_

ca tu I o

...."",

..-

..-

AMINOACIDOS,
PEPTIDOS
..y PROTEINAS
3.1
3.2

Aminocidos

75

3.3

Trabajar con protenas

3.4

Estructura covalente de las protenas

Pptidos y protenas

85
89

3.5 Secuencias de protenas y evolucin

96
106

Quisiera que la palabra que le propongo, protena...

se entendiera como derivada de proteios, porque describe
la sustancia primitiva o principa l de la nutrici n anima l
que las plantas elaboran para los herbvoros y que stos
proporcionan a los carnvoros.
- J. J. Berzelius, carta a G. J. Mulder, 1838

as proteinas son las rnacrornolcu las biolgicas ms abun

clantes y eSln presemes en todas las clulas y en todas las
pa rles d e las mismas. Las protenas t.:'lmbin prpsentan lIua
gran variedad; en lila ::;ola clula se pueden encolllrar miles de
c1a s~::; de p rolcfnas dife re ntes, que vadan e n tamao desde
pptidos relalivamente pequeos ha..<;ta polneros eno rmes dr
masas moleculares dpl orden de millones. Adcm:.s, las proLei-

nas muestran UJl<t gran diversidad en cuanto a su fWlci6n biolgica y son los p roductos finales ms i.mporta ntes de las rulaS
de info rmaci n que se discuten en la Part' III de est.e libro.
Las protenas son los instrumentos moleculares media nte los
que se expres,'l la infonnacin gentica.
La clave de la es tructu ra de los miles de proteinas diferpnl es se encuentra en unas subunidades monomricas relativamente simp les. Torlas las protenas, tanto si provienen de los
linajes bacterianos ms antiguos como de las formas de vida
ms complejas, csttm conslruidas a partir del mismo conjulllu
ub icuo de' 20 aminocidos, unidos d e forma covalente en se-

cuencias lineales caraclersticas. Dcbido a que cada uno de estos aminocidos liene una cadena laleral propia Que detcrmina
sus propiedades Qumicas, se pucd e considerar este grupo de
20 molc ulas precursoras como el alfabeto en el que est escrito el lenguaje de la estructura proteica.
El hecho ms notable es que las clulas puedan prod UCir
protenas con propiedades y act.ividades muy diferentes uniendo los mismos 20 aminocidos en multitud de combinaciones y
secuencias diferentes. A partir de eslos bloques estru cturales
los diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, trans portadores, fibras musculares, la p rotena d el crista lino del ojo, plumas,
telaraii.as, cuernos de rinoceronte, protelas de la leche, anti biticos, venenos de hongos y un sinfn de Olras sustancias
con acLividades biolgicas distint.as (Fig. 3- 1). Entre estos productos prote icos, los enzimas so n los ms va riados y es pecializados. Prcticamenle todas las reacciones celulares estn
catalizaclas po r enzimas.
La estructura y funcin d e las protefnas constituyen el
tema de este captulo y de los I r E'S sigui elites. Empezamos con
Wla d escripcin de las propiedades quimicas fundamentales
de los anunocidos, pptidos y prolenas.

3.1 Aminocidos

Arquitectura de protenas Aminocidos

Las p rotenas son polimeros de aminocidos, en los Que cada
r esiduo aminoci do eSL unido al s iguiente a travs de un
tipo especfico de enlace cova lcntf". ( El trmino "res iduo" refleja la prcUda de los elementos del agua cuando un aminocido
se Wle 3 otro.) Las proLelas se pueden degradar (hidrolizar)
hasta sus aminocidos constiLuyentes med iante diversos mtodos y los estudios inicialps sobre las prote13S se centraron,
naturalmeme, en los aminocidos libres procedentes de las mismas. Veinte son los aminocidos commne m e encontrados en

75

76

Captulo 3

Aminocidos, pptidos y protenas

FlGURA 3- 1 Algunas funciones de las protenas. (a) la luz producida

trudu ral principal del pelo, escJmas, cuernos, lanJ, UilJ.S y plumas. El

por las lucirnagas es el resultado de una reaccin en que intervienen

rinoceronlt! negro est c.;aoi eXllnguirlo en estado sa lvaje debido a los

la prolt:n 'ud(erln<l y el ATP, cata li zadJ por el enzimJ luciferasa (vJ-

mitos prcv<.l lcn tcs en algunds partes del mundo de q ue un polvo deri-

se Recuadro 1.i-2). (h ) los eritroci tos cont ienen grJndes cJ ntidades de

vado de su cuerno l iene p rop iedddes ,lfrodisacas. En rea lidad, la s

la protena transportadora de oxgeno hemoglob ina. (e) lJ prolenJ

prop iedades qumicas del polvo de l.uerno (le rinoceronte no son di -

queratina, producida por fodos los vertebrJdos, es el componente es-

teren tes dd ue lds pezUlla!o de bvidos o de las uas humanas.

protenas. El primer aminoci do descubierto fue la asparagiJla

en 1806. El ltimo de los 20 que se encontr fup la (reon ina,
Qlle no fue identifIcada hast.a 1938. Todos los aminocidos I ipnen nombres comunes o triviales que, en algunos casos, provie nen de la fuente de la cual se aislaron inicialmentp. Ll
aspa ragina se e nco ntr por primrrl. vez en el esp rrago y el
cido glutmico se encont r eu el gluten de trigo; la tirosina Sf'
aisl por pri mpra vez del qucso (su nombre provielle del
griego tyro:>, "queso") y la glicina (df'1 grif'go gl!Jkos, "du lc(''')
se denomi n de esta manera debido a ::ilI sabor dulce.

para ind icar cte manpra lhr('y;ac1a la compos icin y secuencia

de aminocidos pOlimeri:lados ell las protellas.
F:n una prctica que.' puede resulta r confusa, se utilizan
do::; cOl1ve nciones pa ra idenlificar los carbonos dentro de un
aminocido. Los carbonos adicionales de un grupo R se desigmm l;ollllUlle llLe {3 , 'Y, S, e, eLc., empf'zando a partir de l carhono (l. I'ara la mayora de las dems molculas orgHi cas, los
tomos df' ('arbo no s(' 1ll1meran simplemente a partir de Wl
extremo, dando la mxima prioridad (C- 1) al carbo no cuyos
slIslitllyf'n l,('s ('ontp nga n tomos de mayor n(unero atmico.
Sig uiendo es ta llima convencin, el gru po carboxilo de un
aminocido sela el C- I y el ca rbono a serfa el C-2. EH algwlos
casos, COIIIO en aminocidos con gru pos H hctc roccJicos, el
sistema de letras griegas e::; ambiguo y se utiliza por ello la
convencin numrica.

los aminocidos tienen caractersticas

estructurales comunes
Los 20 aminocidos estndar encontmdos en las protenas son
a -aminocidos. Tienen lodos IIn grupo clThoxilo y un grupo
amino 1Inidos al mismo {tomo de carbonu (e l c.:adJullo a ) (Fig.
3-2). Difierell unos de otros f'n sus cadenas latera les, o grupos Rt que varran en est ructura, WllIailo y carga f'l~ctric:l y
que influyen rn la solllhi lid(lc! en agua de lo~ aminocidos.
Adems de estos 20 aJ lJ\ocidos exis ten muchos ms fl Ue' se
enCIlf' nl,ran con me nor frecue ncia. Algunos de eHos son resi duos que llan sido modificados rlesp\l{is de J[I sn tesis de una
prot<'fna; ot ros se hallan presente::; e n urgalslllos vivos 1)('1'0
no como wudades constit uyf'ntC's dI' Jas protefnas. A los aminocidos estndar se les han asignatlo abreviaturas de tres lE"
Lras y smbolus de una sola It'l rn (Tahla :l- ! ) fl lI C' se utilizan
COO
H"N- (>

J{

FIGURA 3- 2 Estruclura general de un aminocido. ( ..1,1 t>.struclu ra es

comn a todos los u -Jminoocidos. con una nica exc.;ep6n. (la excepcin es la prolina, un aminocido cdit.o.) El grUIX) R n cadena laleral
(en rojo) un ido al cJrbono o (azul) es dicrcnte para c.;add aminocido.

f.

'~l

CH 2 - CH 2 -CH 2 - CH 2 -CH -COO-

NHJ

+N H:i

Lisi na
En lOdos los annocidos estndar excepto la g li ci na, rI carbono a est unido a cuatro grupos diferelltes: un grupo carboxilo, un gmpo amlIlo, IIn gmpo J{ y un tomo de hidrgeno (Fig.
:-1-2; en la glicina el grupo R e::> otro tomo de hidrgeno). El
tumo de carbono a es, por t.ant.o, IIn cent-ro (Iuiral (p. 17).
l)C'b icl o al orclcnam.ie nlO tet ra drico de 10::> orbi ta les de enlace
alrededor df'l tomo dp carbono a, los cuatro grupos diferentes pueden ocupar dos ortlenanuentos disl illlos en el espacio,
por lo qll(, los aminocidos pueden aparecer en forma de dos
estereoislIleros. Al ser imgenes especula res no su perponibIes enl rf' sr ( Pig. 3-3) ! las dos ronuas constituyen lm tipo de
estereoiSI1lerus delloJlwlados enantimcl'os (vpasc "ig. 1-1D).
Todas las molculas con lm ceat ro qwral 5011 t:unbin pticamente activas, ('s decir, hacen girar el pl"ulo de la luz polanz.ada (vase Recuadro 1-2).

3.1

Para especificar la configuracin absolu ta de los cuatro

susLituyentes de los tomos de carbono asimtl;ros se ha desarrollado Wla noruellcJatura especial. L.c"lS corlguraciones absoImas de los azcares sencillos y los arninocidos se especificall
mediante el sistema u, L (Fig. 3 -4 ), basado f'1l la conflguracin
absoluta d el azcar de rres carbonos glice raJd chfdo, una convencin propuesta por Emil Fischer en 1891 . (Fischer conoca
los grupos que rodean e l t.omo de carbono asimtri co d el gliceraldehclo pero tuvo que atli vinar su configul'ncin absoluta;
s u prediccin se confi nn posteri ormente por aw lisis de di fraccin de rayos X.) Para tocios los eompu cs to~ Quirales, los
estereoismeros que tienen una configuracin relacionada con
la del L-gli ce ralde hclo se d esignan L y los estereoismeros relacionados con el D-gliceraldehfdo se designan D. Los grupos
fun cionales de la L-alanina se hacen coincidi r con los del L-gli ce raldehdo alin eand o aquellos que pued en intl"rconverlirse
mediante reacciones quimi cas Si mples en w\ solo paso. As, el
grupo carboxilo de la L-alanilla ocu pa la misma posicin respecto al carbono quiral que el grupo aldehdo del L-glicerald ehido, puesto que un aldehdo puede convertirse fr.ilmente en
un grupo ca rboxilo en un solo paso mediante ulla oxidacin.
Hislricamente, las denominaciones similares I y d se utilizaron
para levgiro (ql1e gira la luz a la izqUierda) y dextr giro (que

coo

H3N

('JI:!

(a)

L-Alanina

COO -

(b )

H,- t - H
I
CHa
L-A1anina

COO -

N-

Ha

C- H

Cl[,~

(e)

COO -

L-Alanina

NH,
ClI,
D-Alanina

H - C - NH,

CH.1
o-AJanina

COO -

H- C

HO~ C -H

!
' CH, OH
L-C li ceraldehdo

COO
+

77

OHO

H- C- OH

CH, OH
o-Gliccraldehdo

000
i

H ,3 N- C! H

H-C - N H,

CH,
L-Alanina

CH 3
IJ-AJanina

FIGURA 3-4 Rel acin estri ca de los estercois6meros de la alanin ..

l - y o-glicerald ehdo. En esta s fr-

con la configuracin absoluta del

mulas de perspectiva los carbonos estn alineados vert icalmente con

el tomo qu ira l en el cen tro. loS carbonos de estas molcu las e!ot n
numerados cmpez;:lIldo por los ca rbonos aldehdo- o carboxito-terminalcs (en rojo) de t a 3 y de arr iba abajo tal como se muestr<l. Cuando
se presentan de esta forma , el grupo R del am inocido (cn cste CJSO
el grupo metilo de la alanin l) est siempre debajo del carbono (r . los
l -aminocidos son los que tienen el grupo a -amino J la izqu ierda y los
D-aminoc idos los que tienen el grupo a-ami no a 1" derecha.

gira la luz a la de recha). Sili embargo , no todos los L-3 Itlinocidos son levgir os y se hizo necf'saria la convencin que se
muestra en la l;'igura 3-4 para evitar posibles ambigedades sobre la configuracin absoluta. Segn la convf'nein de Fischer,
I. y D hacell referencia solamente a la configur ac in ahsolut.a
de los cuat ro sustituyentes alrededor de l carbono quira l.
Ot ro sis te ma para especifi car la configu raci n alrededo r
de un centro quiral es el sistema RS , que se utiliza en la nomenclatura sistemtica de la qumica orgnica y describe con
mayor precisin la configuracin de las molculas con ms de
un centro quiral (vase p. 18).

