INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION

EFECTO DEL ESTRS AGUDO POR INMOVILIZACION

EN LA PRODUCCION BASAL DE IgA EN INTESTINO
DELGADO DE RATONES Balb/c

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD
REA: INMUNOLOGA
PRESENTA:

M. C. y P. KARLA RAMREZ JIMNEZ

DIRECTORES DE TESIS

DR. RAFAEL CAMPOS RODRGUEZ

M. EN C. MARYCARMEN GODNEZ VICTORIA

MXICO, D. F.

DICIEMBRE 2009

NDICE
Introduccin

I. Definicin de estrs.

a) Clasificacin de estrs.

b) Etapas de estrs.

II. Eje Hipotlamo-Hipfisis-Adrenal.

a) Hormonas del estrs (glucocorticoides y

4
5

catecolaminas).
III. Interaccin Eje H-H-A y el Sistema inmune.
a) Efecto de las catecolaminas sobre sistema

6
9

inmune.
b) Efecto in vitro de las catecolaminas sobre

macrfagos.
c) Efecto in vitro de las catecolaminas en las

clulas NK.
d) Modelo de actuacin de catecolaminas in

10

vivo en respuesta a linfocitos.

IV. Sistema inmunolgico

11

V. Anatoma y fisiologa de Intestino delgado

12

VI. Sistema Inmunitario de Mucosas

13

a) Sitios inductores y efectores del GALT

14

b) Componentes celulares del GALT

16

c) Componentes humorales del GALT

18

Planteamiento del Problema

23

Justificacin

25

Objetivo General

26

Objetivo Particular

26

Hiptesis

27

Material y Mtodos

28

I. Grupo mustrales.

28

II. Obtencin de material biolgico(suero,

29

bazo,intestino delgado, lquidos intestinales, placas

de Peyer proximal y distal, lmina propia segmento

proximal y distal).
III. Determinacin de corticosterona.

31

IV. Determinacin de niveles de IgA.

31

V. Determinacin de poblaciones linfoides.

32

VI. Anlisis estadstico.

33

VII.

Resultados.

34

VIII.

Niveles de corticosterona en suero.

34

IX. Efecto del estrs sobre los niveles de IgA en suero

35

X. Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre los

36

niveles de IgA en lavados intestinales.

XI. Efecto les estrs agudo sobre el porcentaje de

37

linfocitos T y B en bazo.
XII.

Efecto del estrs agudo sobre el porcentaje de

39

linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento

proximal del intestino delgado.
XIII.

Efecto del estrs agudo sobre el porcentaje de

39

linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento

distal del intestino delgado.
XIV.

Efecto del estrs agudo sobre el porcentaje de

41

linfocitos T y B en lmina propia del segmento

proximal del intestino delgado.
XV.

Efecto del estrs agudo sobre el porcentaje de

43

linfocitos T y B en lmina propia del segmento distal

del intestino delgado.
XVI.

Comparacin de las poblaciones linfoides de las

43

placas de Peyer entre el segmento proximal y distal

del intestino delgado.
XVII. Comparacin de las poblaciones linfoides de

44

lmina propia entre el segmento proximal y distal del

intestino delgado.
Discusin

46

Conclusiones

52

Perspectivas

53

II

Bibliografa

54

Abreviaturas

IV

III

ABREVIATURAS

Ac

Anticuerpo

ACTH

Hormona Adrenocorticotrofa

APC

Clulas presentadoras de Antgenos

BALT

Tejido Linfoide Asociado a Bronquios

Cell NK

Clulas Natural Killer

CRH

Hormona Liberadora de Corticotropina

Eje H-H-A

Eeje Hiptalamo-Hipfisis-Adrenal

ENS

Sistema Nervioso Entrico

GALT

Tejido Linfiode Asociado a Intestino

IgA

Inmunoglobulina A

IgG

Inmunoglobulina G

IL

Interleucina

LgM

Inmunoglobulina M

LIE

Linfocitos Intra-Epiteliales

MALT

Tejido Linfoide Asociado a Mucosas

NALT

Tejido linfoide Asociado a Nariz

RLT

Receptor de Linfocito T

SNC

Sistema Nervioso Central

TGF-

Factor de Crecimiento Transformante Beta

.
IV

INDICE DE CUADROS Y FIGURAS

Pagina
Figura 1

Figura 2

Eje HHA y el sistema nervioso autnomo dispone de

dos vas clave para la desregulacin del sistema
inmunitario.
Caractersticas histolgicas del intestino delgado

12

Figura 3

Modelo de los sitios inductores y efectores en el GALT

15

Figura 4

Sistema inmune de la mucosas

16

Figura 5

Transporte de la IgA en mucosa intestinal

20

Figura 6

Concentracin srica de corticosterona en respuesta al

estrs agudo inducido por inmovilizacin

33

Figura 7

Figura 8

Efecto del estrs agudo sobre los niveles de IgA suero

Efecto del estrs agudo sobre los niveles de IgA en

34

35

lavados intestinales de los segmentos proximal y distal,

del intestino delgado
Figura 9

Efecto de estrs agudo sobre el porcentaje de linfocitos

37

T y B en bazo
Figura 10

Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el

38

porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del

segmento proximal del intestino delgado
Figura 11

Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el

40

porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del

segmento distal del intestino delgado
Figura 12

Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el

41

porcentaje de linfocitos T y B en la lmina propia del

segmento proximal del intestino delgado
Figura 13

Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el

42

porcentaje de linfocitos T y B en la lmina propia del

segmento distal del intestino delgado
Cuadro 1
Cuadro 2

Interaccin de las hormonas con las clulas inmunes

Componentes principales de la inmunidad innata y

7
11

adaptativa
Cuadro 3

Caractersticas principales de la inmunidad innata y

12

adaptativa

VI

RESUMEN

Actualmente se han asociado un gran nmero de enfermedades con la

exposicin repetida y crnica al estrs. Ejemplo de ellas son las enfermedades
neurodegenerativas, cardiovasculares, alrgicas, infecciosas e inflamatorias.
Sin embargo aun se desconocen totalmente los mecanismos a travs de los
cuales el estrs puede modular al sistema inmunolgico y causar estas
patologias.

El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto del estrs agudo
inducido por inmovilizacin sobre el sistema inmune asociado a la mucosa del
intestino delgado de ratones Balb/c, machos. Para esto se determin la
concentracin de inmunoglobulina A total en suero y lquido intestinal de
ratones sanos y ratones sometidos a estrs, por la tcnica de ELISA; el
porcentaje de linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotxicos y linfocitos B,
por citometria de flujo y; la concentradin de corticosterona en suero, por la
tcnica de EIA.

Tambin se determin si existe alguna diferencia en los niveles de IgA y el

porcentaje de linfocitos entre el segmento proximal y distal del intestino
delgado, en ambos grupos de estudio (control y estrs).

VII

ABSTRACT

Currently, several illness have been associated with repeated and chronic
exposure to stress. Examples are neurodegenerative, cardiovascular, allergic,
infectious and inflammatory diseases. However, the mechanisms through which
stress can modulate the immune system and cause these pathologies are still
completey unknown.

The aim of this study was to determine the effect of the acute stress induced by
restraint on the immune system associated with the mucosa of the small
intestinal of BALB/c mice. Accordingly, a determination was made of the levels
of IgA in serum and intestinal fluid of healthy mice and mice subjected to stress
by ELISA, the percentage of T helper cells, cytotoxic T and B lymphocytes by
flow cytometry, and the concentratin of serum corticosterone by the EIA
technique.

Finally, it was examined whether there is any difference in IgA levels and the
percentage of lymphocytes between the proximal and distal small intestine in
both study groups (control and stress).

