ml de LB
Hielo
Equipo:
Juego de micropipetas.
Bao de incubacin a 37 y 42C
Incubadora
Nota: Medio de cultivo LB:
Triptona
Extracto de levadura
NaCl

10g
5g
5g

34

Procedimiento:
1. Rotular un tubo eppendorf con +pGLO y otro con pGLO.
2. Abra los tubos y utilizando una pipeta de transferencia estril, aada 250 l de la
solucin de transformacin (CaCl2).
3. Coloque los tubos en hielo.
4. Con un asa de siembra tome una colonia de la placa con E.coli. Colquelo en el tubo
+pGLO, y disperse en la solucin girando el asa. Coloque el tubo nuevamente en hielo.
Repita con el tubo pGLO.
5. Observe la solucin del DNA pGLO bajo la luz ultravioleta. Anote sus observaciones.
Introduzca un asa en el tubo con el plsmido pGLO, cargar el asa y mezclar en el tubo
+pGLO.
6. Incube los tubos en hielo por 10 minutos
7. Rotule 4 placas de agar LB de la siguiente manera: LB/amp +pGLO, LB/amp/ara
+pGLO, LB/amp pGLO, LB pGLO.
8. Realice un choque trmico, al transferir los tubos al bao a 42 C/50 seg. Pasar
inmediatamente a hielo e incubar por 2 min.
9. Agregar 250 l de caldo LB en cada tubo e incube por 10 min a temperatura ambiente.
10. Transfiera 100 l de cada tubo a las placas correspondientes.
11. Extender la suspensin por la superficie de la placa utilizando un asa con movimientos
de izquierda a derecha.
12. Incubar a 37C/12h.
13. Observar las cajas bajo luz normal y despus bajo luz UV.

V. Resultados
Control
# colonias totales

# colonias transformadas

Transformadas
# colonias totales

# colonias transformadas

LB

LB-amp

Carcular:
Proporcin de clulas transformadas:

Tasa de transformacin:

=
()
Considera que:

ADN (g) = Concentracin ADN (g/l) x Volumen ADN (l)

Fraccin ADN utilizada = Volumen en la placa (l) / Volumen total tubo (l)
ADN pGLO transferido (g) = cantidad total de ADN pGLO usada (g) x fraccin de
ADN pGLO

35

VI. Discusin
1. Qu caractersticas inicialmente observadas en E. coli no parecen haberse alterado?
2. De las caractersticas de E. coli iniciales cules parecen ser significativamente
diferentes despus de la transformacin?
3. Si las clulas transformadas han adquirido la capacidad para crecer en presencia del
antibitico ampicilina, qu puedes decir acerca de los otros genes presentes en el
plsmido utilizado para la transformacin?
4. Basndote en los resultados obtenidos, cmo puedes demostrar que los cambios
producidos se deben al proceso realizado?
5. Qu factores ambientales deben estar presentes para observar el color verde?
6. Qu ventajas tendr para un organismo el poder activar o desactivar determinados
genes en respuesta a diferentes condiciones?

VII. Conclusin

VIII. Bibliografa

Manual De prcticas. Biologa molecular de la clula. Segal Kischinevzky C.A., Ortega

Lule G.J. Facultad de ciencias de la UNAM. Mxico. 2005.
Kit de transformacin bacteriana con pGLO. Biotechnology Explorer. Bio-Rad.

36

Nombre de la prctica:
Biologa Molecular
Reaccin en cadena de la polimerasa
Realiz:

Revis:

Prctica
7

Pginas

Pgina 1

Autoriz:

Fecha:

Contenido
I. INTRODUCCIN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

37

I.

INTRODUCCIN

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una tcnica de biologa

molecular mediante la cual un pequeo fragmento de cido desoxirribonucleico
(ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias mltiples. A travs de
ciclos; donde en cada uno se duplica la cantidad de ADN, por lo que permite
obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento y en unas pocas
horas. Esta metodologa fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B.
Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A.
Faloona en una de las primeras compaas dedicadas a la comercializacin de
la Ingeniera Gentica la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la
utilidad de esta tcnica no se reconoci inmediatamente, en 1991 su uso ya se
haba generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Qumica por este
trabajo.
La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento
de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy
elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas
temperaturas (79C a 85C), de ah su nombre comercial ms conocido: taq
polimerasa. Cuando hacemos una reaccin de PCR simulamos lo que sucede
en una clula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los
ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que
queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar ,
los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos,
etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las
condiciones