Los residuos aminocidos de las protenas

son estereoismeros L

COO-

' CIIO

Am inocidos

NH,

eH,
o-A lan ina

FIGURA 3 .. 3 Estcrcoi so mera en los a-a minocidos. (a) l os dos

estereoismcros de 1" ~lbn ina , la 1- y la o-a laninil, son imgenes e!opecularcs no superponi bles enlrc s (cnantimeros). (b, e) Dos convenc iones diferen tes para mostrar la con figurac in en el espacio de
Jos estereoi smeros. En las f6 rmul as de perspectiva (b) los enla ces
con forma de cua se proyectan fuera del pla no del papel ; los enlaces
a trazos lo hacen hacia atrs. En las frmu las de proyecc in (e) se supone que los enl aces horizonta les se proyectan fuera del plano de l
papel, los enlaces verticales haci .. atrs. No obstlnte. se utiliZdn a
menudo las 6rmulas de proyeccitSn de modo no sistemtico, si n pretender representar una configur;acin estereoqumica espec fica.

Casi lodos los compuestos biolgicos con un ce ntro q Lliral se

preselllan en la naturaleza en una sola de sus fo rmas estereoismeras, la D o la L. Los res iduos aminocidos de las proLe fnas
so n exclusivamente I.-estereois meros. Slo se han r nco ntrad o n-aminocidos en unos pocos pptidos, gene ralmente
pequeflos, que incluyen algunos p ptidos de las paredes cellllares bacterianas y alglUlos antibitiros peptdicos.
Es UJl hecho nok'lble que casi lodos los aminocidos eJE' las
protenas sean L-eslereoismeros. Cuando SE' formall compuestos qllirales en reacciones qumicas ordina rias, el resultado es
w la mezcla racmica oe ismeros u y L, que son c1 iffrilf's de distingllir y aislar por el qulnico. Sin f'm hargo, para los sislemas
vivos, los ismeros n y L son Lan diferentes como la malla derecha y la izquierda. La fo rmacin de sulwsLructuras estables y
repetidas eJllas protefnas (Captulo 4) requiere e n general Qllf'
sus aminocidos sean de WI<I misma serif' est.ereoqumica. La::;
clulas 5011 capaces de si ntetizar especficamente los ismf'ros
L de los aminocidos grac ias a qu e los r ('ntros activos de los
enzi.mas son asimtricos, lo que implica qu e las rearrion('s que
cataUzan sean est.ereoespecficas.

78

Captu lo 3

TABLA 3-1

Am inocidos. pptidos y prot enas

Propiedades y convenciones asociadas con los aminocidos estndar

Valores de pK.

Aminocido

Grupos R apolares
alifticos
Glicina
Alanina
Prolina
Valina
Leucina
Isoleucina
Metionina
Grupos R aromticos
Fenilalanina
Tirosina

Triplfano
Grupos R polares
sin carga
Serina
Treonina
Cisteina
Asparagina
Glutamina

Abreviatura!
smbolo

Gly
Ala
Pro
Val
Leu
"e
Mel

M,

pK,
(- COOH)

pK2
(- NHj )

pi

ndice
Presencia en las
hidroptico' protenas (%)1

5,97
6,01
6.48
5,97
5,98
6,02
5,74

- 0,4
1,8
1,6
4,2
3,8
4,5
1,9

7,2
7,8
5,2
6,6
9,1
5,3
2,3

10,07

5,48
5,66
5,89

2,8
- 1,3
- 0,9

3,9
3,2
1,4

9,15
9,62
10,28
8,80
9,13

8,18

5,68
5,87
5,07
5,41
5,65

- 0,8
-0,7
2,5
- 3,5
- 3,5

6,8
5,9
1,9
4,3
4,2

2,18
1,82
2,17

8,95
9,17
9,04

10,53
6,'00
12,48

9,74
7,59
10,76

- 3,9
-3,2
- 4,5

5,9
2,3
5,1

1,88
2,19

9,60
9,67

3,65
4,25

2,77
3,22

- 3,5
-3,5

5,3
6,3

75
89
115
117
131
131
149

2,34
2,34
1,99
2,32
2,36
2,36
2,28

9,60
9,69
10,96
9,62
9,60
9,68
9,21

Phe F
Tyr Y
Trp W

165
181
204

1,83
2,20
2,38

9,13
9,11
9,39

Ser
Thr
Cys
Asn
Gln

S
T
C
N
Q

105
119
121
132
146

2,21
2,11
1,96
2,02
2,17

Lys K
His H
Arg R

146
155
174

Asp D
Glu E

133
147

G
A
P
V
L

pK.
(grupo R)

Grupos R cargados
positivamente

Lisina
Histidina
Arginina
Grupos R cargados
negativamente
Aspartato
Glutamato

Escala que combina la hicllolobicldad y la hidrofihcidad de los grupos R; puede utilIZarse para predecir la lendeooa de los aminocidos
a buscar un ambiente aCtloso (valores negativos) o un ambienle hiCIlofbico (valores positivos). Vase Capitulo 11. Oc KVle. J. & Doolrttle.
R.F. (1982) A Simple melhod lordisplaying (he hydlOpthic charactel 01a protein. 1. Mol. Biol. 157. 105-132.
' Presencia media en ms de 11 50 protenas, De Doolittle, R.F. ( 1989) Redundancies in protein seQucnces. En Predicrion
of Pro/eln S/ructure allo Ihe PrinCipies ofProlein Conforma/mn (Fasman, G.D.. ecI. ), pp. 599-623. Plenum Press. NewYol1i.

Los aminocidos se pueden clasificar segn su grupo R

I'~l conoci nuento de l a~ propiedades qumicas de los aminori dos esllldar es de vital importancia para la compre nsin de la
bioqufmica. El tema se puede si..ll lplificar agrupando los aminocidos en cinco clases principales basadas e n las propiedades
de sus grupos R (Tabla :3-1), en {'sprrial Sil pola.rida d , o te nrlrnria a interacciona r con el agua a pl-l biolgico (cerca d e p H
7,0). La po laridad de los ~ rupos R va ra {'norm{'m{'ntc desde
totalmente apola r o hidrorbico (i nsoluble en agua) has t.a allarnenle polar o hidrorlico (so lu ble en agua).
En la Figura 3-5 se muestran las estrurt uras de los 20
aminocidos estnrlar y algunas de' s us propiedades se mues-

t mn en la Tabla 3- 1. Dentro de cada clase existen gradaciones

de pOlaridHLI, talt1a(o y fo rllla de los grupos R,

Grupos R apolares alift;cos

Los grupos R de esta clase de aminorirlos son apolares e hid rofbicos. Las ca deltas lalera.les de
la alanilla, "atina , le ucin a e isole ucilla t('ndr n a agruparse
ent re s en las proteulS, e~Labiliz:mdo las es lructuras proteicas
a travs nf' int prarcionps l1irlrof bicas. La g li cin a tiene la est ructura ms sim l)le. AlU tllUe fo rmalmente es apo lar, s u muy
pequeiia rndpna la!('m l no tie ne una contribucin real e n las
ulte racciolwS hidl'of6hicas. La metinnina , \lno de los dos aminocidos que- contienen azufre, tiene W1 grupo lioler apolar r n
su cadena laleral. La prolina tiene tina radpna lateral aliftica

3.1

COO
I
H3 N-C- H
I
CH,

Glicina

Alnnina

COO, I
H, N- C- H
.
I
CH,
I
CH

COOI /H

+/ c,

H ,N
CH ,
I
I
H , C- -CH ,

COOI
H, N-C-H
I
+

"

COO
I
+
H,N- C- H

COO
I
+
H, N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
S
I
CH,

Le ucin a

Isoleucina

Mction.ina

COOI
H, N- C- H
I
CH,OH
+

Serina

COOI
H, N- C-H
I
H- C- OH
I
CH,
+

Treonina

COO I
H"NC.
I H
H,

H,N

/ C'"
" O

Asparar.,rina

Fenilalanina

COOI
H, N- C-H
I
CH,
I
SH
+

Ci stena

COO
I
H,N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
/ C'"
H,N " O
+

Glutamina

coo

I
H 3 N- C- H
I
CH,
I

Qg
OH

'.l'irosina

Triptfano

Grupos R car gados positivamente

COOI
H, N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
CH,
I
CH,
I

COOI
H, N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
CH,
I
NH
I +
C= NH,
I
NH,

COOI
H3 N- C- H
I
CH,
I
C- N H

Lisina

Arginina

Histidina

Grupos R polares sin carga

COOI
H, N- C- H
I
+

/
CH,
CH"

Valioa

CH" CH,

/"

COOI
H 3 N- C- H
I
CH
+

Prolin a

H- C- CH,
I
CH,
I
CH,

79

Grupos R aromticos

Grupos R a polares alifticos

COO
I
H,N- C- H
I
H

Aminocidos

+N H 3

1I
f H
C- N
H

Grupos R cargados negativam ente

COOI
H3 N- C- H
I
CH,
I
COO-

COO
I
H,N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
COO-

Aspartato

Glutamato

FIGURA 3-5 Los 20 aminocidos estndar de las protenas. las frmulas estructu ra les muestran el estado de ionizacin que predomina
a pH 7,0. las partt!s no sombreadas son comunes ti todos los aminocidos; la s partes sombreadas en rojo son los grupos R. Au nque el

grupo R de la hi st idina se muestra sin carga, su pK (vase Tabla 3-1)

es tal que una fraccin pequea pero significativa de estos grupos
est ca rgada posi tiva menl c l pH 7,0.

con una estructura cfclica dislintiva. El grupo amino secW1dario (irnino) de los residuos de' protina t iene \l na conformacin
rgida qUf' reduce la tl cxibilidi;ld estnlctural de la,> regiones popepr.dicas que contienen este aminocido.

fWlcional impo rtanle en algunos enzi.ma,>. La Lirusina y e l triptfano son signH"icativamen te ms pola res q ue la fe nilalanina
debido al grupo h.idrox il o de la tirosina y al nit rgeno de l aniUo indlico del triptfano.
El triptfano y la tirosina, y en m uclLo menor grado la fenilalani.na, absorben la lu z ultravioleta ( F'ig. 3-6; Rec uad ro 3-1).
Esto expUca la fuerte absorbancia de la [uz caracterstica de 1;1
mayora de las protenas a una longi tud de onda de 280 Jun ,
propi edad aprovechada por los investigadores en la C!.:"lracte ri zacin ele Ia..<; protenas.

Grupos R aromticos

La fenilalanina, la ti.rosina y el t rillt-

fano , con sus cadenas laLerales arom ti cas, son relativamente apolares (hidrofbicos). Todos eUos pueden participar
en interaccio nes hidro rbicas. El grupo hidroxilo d e la tirosina
pued e fo rm ar pue ntes d e h idrgeno y constituye un g rupo

80

Captulo 3

Aminocidos, peptidos y proten as

Grupos R polares sin carga Los grupos li de estu!:; aminocidos

son ms solubles en aglla, o l1icLroffiicos, que los de los aminocidos apolares, debido a que co ntienen grupos funcionales que
fo rman p uent.es de hi drgeno con el agua. EII es la C'lase de
aminocidos se illcluy('n la s e rilla, treoninn, cistela, asparagina y g lutamina . La polaridad de la serina y In treonina
proviene de s us gf\lpos hidroxilo; la polarida d de la cistena d e
s u gru po su lihidrilo; y la pola ridad de la aspn ragi na y gllllamina de sus grupo~ amida.
La aspa ragina y la glutami na son las ~lInjcla s c! C' otros dos
aminocidos que lambi(!n se encuentra n N l las protelas, 35part<tto y glu tamato, respec ti va mente, a los que se hid rolizaIl
fcilmente por cido o base. La ristena se oxida fcilrncme
forma ndo Wl aminocido dim.rico llllido covale ntelllente Uamacl o cistina, en el qu e dos mol(!culas de cistena o sus residuos estn unidos a travs de un enlacC' dislllfuro (Fig. 3-7).
Los residuos tmidos por un pllcnte dis ulfuro son fucrtemente
hi clrofbicos (apo lares). Los puentf's csulfuro desempean un
papel especial en la estructu ra de muchas prote nas al formar
un.iones covalentcs enlre parles dC' una molcula de protrina o
entre dos ca d ena~ poli peptfdicas diIeren tes.
Grupos R cargados positivamente (bsicos) Los grllpos It ms hidrofilicos son los que estn cargados, sea positiva o nrgal ivamenl,C'. Los am.inocidos en los que los gru pos R t ic neu lIua
carga neta pos itivn significaLiva a pH 7,0 son la lisina, quc
tiene I1n grupo amino primario adicional en In posici n e de su

:f
J'- - - -'-~-~~ ---'--"' - - "'- -'-

230 240 250 260 270 280 290 300 310

Lon,ritud de onda (nm )

FIGURA 3-6 Absorbcin de la luz ultravioleta por los aminocidos

aromticos. Comparacin de los c!>peclros de il bsorcin de luz de 105
aminocidos aromticos triptfano y l irosina a pH 6,0. los ilminoddos estn presentes en canti dadl.'S (.><:Iuimolares (10 1 M) en idnticas
condiciones. la absorcin de la luz por el triptfilno es cua tro veces
mayor que la de la tirosina. Obsrvese que t!1 mximo de absorcin
tanto pilra el triptfano como para la tirosi na C!>t cerca no a una longilud de onda de 280 nm. la absorcin de luz por el tercer amino,icido
dromtico, la fen ilalan in<l (no mostrildo), generalmente contribuye
poco d las propiedades espectroscpicas de Iils protenas.

coo-

coo
H,N
Cistena

CH

H3

CH 2

CH 2

I
SH

I
S

SH
I

Cistena

CH,

N-9I H
+

Cist ina

CH ,

CH -, H"

CH - NH,

coo

COO-

FIGURA 3-7 forrnat.i{m reversib le de un puente dlsu lfuro por oxidacin de dos Illolt.ul;s de cistena. l os puentes disu[furo entre residuos de Cys estab ili zan leI " estructuras de muchas protenas.

cadena a liftk a ; la arginina, que tiene un g ru po guanidino

cargado posit ivam ellLe; y la histidin a, q ue co ntiene un grupo
imida:lOl. La hislidina ('s el nico aminocido estndar quC'
tie ne una radcna lateral ioniza hl f' ro n un pKa prxima a la
l1('lItralidad. En mllc h n~ rC'acciones calalizadas por enziums,
Wl residuo de I lis facili La la I'eac.cin al servir de dador/ace ptor
de protones.
Grupos R cargados negativamente (cidos) Los dos aminocidos
lue tienen grupos R eUIl una carga nct.:'1 negativa a pH 7,0 son
e l aspartato y g llltamato, cada uno de los cuales tiene un
sf'gundo gr upo carboxilo.