VIII

Introduccin

Actualmente se han asociado un gran nmero de enfermedades con la

exposicin repetida y crnica al estrs. Ejemplo de ellas son las enfermedades
neurodegenerativas, migraa, depresin, hipertensin, infarto, aneurisma,
alergias, asma, infections respiratoires de vas areas altas y bajas,
enfermedad inflamatoria intestinal como colitis ulcerativa, enfermedad de
Chron, entre otras1

El estrs es un conjunto de eventos que se inician con un estmulo (estresor)

que inicia una reaccin en el cerebro (percepcin del estrs) que
posteriormente activa a los sistemas fisiolgicos del cuerpo (respuesta de
estrs) 2.. Tambin se define como un estado de amenaza para la
homeostasis,

durante

el

cual

se

activa

una

respuesta

adaptativa

compensatoria 3, y en una forma mas simple, como la respuesta general del

organismo ante cualquier estimulo estresor o situacin estresante. Sin
embargo, no existe en la actualidad una definicin del estrs aceptada en
forma generalizada 4, 5

I. Definicin de estrs
En 1930, Hans Selye defini al estrs como "la respuesta no especfica del
organismo a cualquier demanda de cambio". 6. En 1966, Richard Lazaros, lo
describe como "el resultado de la relacin entre el individuo y el entorno
poniendo en peligro su bienestar". 7. En medicina el estrs es un proceso
fisicoqumico y emocional. La Organizacin Mundial de la Salud (O.M.S.)
postula que el estrs es "el conjunto de reacciones fisiolgicas que prepara al
organismo para la accin". 8 .

De acuerdo a lo antes mencionado, se permite dfinir al estrs como la

respuesta del organismo a condiciones externas que perturban la homeostasis
de una persona, dando como resultado la activacin y la inhibicin fisiolgica y
patolgica de diferentes procesos biolgicos.

Clasificacin de Estrs
En la actualidad existen diferentes formas de clasificar al estrs. De acuerdo a
su etiologa se puede clasificar en fsico (trauma, ciruga, quemaduras e
infecciones), psicolgico o emocional (problemas interpersonales, disgustos,
depresin),

metablico

(deshidratacin,

hemorragias,

cetocidosis,

hipoglicemia) y farmacolgico (cocana, anfetaminas, hipoglicemia).

Otra forma de clasificarlo dependiendo de su duracin es en estrs agudo y

estrs crnico.

Se denomina estrs agudo cuando el estimulo estresor dura de minutos a

horas y su duracin no es prolongada en el tiempo y se presenta en una sola
ocasin.

Estrs crnico es cuando la accin de respuesta y el estimulo estresor que el

sujeto debe enfrentar se prolonga en el tiempo y la sensacin de amenaza es
constante. Si la situacin de estrs crnico se mantiene constante durante un
tiempo muy prolongado ocasiona agotamiento de la respuesta tanto del
sistema nervioso y este agotamiento puede debilitar al sistema inmunolgico
siendo ms vulnerable a las enfermedades (inmunolgicas y crnico
degenerativas), as como tambin provoca trastornos metablicos

psicolgicos. 9

Etapas de estrs
La respuesta de adaptacin orgnica o estrs tiene tres etapas: alarma o
reaccin, adaptacin y descompensacin. Las dos primeras se consideran
frecuentes, cotidianas y benficas para la vida, aumentan levemente las
hormonas de estrs y mejoran las funciones orgnicas para lograr adaptacin o
triunfar sobre retos estresantes; esos niveles de estrs se advierten en
3

situaciones an placenteras tales como comer, rer, hacer ejercicio moderado y

cuando los problemas estresantes encuentran solucin o escape. La tercera
fase o descompensacin del estrs es negativa para el organismo,
predisponiendo el desarrollo de enfermedades serias agudas, crnicas y
mortales

10

La reaccin al estrs, se desencadena como una respuesta inespecfica

encaminada a compensar cualquier situacin en la que el organismo se
encuentre en peligro y altere su homeostasis. Durante las fases de alarma y
agotamiento del sndrome general de adaptacin o sndrome de estrs, ocurre
inhibicin del sistema inmune como parte de la respuesta normal del organismo
ante la estimulacin y ocurre un hipofuncionamiento del sistema inmune, con
lo que el organismo queda expuesto a la accin de los agentes infecciosos del
ambiente, siendo ms susceptible a padecer enfermedades4.

II.Eje hipotlamo-hipfisis-adrenal

La habilidad de adaptarse a una situacin de estrs est determinado por el

modo en que se percibe la situacin, fisiolgicamente la respuesta al estrs
est controlada por el sistema nervioso central (SNC) y la coordinacin que
ste ejerce sobre los tres sistemas encargados de mantener la homeostasis:
autnomo, endocrino e inmune. El principal efector de la respuesta al estrs es
el eje hipotlamo-hipfisis-glndulas adrenales (HHA) 11,12

En el hipotlamo, las neuronas de la regin parvocelular del ncleo

paraventricular poseen axones que se proyectan a la capa externa de la
eminencia media donde secretan la hormona liberadora de corticotropina
(CRH). La hormona liberadora de corticotropina desde la circulacin portahipofisiaria estimula a las clulas corticotropas de la adenohipfisis a que
secreten la hormona adrenocorticotrofa (ACTH) que tiene como rgano blanco
la corteza de las glndulas suprarrenales, especficamente las porciones
fasciculada y reticular, que en respuesta a la estimulacin de la ACTH secretan
glucocorticoides; en especial el cortisol que es el glucocorticoide predominante.
Esta hormona estimula la glucogenlisis, la protelisis y la liplisis, teniendo
efectos cardiacos inotrpicos (taqicardia, hipertensin arterial, vasoconstriccin
perifrica sobre todo a nivel intestinal) e induce la expresin gentica de varias
protenas reguladoras y secretoras2.

El sistema nervioso autnomo simptico es otro efector de la respuesta el cual

genera activacin de las neuronas preganglionares simpticas y la liberacin
concomitante de noradrenalina por las neuronas posganglionares simpticas, la
activacin simptica estimula a las clulas cromafines de la mdula de la
glndula

suprarrenal a que secrete adrenalina al torrente sanguneo. La

adrenalina aumenta la frecuencia cardiaca y respiratoria y el flujo sanguneo a

los msculos, con lo que prepara al organismo para emitir una de dos
respuestas, pelear o huir.9

III. Interaccin del eje hipotlamo-hipfisis-adrenal y sistema

inmune

Las hormonas glucocorticoides y catecolaminas, liberadas durante la

exposicin del organismo al estrs, ejercen funciones inmunoestimulantes o
inmunosupresoras dependiendo del tipo de estrs al que est expuesto el
individuo. Estos efectos se llevan a cabo a travs de su unin directa a sus
receptores especficos, localizados en el citoplasma y en la membrana celular,
de las clulas inmunes. Los rganos linfoides primarios y secundarios, as
como los linfocitos T y B, los neurotrfilos, los monocitos y los macrfagos,
poseen receptores para hormonas glucocorticoides tipo II, predominantemente.
13

Las catecolaminas adrenalina y noradrenalina modulan el funcionamiento del

sistema inmune a travs de sus receptores beta-adrenrgicos localizados en
todos los rganos inmunes y en los linfocitos T y B, las clulas asesinas
naturales (NK), los monocitos y macrfagos (Cuadro 1)12. El sistema nervioso
autnomo, en su divisin simptica, inerva la red vascular y parnquima de los
rganos linfoides primarios, como la mdula sea y el timo, y tambin inerva a
los rganos linfoides secundarios, el bazo, los ganglios linfticos y el tejido
linfoide asociado a la mucosa pulmonar y al intestino. Las fibras del sistema
nervioso simptico arborizan dentro de compartimentos especficos en los
rganos linfticos, en la vaina periarteriolar linftica y seno marginal de la pulpa
blanca del bazo y en los cordones medulares, corteza y paracorteza de los
ganglios linfticos; y establecen contactos, similares a sinapsis neurona6

neurona, con clulas inmunes como linfocitos T, granulocitos, macrfagos y

clulas asesinas naturales (NK). La inervacin simptica de los rganos del
sistema inmune promueve la maduracin y movilizacin de los linfocitos,
timocitos, clulas NK y granulocitos en condiciones normales y durante
infeccin del organismo; mientras que la denervacin, por el uso de
antagonistas noradrenrgicos o por simpatectoma, produce supresin de la
respuesta inmune 14. En la figura 1 se muestra la relacin entre el HHA y el
sistema inmune.