para

que

la

enzima

trabaje

adecuadamente

(cierto

pH,

determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden

necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa).
Ya que se tienen los tubos listos con todo lo necesario para que la sntesis del
fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucletidos,
ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y oligonucletidos). El siguiente
38

paso es colocar los tubos en un

termociclador, que bsicamente sirve para

calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. el termociclador calienta o

enfra los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (lo
que se llama los ciclos de reaccin), la primera es a 95C (y a este paso se le
llama desnaturalizacin) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o
desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; despus el
termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40 y 60C (llamada de
alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los
puentes de hidrgeno entre los oligonucletidos
y el ADN, y aquellas uniones ms estables (las que son complementarias)
durarn mayor tiempo, quedando los oligonucletidos alineados formando una
pequea regin de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeo pedazo
de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5 a 3; al agregar unas
bases ms, los puentes de hidrgeno que se forman entre las bases estabilizan
ms la unin y el oligonucletido permanece en este sitio para el siguiente paso.
Despus la temperatura sube a 72C (paso que se conoce como extensin), ya
que 72C es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su mxima
actividad, y contina la sntesis de los fragmentos de ADN a partir de los
oligonucletidos que ya se haban alineado. En el primer ciclo, con estas tres
temperaturas, se sintetizarn los primeros fragmentos a partir del ADN
genmico. Estos primeros fragmentos no tendrn el tamao esperado, sern un
poco ms grandes ya que la taq copiar hasta donde le sea posible, pero como
veremos ms adelante, se obtendrn en cantidades tan pequeas que al final no
podremos detectarlos. Despus se repiten una vez ms las tres temperaturas,
pero en este segundo ciclo, los oligonucletidos, adems de unirse al ADN que
pusimos al inicio, tambin se unirn a los fragmentos recin sintetizados del
primer ciclo (ver segundo ciclo de la figura 1), por lo tanto en este segundo paso
la polimerasa sintetizar 2 fragmentos largos copiados directamente del ADN y 2
fragmentos del tamao esperado, que es el tamao que hay entre los dos
oligonucletidos que hemos usado. De esta forma con cada ciclo aumentar el
nmero de fragmentos del tamao que queremos. Cabe mencionar que antes y
39

despus de estos ciclos se programan dos pasos, uno de 95C durante varios
minutos para iniciar con desnaturalizacin, y al final de los ciclos, un paso ltimo
de extensin a 72C para permitir que la taq termine de sintetizar todos los
fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
Dentro de las principales aplicaciones de la PCR se encuentran: Estudios
Arqueolgicos,

Medicina

Forense,

Gentica,

Pruebas

de

paternidad,

Investigaciones Biomdicas, Ambientales, Industriales y Diagnstico Clnico. En

este ltimo, los Laboratoristas Clnicos, pueden tomar una muestra mnima de
material gentico, copiar la secuencia de inters las veces necesarias y generar
suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o ausencia de
patgenos y en muchos casos realizar la cuantificacin del mismo.
PCR hace uso de los mismos procesos bsicos que utilizan las clulas para
duplicar su ADN.
Cadena complementaria de ADN de hibridacin
Sntesis de la hebra de ADN a travs de la ADN polimerasa
Los dos cebadores de ADN proporcionadas en este kit estn diseados para
flanquear una secuencia de ADN dentro de su genoma y as proporcionar la
seal de inicio exacto de la ADN polimerasa a " concentrarse " y comenz a
sintetizar ( replicacin ) copias de dicho ADN diana . Cadena complementaria de
hibridacin tiene lugar cuando los dos cebadores hibridan diferentes , o se unen
a cada uno de sus respectivas secuencias de bases complementarias en el ADN
plantilla.
Los cebadores son dos molculas cortas de ADN de cadena sencilla ( 23 bases
de largo ) , que es complementaria a una porcin de una cadena de la plantilla, y
otro que es complementario a una porcin de la cadena opuesta . Estos
cebadores se hibridan a la separado cadenas de molde y servir como puntos de
partida para el ADN Taq la replicacin por la ADN polimerasa. Taq ADN
polimerasa extiende los cebadores apareados "leyendo " la cadena molde y
sintetizando la secuencia complementaria . De esta manera, Taq polimerasa
replica los dos hebras de ADN plantilla

40

CONOCIMIENTOS PREVIOS

II.