Los aminocidos no estndar tienen tambin

Importantes funciones
Adems de los 20 aminocidos estndar, las protenas pueden
conle nf'l" 1'f'si clu os creados por mocl ifi caciu de los rC'siduos
C'st.nclar ya incorporarlos a un poHpplido (pig. 3-8a). Entre
lu!:; aminocidos no esllldar rstfll1 la 4-hidroxiprolina, que
('s l Ul derivad o de In prolina, y la 5-hidroxiJisina, derivada de
la lisilla. La primera se encuentra en la par ed celular de plan tas
y al1luas se encuentran el1 el colgeno, una protela fi brosa del
I('jido conjwltivo. La -N- mctH-lisina es Wl constituyente de
la miosina, una protena <":oll trctil de l msc ulo. Olro am inocido no estndar unpOl"lantC' es el y-carboxiglutamato, que
se encuentra en la protena pro tl'O mbina que interviene C'n la
coagulacin de la sangre, as como en ciertas otras prolenas
que unen Ca2 + como parle de SlI funci n biolgica. Ms complC'ja es la desmosina , quc es LUl derivado df' cuatro residuos
diferentes rlf' Lys y que se encuentra en la protema fihrosa
C'lastina.
La sclcnocistena e:l un caso especial. Esle r('siduo poco
frecuente es introducido d W'~UlL e la sntC'sis ele prOLe13s f' 1l lugar dr ser creado a lravps dC' u na modificacin postsinttica.
COlltielle selenio cn luga r del azufrE' de la cistena. La sele nocisleina, qll de hecho proviene ele la serina, SP encuentra en
slo ullas paras protelas conocidas.
Se han encon l rado alrededor de 01 ros :300 aminocidos
en las ('t"lulns. 8Sl0S tienen funrioll(,s di versa~ pero no forman

3. 1

Aminocidos

81

FIGURA 3- 8 Aminocidos no estndar. (a) A lgunos am inoc idos no

estnda r encon trados en protenas. Todos ellos provienen de amino-

HO- C- -CH ,

cidos estndar. Los grupos funci ona les extra a adidos a travs de
reacc iones de modificacin se muestra n e n rojo. l a des mosina se

H, C,

/ CH- COO-

/ N,
H
H

forma l parti r de cuatro res iduos de Lys (los cuatro esqueletos carbonados estn sombrea dos en amar il lo). O bst!rvesc que se utilizan tanto

4-Hidroxipr oli na

nmeros como letras griegas para identi icar 10 5 tomos de carbono

de estas estru{:tu ras . (b) LJ orni tin;: y la citrulina, q ue no

H, N- CH , - CH- CH, -CH, - CH- COO-

encuen-

el ci clo de la urea.

+NH,

OH
5-Hidroxit isina

SI:!

tfan en protenas, son intermedi arios en la biosntesis de argi nina y en

O
11

-IQ- C

CH,,- NH- CH, -CH, -CH, - CH,-?H- CO<J

H,N-

+N H3

e
I

Ha,,- C- H

F orm a
no inica

Forma
zwitterinica

6-N-metil-lisina

coo

I
CI

FIGURA 3 - 9 Formas no inica y zwillcrinica de los aminocidos.

-OOC- CH- CH, - CH- COO-

La fo rma no inica no se encuentra en can tidades signifi cativas en di-

+NHa

soluciones acuosas. El zw itter in predomina a pH neutro.

y-Car boxiglu tamato

Los aminocidos pueden actuar como cidos

y como bases
Cuando un aminocido se disue lve en agua , se encuentra en
solucin en forma del ion dipolar, o zwitterion (e n ale mn
"ion hbrido") , mostrado en la Figura 3-9. Un zv.itterion puede
actuar bien como cido (dador de protones) :
H

R- C- COO =

R- C- COO + 1-1'

NH,

' 1\Tf13
Zwitterion

HSe- CH, - CH- COO-

o como base (aceptar de protones):

- NH,
Selenoci stena

(a)

R- C- COO

+NH3
Zwi tterion

H"N- CH, - CH, -CH 2 - ? H- COO-

+NH 3
Om itina

H, N - C- N- CH, -CH o-CI-l , - CH- COO

II

O H
(b )

+NH,

Citrulina

parte r!f' prolelIas. La ornitina y la citrulina (Fig. 3-8b) merecell una mencin es pecial porque son intermediarios clave
(mrl,abolitos) en la biosntesis de la arginina (Captulo 22) y
en el ciclo ele la urea (Captulo 18) .

Las sustancias con esta naturalc7,...'l dual son aufteras y a meIludo se denomina n a.nfolitos (de "electrolit os anfteros').
Un a -aminocido sencillo monoamnico y monocar boxflico, tal
como la alanina, es Wl ci do diprLico cuando est totalmente
pro tonado - esto es, l"iene dos grupos, el grupo - GOOI-! y c l
grupo - NHj, que pueden dar pro tones:

y
R- C- COOH

Carga NH g
neta :
+1

H'

...L.

Y
R- C- COO -

+NHa
O

...L.

I
I

R- C- COO -

NH,
-1

82

Captulo 3

Am inocidos, pptidos y protenas

RECUADRO 3-1

BIOQuMICA PRCTICA

Absorcin de la luz por las molculas:

ley de Lambert-Beer
Una gran variedad de biomolculas absorben luz a longitudes de onda caraclerslicas, de la misma forma que el Lriplfano absorbe luz a 280 IUn (FiS. 3-6). La medida de la
absorcin ele la luz mediante un espectrofolmelro se utiliza
para deleclar e identificar molculas y para medir su co ncentracin en solucin. La fraccin de la luz incidenle absorbiela por una solucin a lma longitud de onda determinada
est relacionada con el espesor de la capa absorbente (paso
ptico) y con la conce nt racin de la especie absorben te
(Fig. 1) . Estas dos relaciones se cornbinan en la ley de L.,1mbert-Beer,
log

lo

ecl

en donde lo es la intensidad de la luz incidente, J es la intensidad de la luz transmitida, e es el coeficiente de absorcin

(o extincin) molar (en unidades de litros por mol-centne-

tro), e es la concentracin de la especie absorbente (en moles por litro) y l el paso ptico de la muestra que absorbe la
luz (en centmetros). La ley de Lambert.-Beer supone qu e
la luz incidente es paralela y monocromtica (de una sola
longitud de onda) y que las molculas de disolvente y de soluto eslll orientadas al azar. La expresin log(h/J) se denomina absorbancia y se designa como A.
Es import.ante resaltar que cada rnillmetro sucesivo de
paso ptico de la solucin absorbeme en lila cubeta de 1,0 cm
no absorbe wm cantidad const,.;mte sino una fraccin conslante de la luz que incide en l. No obstante, con una capa
absorbenle d e paso ptico fijo , la absorbancia A es directamente 1J'mporcional a la concentracin del solUlO absorbente.
El coeficiente de absorcin molar varia con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente y la longitud de
onda, y t.ambin con e l p i [ si la especie absorbente de luz
est en equilibrio con W1 estado de ionizacin Que tiene diferemes propiedades de absorbancia.

FlGURA 1 Componentes principales de un

cspeclrofolmetro. Una fuente de luz emite

Intensidad
de la luz

lu z en un amp li o espectro. A conti nuacin,

incidente

el monocromador selecciona y transmite

luz de una longitud de onda determinada.
la luz del monocromador pa sa a travs de
la muestra situada en una cubeta de paso
ptico I y es absorbida por la muestr<l en

Lmpara

Intensidad
de la luz
tr ansmitida

'-------'~

proporcin a la concentracin de la
especie absorbente. la luz transmitida

se mide mediante un detector.

Los aminocidos tienen curvas de titulacin

caractersticas
La lit.ulacin cido-base implica la adicin o e liminacin gradual de protones (Capitulo 2). La Figura 3-10 muestra la curva
de titulacin ele la forma diprtica ele la glidna. La grfica
tiene dos etapas distintas, que corresponden a la dcsprotOlwcin de dos grupos diferentes de la glicina. Cada una de las
etapas se asemeja e n su forma a la cu rva dE' itulacin de un
cido monop rtico tal como pi cido actico (vase Fig. 2- 17)
Y puede analizarse de la misma manera. A pll muy bajo, la especie inica vredorninante (Je> la glicina es + -IJ N- CH 2 - COO 1-1 ,
la forma totalmente protonaua. En el punto medio de la primera etapa de la titulacin, en el Que el grupo -COOH de la
glicina pierde su protn, se encuentran presentes concentraciones equimolares del dador de protones (+ H,N-CH, - COOl I)
y del aceptor ele protones (+ H.'lN-C I-I 2 - COO- ). EI1 el punt.o
medio de cualqUier titulacin se alcanza un punto df' inflexin
en qu e el pH es igual al pK", del grupo pro tonado que se est
titulando (vase Fig. 2-18). Para la glicina e l pll e n el pw,w
medio es 2,34 y por lo tanto su grupo -COOH tie ne un pKa

Monocromador

Detector

Cubeta de muestra
con e mol es/Utro
de la especie
absorbente

(rotulado como pK, en la l'ig. 3-10) de 2,34. (Recu6rdese del

CapitulO2 Que pH y pKa son simplemente notaciones tiles de
1.. concentracin de protones y de la ("'Qllsuulte de equilibrio ele la
ionizacill, respeclivamenl,f'. El pKa es una medida de la tendencia de un grupo a ceder Wl protn, t.endencia que disminuye en un factor de l Ocada vez que el pKa se incremcnta e n
una unidad.) A medida que avanza la titulacin se alcanza otro
PWllO importante a p H 5.97. AqL hay otro punto de inflC'xin
en e l q1lC' la eliminacin <.lel primer protn ('s prcticamente
co mpleta mientras que tan slo se ha iniciado la eliminacin
del segundo. A esle pH la glicina se enc uentra mayoritariamente en forma de l ion dipolar +1-l 3 N-C H2 -COO- . Pronto
volveremos a hablar sobre el significado de este pWll0 de inflexin en la curva de titulacin (pI en la Fig. 3-10).
La segunda e tapa de la titulacin corresponde a la eliminacin el(' un protn del grupo -NH~ de la glicina. El pH en el
plU1tO lIIedio de e5t..1. etapa tiene un valor de 9,60, igual al valor
elel pK. (rot.u lado pK2 en la Fig. 3-10) del grupo -N II;. La
tit.ulacin es prcti carncmc complela a un pH de aproximadamente 12, en donde la forma predomina nte de la glicina PS
H2 N-CH"-COO-.

3. 1

NH 3

I
CH,
I

NH 3

CH,

CH,

600-

COOH

600

13
Glicina
pl(,

9,60

------ -

7
pH

pi
pK,

5,97

2,34

0 '--- - - - " - - - - -"------'---------'

0
0,5
1
1,5
2
OH- (eq ui va lentes)
FIGURA 3-10 Titulacin de un aminocido. Se muestra aqu la curva
de titulacin de glicina 0,1 M a 25 oc. las especies nicas predominantes en puntos clave de la titulacin se muestran enci ma de la gr-

fica. l os recuadros sombreados. centrados alrededor de pK = 2,3 4 Y

pK2 = 9,60, indican las regiones de mximo poder tamponanle.