Cuadro 1. Interaccin de las hormonas con las clulas inmunes

Hormona

Glucocorticoides

Clulas que expresan

receptores

Clulas

B,

neutrfilos y macrfagos

Hormona liberadora

Clulas T, monocitos y

corticotropina

macrfagos

Catecolaminas:

Clulas T y B, clulas

adrenalina y

NK,

noradrenalina

macrfagos

monocitos

Funcin celular

Inhibe la inflamacin, inhibe la produccin

de ILl-12 por CPA, inducir a un cambio
de la produccin de citocinas TH2 a TH1

Aumenta la produccin de IL-1, pruebas

de la modulacin de la inflamacin
autocrina y / o paracrina

Inducir cambio hacia la respuesta th2,

participa CPA y clulas th1

Estrs

Hipotalamo

Hormona liberadora
de corticotropina

Hipfisis
Cerebro

Inervacin
simptica

Hormona
Adrenocorticotropa

Nodo linftico

Corteza

Hormona lib.
prolactina

Nodo linftico
Mdula

Sangre perifrica
Glucocorticoides

Clula NK
Adrenalina y
Noradrenalina

Clula B

Clula T
Monocito

Citocinas tal
como: IL-1

Clula Presentadora de
antgeno

Figura 1 El eje HHA y el sistema nervioso autnomo dispone de dos vas clave
para la desregulacin del sistema inmunitario. Los factores de estrs pueden
activar el eje simptico-adrenal-medular (SAM), as como el eje HPA, y por lo
tanto provocar la liberacin de hormonas hipofisarias y suprarrenales como las
catecolaminas (adrenalina y noradrenalina), hormona corticotropina (ACTH),
cortisol, hormona del crecimiento y la prolactina, que a su vez pueden actuar
directa o indirectamente sobre el sistema inmunolgico.11

El efecto inmunosupresor de los glucocorticoides se debe principalmente a la

disminucin en la produccin de citocinas como el interfern- (IFN-), el factor
de necrosis tumoral

(TNF) y las IL-1, IL-2 e IL-6, necesarias para la

maduracin y movilizacin de los linfocitos y otras clulas inmunitarias.

Efecto de las catecolaminas sobre el sistema inmune

Cuando

los

niveles

de

catecolaminas

se

elevan

por

el

estrs,

concentraciones de 10-4 M, inhiben la produccin de linfocitos T, pero a

concentraciones de 10-8 M y en presencia de hidrocortisona estimulan la
proliferacin de estas clulas. .

Efecto "in vitro" de las catecolaminas sobre los macrfagos

Solo concentraciones de 10-12 M aumentan significativamente la quimiotaxis de
macrfagos. Pero los receptores
son m
s importantes en este proceso.
Concentraciones

farmacolgicas

(altas) o

fisiolgicas

de norepinefrina

estimulan la capacidad fagoctica de los macrfagos, a no ser que uno de los

receptores est bloqueado.

Se supone que la quimiotaxis necesita menos concentracin de norepinefrina

que la fagocitosis porque en los vasos no hay mucha cantidad, pero cuando los
macrfagos son atrados al foco infeccioso, la epinefrina y norepinefrina actan
autocrinamente sobre las clulas aumentando la concentracin en un lugar
localizado. Concentraciones de 10-5 a 10-12 M son adems quimioatrayentes
para los fagocitos.

Efectos "in vitro" de las catecolaminas en las clulas NK

Concentraciones mayores o iguales a 10-7 M de norepinefrina inhiben la
proliferacin de clulas NK. Concentraciones menores de 10-7

la estimulan

bajo determinadas circunstancias. Este efecto se ha visto que influye

directamente sobre las clulas NK y no sobre las clulas tumorales.

Modelo de actuacin de catecolaminas "in vivo" en respuesta a

linfocitos
La actuacin se divide en tres fases temporales: fase inductiva, proliferativa y
efectora.

Fase inductiva: La noradrenalina liberada por las terminaciones nerviosas

estimula la fagocitosis y presentacin antignica as como la colaboracin
celular en general a travs de receptores
y adrenrgicos. Se favorece el
inicio de la respuesta inmunitaria. Las citoquinas producidas por los
macrfagos (fundamentalmente la IL-1) inhiben la accin de la noradrenalina
disminuyendo su concentracin.

Fase proliferativa: Concentraciones bajas de noradrenalina a travs de

receptores estimulan la proliferaci
n de los linfocitos T. Segregan IL -2 que
tambin estimula la produccin de noradrenalina. Concentraciones de
noradrenalina altas por receptores inhiben la proliferaci
n de los linfocitos,
con lo que se para y regula la respuesta proliferativa.

Fase efectora: La noradrenalina, a travs de receptores

, disminuye la
produccin de anticuerpos o la actividad de linfocitos citotxicos (CTL).

10

IV. Sistema Inmunolgico

El sistema inmune es la defensa natural del cuerpo contra infecciones, como

las bacterias y los virus. Los individuos se encuentran protegidos contra
microorganismos por medio de diferentes mecanismos: la inmunidad Innata,
que representa la primera lnea de defensa contra microorganismos y la
inmunidad adaptativa que es estimulada tras la exposicin a agentes
infecciosos y cuya intensidad y capacidad defensiva aumentan despus de la
exposicin an determinado microorganismo pero con caractersticas de
especificidad, especializacin y la capacidad de recordar y responder con ms
fuerza tras exposiciones repetidas al mismo organismo. 15,16

En el Cuadro 2 se describen los componentes celulares y humorales de los dos

tipos de respuesta inmune y en el Cuadro 3, se describen algunas
caractersticas de estas respuestas.

Cuadro 2. Componentes principales de la inmunidad innata y

adaptativa
Innata
Barreras celulares y
qumicas

Protenas sanguneas

Piel, epitelios mucosos,

productos qumicos
antimicrobianos
Complemento, otras

Adaptativo
Linfocitos presentes en los
epitelios; anticuerpos
segregados en las
superficies epiteliales
Anticuerpos

Fagocitos(macrfagos,
Clulas

neutrfilos),linfocitos

Linfocitos

citolticos naturales

11

Cuadro 3. Caractersticas principales de la inmunidad innata y

adaptativa
Innata
Contra patrones
Respuesta

moleculares conservado
(PRRs)

Especificidad

Limitada, codificada por la

lnea celular

Adaptativo
Contra antgenos
microbianos o particulados
Muy amplia; los receptores
se producen por
recombinacin gentica

Diversidad

Nula

Memoria

V. Anatoma y fisiologa de intestino delgado

El intestino es un rgano tubular formado por tres regiones (duodeno, yeyuno e

leon)13. Histolgicamente est compuesto por cuatro capas concntricas que
constituyen la pared: mucosa, submucosa, muscular y serosa (Figura 2)17. La
funcin principal del aparato digestivo es permitir que los alimentos ingeridos
puedan ser digeridos y absorbidos para proveer al organismo los nutrientes
necesarios para el mantenimiento general de las funciones corporales, a la vez
que protege frente agentes patgenos (flora bacteriana), esto se consigue
debido a la respuesta integrada por tres sistemas que se encuentran
distribuidos por todo el organismo: l sistema nervioso, sistema inmunitario y
sistema endocrino2.

12

Figura 2. Caractersticas histolgicas del intestino delgado.