Qu tipos de ADN polimerasas se pueden emplear para PCR y que

utilidad tienen?

Qu condiciones deben tener los Primers utilizados para la PCR?

El buffer empleado para PCR qu caractersticas tiene?

El cloruro de magnesio que utilidad tiene?

Cmo se sabe la Tm de un primer?

Por qu es necesario tener un cebador a cada lado del segmento de

ADN a amplificar?

Describir las tres pasos principales de cada ciclo de amplificacin por

PCR y lo que ocurrir en cada temperatura de las reacciones.

III.

OBJETIVO

Realizar la amplificacion de fragmentos de DNA previamente extrados

mediante la reaccin en cadena de la polimerasa.

IV.

METODOLOGA

V.

Material y equipo
Micro tubos de ensayo 1,5 ml
Tubos de PCR
Tubos tapa rosca con 200 l de matriz InstaGene
Espuma soporte para tubos
P-20 micropipeta, 2-20 l, 20-200 l, 200-1000 l
Puntas de pipeta (tipo de filtro), 2-20 l, 20-200 l, 200-1000 l
Marcador permanente
Copia de la Gua Rpida o en el protocolo
Contenedor de residuos
Bote o matraz para bao mara
Vasos precipitado de 100, 50 mL
41

 Matraz EM
Probeta
Tubos ensayo
Micropipeta 1, 5 mL
Jeringas
Vortex
Plato caliente
Bandejas para gel
Centrifuga

VI.

Reactivos y soluciones

Tazas con 10 ml de solucin salina al 0,9%

Mezcla completa principal (con cebadores) sobre hielo 1 tubo.
Hielo
Muestras de PCR por estudiante
MMR (ADN estndar)
ADN XC PV92 carga de tinte.
TAE 1x Tampn de electroforesis 275 ml.

VII.

Requerimientos de seguridad

Bata blanca larga y de mangas largas. Necesario guantes, lentes o mascarilla

debido a que se trabajara con bromuro de etidio nuevamente.

VIII.

Procedimiento

Preparacin muestra de DNA por enjuague bucal

1. Cada miembro del equipo debe contar con 1 tubo de tapn de rosca que
contenga con 200 l Matriz InstaGene , un micro tubo de ensayo de1,5 ml,
y una taza que contiene 10 ml de 0,9% de solucin salina. Marque uno de
cada tubo y una taza con sus iniciales.

42

2. No se deshaga de la solucin salina despus de completar este paso. Vierta

la solucin salina de la copa en la boca. Enjuague vigorosamente durante 30
segundos. Expulsar a la solucin salina de nuevo en la copa.

3. Con una micropipeta de 1000 l pasar 1 ml de su enjuague bucal en el micro

tubo de ensayo con sus iniciales.

4. Hacer girar su tubo en una centrfuga balanceada durante 2 minutos a

velocidad mxima. Cuando la centrifugadora se ha detenido completamente,
retire el tubo. Usted debe ser capaz de ver una bolita de clulas blanquecinas
en la parte inferior del tubo. Idealmente, la pastilla debe ser de
aproximadamente del tamao de la base del tubo. Si el pellet es demasiado
pequeo, verter la solucin salina al sobrenadante, aadir ms de su
enjuague de solucin salina, y girar de nuevo.
43

5. Retirar el sobrenadante y desechar. Teniendo cuidado de no perder el pellet

celular, cuidadosamente limpiar o golpear el micro tubo de ensayo en un
pauelo o toalla de papel. No est mal que quede una pequea cantidad de
solucin salina (~ 50 l, aproximadamente el mismo tamao que la de pellets)
en la parte inferior de la tubo.
6. Resuspender el pellet del fondo por agitacin o agitando los tubos hasta que
no queden grupos de clulas.
7. Usando una micropipeta de volumen ajustado a 20 l, transferir sus clulas
resuspendidas en el tubo que contiene el tapn de rosca InstaGene con sus
iniciales. Puede que tenga que utilizar la pipeta varias veces para transferir
todas sus clulas.
8. Enrosque las tapas firmemente en los tubos. Agite manualmente o el vortex
para mezclar el contenido.
9. Colocar los tubos en a espuma para tubos de ensayo. Cuando todos los
miembros de su equipo han recogido sus muestras, flotar el soporte con
tubos en un bao de agua a 56 C durante 10 minutos. A mitad de camino (5
minutos), sacudir y agitar los tubos varias veces. Coloque los tubos de nuevo
en el bao de agua durante los 5 minutos restantes.