Grupos carboxilo
y amino metilsusrituid!:i

10

CH 3 -COO-

H- C - COO!-I

NH3

a-Ami nocido (g lic ina)

pKa = 2,34
La repulsin entre el grupo amino
y el protn saliente disminuye el pKa
del grupo c8l'boxilo y los grupos con ca rgas
opuestas disminuyen el pKn
al estabilizar el zwitLeri un..

tilo. Estas modificaciones que dism inuyen el pKd son debidas a nter-

H- C - COO

AGURA 3-11 Efedo del entorno qu mi co en el pK.... Los valo res de

pK... para los grupos ionizables de la gli ci na son menores que los
de los grupos amino y carbox ilo susti tui dos simplemente por un mc-

CH3 - NH, ~ CH O- NH2

l\,fetiJamina
El pKa norm a l de un grupo
ami no es aproximada mente 10,6.

N H,

12

cid o actico
El pK. norm a l de un grupo
carboxi lo es a proximada mente 4,8.

Grupos carboKilo y amino

de la gli cina

CH 3 - COOH

83

A pa rtir de la curva de Liwlacin de la glicina se pueden

ded ucir diversas ilormaciones interesantes. En primer lugar,
da una medida cuantiwtiva del pKa de cada UlIO de los dos
gru pos ionizables: 2,34 para el -COO H y 9,GO para el grupo
- NH;. Obsrvese que el grupo cal'boxilo de la glicina es ms
de 100 veces ms cido (se ioniza ms fcilmente) que el grupo ca rboxilo del cido ac[co que , como hemos visto en el Captulo 2, tien e un pKa de 4,76, cercano al promedio para un
grupo carboxi lo unido a un hidrocarburo aliftico sin ms sustituyentes. La modificacin del pK.. de la glicina est causada
por la repulsin entre el protn salient.e y e l grupo amino cargaclo positivamem e ce rcano situado e n el tomo ele carbono a
tal como se clescribe en la Figw'a 3-11 . Las ca rgas opuestas eIl
e l zwitterion result.ante rie nen un efecto estabi.l.izaHle, desplazando e l e qtlibrio an ms ha cia la derec ha . De modo si.milar,
e l pKa del grupo amino de la glici.na es menor que el pKn medio
de un grupo amino. Este efecto es debido en parte a los tomos
de o)...igeno e leetronegmivos del grupo carbox il o, que t ie nden
a atraer electrones hacia ellos, aumente'melo as la tendencia de l
grupo amino a ceder un p rotn . Por tanto, pi grupo a-a mino
tiene un pKa menor que e l ele una amina aliftica tal como la
metilamina (Pig. 3-11 ). En res w nen, el pKa. de cualquie r grupo
fLmcional se ve flle rtemente afectado po r su enlom o q\lm ico,
un fen meno que a veces es uLiliz..1.do en los centros activos de
los enzimas para promove r mecanismos de reaccin exquisitame nte adapte1dos que dependen de los va lores modificados de
los pKa de grupos dadores/aceptares de prolones de residuos
especficos.

NH,

pK,

Aminocidos

NH,

H- C - COO-

H
a-Aminocido (glicina)

pK, ~ 9,60
Los tomos de oxgeno
elect.ronegativos del grupo
carboxi lo atraen electrones
del gru po amino, di smin uyendo
su pKa.

acciones intrarnolcculart.'S. Efe<.:tos si milares Pl leden ser ca usados por

grupos qumi cos quc estn posicionados en IJS cercanas de un grupo
ionizable -por ejemp lo. en el centro activo de un enzimJ.

84

Captulo 3

Am inocidos, pptldos y protenas

La sC'gtmda itormacin qllf" proporciona la CllrV3 de titulaci n de la glicina es que e::; le aminocido Liene dos regiones
d!"' capac khu..lt;;tmponant;r. ena de sta s es In po rcin relati vame nte plana d e la cu rva qu e a bnrca alred edo r de \lna unidad
dr pH a cada lado del primer pKa de 2 ,34, lo que imtic'l que la
glicin a es un burn t.ampn cerca de esl r pH. La otra zon a de
w mponamiento est cemrada alrededor ele pH 9,GO. (Ob::;rvese que la glicina no es un buen wrnpn al pH del fluido intrace lular o de la sangre, que es dr alrededor de 7, 4.) Dentro de
los m rgelles de t.amponamleltto de la glicina, se puede utiliz.:'u
la ecuH cin de Hf' nder::;oll- I-Iasse lbalc h (va::;e Recuadro 2-3)
para calc ular la : : proporcionE's de esvec ies dndora y acepto ra
de protOI1f's de la glici nl que se requiere n para preparar un
I ampn a W'I 1'11dctC'nninado.

simil i.lre~, a unque no idnticos: el pKn del grupo -COO H en el

intf' rva lo de 1.8 a 2,4 y f'1 pKII del grupo -NH; en el inte rvalo
tle 8,8 a 11 ,0 (Tabla 3- 1).
En ::::egundo lugar, los anllocid ofi con un gru po ]{ i on i za ~
ble tienen cu rvas de titulacin ms complejas, eDil tres e tapas
correspondien tes a los trf'S pa::;os de ionizaci n po~ i bles; tienen por tanto tres valores de pK... 1.<'1 eLapa adicional c! f>hida a
la titulacin del grupo H ionizable se fusiona en cierto grado
ron las otras dos. P.n la Figura 3- 12 SC' muestrdJ1las curvas df'
titulacin df' dos <.-lJlliltocidos df' e~te tipo, el glmama to y ICt
hist id in a. Los pWltos isof']pc trico::; re nejan la naturaleza de los

CooH

CH

La curva de titulacin predice la carga elctrica

de los aminocidos

('H 1

"2 (pK, + pK2 ) = "2 (2 ,34 + 9.60 )

COOH

pH

pKB

_ ~1 !9

1.0
OH

3,0

2,0
(equivalentes)

(a)

eH

H., :\"-GH

10

.~

H1N

~IJ~ ~

CH1 u
(.:'

roo

COO

l'OO H
1I,f\"

eH

el!

el!

t~~

pKIl !_:-t",CII

pK~

His tidina

8
pH 6
4

Los aminocidos difieren en sus propiedades '

cido-base
Las propiedndps co mpartidas por muchos i.UnlllOciclos permiten a lglll1a~ ~ implifica c ionf' s ge ne rales acerca df' su cowpo rtamielllo cido-base. En prinler lugar, todos los aJ llIOcidos con
un so lo grupo a-arnino, un solo glllpo a -carboxilo y un gruJ)O R
no ionizable tienen curvac; de titulacin pareddas a la de la glicina ( I'ig. 3-10). Estos aminoc id os lif'ne n valo res de pKa muy

pK,
2

4,25

5,97

Como resulta evide nte de la Figura 3-10, la g licinl tiene tilia

ca rga lleta negativa a cualquie r p ll por rl1ci ma de::;u pI. por lo
qUf' se desplazar hacia el r lC'ct rodo posit ivo (nodo) cuando
se coloquC' C'n un campo elc trico. A cualquier p ll por df'hajo
de su pI, la gliciHa tiene una carga lI et<.t positi\'a y se desplazar hacia el electrodo negativo (el ctorlo) . Cuanto ms alejado C's l e l pH de una diso lu cin ue glicina dC' su punto
isoelctrico, mayor ser la carga el c tlira net.a de la poblaCin
de molc ulas de glicina. Por r j f'mplo. a p ll 1,0 la glici na se
f'JlCllentrcl c:lsi enteramente e n ::::u forma +H:1N-CH:,!-COO H
COII una ca rga positiva lIew que eqllivalf' a 1,0. A pI1 2,34, ell el
q\lf' ex is te Ulla mezcla paritaria de + 11 ~IN-C H 2-COO II .v
+ II 'J~-C H~-COO ,la cm'ga posiliva nela o promrdio f'S de
0,5. De la misma manera Sf1 pueu e predeci r pI sigilO y la magnitud de la ca rga neLa de cualquier amino~lciuo a cualquier pH .

(;11 , .pli l,

Otra in formac in importantE' ded uci da el e la Cll rva de titulacin de un a minocido e::; la relacin enl re su cCtrga elct rica
neta y el pH de la disolucin. A p H 5,97, punto df' in flexin
C'111 re las dos etapas de s u c urva de titulacin, la glit:ina est
presente ele mane ra predominantC' f'n Sil fo rma di polar, totalmente ionizada pe ro si n carga elctrica neta ( Pig. 3- 10). El pll
car acte rstico en que la carga elct rica neta es cero Sf> de nomina punto isoel ctrico o pO is o e lctri co, desigllado pI.
ElI e l caso de la gli cina, que 110 Uene grupo ionizable en su cadena la te ral, el punto isoC'lct rico e::; simplC'ment e la med ia
aritrntica de los dos valores de pK::
pI =

coo

(;00

COO
H)

II .."I-CII

2,0
1,0
OH - (equivalentes)

3,0

(b)
RGURA 3-12 Curvas.de titul"cin de (a) glutamato y (h) hislidinJ. El
P"~

del grupo R se designa lOmo pK..:.

3.2

grupos R ionizables presentes. Por ejemplo, el gl utamato li ene

WI pI de 3,22, cons iderahlemente inferior al de la glicina. Esto
es el resultado de la presenda de dos grupos carboxilo que, f'n
el promedio de sus valores dp pKIl (3,22), contribuyen con una
ca rga negativa neta de -1 que eq uilibra la de + 1 debida a\
grupo arnino. De modo semejant(', ('\ p i de la histiclina, co n dos
grupos cargados positivamente cuando estn protonael os, es el e
7,59 (e l promedio de los valo res de pf(a de los grupos anuuo e
unidazol) , lItut:ho mayor que el de la glicina.
F'inal mC'nte, y como se ha indicado anteriormente, en las
t:omticiolles genemles de exposicin libre y abierta al e ntorno
acuoso, s lo la histidina tiene WI grupo R (pK;: = 6,0) que proporci ona poder tamponante significativo al pI! cercano a la
neutralidad presellte normalmente en los flu idos intra- y extra(:(' lulares de la mayora de animal es y bacterias ( Tabla 3-1).

RESUMEN 3.1 Aminocidos

Lo s 20 aminocidos Que se encuentran nOlll1ahnem e

como residuos en las proteutS cOIlLienen UII grupo
a -carboxilo, IIn grupo a -amino y un grupo H.
c<:lractel'stico unido al carbono a. El tomo de
ca rbono O' de todos los ami.lloddos excepto la gli cina
es asimtrico, por lo qu e los aminocidos pued en
existir en al menos dos formas estereoisomricas. En
protenas tan slo se encuentran los estereoismeros
L, cuya configuracin es t relacionada con la de la
mo lcula de referencia) L-gliceraJd etdo.

Tambin e).:isten otros aminocidos menos

COIllLUles, ya sea cOlno constituye ntes de las
protenas (med iante la mod if1caci n ele los
aminocidos est.ndar dE'spus et e la sntesis
de protelas) o t:OlllO melauolitos libres.

Los aminocidos se clasifi can en cinco tipos en virtud

ele la polaridad y carga de sus grupos R Ca pH 7).

Los aminocidos se diferencian en sus propiedades

cidu-base y tienen curvas de tit.ulaci n
caracterfsticas . Los aminocidos rnonoaminoHlo.l\ot:arboxlicos (con grupos R no ionizables)

Pptidos'i protenas

85

Los pptidos son cadenas de aminocidos

Dos molcu las de aminocid os pu eden un irse de fOfma covalente a travs de Wl enlace amida s ustituido. de nominado e nlace peptdico, formando un dipptido. ~;ste enlace se forma
por e Jjminacin d e los ele meJl LOs del agua (d eshid rata cin)
del grupo a -carboxilo de un amino cido y el g rupo a -amino
de utro (F ig. 3~ 1 3). La formacin d el ('n lace peptfd ico es un
ejempl o de una reaccin de conde nsacin, que es un tipo de
reaccill frecuellLe en las clulas vi vas. En condiciones bioQumicas norma les, el equi librio de la reacci611 qu e se muestra
en la Figura 3- 13 favorece a los aminocidos por encima del
dipptido. Para conseguir que la reat:cn sea tC lmodinmicamente ms favorahle, es necesa rio mod ifi car o activar qumica mente el grupo ca rboxi lo de lIIodu que su ~ rupo hidro xilo
pUf'da se r eli mi nado ms f cilmente. Al final de es te caVt ulo
se esquematiza ulla aproximacin qumi ca a 0s l(' probl ema . La
aproximacin biolgica a la fon nat:in del enlace peptdico f'S
lU1 lema impo rtante de l Captulo 27.
Se pueden unir tres am ino cido:s medianle dos e nlaces
pepLdicos para fo rmar un trippl ido; de manf'rtl similar se
pueden unir aminocidos para dar tetrapptidos, pelltappL dos y as sucesivamente. Cuando sc un en un os pocos aminocidos de este modo , la esl ruclura result.ant.e Sf' d enom ina
oligop ptido. Cuando se unen muchos a minocid os el produelo se denomina polipptido. Las prot ('nils pucden tener
miles d e residuos aminocid os. ALUlque a veces los tnnlllos
' polippLiclo" y ';protena" son intercambiables) las molculas
denominadas poUpptidos tienen generalmen te masas moleculares infe riores a 10.000 y las Que se denominan protenas
tienen masas moleculares superiores.
La Figura 3- 14 muestra la estructmil de un pentapptido.
Corno ya se ha indit:ado, las unidades de aminocido de un
pptido se denominan frecuentemente res idu os (la parte que
queda tras perder W'I LOIlIO de hidrgeno de su grupo amino y
una porcin hidroxilo de su grupo cal'box ilo). I~ I residuo arni-

R'
;

H R'

H.,N- CH- C- OH
[[

"

+ H- N- CH COO

son cidos cliprticos [+ 1I"NCII ( R)COOI I[ a pll

bajo y exislen en diversas formas derentes

1I 0 1~ H O

al ir atmle ntando el pI 1. Los aminocidos con

grupos R ionizables poseen especies inicas
tldicionales, dependiendo d el pll elel medio
y d el pK,'l del grupo R.