VI. Sistema inmune de mucosas

El MALT contiene ms del 80% de las clulas inmunes y la respuesta

inmunitaria

frente

antgenos

orales

difiere

en

algunos

aspectos

fundamentales en comparacin con la respuesta a antgenos que se

encuentran en otras localizaciones15,16

Las mucosas juegan un papel muy importante en la defensa inmunolgica, ya

que un gran nmero de agentes patgenos entran por estas vas. Las mucosas
cuentan con una cantidad considerable de tejido linfoide asociado a mucosas
denominado (MALT, por sus siglas en ingles, Mucosal Associated Lymphoid
Tissue), en base a su sitio anatmico se divide en: tejido linfoide asociado a
nariz (NALT, por sus siglas en ingles, nasal associated lymphoid tissue), tejido
linfoide asociado a bronquios (BALT, por sus siglas en ingles, bronchiol

13

associated lymphoid tissue) y tejido linfoide asociado a intestino (GALT, por sus
siglas en ingles, gut associated lymphoid tissue).

El GALT, es el tejido ms extenso del organismo. Este se encuentra en

constante renovacin, por lo que hay una alta probabilidad de producirse
clulas tumorales, tambin es un lugar de entrada de agentes infecciosos y
alrgenos. 17

Sitios inductores y efectores del GALT

En la mucosa gastrointestinal existen sitios para estimular la respuesta inmune,

denominados sitios inductores, y donde se desarrolla la funcin inmune,
denominados sitios efectores.

Las placas de Peyer (PP) son los sitios inductores reconocidos del GALT. En
el epitelio de las placas existen clulas especializadas llamadas clulas M, por
debajo del epitelio se encuentran abundantes clulas dendrticas (DC), con
capacidad fagoctica, que expresan en su superficie molculas clase II del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-II), que las capacita como clulas
presentadoras de antgeno (APC). Despus de captar los antgenos, los
procesan intracelularmente y migran hacia el interior de las PP para presentar
al antgeno al los linfocitos T (clulas inductoras de la respuesta inmune) ya
procesados en la molcula MHC-II, para iniciar la respuesta inmune. Una vez
14

realizada la activacin, los linfocitos T y los B (productores de los anticuerpos),

especficos contra el antgeno (Ag), proliferan y abandonan el sitio inductor a
travs de la linfa llegando a los ganglios linfticos regionales (mesentricos).
De ah viajan a travs del torrente sanguineo y llegan a las otras mucosas del
organismo. Finalmente, la mayora de esas clulas llegan a la lamina propia
(LP) intestinal (sitio efector) a travs de este mecanismo de recirculacin
(Figura 3), 18

Figura 3. Modelo de los sitios inductores y sitios efectores en el GALT.

15

Componentes celulares del GALT

En la mucosa del intestino hay una gran cantidad de linfocitos repartidos en
tres regiones (Figura 4):

1. Dentro de la capa epitelial (linfocitos intraepiteliales, LIE)

2. Lamina propia
3. Grupo de placas de Peyer (a lo largo del intestino delgado)

Figura 4 El sistema inmune de la mucosa. A. Esquema de los componentes

celulares del sistema inmune de la mucosa del intestino. B. Microfotografa de
tejido linftico de la mucosa del intestino humano. Similares agregados de
tejido linfoide se encuentran en todo el tracto gastrointestinal y tracto
respiratorio15.

16

Los LIE corresponden a linfocitos. T, en el hombre gran parte son CD8+, en

ratn el 50% expresan RLT
, l

las clulas
T constituyen una porci
n

minoritaria del total de clulas T (globalmente menos del 5%), aunque los
porcentajes varan segn el tejido y la especie.
En los humanos, las clulas T slo son aproximadamente entre un 0.5-15%
de las clulas T de sangre perifrica, pero muestran una gran dominancia en el
epitelio intestinal (10% de las clulas T intestinales) y piel. En el ratn, los
linfocitos intraepiteliales son predominantemente clulas T (el 50%).

La lmina propia, contiene una poblacin mixta entre las que cuentan los
linfocitos T CD4+, dotados de fenotipo de clulas activadas y es probable que
los linfocitos T reconozcan el antgeno en primera instancia a nivel de ganglios
linfticos mesentricos de drenaje hacia intestino para poblar la lmina propia.
Posee linfocitos B activados y clulas plasmticas as como macrfagos,
clulas dendrticas, eosinofilos y mastocitos .Adems los linfocitos b presentes
en la lamina propia producen IgA15 .

El MALT adems de linfocitos contiene tejidos linfticos organizados: placas de

Peyer de intestino delgado, folculos linfticos pertenecientes a bazo y ganglios,
los folculos en mucosas forman zonas pobladas de linfocitos que suelen
mostrar centros germinales Las placas de Peyer poseen un nmero de
linfocitos T CD4+, en la regin interfolicular. Existen las clulas M
caracterizadas por que carecen de microvellosidades permitiendo el paso
antignico.15,16.

17

Componentes humorales del GALT

La IgA es la inmunoglobulina que se produce en gran cantidad en estos
tejidos, a nivel de las mucosas existe un contacto ntimo entre organismo y
medio ambiente. La mayora de los agentes infecciosos llegan al cuerpo a
travs de las mucosas, y el moco adherido a la superficie constituye una parte
esencial del sistema inmune mucosa.

En el organismo la IgA constituye ms del 80% de todos los anticuerpos

producidos por el MALT. Adems, los anticuerpos de IgA no solo estn
presentes en las secreciones externas, sino tambin ejercen propiedades
antimicrobianas a las clulas epiteliales durante su transporte a travs del
epitelio. Representan la clase de inmunoglobulina predominante en las
secreciones externas, cantidad bien definida, que brinda una proteccin
inmunolgica especfica para todas las superficies mucosas, al producir un
bloqueo a este nivel ante la penetracin al organismo de agentes patgenos.

La IgA es la inmunoglobulina predominante en la saliva y secreciones

intestinales en forma de IgA secretoria, la mayora se produce como resultado
de una sntesis y no del torrente circulatorio. Entre sus funciones estn la de
inhibir la adherencia bacteriana y la neutralizacin de enzimas, virus y toxinas.
19

. Puede unirse de forma especfica a molculas presentes en la superficie

bacteriana mediadora de la unin de esta clula epitelial, y su unin a la

bacteria aumenta la afinidad de este complejo a la mucina, lo cual facilita la
18

inmovilizacin del microorganismo a la capa mucosa con la consiguiente

eliminacin. Cuando se une a la partcula viral, no solo previene la unin de
esta a la clula husped mediante el bloqueo de receptores especficos, sino
que este encuentro puede ocurrir dentro de la clula epitelial en el momento del
transporte de IgA (Figura 5) La neutralizacin de enzimas y toxinas puede
ocurrir por bloqueo del sitio de unin de la toxina con un receptor, o por
modificacin conformaciones de este sitio.4.

La cantidad de IgA secretora que produce y transporta hacia las superficies

mucosas cada da, excede los niveles de IgG del suero. La superficie mucosa
en el intestino est cubierta por una capa nica de clulas, entre las que se
encuentran las clulas absortivas (enterocitos), que son muy numerosas y
cubiertas por mocos y glicocolyx, las Globet cells que sintetizan el moco, las
clulas de paneth localizadas en el intestino delgado, y que presentan en su
citoplasma grnulos secretorios que contienen lisozimas, IgA, IgE, as como
tambin clulas enteroendocrinas, situadas a lo largo del tracto gastrointestinal,
cuya funcin principal es liberar hormonas al tejido conectivo en respuesta a
cambios en el ambiente exterior. 20

Las clulas M que se encuentran esparcidas por todo el epitelio mucoso y su

funcin principal de esta clula M es la absorcin de partculas desde la luz
gastrointestinal transportndola hacia la regin vasolateral rica en linfocitos y
otras clulas inmunes; adems, debido a su bajo contenido en lisozima,
pueden transportar antgenos con una casi nula degradacin enzimtica. Su

19

superficie contiene receptores especficos para la regin Fc. de la IgA, por lo

que puede fijar y transportar complejos antgenos anticuerpos.

