Fundamentos y Tipos de ELISAs.

El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una

enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes
(antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre
un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar
inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin
de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color
observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
- ELISA Directo
- ELISA Indirecto
- ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
- ELISA competitivo
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes
grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
Western Blot
La tcnica del Western Blot (tambin llamado inmunoblotting debido a
que se utilizan anticuerpos para detectar el antgeno o los antgenos
especficos de inters) fue descrita por primera vez por Towbin et al. en
1979 y en la actualidad es una tcnica de rutina en todos los
laboratorios que realizan anlisis de protenas. La especificidad de la
unin antgeno anticuerpo permite la deteccin de una nica protena
dentro de una mezcla compleja de otras protenas. En la actualidad se
utiliza como criterio de identificacin positivo de una protena especifica
en una mezcla compleja y para obtener datos cualitativos y
semicuantitativos sobre la misma.
El primer paso de todo Western Blot es la separacin de las
macromolculas mediante geles de electroforesis; despus de la misma,
las macromolculas ya separadas en funcin de su diferente peso
molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una
membrana de nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la
membrana para evitar la unininespecfica a su superficie de los

anticuerpos que se van a utilizar para la deteccin de la protena de

inters. En el siguiente paso, se une a dicha protena transferida un
anticuerpo especifico marcado con una enzima y, finalmente, se aade
un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se produce un
producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromognico o
fluorognico en la membrana. En la actualidad, los mtodos ms
sensibles emplean sustratos
quimioluminiscentes que cuando se combinan con la enzima
correspondiente, producen luz como producto final, que puede
detectarse mediante una pelcula o una cmara CCD. En todos los casos
y sea cual sea el sustrato que se utilice, la intensidad de la seal se
correlaciona con la cantidad del antgeno en la superficie de la
membrana.
En el mtodo directo de deteccin, el anticuerpo primario que se utiliza
para detectar el antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir
marcado con una enzima o sonda fluorescente; no obstante, este
mtodo no es muy utilizado por diversas razones como posteriormente
se puede ver en la tabla I. En el mtodo indirecto, se aade primero un
anticuerpo primario sin marcar contra el antgeno de la superficie de la
membrana; posteriormente se aade un anticuerpo secundario marcado
contra el anticuerpo primario. Los tipos de marcaje son diversos y
variados y entre ellos se encuentran la biotina, las sondas fluorescentes
como la fluorescena o la rodamina, y las conjugados con enzimas como
la peroxidasa de rbano (HRP) o la fosfatasa alcalina.
La electroforesis es un mtodo analtico en el que se utiliza una corriente
elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su
relacin tamao a carga elctrica, usndose como base una matriz
gelatinosa.
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son
posicionadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de
atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir
cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el ctodo (polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se
desplazarn hacia el nodo (polo positivo),
En funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizacin) a lo
largo del proceso electrofortico, stas se clasifican en electroforesis
nativas o desnaturalizantes:o En una electroforesis desnaturalizante, es
la que somete a las protenas a migracin asegurando la completa
desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta
situacin la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la
molcula pero no a su forma.o En una electroforesis nativa a las
protenas se les somete a una migracin sin desnaturalizacin. En esta
situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y

de su forma. Adems se mantienen en ciertos casos las interacciones

entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos.
Inmunoblot prueba de anticuerpos tambin se conoce como:
Inmunotransferencia, Western Blot, inmunoblot, inmunoblot ensayo,
inmunoblot
prueba
Inmunoblot prueba de anticuerpos es un procedimiento mdico
utilizados para diagnsticos tales como: babesiosis, acrodermatitis
crnica atrfica y loiasis.
El uso de tcnicas moleculares, como la hibridacin de cidos nuclicos
para la deteccin o diagnstico de patgenos en plantas, son una opcin
relativamente novedosa en el pas para suplir la carencia local de
inmunoensayos enzimticos (ELISA), tiles en la deteccin general de
Begomovirus en Solanceas y Cucurbitceas, y para aplicar un mtodo
complementario en la deteccin y/o tipificacin del virus de la tristeza de
los ctricos (CTV).
La tecnologa de produccin de estuches para diagnstico molecular,
involucra la interaccin del conocimiento detallado en diversas ramas de
la biologa, qumica, informtica y tecnologa de procesos, entre otras; y
su uso es de gran importancia en diversos mbitos como la gestin de la
salud humana y animal, trazabilidad de organismos transgnicos,
agrocomercio y sanidad vegetal.
Bsicamente, esta tecnologa procesa molculas y las incorpora en los
mencionados estuches, en los que se incluyen procedimientos para su
uso adecuado. Tanto la produccin de las molculas activas (sondas),
como los procedimientos de anlisis, deben ser previamente validados.
La capacidad de diagnstico derivada del uso de mtodos moleculares
que sean rpidos, econmicos, escalables, sensibles y especficos (como
es el caso de la hibridacin de cidos nuclicos), contribuye a aumentar
la productividad, eficiencia y rentabilidad de la produccin agrcola.
http://www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap17.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISAprotocolos.pdf
http://www.aea.gob.es/media/126624/m%C3%A9todos%20electrofor
%C3%A9ticos.pdf
http://www.inia.gob.ve/index2.php?
option=com_docman&task=doc_view&gid=1403&Itemid=28