R'

R'
[ [
H 3 N- CH- C- N- CH- COO
[[

3.2 Pptidos y protenas

FIGURA 3-13 Formacin de un enlace pepldico por condensacin.

1:1 grupo (l'-amino de un amino ci do (con el grupo R2) acta como

Ahora 1I0:S ocuparernu:s de los polneros de los aminoddos.

los pptidos y las protenas. Los pptidos Que se enCUE'ntran
en la naturaleza varan en tama i'lo desde pequeas mol-clIlas
que cont ienen dos o tres aminocidos hasla molculas muy
grandes quP conl"lenen miles d(' pilos. AQU nos centraremos en
las propiedades qumicas fLU1damentales de estos polinleros.

nuclefilo desplaza ndo el grupo hidroxilo de otro amino,kido (con el

grupo R') para formar un en lace peptdico (sombreado en amarillo).
los grupos ami no son buenos nucl efilos, pero el grupo hidroxilo es

fjc il mente. A pH
no tiene luga r de forma

un mal grupo saliente, por 10 que no es desplazado

fis iolgico, la reaccin, la l como se

aprec iab le.

mue~trd.

Captulo 3

86

Aminocidos, pptidos y proten as

(,JH

CH . CI1 ,
('H

~Il,

CIl, OH H H
H
H CH
H CH ,
I I I
I I
I I
I
H,N-?--~-N-?-~-N- ?-~-N- I -~- N-?-COO
H

H O

H O

H O

Extremo
amino-terminaJ

Extremo
c3l'boxilo-lerminal

FIGURA 3-14 El pentapptido serilgl icilt irosinilalJnil-leuci nfl, o SerGly-Tyr-Ala- l eu. Los pptidos se nombran empezando por el residuo

amino-term inal que, por convencin, se si ta a la izquierda. l os enamari llo y 105 grupos R en rojo.

I(ces pcptdicos estn sombreados en

nocido del extremo de un pplido que tiene un gl11po u -amino

li bre es el residuo amino-terminal (o N-tprrninal); d residuo
del otro extrerno , quC' tiene un grupo carboxilo librC', PS pi residuo carboxilo-terminal (e-terminal).
AWlque la h.idrlisis de un ('nlace pepldico es Wla reaccin
exergnica, tiene lugar lentamente debido a su alt;!. pnerga de
activacin. En consecuencia, los (' nlaces peplidicos de las protenas son bastante eSlables, con una vicia m('dia (tI!.!) de alrededor de 7 aos en la mayota de concticiolle~ intracelularC's.

Los pptidos pueden distinguirse

por su comportamiento de ionizacin
Los pptidos contieHen Wl nico grupo a -amino y UIl nico
grupo a-carboxilo libres, lino en cada extremo de Irl ('<10('11:1
( l"ig. 3- 15). Estos grupos se ionizan de la misma manem que lo
hacen en lo~ aminocidos libres, aunque las cOlIstantes de ioni2.:1.cin son diferentes debido el que el gmpo ('on rarga opuesta
est ausente del ca rbo no a. Los grupos a-amino y u -cl rhox ilo
de todos los aminocidos no tenninales eSTn unidos covalellte-

:r.

No puede hac('fse ninguna generalizacin acerca de las masas moleculares de los ppfidos y prole13s biolgicamente
activos en relacin ron su fWlcin. La longitud dp los pPlidos
ll<1tllrales vara entre dos y mu chos miles de residuos aminocidos. Incluso los ppl idos ms pequeilos pueden tener efectos biolgicamente imponantes. Considrese por ejemplo el
d ipptido sintetizado romercialmellte L-aspartil-I.~fenilalanil
mC'til <"51.C'1', el edulcorante arti ficial ms conocido como aspa rI.<.U110 O Nutra.Sw(,C'I.

CH 2 O

O= C

o
CH ,
I

11

CJ-I- C- N-CH-C-OCH,
H
I.-Aspurtil-J.-fcni lal anil metil ster

NH

CI-I- CH,-CH 2 - COO

Glu

Existen pptidos y pollpptldos biolgicamente

activos de una gran variedad de tamaos

coa

CH- CH 3

Ala

mellte en forma de enlaces peptidicos, que no se ionizan y, por

lanto, no conLribuyen al ('ompo rtamiento tot..:11 cido-base de
los p ptidos. No obstante, los grupos R de algW10~ arninocidos
pl leelen ionizarse (Tabla :1- 1) y contribuyen en un pptido l las
propiedades cido-base globales de la molcula (Fi. 3- 15). Por
tanto, puede predecirse el comportamiento cido-base de un
ppptido l partir ele sus grupos a -amino y O'-carboxilo libres y de
la natur<1l('za y nmero de sus grupos R ioniza bIes.
i\J igual que los am inocidos libres) los pptidos tie nen
curvas de tit.ulacin cJractersticas y pH isoelctricos (p i) cara cl(' rst.icos a los que no sufre n desplaz.amiento en un campo
elctrico. Estas propif'dades se aprovechan en algW1i.lS de las
I cniras Illilizadas para separa r ppt idos y protenas) como ver 1Il0S postcriorm('llle en es te captulo. Dehe' resaltarse que el
valor elC'1 pKII de UJl grupo I{ ionizable puede cambiar ligera mente cualldo un aminocido se convierte en un residuo de
UII pptido. La prdida de carga e n los grupos a -carboxilo y
u -ami no, las iJl teraccio n('s con otros grupos R del ppl ido
y oLras condicio nes del entomO pueden afect.ar al pK,'l' Los valores dp pKn para los grupos 1{ q11e se mueslrall en la Tabla :.3-1
pueden ~er una gua til para deducir el intervalo de pH en
que se ion izar un grupo determi nado , pero no pueden ~pli
rarse a los pPlielos el e modo esl ricto.

(aspar tamo)

O=C

NH

CH,

Gly

O= C
NH
Lys

? H-CH,-CH z

CI-I,

CH 2 - X H

coa
FIGURA 3 - 15 Al anil glutam ilgli cil -lisina. l:ste 1t'lrtlpptida tiene un
~rupo a-am ina

libre, un grupo (t -carbox ilo libre y dos grupos R olli-

Lablcs. los grupos ionizados a pH 7,0 se mut.~trnn en rojo.

M1Ichos pptidos pequclios naturales producell sus efectos a

cOllcentracio nes m11y ha.ia ~. Por ejem plo, divNsas hormonas
de vertf'hrados (Captulo 2:.3) son pptidos pequeflos. Entre
S las se incluyen la oxitocina (nueve residuos am inocidos),
qu(' ('s s('creLada por la hipfisis posl,prior y esrnula las contnu.:<..:io nes Llterinas; In. hradjquinulH (nueve residuos), que inhibe la inl1amacin de los tejidos ; y ("1 faclor libe rador de la
lirolropilli.l ( tres residuos), qUf' se forma en el hipotlamo y
eSlimula la liberacin df' la hipfiSis anterior (1 (' otra honTIona ,
la tirotl'OpLlla. Algunos venenos elC' Sf'las extremadamente txit:os, tales como la amanitina, son tambin pptidos pequeos, lo mismo que muchos antibitiros.

3.2

Algo mayores son lo!> polipptidos pequclios y oligopptidos ta les como la hormona pancretica insulina, que contiene
dos cadenas poli peptdicas, una de cUas con 30 residuos aminocidos y la otra COII 2 1. El glucagn, otra hormona pancretica que se opone a la accin de la insulina, tiene 29 res iduos.
La corticotropina es Wla hormona de 39 residuos de la hipfisis anterior y estimula la cOl1eza adrenal.
Qu longit ud tienen las cadenas poli peptfdicas de las
protenas? Como muestra la T'dbla 3-2, la longitlld van a considerablemenlC'. F;I citocromoc humano t.iene 104 residuos aminocidos unidos eH una nica cadena; el qll imotripsingeno
bovino tiene 245 rf's idlloS. En el extremo se ellc uenlra la li tina, que tie ne cerca de 27.000 residuos aminocidos y una
masa molecula r de alrededor de 3.000.000. La inmensa mayora de los polipptidos natura les son mucho menores y conUenen menos de 2000 residuos aminocidos.
Algunas protenas p!>l.n constituidas por Wla sola cadena
peptfdica, pero otras, de nominadas pro tenas con s ubullid ades ml tiples, tie nen dos o ms poli pptidos asociados de
rorma no covalente (T'dbla 3-2). Las cadenas polipeptdicas individuales de una protena eOIl diversas subunidades pueden
ser idlllicas o diferemes. Si como mnimo dos son idnticas,
la protena se denomina oligom rica y las subunidades idnlicas (constituidas por una o ms cadenas polipeptIdicas) se
denominan p ro tme ros . La hemoglobina, por ejemplO, tiene
cuatro subunidades poli peptfelicas: dos cadenas O' idnticas y
dos cadenas f3 idnticas, unidas todas ellas entre s por interacciones no covalentes. Cada subwudad O' est unida de forma
idntica con w m subunidad f3 dentro de la estructura de esta
protena con sub unidades mltiples, de forma que la hemoglobina puede considerarsC' como un tetrmero de cuatro subwudades polipeptidicas o como Wl dnero de protmeros crf3.
Unas pocas protenas contienen una o ms cadenas polipe ptdicas unidas covalememente. Por ejemplo, las dos cadenas polipeptdicas de la insulina estn unidas entre s a travs
de pue ntes dis ulfuro. En es tos casos, los poli pptidos indivi-

TABLA 3- 2

Pptidos y protenas

dualrs no se co nsiderall subwlidades, sino que se suelen denorninar simplemenl,e cadr-nas.

Se puede calcular el n mero aproximado de residuos aminocidos de una protena sencilla, que no co nte nga ningn
otro grupo qulmico, di vidielldo su masa mo lecular po r 110.
Aunque la masa molecular media de los 20 amlllocidos estndar es de alrededor de 138, en la mayora de pro ternas predominan los aminocidos ms pequei'los; cuando se tpnf'1l en
cuenta las proporciones pn qU E' se presentan los distintos aminoAcidos e n las protelas (T'..tbla 3-1) , la masa molecula r media est prxima a 128. Darlo que se el.i mina lll la lIIolcula de
agua (M r 18) para c rea r cada enlace pe ptdico, la masa molecular media de un residuo aminocido de una protena es de
alrededor de 128 - 18 = 1JO.

los pollpptldos tienen una composicin

de aminocidos caracterstica
La hidrlisis de pptidos o protenas con ci do produce un a
mezc la de a -aminocidos li bres. Cuando se ha hidrolizado
completamente, cada tipo de pro tena da \Ina proporcin o
mezcla caracterstica de los diferentes aminocidos. Los 20
aminocidos estndar casi nunca se presentan ('n cantidades
iguales en una protena. Algunos aminocidos pueden apar'cer solamente una vez. o ninguna, por molcula en un tipo deI;erminado de protena; otros pueden prese nt.arse 'n nmeros
elevados. La Tabla 3-3 muest ra la composicin de las mezclas
de a minocidos que se obtienen en la hidrlisis completa del
citocromo e y del quimotripsingeno bovinos, este ltimo el precursor inactivo del enzima digestivo quimolripsina . 8stas dos
protenas, con funciones muy diferentes, tambin difieren de manera significativa en el nmero relativo dC' rada clase de anunocido que contienen.
Sin embargo, lUla hidrlisis comple ta no es sllnciente para
obt.ener un anl isis exacto de la composicin de aminocidos,
a Causa de ciertas reacciones laterales que se clan durallte el

Datos moleculares de algunas protenas

Masa
molecular

Citoeromo e (humano)
Ribonucleasa A (pncreas bovino)
Lisozima (clara de huevo de pollo)
Mioglobina (corazn de caballo)
Quimotripsina (pncreas bovino)
Quimotripsingeno (bovino)
Hemoglobina (humana)
Albmina sriea (humana)
Hexoquinasa (levadura)
RNA polimerasa (E. eoli)
Apolipoprotena 8 (humana)
Glutamina sintetasa (E. eoli)
Titina (humana)

13.000
13.700
13.930
16.890
21.600
22.000
64.500
68.500
102.000
450.000
513.000
619 .000
2.993 .000

87

Nmero de
residuos

104
124
129
153
241
245
574
609
972
4158
4536
5628
26.926

Nmero de cadenas
polipeptldieas

1
1
1
1
3
1
4
1
2
5
1
12
1

88

Captulo 3

Am inocidos, pptldos y protenas

TABLA 3-4

TABLA 3-3

Composicin de aminocidos
de dos protenas
Nmero de residuos
por molcula de protena'

Aminocido

Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
lIe
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val

Citocromo C
bovino
6

2
5
3
2
3
9
14
3
6
6

18
2
4
4
1
8
1
Total

Quimotripsingeno
bovino

22
4
15
8
10
10
5
23
2
10
19
14
2

23
245

Grupo prosttico

Ejemplo

Upoprotenas

Lpidos

Glucoprotenas
Fosfoprotenas
Hemoprotenas
Flavoprotenas

Glci dos
Grupos fosfato
Hemo (ferroporfirina)
Nucletidos de flavina

Metaloprotenas

Hierro
Zinc

Lipoproteina {jI
de la sangre
Inmunoglobulina G
Casena de la leche
Hemoglobina
Succinato
deshidrogenasa
Ferritina
Alcohol
deshidrogenasa
Calmodulina
Dinitrogenasa
Plastocianina

na co njugada se denomina habitualmen te' grupo pros t tico.