Figura 5. Transporte de la IgA en la mucosa intestinal. La IgA es producida por

el linfocito B en lamina propia y se secreta en forma de dimero y se mantiene
unido mediante una cadena J. La IgA es transportada al lumen por el receptor
de poli-Ig (sintetizado en clulas epiteliales). El complejo se endocita y es
secretado hacia el lumen por transporte activo mediante vesculas15

La superficie mucosa intestinal est colonizada por una microflora que alcanza
un gran nmero de clulas bacterianas en el intestino distal, y ms
especficamente en el colon, al mismo tiempo, estas reas extensas son la
interfase con el ambiente externo, a travs del cual la mayora de los agentes
patgenos inician los procesos infecciosos. Los mecanismos intestinales de
defensa necesitan discernir correctamente entre la micro flora simbitica y los
patgenos exgenos. An no se entiende bien este mecanismo pero
20

probablemente, tanto la respuesta inmunolgica innata como las adaptativa

participen en este proceso. 21

Se sugiere un posible papel de las clulas epiteliales en la presentacin de

antgenos. Las clulas dendrticas situadas en el epitelio de las mucosas que
pueden presentar directamente antgenos hacia las clulas B, y dirigir sus
cambios de isotipo hacia la IgA e IgA2 con la ayuda de las citoquinas
producidas por las clulas epiteliales. Las clulas epiteliales pueden, jugar un
rol mayor en la produccin de anticuerpos IgA de las mucosas, los cuales son
esenciales para la defensa contra microorganismos22

Los linfocitos indican que las clulas inmunolgicamente activas son

transportadas hacia secreciones de superficie, y que hay una mayora
sustancial desde la amgdala nasofarngea de clulas inmunolgicamente
activas, hacia las secreciones de superficie.

En el epitelio de las vas respiratorias como en aparato gastrointestinal se

produce IL-2, IL-6, IL-10 y TGF, factores esenciales para la proliferacin clonal
de las clulas B. La estrecha proximidad de las clulas B al epitelio de las vas
respiratorias, probablemente garantiza un aporte constante de factores de
crecimiento y diferenciacin necesarios para la produccin de IgA mucosa.
Adems,

las

clulas

epiteliales

producen

una

glicoprotena,

llamada

componente secretor, que no solo confiere creciente estabilidad a la IgA, sino

que es cuantitativamente el receptor ms importante del sistema inmunolgico

21

de las mucosas, al ser responsable del transporte externo de polmeros de IgA

e IgM producidos localmente.

22

Planteamiento del Problema

El problema que se pretende estudiar es el siguiente: Si el estrs agudo por

inmovilizacin modifica la produccin basal de IgA en el intestino delgado de
ratn Balb/C? Esta pregunta, es relevante por las razones que a continuacin
se exponen.

Primero, la mucosa intestinal es sitio de entrada de alrgenos y

microorganismos,

potencialmente patgenos por lo tanto es importante

establecer cules son los efectos del estrs sobre las respuestas inmunitarias
humorales y celulares en este lugar.

Segundo, La inmunoglobulina A secretora (IgAs) desempea una funcin

crucial en la defensa del organismo a nivel de mucosa. La secrecin de esta
inmunoglobulina esta bajo control de nervios entricos con fibras colinrgicas y
adrenrgicas. Esta inervacin se encuentra afectada durante ests agudo
dando como respuesta la estimulacin la secrecin de IgAs

22

. Satoshi

Tsujita,1998 demostr que los niveles de IgAs se ven afectados por el estrs.
Sin embargo, a nivel de mucosa intestinal no hay nada escrito. Por otra parte
Jarillo luna, 2007, demostr que durante el estrs crnico afecta el porcentaje
de linfocitos intra epiteliales.

23

Tercero, Las placas de Peyer juegan un papel importante en el abastecimiento

de clulas responsables de la inmunidad humoral local lo que sugieren un
camino diferencial para los precursores de IgA y su destino cuando el antgeno
puede causar la expansin de una poblacin de clulas especficas, 23.

De aqu la importancia de saber si el estrs agudo es capaz de modificar las

poblaciones linfoides tanto de los sitios inductores (placas de Peyer) como en
los efectores (lmina propia), del tejido linfoide asociado a mucosa intestinal
(GALT)

As tambin el resaltar la importancia y la diferencia humoral y celular entre los

segmentos proximales y distal del intestino delgado.

24

Justificacin

Numerosos estudios han demostrado la asociacin entre el estrs y el sistema

inmune en el desarrollo de enfermedades alrgicas, inflamatorias, infecciosas y
autoinmunes, sin embargo poco se sabe sobre el efecto del estrs agudo sobre
el sistema inmune humoral y celular a nivel de mucosa intestinal, lo cual marca
una gran necesidad de estudiar estas respuestas biolgicas para lograr
entender los mecanismos fisiopatolgicos a travs de los cuales se desarrollan
estas enfermedades y proponer nuevas estrategias preventivas y teraputicas

An no se ha logrado demostrar la importancia del estrs agudo sobre la

produccin de IgA y la modificacin de las poblaciones linfoides en este sitio
anatmico as mismo se desconoce si existe alguna diferencia estructural sobre
el sistema inmune entre el segmento proximal y distal del intestino delgado.

25

Objetivo General

Determinar si el estrs agudo inducido por inmovilizacin es capaz de modificar

el porcentaje de linfocitos T y clulas B, as como la secrecin de IgA en tejido
linfoide asociado al intestino de ratones Balb/c.

Objetivos Particulares

1. Determinar si el estrs agudo por inmovilizacin modifica los niveles de IgA

en el lquido intestinal del segmento proximal y del distal del intestino
delgado.

2. Determinar si el estrs agudo por inmovilizacin modifica las poblaciones de

linfocitos B, linfocitos T cooperadores (CD4) y linfocitos T citotoxicos (CD8)
en las placas de Peyer del segmento proximal y distal del intestino delgado.

3. Determinar si existen diferencias entre los segmentos proximal y distal del

intestino delgado, sobre la produccin de IgA y en los porcentajes de
linfocitos T y B.

26

Hiptesis

El estrs

agudo inducido por inmovilizacin es capaz de modificar la

produccin basal de IgA en lquido intestinal y de las poblaciones linfoides en

GALT del segmento proximal y distal de intestino delgado en ratones Balb/c,
debido a la secrecin elevada de glucocorticoides los cuales tienen efectos
sobre la liberacin de citocinas responsables de la proliferacin de los linfocitos
y el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas.

27

Material y Mtodos

I. Grupos mustrales
Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c de 8 -10 semanas de edad, de
20-25 g de peso, proporcionados por el bioterio de la Escuela Superior de
Medicina (ESM), del Instituto Politcnico Nacional.

Los Animales fueron mantenidos a una temperatura entre 20 y 25 C, con una

humedad entre el 40 y 70%, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, bajo
condiciones libres de patgenos y alimentados con Lab Diet 503 de PMI
International. Los ratones fueron divididos en 2 grupos de 5 ratones cada uno,
de la siguiente manera:

Grupo l (control): Este grupo corresponde a los ratones control, los cuales se
mantuvieron bajo restriccin de agua y alimento durante un periodo de 4 horas
correspondiente al periodo de estrs al cual fue sometido el grupo problema.

Grupo ll (estresados): Estos ratones fueron sometidos a un periodo de estrs

agudo por inmovilizacin, durante 4 horas continuas. El modelo de estrs
consisti en sujetar las cuatro extremidades de los animales, a una placa de
acrlico de 15 x 25 cm, lo cual impidi su movilizacin tanto horizontal como
longitudinalmente.

28

II. Obtencin de material biolgico

Al concluir el periodo de estrs, ambos grupos de ratones fueron sacrificados
en una cmara de ter. Los lquidos biolgicos y los tejidos fueron obtenidos
en condiciones fras (en hielo), de la siguiente manera:

Suero: Para obtener el suero se realiz una puncin intracardiaca, obteniendo

1 ml de sangre aproximadamente, por cada ratn. La sangre se centrifug
inmediatamente a 4000 rpm, por 10 min a 8 C. Se separ el suero y se
almacen a -70 C hasta el momento de su anlisis.

Bazo: Este rgano se obtuvo realizando una incisin a nivel de la lnea media
en el abdomen de cada animal. Posteriormente fue disgregado y lavado con
medio de cultivo RPMI-1640 y ajustado a 1x106 clulas/muestra para su tincin
fenotpica y anlisis citofluoromtrico.