44

10. Retire los tubos del bao de agua y agitar varias veces. Ahora colocar el
soporte con los tubos en un bao de agua a 100 C durante 5 minutos.

11. Retire los tubos del bao de agua a 100 C y agitar varias veces para
resuspender la muestra. Coloque los ocho tubos en una centrfuga haciendo
girar durante 5 minutos a 6000 xg (o 10 minutos a 2.000 xg).

Amplificacin por PCR (Protocolo de Laboratorio)

1. Obtener el tubo de tapn de rosca que contiene la plantilla de ADN genmico
de la nevera. Centrifugar los tubos durante 2 minutos a 6000 xg o durante 5
minutos a 2000 xg en una centrfuga.

2. Cada miembro del equipo debe obtener un micro tubo de ensayo y un tubo
de PCR y sin tapa. Etiquetar cada tubo de PCR en el lado del tubo con sus
iniciales y colocar el tubo de PCR en el tubo de prueba de micro sin tapa
como se muestra. Coloque el tubo de PCR en la espuma de retencin del
tubos.

45

3. Transfiera 20 microL del templado de ADN , del sobrenadante de su tubo de

tapn de rosca a la parte inferior del tubo de PCR. No transferir cualquiera
de las perlas de matriz en la reaccin de PCR, ya que se inhibe la reaccin
de PCR.

4. Localice el tubo de color amarillo de la mezcla maestra de PCR (con la

etiqueta "Master") en el cubo de hielo.
5. Transfiera 20 microL de la mezcla maestra a su tubo de PCR. Mezclar con la
pipeta hacia arriba y abajo 2-3 veces. Tape el tubo de PCR hermticamente y
mantener en hielo hasta que sea instruido para proceder con el siguiente
paso. Evitar burbujas, especialmente en la parte inferior de los tubos.

6. 5. Retire el tubo de PCR del tubo de micro ensayo sin tapa y colocar el tubo
en el termociclador Gene o MyCycler termociclador.
7. 6. Cuando todas las muestras de PCR estn en el termociclador, el profesor
46

comenzar la reaccin de PCR. La reaccin se someter a 40 ciclos de

amplificacin, que tendr una duracin aproximada de 3 horas.
8. Si su maestro le indica que debes hacerlo, ahora verter sus geles de
agarosa (los geles pueden haber sido preparados de antemano por el
profesor).

Electroforesis en gel de muestras amplificadas de PCR

1. Retire sus muestras de PCR del termociclador y colocar en el micro tubo de
ensayo. Si una centrfuga est disponible, coloque los tubos de PCR en los
tubos de ensayo sin tapa y girar los tubos (~ 3 segundos a 2.000 xg) para
llevar a cabo la condensacin que se pudo haber formado en las tapas a la
parte inferior de los tubos.
2. Aadir 10 l de PV92 XC colorante de carga a cada tubo de PCR y mezclar
suavemente.
3. Obtener un gel de agarosa (ya sea el que usted vierte o una pre-vertido por
su profesor).
4. Coloque la bandeja de colada con el gel solidificado en ella, la plataforma en
el cuadro de gel y los pozos deben estar en el ctodo - extremo de la caja,
donde se conecta el cable negro.

5. Con mucho cuidado retire el peine del gel tirando de l hacia arriba,
lentamente.
6. Vierta ~ 275 ml de tampn de electroforesis en la cmara de electroforesis,
47

hasta que slo cubra los pozos.

7. Cuando electroforesis este completa, desconecte la alimentacin y retire la
tapa de la caja del gel. Retire con cuidado la bandeja de gel y el gel de la
caja de gel. Ten cuidado, el gel es muy resbaladizo. Empujar el gel fuera de
la bandeja de gel con el dedo pulgar y cuidadosamente deslcelo en la
bandeja de tincin de plstico.

IX.

X.
XI.

Resultados

Conclusiones
Bibliografa
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Gel electroforesis of
DNA en: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular
Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, captulo 6.
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods
and Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.

48