Las protpnas conjugadas se clasifican segLUl la natura lc7..,,' qufmica de su grupo prost(>tico (Tabla 3-4); por rjemplo, las lipoprotenas contienen lipidos. las glu CO IJrote llas contienen
gmpos glucdicos y las me taJoprotelas contienen un melal
especfico. Algunas proLel<.Is contient'"'n ms de Wl grupo prost~t i ('o. Normalmente el g111pO prosttico juega un papel ilnporlaJlte en la funcin biolgica de la pro!rfna.

Clase

Calcio
Molibdeno
Cobre

9
28
23
8

3
104

Protenas conjugadas

Existen varios niveles de estructura de las protenas

En alUn tipo de anlisis, como sucede en la hidrliSiS cida, Asp y Asn no se

distlnguen y se designan Asx (o B). De maflera SllTUlar no es posible diStmguir
Glu y Gln, QIJe se designan GIx (o Z). Adems. el Trp es destruido. Deben emplealSe
procedimientos adicionales para determInar COfrectamente el contenido total
en ammocidos.

proceso. Por ejemplo, los C' nl)('Ps anuda de las cadr nas laterales de la asparagina y la gluli.llniu<I se rompC'n por IraLarniento
cido, dando TPspectivamente aspartato y gluLamato. La cadena
lateral delt ri ptfano es dpgmdada casi co mplrtampnte por la
hid rl isis ~<'ida y tam bill se pi rde n pC'qtlcii.as cantidades de
sf'J'ina. treo lliJlfl y ti rosinn. Los bioqumicos ll lili7.an proced inuentos adirionalps pard resolver las amhigl ledades resultantes
de la hidrlisis cida cuando ('5 n('('Psano conocer la composicin de ami nor idos de UBa forma precisa.

Algunas protenas contienen grupos qumiCOS

diferentes a los aminocidos
Muchas protdnas, talf's como lo::; enzimas Iibonurlf'asa A y quimotripsingeno, contienen s610 rrsiduos i:uniJlocidos y ningn
olro gr upo qumiro adicional; a este Lipo elC' prote tas se las
considera pro tetas simples. Sin C'lllba rgo, algu nas pro lt'"'nas
contienen componentes qumicos diferentes a los aminocidos
asociados permanentemente; estas pro! pinas se denominan
prote nas conjugadas. l .., partp no amillocida dC' una pl"Ole-

Para !Ha ro moll"culas gramles tales romo las protetas , la tarea ne desc ribir y compre nder la esLruCtu ra se aborda a va rios
niveles de complC'jidad, ordenados en \lna especie de jerarqta
concep! lIal. Se derlllen normalmeme cuatro luve les de ('51 nI(,tura de las protenas ( F'ig. 3-16). La estructura priularia es
una descriprin de Lodos los e nlaces covale ntes ( pri nci palmente ellla <.:es peptirl iros y puentes dis ll lfuro) que ullen los
res id uos aminot:iuos ele una cadena puli pepticlica. ;; I e lemento ms importanrC' dC' la eslruclllra primaria es la seCl.u.:ncia ue los residuos aminokidos. L, estructura secLUldaria
se rrfi('1'(" a (sposiciones part iClllan nel1te estables de los aminocidos que da n luga r a patrones cs trncltira les repetitivos.
La estructura te rcia.rin describe todos los aspectos eld plpganuelllo tridimensional de WI popptido. Cuando LUla protena posee dos o ms subwudades polipepLdicas, su disposicin
f'1l el es paciO se de nomina estru ctu ra c uate rnaria. En la
Seccin 3.4 se describe la estructura prima ria ; los ni v('lf's superiores de estructura se l ralaH en e l Ca pt lll o 4.

RESUMEN 3.2 Pptidos y protenas

Los ami norinos puedell wtirsc cova lC'ntemente

mC'diante enlaces peptidicos pa ra formar pptidos y
protenas. Las rplulas contienen generalmente miles
de protC'nas diferenles, cada una dfO ellas con uJla
3rti\ridad biolgica distinta.

3.3

Estruc tura
primaria

Estructura
te rciaria

Estructura
secundaria

Trabajar con protenas

89

Estructura
c uaternaria

----------------

--

-Residuos ami nocidos

Hlice a

Cadena polipeplfdica

FIGURA 3-16 Niveles de es lructura de las protenas . la estructura

primaria consiste en una secuencia de aminocidos unidos (mIre s el

travs de enlaces pt.>ptdicos e inclu)'e los puentes disulfuro que exis(1 pol ipeptido resultante puede estar enrol lado en unidades de

Idn.

Las protelas pueden ser cadenas polipeptfdic.:1s muy

largas de' 100 a varios mUes de residuos aminocidos.
Sin e mbargo, algunos pptidos naturales tieuen slo
unos pocos aminocidos. Algunas protelas estn
compuestas por varias cadellas polipeptdicas
asociadas de forllla no covalCl1le que reciben el
nombre de subu nidades. Las protenas simples
gene ra n tan s610 aminocidos despus de la hidrlisis;
las prot enas conjugadas contienen algn Olro
componente adicional, como por ejemplo un grupo
prosttico metlico u orgnico.
La secuencia de aminocidos de W1a protC'fna es una
caraclerstica propia de esa protena que se denomina
es t ru c.: lma primaria. ste es uno de los cuatro niveles
con qlle generalmente se describe la cstmctUTa de las
prolelas.

3.3 Trabajar con protenas

Nuestro conocimiento de la estructura y fWlcin de las prolenas provielle' del estudio de muchas protenas individ uales.
Para estudiar lUla protefna c.:on cierto detalle es neccsario separarla del reS10 de protenas y disponer de tcnf'as que permitan dCI,f' rmillar sus propiedades. Los m! odos necesarios
provienen de la qumica de protenas, disciplina mn anligua
co mo la bioqumica qUf' mantiene una posicilI central cn la
inves tigacin bioqunica.

Las protenas se pueden separar y purificar

Una preparacin pura de una protela es esenrial para poder
de!('rminar sus propicctades y su actividad. Puesto que las clulas contirne'f\ miles ele tipos diferentes de protenas, cmo
puede' purificarse una protena? Los mtodos de separacin de
prol ellas aprovcchan propiedades que varan de una proteIna
a otra, enl re las que se inrluyen el k'Unao, la carga y las propje'dad es de unin.

Subunidudcs unjdas

estructura secundaria. tales como unil hlicc a. la hlice es una pa rte

de la estructura lerci.1(ia del polipptido plegado. el cua l cs en s
mismo una de las subunidades que constituyen la estructura cuater
naria de una protena multisubun iddd. en este CJSO la hemoglobina .

La fuente de W1a protena son generalnlf'nle las clulas de

un tejido o clu las microbianas. El primer paso e n cualquier
purificacin de protemas es la rotura de estas cl ulas, para liberar sus protelas en una solucin de nominada extracto
crudo. En caso necesario puede utilizarse la centrifugacin
diferencial para preparar fracciones su bce'lula res o aislar determinaclos orgnulos (vasc I'ig. 1-8) .
Una vez est a punto el ext racto o la preparacin de orgnulo, se dispone ele diversos mtodos para pW'ificar un:l o ms
de las protenas que contie nen. Normalmente, el extracto se
somete a tratamientos Que separan 1M proLela5 en dilerf'ntes
fracciones en virtud de alguna propiedad tal co rno el tamao o
la carga, Wl proceso que se denomina fracciona.miento . Los
pasos iniciales de frdccionamic nl o de WIa pur'icacin utilizan
diferencias en la solubilidad de las prolefnas, que es Wla fWlcin compleja df'1 pH, tempe ratura, concelllracin de' sal y
otros faclores. La solubilidad de las protefnas disminuye gen'rahnente a concentraciones elevadas de sal, un ('[f'C'tO denominado "salting out" (salado). La adicin de- algunas sales en
cantidades apropiadas puede precipitar selectivame nte algu nas protelas, permanccie'ndo las restante'S en sol ucin. El
sulfato amnico I(NH4)2S0,al es particularmente efectivo y se
uti Uza a menudo para "salar" protenas.
La solucin que contiene la protena de inters debe a
menudo sufrir otros cambios :lnt.es de que sean posibles paSO!; de purificacin post.eriores. La dilisis, por ejemplO, es
un procedimie nto Que separa las prole as de los disolventes
aprovechandO el mayor tamailo de las protenas. El extracto
parcialmente purificado se coloca en un saco o tubo de membrana semi permeable. Cuando sLe se suspe nde f' n un volwnen
mayor de solucin tampollada de fuerza inica apropiada,
la membrana permite el int erca mbio de sal y tampn, pero
no de protelas. De esta forma, la dilisis re tie ne las protenas
grandes den tro del saco o tubo de memhrana, mientras que
permite que la concentracin de los df'ms solutos en la preparacin de prot.ena cambir hasta llegar al equilibrio con la
solucin del exterior de la membrana. La dilisis puede utili-

90

Captulo 3

Aminocidos, pptidos y protenas

zarse, por ejemplo, para elimi nar el suUato amnico dI" una
preparacin de protena.
Los mlOdos ms potentes para el fraccio namiC'nto de
protenas utiUzan la cromatografa en cohullna, que aprovecha las diferencias de carga, ta.lllaflo, afinidad d(' unin y otras
propiedad es de las protenas (Fig. 3-17). Se intl'Och l(,C' C'11 \lna
col umna un material slido poroso de propiedades qumicas
adecuadas (la fase es tacionaria ) y se hace pasar a trav(>s 0('1
mismo una sohlcin tamponada (la fase mvil). La sol ucin
q1le contiene las protenas se in troduce en la cabeza de la coIW IUla y a continuacin se Jtra a lravs de la matriz slida, en
forma de una banda que va expandind ose cont,ill1lamente
dentro de> la fase mvil (Fig. 3-17) . Las protenas individuales
migran ms rpido o ms lentamente a trav0S de la col umna
en funcin de sus propiedades. Por ejemplu, en la cromatografa de inte r cambio catiIlco (Fig. 3- 18a), la matriz slida tiene grupos cargados negativamente. En la fasC' mvil , las
proten as rO I1 ca rga pos itiva net.a migran ms le lllamente a
travs de la matriz Que aqu ll as con c<l rga negativa n('ta,
puesto que la migracin de l<ls primeras S' Ve' ms retardada
por la interaccin con la fase estacionaria. Los dos t.ipos de
protenas puede n se pararse en dos ba ndas definidas. La expansin de la banda de protenas en la fase mvil (la solucin
de prote(nas) se debe Lanto a la separacin de las protenas etC'
diferentes propiedades corno a la difusin. Ln resolucin ellLre

Muestra
proteica _""-~I

(fase
mvil)
Matri z

slida
porosa

(fase estacionaria )
poroso
EOuente /

dos tipos de protenas con diferente carga nNa suc le mejorar

n medida que se aumenta la longiLlld de la col umna. Sin em-

lmrgo, la velocidad a la que la solucin de protenas puede paa travs de la colwnna s1Iele disminuir con la longitud de la
misma. A mC'dida que awnellla elliempo de residencia en la coIUHUla, la resolucin puede disminuir debido a la di fusin dent.ro de> cada una de las bandas de prot.ena.
La f igu ra 3- 18 mllesl ra otras dos va riantes de cro matogra fa en colu mna adems de la de intercambio inico. La cromatografa de exclusin mol ec ular separa prot.enas segn
Sil tamao. I:;n este mtodo, las pro lcinas de mayor tamao
emergen de la columna antes que las pequefas - lIna observacin que contradice la inLUicin en cierto modo-o La fas e slida co nsiste en pcqueilas perla s, pa rUcu las que contienen
unos poros o cavidades d" tamai"to calibrado. Las proteinas de
mayor tamaio no pueden ent rar e n las cavidades, por lo que
loman el camino ms co rto Cy ms rpido) a lravs de la coIlIm na , rodeando las partculas po r ('1 exterior. Las prutenas
ms pequeflas penetran C'n las cavidades y, por tanto , migran
ms lentamente a travs tle la collUnna (Pig. 3- 18b) . La cromatografa d e afinidad se basa eJl la afinidad de unin de
[as protelas. Las partculas de la columna tie nen en este caso
un grupo qumiCO un ido covalentemente. Una protena afn a
este grupo quruco particular se unir a las partculas de la columna, lo que retardar su nLigracin (Fig. 3- 18c).
Un refmumiento mod erno d e los mtodos eromatogrlicos
es la UPLC, o cromatografa lquida d e alta resoluc,i n,
La HPLC ul Hiza bombas de alta presin que ace leran el movimiC'nt.o de las molculas de protena cn la colurtma, as como
materiales cromatogrlicos de calidad superior que pueden soport",1r la fuert.a de compresin del flujo presurizado. Al redu cir el tiempo de trnsito en la columna, la HPLC puede liItutar
&11'