Intestino delgado: Con el animal en decbito dorsal sobre una cama de

diseccin de 15x25cm, se hace una incisin media de apndice xifoides hasta
regin plvica exponiendo las vsceras, se localiza el estomago tomndolo
como base para la diseccin del intestino delgado 3 mm por debajo del ploro
hasta 3 mm por arriba del ciego y se divide en porcin proximal y distal
respectivamente.

29

Liquido Intestinal: Obtenida la porcin proximal y distal de cada muestra y

colocadas en cajas de petri estriles y en medio de cultivo RPMI-1640, se
realizo un lavado con 3 ml de RPMI-1640, utilizando una cnula estril. Se
adicion 200 l de un inhibidor de proteasas, a cada muestra y se centrifugaron
a 1500 rpm, por 10 min, a 4 C. Se separ el sobrenadante y se almacenaron a
-70 C hasta el da de su anlisis.

Placas de Peyer: Las placas de Peyer fueron removidas de cada segmento

del intestino y colocadas en RPMI-1640, posteriormente fueron disgregadas en
una malla metlica y por ultimo fueron lavadas con PBS 1x y ajustadas a 1x10 6
clulas/muestra para su tincin y anlisis citofluoromtrico.

Lamina propia de intestino delgado (proximal y distal): Se evirtieron los

intestinos de cada grupo y se incubaron en colagenasa a 37C, por 30 min, en
agitacin continua (200 rpm). Posteriormente se disgregaron y se filtraron con
una malla de organza. El filtrado se centrifug a 1500 rpm, por 10 min a 4 C.
El botn celular fue lavado dos veces con RPMI-1640. Para separar las clulas
mononucleares, se utiliz un gradiente de percoll.. El gradiente se realiz de la
siguiente manera: el botn celular se resuspendi en una solucin de percoll al
40% y fue depositada sobre las paredes de un tubo falcn el cual contena una
solucin de percoll al 70%. Una vez hecho el gradiente, y sin mezclar las fases,
las muestras fueron centrifugadas a 2500 rpm, durante 30 min, a 8 C,
utilizando una aceleracin y desaceleracin de cero. El anillo correspondiente a
las clulas mononucleares fue separado utilizando una pipeta Pasteur y lavado
30

dos

veces

con

RPMI-1640.

Las

clulas

fueron

ajustadas

1x106

clulas/muestra para su tincin fenotpica y anlisis citofluoromtrico.

III. Determinacin de corticosterona

Los niveles de corticosterona fueron determinados en suero por inmunoensayo
enzimtico (EIA, por sus siglas en ingles enzyme immunoassay) utilizando un
kit de la marca Stressgen (catalogo 901-097 480), con base a las instrucciones
del fabricante. La lectura de placa se llev a cabo en un lector de ELISA (BIORAD), a una longitud de onda de 405 nm. Se realiz una curva estndar para
conocer la concentracin de corticosterona en ng/ml.

IV. Determinacin de los niveles de IgA

La concentracin de IgA fue determinada en suero y lavados intestinales por
medio de la tcnica de ELISA.

Se utiliz una placa de ELISA de 96 pozos, la cual se recubri con un primer

anticuerpo de conejo anti-IgA de mieloma de ratn. Posteriormente se bloqueo
la placa con leche Svelty al 6%, disuelta en PBS 1x y se incub con los sueros
y los lavados intestinales. Para el suero se utiliz una dilucin de 1:1000 y para
los lquidos intestinales, una dilucin de 1:2. Despus se agreg un segundo
anticuerpo de chivo anti-IgA de ratn peroxidado, a una dilucin de 1:1000. Por
ltimo se revel con un regulador de citrato-fosfatos. La reaccin fue detenida

31

con una solucin de H2SO4, a una concentracin de 2.5 M. La placa se ley en

un lector de ELISA de la marca BIO-RAD, a una longitud de onda de 492 nm.

V. Determinacin de poblacin linfoides

Los porcentajes de linfocitos T y B fueron determinados en bazo, placas de
Peyer y lmina propia de los segmentos proximal y distal del intestino delgado,
por citometra de flujo.

Los linfocitos T cooperadores fueron marcados con un anticuerpo (Ac) antiCD4/FITC (BD Biobienses), los linfocitos T citotxicos, con un Ac anti-CD8/PE
(Caltag) y los linfocitos B, con la combinacin de los Acs anti-CD19/-APC (BD
Biobienses) y anti-B220/PerCP (BD Biobienses). Las clulas CD19+/B220+
involucran a las clulas pro B, Pre B, B inmaduras y B naive.

Una vez teidas las clulas, fueron fijadas en una solucin de paraformaldehido/PBS al 2% y adquiridas en un citmetro FASC Calibur, Becton
Dickinson, utilizando el software Cell Queso-Pro, versin 4.0. Se adquirieron
10,000 eventos de la regin de linfocitos delimitada en el histograma de puntos
de tamao (FSC) contra granularidad (SSC). Los archivos fueron analizados
utilizando el software Summit V 4.0. Los datos representan el porcentaje de
clulas positivas tomadas de la regin de linfocitos totales.

32

VI. Anlisis estadstico

El anlisis estadstico se realiz utilizando el paquete estadstico Sigma-Stat,
versin 11.0

En todos los casos se compararon las medias de los resultados obtenidos entre
el grupo control y el grupo de estrs (t de student). Tambin se compararon las
medias de los resultados obtenidos de los porcentajes de cada poblacin
linfoide y los niveles de IgA en lavados intestinales entre el segmento proximal
y el segmento distal de cada grupo (andova). La significancia estadstica se
consider cuando el valor de p fue 0.05.

Para la tincin fenotpica, se hizo un concentrado de los rganos de estudio de

los 5 ratones que conformaban cada grupo y se realizaron tres experimentos
independientes entre s.

33

VII. Resultados
VIII. Niveles de corticosterona en suero
Los niveles de corticosterona srica fueron determinados tanto en el grupo
control con el grupo de estrs, por la tcnica de EIA, con la finalidad de
corroborar que el tipo de estrs al cual fueron sometidos los animales, es capaz
de estimular el eje hipotlamo-hipfisis-adrenal (HHA).

En la

Figura 6 muestra la media D.S. de las concentraciones de

corticosterona en suero de ambos grupos de ratones. En esta figura se pueda

observar un aumento significativo (p<0.001) en la concentracin de
corticosterona en el grupo de estrs (1792.0 ng/ml), en comparacin con el
grupo control (18.581.01. ng/ml).

250

Densidad Optica (ng/ml)

*
200

150

100

50

Control

Inmovilizacin

Figura 6. Concentracin srica de corticosterona en respuesta al estrs agudo

inducido por inmovilizacin. *p<0.0001
34

IX. Efecto del estrs agudo sobre los niveles de IgA en suero
Los niveles de IgA fueron determinados en suero por la tcnica de ELISA, con
la finalidad de observar si el estrs agudo inducido por inmovilizacin, tiene
algn efecto sobre los niveles de IgA a nivel sistmico (sangre).

En la Figura 7 se puede observar que este tipo de estrs aument los niveles
de IgA en suero en comparacin con el grupo control (*p=0.001).

Densidad Optica (492nm)

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Suero

Figura 7. Efecto del estrs agudo sobre los niveles de IgA suero. En esta figura
se muestra la media D.S. de la densidad ptica del triplicado de tres
experimentos independientes entre s. *p=0.001; t de student.

35

X. Efecto del estrs agudo inducido por inmovilizacin sobre los

niveles de de IgA en lavados intestinales
Los niveles de IgA en lavados intestinales del segmento proximal y distal de
cada grupo de ratones (estrs y control), fueron determinados por la tcnica de
ELISA.

