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restriccin). Los plasmidios que se utilizan como vectores tienen una regin que contiene
mltiples sitios de restriccin (polylinker) para facilitar la insercin del gen de inters (ver
figura 1). La ligasa de DNA, es la misma que forma parte de la maquinaria de replicacin
catalizando la formacin de los enlaces fosfodister entre los nucletidos (ver figura 2). La
identificacin de bacterias transformadas con plasmidios se facilita por la presencia de genes que
confieren resistencia a antibiticos (ej. Ampicilina) y por otras enzimas que estn involucradas
en el metabolismo de ciertas molculas. El plasmidio que utilizaremos en este ejercicio es, pUC
19 (figura 1), y contiene el gen lacZ, el cual codifica para la enzima -galactosidasa. Esta
enzima cataliza la degradacin de lactosa y sus anlogos (ej. X-gal) en presencia de un inductor
(i.e., IPTG). Las bacterias transformados con el plasmidio se pueden identificar por la formacin
de colonias color azul que se produce por la degradacin de X-gal.
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UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
BIOLOGIA 3101
Transformacin de Bactrias
Procedimiento
1. Aada 1.5 ml de cultivo de bacterias a los tubos BC y C1
2. centrifugue por 15 segundos
3. Descarte el sobrenadante
4. Ponga los tubos con el pellet en hielo
5. Aada 200 ul de TS a cada tubo
6. Mezcle con la punta de la pipeta
7. Incube por 20 minutos en hielo para hacer las bacterias competentes.
8. Transfiera el contenido del tubo BC al tubo BP.
9. Mantenga el tubo BP y C1 en hielo incubando por 30 minutos.
10. Haga un Heat shock poniendo los tubos en incubacin en un bao
termal por 30 segundos a 42 grados centgrados.
11. Ponga los tubos en hielo por 5 minutos
12. Aada 200ul de LB a cada tubo.
13. Incube los tubos BC o BP y C1 por 1 hora a 37 grados centgrados en
bao con movimiento.
14. Transfiera 10ul de cada tubo a las placas rotuladas BC y C1.
15. Utilice un Loop de inocular para estriar cada placa.
16. Ponga las placas invertidas en la incubadora por 15 horas a 37 grados
centgrados.
17. Vea el crecimiento al prximo da.
Preguntas de discusin:
1. Cul es tu hiptesis en este experimento?
5. RETO: Podras pensar alguna forma en que puedes utilizar el gen de lacZ para
identificar bacterias con plasmidios recombinantes? Ayuda: Ver mapa del plasmidio y
referencias.
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Referencias:
Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 1999. Biology. Quinta edicin. The Benjamin/
Cummings Publishing Company, Inc., Redwood City, CA.
Perry, J.W., Morton, D., Perry, J.B. 2002. Laboratory manual for Starrs Biology: The Unity
and Diversity of Life and Starrs Biology: Concepts and Applications. Brooks/Cole, Canada.
Invitrogen life technologies. One Shot TOP10F Competent Cells. Versin H 061202 280124.
Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. 1992. Recombinant DNA. Segunda
edicin. Scientific American Books, New York, NY.