FIGURA 3-17 Cromatografa en columna. Elementos estndar de una

colum na cromatogr(ica. Un material slido poroso se deposita en el
interior de una co lumna hecha generalmente de plstico o vid rio. El
ma terial s li do (matriz) constituye la (ase estacionaria, a travs de la
cual flu ye una soluc in, la fase mvil. la solucin que sale de la columna por la parte inferior (el efl uente) es reemplazada constantemente por solucin suministrada por un depsito en la parte superior.
la sol uci n de protena qlle debe separarse se depositJ sobre la cabeza de la columna y se deja pcrcolar hacia el interior de IJ matriz slidJ. Se arl ade ms solucin sobre ella. la solucin de protena forma
una ba nda dentro de la fase mvil que tiene inicialmen te la anchura
de 1<1 solucin de protena ap li cada a la columna. A medida que las
protenas se desplazan a travs de la columna, se retardan en diferenIps grados segn sus diferentes intel(lcciones con el material de la maIriz. L; banda de protena se ensancha as a medida que se desplaza a
trav(-s de la <..:olu mna. Los tipos individuales de protenas (tales como
A, S, C. mostradas en azul, rojo y verde) se separan gradualmente entre s, formando bandas dentro de la banda ms ancha de protenas .
La separacin mejora (aumenta la resolucin) a med ida que aumenta
1<1 longitud de 1.-. columna . Si n emba rgo, cada banda de protena individual tambin se ensancha con el tiempo debido J la difusin, un
pro<..:eso que disminuye la resolucin. (n c!>te ejemplo, la protena A
esl5 bien scpari'lda de B y e, pero e[ ensanchamiento r or di fusin impide [a separH.. i6n <.:ompleta de 8 y e en estas condiciones.

f
,

Ca rga
Ca rga
Carga
Car ga

positiva neta grande

posit.iva net a
negativa neta
negativa neta b~an dc

porosas

Partcul as
polim ricas con
grupos fu ncionales
cargados
negativamente

Se aade la mezcla
de p rotenas a la
colum na que cont.iene
intercambiadores.

:U[1

1 23456

(a)

Se aade la mezcla de protenas

a la columna que cont iene
un polmero entrecru zado.

Las molculas de proten a se separan

por ta ma os; las molculas mayor es
pasan ms librcmente, apareciendo
cn las primeras fracciones.

(b)

i: ~U

1 23 4

Las protenas se des pla zan por In columna a

velocidades detenninadas por s u carga n eta al
pH u sado. Con los intercambiado res cat.i6nicos,
las proten as con ms ca rga neta n egati va se
desplazan m s rpido y cluyen a ntes.

"

Prote na
d e inters

FlGURA 3-18 Tres mtodos cromatogrficos para la purifi cacin de

protenas. (a) l a c romatugrafa de intercambio inico aprovcchJ I(J~
diferenc..:ids en el signo

y la

56

Liga ndo

magn itud de las cargas elctricas netas dc

las protenas a un pH determ inado. l a ma triz de la colu mn a es un

polmero sinllico que tiene unidos grupos cargados; los que tiencn

uni dos grupos aninicos son intercambiadorcs ca tinicos y los que

ticnen unidos grupos catinicos, intercambiadores aninicos. Se
muestra <lq u u na crom<Jlografa de intercambio inico !tobre un intercambiador catinico. la afinidad de cada protena JXlr los grupos cargados de la colum na est afecta da por el pH y la concen tr;:lc in de
iones salinos libres en competencia en la so lucin que les rodea. la
separacin puede oplirn iz;:lrse ca mbiando gradu<llm en te e l 1'11 y/o la
co ncentracin de sa l de la fase mvil de forma que se cree un gra diente de p I-! o s.:lI. (b ) l a cromatografa de exclusin por tamao se
para IdS protenas segn su tamao. l a matriz de la Lolumna es un
polmero entrecruz,ldo con po ros de un tamao seleccionado. Las
protenas mayores se desplazan mds rpidamente que las menores, ya
que son rnu)' grandes para penetrar en los poros de las partcll las y si
guen una ruta ms directa. Las ms pequeas penetran en los poros y
son retardadas por la ruta mds laberntica que describen a travs de la
columna. (el la cromatograia de afi nidad separa las protenas segn
su especifiLidad de unin. l as protenas retenidas en la columna son Is
que se unen especficamente a un ligando unido covalentemcnte a las
partcu las. (En bicxlufmica, "ligando" se refiere a una mol<.ula o grupo
que se une a una macromolcula 1.11 como una protena.) Una vez w
han lavado las protenas qut! no se unen a travs de la colum na. Id
protena unida de inters se cluye por medio de una solucin que con
tiene liga ndo libre.

Mezcl a de
prot.en as

Se a ade la mezcla
de protenas a una
colu mna que contiene
un ligando especfi co
para la protena
de inters unido
a I polmero.
(e)

1 2 3 ,1 5

3 4 5 6

Las protenas no
La proten a de in ters se
deseadas se lava n a eluye por medio de una
travs de la columna.
solucin de ligando.

92

Captulo 3

TABLA 3-5

Aminocidos, pptidos y protenas

Tabla de purificacin para un enzima hipottico

Procedimiento o paso

Volumen de la fraccin
(mi)

Protena total
(mg)

Actividad
(unidades)

Actividad especfica
(unidadesj mg)

1400
280
90
80
6

10.000
3000
400
100
3

100.000
96.000
80.000
60.000
45.000

10
32
200
600
15.000

1. Extracto celular crudo

2. Precipitacin con sulfato amnico
3. Cromatografa de intercambio inico
4. Cromatografa de exclusin por tamao
5. Cromatografa de afinidad

Nota: lodos los datos represenlan el estado de la muestra despus de haber efectuado el procedimiento indicado. la actMdad y la actiVidad especfica se definen en la pgina 94.

la expansin de las bandas de protplla por di fusin y por tanto

mejorar notabl emente la resolu cin.
La es trategia de purificacin de una protena quP no ha
sido pre\o;amente aislada se> gufa tanto por los prf'ccdelltes establecidos como por el sentido comn. En la mayora (if' f'asos
deben utilizarse varios mtodos iliferenl('s de moclo secupnf'ia l
para pu ri fica r comple Lam(,nle un a protena. La <,leccin de
mNodo es en cierto modo elllp[rica y pl1N!C se r Itecesario probar mUf'hos protocolos anlps de e ncO lltrar el ms ('fccti vo. El
proceso de ensayo y elTor puede a l11<,nudo reduci rse al mnimo hasand o e l procedimiento e n tcnif'<1s de pu ri ficacin
desa rrolladas pa ra protenas si milares. Se puedpn C'l1cont rar
publif'ados protocolos de purilic..:acin par<1 1ll11choS millares dp
protenas. El spntido comn indi rfl que se IWIl de lll il i7. a r procedimif'lll os ba ratos, tale s como el sall ina m il, al prillcipio.
cuando el volumen total y el nmel'o de contammanlC'S es m>..~mo . A menudo los mtodos tTomatogn'ifi cos no ~Oll pr(' lif'os
en las primeras fases debido a Que la ca llL idad dr medio cromatogl'fico npcf'sfl rio amuellla con e l lama i'lo tl e la mU f's tra.
A I11pdida que se com plpt.a cada paso dp puri fi caci n, e l la mallO de la mues tra es ge neralm cnte mello r (Tahla 3-0), lo
que ha ce posible ulili7..ar pl'ocedimipnt.os cromatogrficos ms
sofisticados (y caros) en las N <1P.:'lS posteriores.

Las protenas pueden separarse y caracterizarse

por electroforesls
Otr<1 tcnica importante para 1<1 sepa ral:i n de protenas se
hasa en e l Lies plaz<lmiento de las protrnas cargadi.ls en un
campo pl(-f't.ri co, proceso dC'llominado e lectrofore sis. Estos
proccdintienlos no son utilizados gf'l1rrahneme para purifi f'ar
pl'ol,en<1s rn grallues cantid<1d es, dado quP f'x isten normalmente mtodos a lternativos ms sr-nci Jtos y los mtodos e lect rofor't iros freC Uenl f'mf' nte afec tan a la ('sI rllclu ra y por
tan to a la [undn de las prote[nas. No obsta nte, la elpcl roforesis p~ mu.\' til como mNodo lnalftico. Su v('maja es tu~ I<ls
proteJI<lS pueden visualizarsp :ldC' ms de separars(', lo qu e
pe rmite a l nvesl gad or hacer una psIima rin rpid<1 dpl m mero de protenas en una nlf'7.f'la Odel grado de pllrf'7.a de UBa
preparacin prol.eica dctermilli..u.la. La f'1C'ct roforesis tarnhipll
permite la dctf' rmiu i.l(.:in dC' propiedades t:rucialf's de una
prol ('fna tales como S ll punto isoelclr; ro y su m3S<l lHolf"f"ular
aproximada.

La f' lectroforesis df" protenas se lleva a caho generalmeme

en geles formados por e l poluero f' ntrccnl7..ado poliacrilamida
(Fig. :1-19). r:l gel de poliaf'rilamida retrasa el desplazamiento
de la prOleli..lS pn una forma aproximadamente proporciona l a
su cocie nte carga/masa. El desplazamiento tambin puede esta r afectad o por la forllla de la pl'otefna. En la electroforesis, la
fuerza que Illueve la mar rornolcula es el potencial elctrico, .:.
La movilid<1d elec trofo rtica df' la molcula, Ji , es el cociente
f'nt rc la velocidad dr la partcula, V, y el pOI.encial elctrico. La
Illovilidad f'1 ctrofortica tamhi'n es igual ;.t la carga net:'1 de la
molcula, Z, rl h~ d id a por el coeficie nt e" friccional,!, que re neja
f'11 pmte la forma de la protena. As

p. = - = -

El desplazamiento de Wli.l prol ena en W1 gel duranle una elecll'oforesis es por t<1111O funcin de S il tamailo y de s u fOlma .
Un mtodo elec LroforNico frecuelltemenlP utilizado para
la estima cin de la pureza y la masa molecular emplea el detf'l"ge ntc dodecil sulfa t o sdico (SDS ).

o
II

N. ' - O- S- O-(CH,)"CH,
11

O
Dodcc il sulfato sdico
(SOS)

I; ,sOS se UIlP a la mayo ra de protenas en una callLidad aproximadamente proporrion<11 a la masa molecular de la protena,
alrededor dC' Hna molcula po r cada dos residuos aminocidos.
El SDS ligado incorpornllna g ran ca rga ne l<1 negativa, lo que
hace qUf' la (,<1I'ga intrnseca df' la protela sea insignifi cante y
f'o nfiere a todas lao; protenas UH cociente carga/masa similar.
Adems, la co n[onnac..:in nativ<1 de la prote ta se altera cuando
se fija el SDS y la nlaj'oria de las protenas adoptan una fOI"1TI<1
similar. 1.<1 e lectrofo res is en presencia de SDS sepa ra, por
tanto, las protenas rasi exclusivarnenl p en funci n de la masa
1lI0lpf'tllnr, de forllla que los polippticJos peq ueos se desplazall ms rpidamente. Despus de la electroforesis 1<15 protenas sr visua lizaIl a ftadipnd o un colorallle lal f'omo el azul de
COOIII<\ssie. (Jllf' se tija a las protenas pero no al gel (Fig. 3- 19b).
Or ('sta forma I.JUede sC'guirse el progreso df' un proced.i.miell l o
eJe purificacin de una protena, ya Que el nmpro de ba ndas
proteicas \isi hles e n el gel dehe disminuir tra s cada nuevo

3.3

= ""

Pocillo

...... ~ UUUUU
O

Direccin
del
desp lazamiento

93

-- --

Trabajar con protenas

(a)

(b)

AGURA 3-19 Electrofores is. (a) Se cargan diferentes mueslras en los

banda del gel representa una protena diferente (o subun idad pro-

pocil los o depres iones en la parte superior de un gel de poliacrila -

tei ca); las protenas ms pequea s se despl l7<1n ms r.:ipidamente y,

mida . las prolenas se traslada n J travs del gel c uando se a pli ca un

por tanto, se encuentran cerca del extremo in ferior del gel. Este gel

campo elctrico . El gel manl ienc al mnimo las corrientes de convec-

i lustra la purifi cac in del enzima RNA po limerasa de la bactcria

ci n producidas por pequeos gradientes de tcmpe ratuf<1 ~' tambin

E. coli. El primer carril muestra las protena s presentes en el extracto

min imi za los mov im ientos de protenas que no sean los producidos

celular crudo. Los carril es siguien tes (de izqu ierda J derecha) mues-

por el G lrnpO el clri co. (b) Despus de la electroforl.'Sis se plJeden vi sualizar la s pro tenas trJtando d ge l con un colo ran te ta l como el
azul de Coomass ic, qu e se fija a la s protenas pero no al gel. CadJ

protcn a pllrificada contiene cuatro subunida des, tal como se ve en el

paso ele purificacin. Cuando se compara eDIl las posiciones a

las q llC' se d es p lazan e n el ge l protellas d e ma sa Illulec ular
conocida , la pos icin de una protena desconocid a puede
proporc ionar u na medida exce lente de s u masa mo lec ula r
( F'ig. 3-20). Si la prot.ena tiene dos o m s submudades clifc-

re ntes, las sub unidades se' sepa rarn ge neralmente a consecuencia e1 el tratamiento eDil SDS y aparecer ulla banda individual para cada una . .. Eleclroforesis en gel con SOS
El enfoque isoelctrico es un procedimie nto utilizado
para ne terrninar el pUllto isoelrc l rico ( pI) de 11na protena

Miosina 200.000

J-Galactosidasa 116.250
Glucgeno fosforilasa b 97.400
Albmina de suero bovino

66.200

Ovoalblllin a

45.000

Carbnico anhidrasa

31.000

Tnhibidor de t ri psina de soja

Lisozima

21 .500
14.400

---

--- -

0 '-__-,--_-'
(a)

Patrones Protena
de M r desconocida

tran las protenas presentes despus de cad I),)so de pu ri ficacin. la

lti mo carril de la derecha.