En ambos segmentos intestinales se observ un incremento significativo en los

niveles de IgA en comparacin con los ratones del grupo control (p<0,001).
Tambin se observo que los niveles de IgA en el segmento proximal fueron
significativamente mas altos en comparacin con el segmento distal tanto en el
grupo control como en los ratones sometidos a estrs (p<0.001) (Figura 8).

36

*
*

2.5

Densidad optica (492nm)

*
2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Proximal

Distal

Figura 8. Efecto del estrs agudo sobre los niveles de IgA en lavados
intestinales de los segmentos proximal y distal, del intestino delgado. En esta
figura se muestra la media D.S. de la densidad ptica del triplicado de tres
experimentos independientes entre s. *p<0.001; t de student.

XI. Efecto de estrs agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

bazo
Los porcentajes de linfocitos T (clulas CD4+ y CD8+) y linfocitos B (CD19+ y
CD19+/B220+) en bazo, fueron determinados por citometra de flujo.

37

En la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos entre el grupo de estrs y

el control, donde se observa que el estrs es capaz de aumentar
significativamente el porcentaje de linfocitos T citotxicos (CD8+), en este
rgano (p<0.001). Los porcentajes de linfocitos T cooperadores (CD4+) y
linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), no se vieron modificadas por el estrs en
este modelo

Clulas Positivas (%)

50

40

30

20
*

10

Figura 9.

CD4

CD8

CD19

CD19/B220

Efecto de estrs agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

bazo. Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T

citotxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+). *p<0.001; t de
student.

38

XII. Efecto de estrs sobre el porcentaje de linfocitos T y B en placas

de Peyer del segmento proximal del intestino delgado
El efecto del estrs sobre las poblaciones de linfocitos T y B en las placas de
Peyer del segmento proximal del intestino delgado (Figura 10), solo modific, al
igual que en bazo, el porcentaje de linfocitos T citotxicos, observndose un
aumento significativo de esta poblacin (4.591.36% de clulas T CD8+) en
comparacin con el grupo control (3.370.36 % de clulas T CD8+; p<0.001).

El resto de las poblaciones no se vieron modificadas.

XIII. Efecto del estrs agudo sobre el porcentaje de los linfocitos T y B en

placas de Peyer del segmento distal del intestino delgado
Al evaluar por citometra de flujo, el efecto del estrs agudo sobre las
poblaciones linfoides en las placas de Peyer, del segmento distal del intestino
delgado, los porcentajes de linfocitos T cooperadores, T citotxicos y clulas B,
no se vieron modificadas por el estrs (Figura 11).

39

Clulas Positivas(%)

80

60

40

20

*
0
CD4

CD8

CD19

CD19/B220

Figura 10. Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento proximal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometra de
flujo. *p<0.001; t de student.

40

Clulas Positivas (%)

80

60

40

20

0
CD4

CD8

CD19

CD19/B220

Figura 11. Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento distal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometra de
flujo.

XIV. Efecto de estrs agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

lmina propia del segmento proximal del intestino delgado
El estrs agudo inducido por inmovilizacin no modific los porcentajes de
linfocitos T cooperadores ni citotxicos pero aument significativamente los
porcentajes de linfocitos B (64.718.34% de clulas CD19+/B220+)

en

41

comparacin con el grupo control (24.351.33%), en la lmina propia del

segmento proximal del intestino delgado (Figura 12).

Clulas Positivas(%)

80

60

40

20

0
CD4

CD8

CD19

CD19/B220

Figura 12. Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en la lmina propia del segmento proximal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotxicos (CD8+), los linfocitos B totales (CD19+ y CD19+/B220+), por
citometra de flujo. *p<0.001; t de student.

42

XV. Efectos de estrs sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

lmina propia del segmento distal intestino delgado
El estrs agudo inducido por inmovilizacin, modific los porcentajes de
linfocitos T y B, en la lmina propia del segmento distal del intestino delgado
(Figura 13). Las poblaciones que se vieron modificadas fueron los linfocitos T
cooperadores (clulas CD4+) los cuales disminuyeron del 43.362.81% en el
grupo control a 33.721.97% en el grupo de estrs. Las clulas B por el
contrario aumentaron significativamente en el grupo de estrs (52.173.71% de
clulas CD19+ versus 40.073.21% en el grupo control; y

49.962.0% de

clulas CD19+/B220+ versus 12.5510.7% en el grupo control). Los

porcentajes de linfocitos T citotxicos (CD8+), no se vieron modificados por el
estrs en este sitio.

XVI. Comparacin de las poblaciones linfoides de las placas de

Peyer entre el segmento proximal y distal del intestino delgado
Al comparar los porcentajes de linfocitos T y B, entre las placas de Peyer del
segmento proximal y distal (anova de dos-vas), los linfocitos T cooperadores
(CD4+) se encuentran estadsticamente ms altos en el segmento proximal
(*p=0.025). Con respecto a la poblacin de linfocitos T citotxicos (p=0.771) y
linfocitos B (p=0.237), no se observ ninguna diferencia estadstica, entre
ambos grupos (control y estrs).

43

80

Clulas Positivas(%)

*
60

*
*

40

20

0
CD4

CD8

CD19

CD19/B220

Figura 13. Efecto del estrs agudo por inmovilizacin sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en la lmina propia del segmento distal del intestino delgado. Se
determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T citotxicos
(CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometra de flujo.
*p<0.001; t de student.

XVII. Comparacin de las poblaciones linfoides en lmina propia

entre el segmento proximal y distal del intestino delgado.
A nivel de lmina propia en el anlisis de anova de dos-vas, no se observ
diferencia estadstica entre ambos segmentos (proximal y distal) ni entre
44

grupos (control y estrs). Sin embrago, al hacer una comparacin entre

segmentos por grupo (anova de una-va), se observ que el porcentaje de
linfocitos T CD8+ fue estadsticamente mayor (*p=0.0101) en el segmento
distal del grupo control. Sin embargo esta diferencia se pierde cuando los
ratones son sometidos a un periodo de estrs agudo (p=0.9595). Adems en
este ltimo grupo se observa una diferencia estadstica entre los porcentajes de
linfocitos B (CD19+/B220+) entre el segmento proximal y distal (p=0.0138*),
siendo ms alto el porcentaje en el ltimo segmento.

45

Discusin

Las respuestas fisiolgicas inducidas por el estrs involucran al eje hipotlamohipfisis-adrenal y el sistema nervioso autnomo y son mediadas, en parte, por
la liberacin de glucocorticoides y catecolaminas, respectivamente 24,25. Otras
interacciones involucran el contacto directo de terminaciones nerviosas con
linfocitos en rganos linfoides 26

El sistema neuroendrocrino influye en las respuestas inmunitarias, sobre todo

en el sistema inmunitario de las mucosas 27,28,en particular el sistema
inmunitario del intestino. El aparato digestivo est controlado por un sistema
nervioso integrador e independiente con una cantidad de neuronas semejante a
de la medula espinal. Este sistema se considera como una tercera divisin del
sistema nervioso autnomo y se denomina sistema nervioso entrico. Los
nervios extrnsecos conectan al sistema nervioso entrico (ENS) con el SNC al
travs de las vas simptica y parasimptica. Por otro lado, el aparato digestivo
contiene un sistema inmunitario formado por un nmero igual de clulas a las
existentes en el resto del cuerpo 32,29,30. La comunicacin directa bidireccional
entre el sistema inmunitario y sistema neuroendocrino dentro del intestino esta
mediada en gran parte, por neurotransmisores (noradrenalina, acetilcolina),
neuropptidos (sustancia P, somatostatina, VIP, etc.) y receptores que son
comunes en ambos sistemas

31,32,33

46

El estudio de la regulacin neuroendocrina de la inmunidad de mucosas se ha

basado principalmente en la determinacin de la secrecin de IgA en
saliva 34,35, en la sntesis y secrecin del componente secretor de las glndulas
lagrimales

36,37

y en la regulacin de la sntesis del componente secretor en el

aparato reproductor femenino 38,39. Otros hallazgos importantes son el

incremento en la secrecin de S-IgA despus de la administracin de
colecistocinina y pilocarpina 40,41; el incremento en la secrecin de varios
neuropptidos, como son sustancia P, neurocinina A y pptido vasoactivo
intestinal despus de la estimulacin elctrica de nervios extrnsecos del
intestino 42,43; y el incremento en la secrecin de IgA en ileon despus de la
administracin de somatostatina y su inhibicin con la noradrenalina 44

Los efectos del estrs sobre las respuestas inmunitarias en mucosas se han
estudiado casi exclusivamente sobre las enfermedades inflamatorias del
intestino, y en la secrecin de la IgA en saliva. La abundante informacin
existente confirma que el estrs psicolgico desempea un papel fundamental
en la fisiopatologa y presentacin clnica de la enfermedad inflamatoria del
intestino 45,46. Adems, estudios en animales, confirman que el estrs
contribuye a la patognesis de esa enfermedad51. Por otro lado, diversos
estudios han analizado la relacin entre los niveles de IgA secretoria (S-IgA) en
saliva y diferentes circunstancias de estrs, tales como ejercicio, estados de
humor, y exmenes acadmicos; sin embargo, los resultados han sido
contradictorios. En unos se encuentra que el estrs psicolgico y fsico reduce
los niveles de IgA presente en la saliva de individuos humanos, por el contrario,
en otros se encontr que los niveles de IgA aumenta como consecuencia del
47

estrs 47,48,49,50. En corredores de maratn 51 no hay reduccin en el nmero de

clulas plasmticas productoras de IgA o IgM en la mucosa duodenal. Lo
anterior impide realizar una conclusin acerca del efecto del estrs sobre la
respuesta inmune humoral de las mucosas, representada por la S-IgA.
Recientemente, hemos reportado que el estrs por inmovilizacin afecta los
niveles intestinales de IgA, as como de la poblacin de linfocitos intraepiteliales
de la mucosa duodenal de los ratones 52,53.

Los objetivos del presente trabajo fueron determinar si es estrs agudo

inducido por inmovilizacin modifica los niveles de IgA en suero y en el lquido
intestinal del intestino delgado, determinar si hay alguna modificacin en el
porcentaje de linfocitos T y B tanto en las placas de peyer como en la lmina
propia del intestino y evaluar si existe alguna diferencia en los niveles de IgA y
en los porcentajes de las poblaciones linfoides entre el segmento proximal y
distal del intestino delgado.

Uno de los efectos del estrs agudo o crnico sobre el sistema endocrino es el
aumento en las concentraciones sricas de corticosterona (Miroslav Adzic y
cols, 2009, Gomez Gonzlez, 2006). En este estudio observamos, que los
ratones someidos a estrs aumentaron las concentraciones de corticosterona
hasta un 200% en comparacin con el grupo control lo que valida el modelo de
estrs empleado en este protocolo (Figura 6).

48

Otro de los efectos del estrs agudo observado por Ramal et al, ha sido una
disminucin en los niveles de IgA en suero inducido por un periodo excesivo de
ansiedad 54; Laidlaw et al, no observ cambios en el mismo tipo de estrs 55. Sin
embargo Rehenbinder et al, demostraron que los niveles disminuyen en sangre
y aumentan en heces fecales56. En otro modelo tambin se ha demostrado que
el estrs agudo produce un incremento en las concentraciones de IgA en
saliva 57. Por otra parte, Jarillo et al, demostraron que el estrs crnico redujo la
concentracin de IgA en lquido intestinal. Estas observaciones nos permiten
confirmar que la respuesta a nivel inmunolgico depende tanto del tipo de
estrs como de la duracin del mismo (agudo y crnico). En este modelo de
estrs agudo inducido por inmovilizacin observamos que los niveles de IgA
aumentaron tanto en suero como en lquido intestinal de ambos segmentos y
que la respuesta al estrs en el segmento proximal fue significativamente
mayor en comparacin con el segmento distal del intestino tanto en el grupo
control como en el de estrs (Figura 8). El aumento en las concentraciones en
suero correlacionan con lo observado por Karacabey et al, en mujeres
sometidas a un periodo de estrs inducido por ejercicio 58.

Con respecto a las poblaciones de linfocitos T (CD4+ y CD8+) y linfocitos B

(CD19, CD19+/B220+), en un modelo de estrs inducido por inmovilizacin, no
se observaron modificaciones en bazo ni timo. Sin embargo, el estrs
disminuy el porcentaje total de linfocitos, en hgado 59. Rammal H, observ que
hubo una disminucin en el porcentaje de estas poblaciones en sangre, tras un
periodo de ansiedad excesivo auque en otros estudios se ha demostrado que
durante el estrs agudo existe una movilizacin de linfocitos a la circulacin
49

como un mecanismo de defensa del organismo ante esta situacin, siendo los
linfocitos T CD8+, T, y clulas NK, las ms afectadas60. Otra hiptesis sobre
la modificacin de los porcentajes de linfocitos en la circulacin y en otros
rganos, ha sido la induccin de apoptosis en estas clulas debido al aumento
en las concentraciones de corticosterona 61. Sin embargo la redistribucin de
los linfocitos o la muerte de estos no han sido totalmente demostradas. A nivel
de GALT solo se encuentra el trabajo de Jarillo et al, donde observaron una
disminucin en el porcentaje de linfocitos intraepiteliales en intestino delgado,
en ratones sometidos a estrs crnico. En el presente trabajo se realizo un
anlisis del porcentaje de linfocitos T y B en diferentes regiones del GALT y
bazo. Los resultados mostraron que a nivel de sitios efectores como la lmina
propia, hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos B. Este incremento
pudiera deberse a una activacin policlonal o a una redistribucin de las
clulas, sin embargo nuestros estudios no nos permiten dar una explicacin a
este fenmeno.

A nivel de sitios inductores se pudo observar un aumento en el porcentaje de

linfocitos T citotxicos (placas de peyer del segmento proximal y bazo). Los
linfocitos T cooperadores solo se vieron modificados en las placas de peyer del
segmento distal del intestino delgado.

Una situacin sobresaliente sobre la distribucin y la respuesta ante el estrs

entre los segmentos intestinales es el hecho de que en las placas de Peyer del
segmento proximal aumentan los linfocitos T CD8+ y que en el segmento distal
50

disminuyen y aumentan los linfocitos T CD4+. Las diferencias sobre el

porcentaje de linfocitos T y B entre los segmentos proximal y distal del intestino
delgado se deben probablemente a que en el segmento distal, la flora intestinal
es ms abundante. Esto demanda a que haya una mejor regulacin y
tolerancia del sistema inmunolgico.

51

Conclusiones

El periodo de estrs inducido por inmovilizacin, durante cuatro horas, es

capaz de aumentar las concentraciones sricas de corticosterona en ratones
Balb/c. Este tipo de estrs present un efecto inmunoestimulador a nivel
humoral demostrado por el aumento en los niveles de IgA en suero y en lquido
intestinal y a nivel celular, demostrado por el aumento en el porcentaje de
linfocitos T y B en bazo y GALT. La respuesta humoral (IgA) y celular (linfocitos
T y B) de las placas de Peyer y la lmina propia del segmento proximal fue
estadsticamente diferente con respecto al segmento distal.

52

Perspectivas

1. Correlacionar los niveles de IgA en lquidos intestinales con el porcentaje

de linfocitos B y clulas productoras de anticuerpos localizadas en tanto
en los sitios inductores (placas de Peyer) y sitos efectores (lmina
propia) de los segmentos proximal y distal del intestino delgado de
ratones control y estresados.

2. Conocer si el estrs agudo modifica la expresin de citocinas (TGF-,

IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6) involucradas en el cambio de isotipo para IgA en
clulas productoras de anticuerpos (lgA+)en el segmento proximal y
distal de intestino delgado en sus sitios inductores (placas de Peyer) y
sitios efectores (lamina propia).

3. Medir el componente secretor del segmento proximal y distal del

intestino delgado para relacionarlo con los niveles de IgA as como de la
cuantificacin de IL.

53

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