FIGURA 3-20 Estimacin de la masa molecular de una protena .

La movili dJd eleclroforticJ de una protena en un gel de

poli acrilam ida co n SDS es proporcional a su masa mo lecula r, M,.

(a) Protenas patr n de masa molecular conoci da se someten a
clectroioresis (carril 1). Estas protenJS marcadoras sirven para estimar
la masa molecula r de una protena desconocida (carr il 2). (b) U na
gr fi ca dell og M, de las protenas marcadorJ s frente al desp laza miento
rda tivo durante la electroforesis es li neal. lo que permite leer
la masa molecular de la protena desconoc ida a pa rtir de ell a.

(bl

Des plazamiento
rel at ivo

94

Ca pitulo 3

Se incor pora
una solucin
de a nfolitos
a un

Aminocidos, pptldos y protenas

El

pH 9

'--. '
'--. '

gel.

e :

pH 3
Se es ta blece un gradiente
de pH estable en el gel
t ras la aplicacin de
un cam po elctrico.

\::::, I

~# :

=:'
'--. '

e :

'----' 0

Se aade la solu cin

Despu s de t eir, se
d e protenas y se observa cmo se dis tribuyen
vuelve a aplicar
las protenas a lo largo del
el campo elctri co.
grad iente de pH segn
s us valores de pI.

(Fig. 3-2 1). Se establece un gradiente de pH dej ando que Wla

mezcla de cidos y bases orgn icos de baja masa molecula r
(anfoti tos; p. 81) se distribuya esvolltnenmrn tc en un t.:'lI llpO
elctrico ge nerado a travs drl gel. C:ualldo se aplica una mezcla de protenas, r ad a una de e llas se des plaza hasta q\1 e' al canza el pH que iguala su pi (Ta bla 3-6). De estC' modo las
protena s COJl puntos isoelct ricos dis1.imos se distribuyen de
manera difC'rcnte a lo largo dC'1 gC'1.
La cOlllbinacin secuencial del e nfoque isoelct rico y la
electroforesis en gel con SDS en t Ul proceso "rnominado e lectroforesis bidime ns io nal permitr la resolucin ele mrzclas
comp lC'j as de protenas ( F'ig. 3-22). ste es un mtodo analtico ms sensible que cualquier m'lodo cleclrofortico indi vidual. l.a elect roforesis bidimensiollal separa protemas <.le masa
llIolecular idnrica que difieren en el pi o prolrnas con valoI'es de pI similarC's pero con difere ntes masas lIIolecularf's.

Es posible cuantificar las protenas no aisladas

A fu i <.le pU1ifical' una protena es C'senc ial disponer de un mlodo ))<'lra detectar y cuantificar c.licha protC'na en presencia de
muchas protenas ms en cada etapn del proceso. A mrnurlo, la
purificncin e1ebe realizarse en ausellda dr loda informacin
sobre el tamao y las propiedades fsicas de la prolrnn, o sobre la fraccin que repr('senta sobre la mnsa (otal de protena
ell el extrncto. E:n el caso de protenas enzimnl'i cas, se puede
determina r la canlidad de ellzima rn una solucin o f'Xlr<lcto
de tejido de'te rmi llados en funci 6n del eff'clo cataltico que
produce el enzima, ('s decir, el inrrrmento de l<.i velocidad a la
cual su sustrato se convierte en produc tos ele la reacc in
cuando esl presente el enz ima. Con este fUI hay qu(' conocer
(1) la C'cuacin global de la reaccilI cat..'1Ii7.ada, (2) LUl procedimiento analtico pm'tl detennmar la desapariCIn del SIlSt rato O
la apaJi cin de tUl producto dC' la reaccin, (;.J) si el enzuna re-

FIGURA 3-21 Enfoq ue isoelclrico. Esta

tcnica separa las protenas segn sus puntos
isocld ricos. Se establece un gradie nte
estJbl e de p" e n e l gel por ;:dic i n de
anfolitos adewados. Se coloca una me7da
de protenas en un pocillo del gel. Con la
a plicacin de un ca mpo elctrico. las
prote nas entran e n el gel y se desplJZJIl
hasta alcanzar un pH equiva le nte a su pI.
Recurdese que la carga neta de una
protena es cero cuando pH = pI.

qllierr cofa ctores tales corno iones metlicos o coem:imas, (4)

la dependencia de la actividad enzimtica, respecto de la concentraci6n de sustent.o , (5) el pH ptimo y (6) una zo na de
1.emperatura en la que el e nzima sea estable y tenga rula actividad elevann. Los e nzifllas se e nsayan normalmente a Sil pl-I
ptimo y a una temperatura conve niente dentro de l intervalo
de 25 <:1 38 oc. Tamb in se requie ren ge nera lmente elevadas
concentra ciones de s ustra to de modo que la velocidad inicial
de reaccin, Que se mide experimentalmente, sea proporcionaJ
a la co ncentracin dr rnzima (CO:iptulo 6) .
Po r aC\lc rdo internacional, se de fin e 1,0 unidad de actividad e nzim tica como la cantidad de e nzima que produce la
transformacin de 1,0 ,""mol de s ustrato por minuto a 25 uC en
condiciones ptimns de medida. El I.(-rmino a ctividad se ren('re a las unidades t.ot.ales de enzima en una sol ucin. La ac
Ovidad especifi ca es elllmero or unidad es enzimticas por

TABLA 3-6 Punto isoelctrico

de algunas protenas
Protena
Pepsina
Albmina de huevo
Albmina srica
Ureasa
3-Lactoglobulina
Hemoglobina
Mioglobina
Quimotripsingeno
Cilocromo e

lisozima

pi

< 1.0
4,6
4,9
5,0
5,2

6,8
7,0
9,5
10.7
11,0

3.3

Trabajar con protenas

95

r-r- - , -

~l
,=:1
Prime r a

"-. '

dime nsi n

~:

Enfoque

1.- '

isoeldrico

pI

decreciente

~::

'-. '
'-.-'

)))) )) ) )) ) )
El ge l de enfoque
isoelctrico se coloca
sobn;! un gel de
poliacril a mida con SDS.

1
S e gunda
dime nsin
Electrofor esis en gel
de pol iacrilamida con

(a)

---- -

(b)

SDS

pi
decreciente

---+

miligramo de p rotena ( Fig. 3-23). La activi dad especfica

cons tituye una medida de la pureza enzimtica: a wnenta duran te la pu rificacin de un enzima y llega a se r mxima y constante cuando el enzi.ma es puro ('fabla 3-5) .
Despus d e cada paso de purificacin, se determina la actividad de la preparacin (en wlidades de especifidad enzi..mLica), se determina independientemente la cantid ad total de
protena y su cociente da la actividad especfica. La actividad y
la protena total gene ralmente dismin uyen e n ca da paso. La
actividad d isminuye porq ue siempre se p roduce alg wla p rdida debido a i.nactivaci6n O a interacciones no ptin13S con los
ma leriales cromatogrficos o eOIl ot ras mol culas de la sol ucin. La protena to tal dismin uye porque e l objetivo es elirninar
tanta protena no deseada o no especfi ca como sea posible.
En LUl paso de puriflcacilI exitoso, la prdi da d e p rotelLa no
especfica es m ucho mayor qu e la prdida de actividad; po r
tanto, a un cuando la act.ividad total disminuye, la actividad especfi ca aumenLa. Los datos se recogen fmalm enle en lUla 1:.:,bIa de p uri fi cacin similar a la Tabla 3-5. Ge neralrnem e se

AGURA 3-22 Electroforesis bidimensional. (a) Las protenas se separan primero medi ante enfoq ue isodctri co en un gel cilndrico. A
continuacin se extiende el gel horizontal mente sob re un segu ndo
gel, en for ma de plancha, y las protcnas se separan medi ante electroforesis en gel de poliacrilamida con sos. l;... separacin horizonta l refleja las diferencias de pi; la vert icJ I refleja las diferencias en masa
molecular. (b) Utilizando esta tcnica se pueden separar ms de 1000
protenas diferentes de E. coli.

considera que lUla protena es pu ra cuando pasos adicionales

de puri ficac i n no consiguen aum enta r 511 act ividad especfica y cuando slo se puede detectar W \a especie proteica (me(liante electroforesis, por ejemplo).
En el caso de protenas que no sean enzimas, se requieren
ot ros mtodos de cuantiri caciu. Las protemas de transporte
pueden determinarse por su unin a la molcula que t ransportan , y las hormonas y las toxinas por los efectos bi olgicos que
producen; por ejemplo, las ho rmonas de crecun.iellto estimulan
el crecimiento de ciertas cl ulas cultivadas. AJgunas protenas
estructurales representan una fraccin r.an grande de la masa
tisula r que pueden extraersf" y pUlIDcarse fc.:ilmente s in necesidad d e un ensayo fW1cional. Los m t odos son tan variados
como las propias protenas.

AGURA 3-23 Actividad frente a actividad especfica. Se puede ilus

trar la diferencia entre estos dos trm inos considerando dos reci pien
tes con ca nicas. Ambos contiene n e l mismo nmcro de canicas ro jas,
pero can tid<:l des diere ntes de l.:tlllicas de otros colores. Si se considera que l<:ls can icas representan pro1enas, ambos reci pientes conti enen la misma actividad de la protena representa da por las canicas
rojas. o obstante, el segundo rcLipiente tiene una actividad especi
(ica mayor debido a que las canicas ro jas son una fraccin mucho
mayor dellola!.

96

Captulo 3

Aminoci dos, pept ldos y protenas

RESUMEN 3.3 Trabajar con protenas

Las protenas se separan y purifican el1 fWlcill de

diferelldas ~ 11 sus propiedades. Las prot en;1s se
pueden prec ipitar selectivamente mediante la adidn
de ciertas sal('s. 8xistc una amplia ~"lIl1a de mtodos
cromatogr{ificos que exp lotan las difereJlcias de
tantano, afinidad de unin, carga y otras propiedaelC's.
~ntre estos mtodos se il1cluyen las cromalOgrafias
de int.ercamhio inico, de excl usin molecular, de
afini dad y liquida de alLa rpsolurin.

La electroforesis separa protenas sf'g n S1I masa .r Sil

('arga. La e lectroforesis e n gel con SDS y el enfoque
h:ioelclrko se pued en u\ iUzar por spparado o
combinados pa ra oblene r lUla Illejor resoludl l.
Todos los procedimienls de purificaci n reQuierfn
un m(>todo para cuanlilica r o d isti nguir la protena
de inters el1 presenda de olras protenas. La
purificacin puede segu.i rse mediante la
determinadn de la ael ividad psp('('fira.

3.4 Estructura covalente de las protenas

La pmif('acin de un a prote na es gene ralmen te tall slu el

prel udio de una dis('('dn rlf'lallad<l d(' Su ('sI ructura y funcin. Qu es lo Que hace que lItm prote lCI sea WI enzi.ma, olra
LICIa hormona, ot ra 11Ila prolf'fna estru ctura l y ot ra un anticue rpo? Cmo se d ifere llcian qulucamente? Las dife rel1 ('ias
ms ohvias son f'sII"lI('luralcs y pueden aborclarse en cada nivel
estructural defInido en la Figura 3-16.
Las diferencias en la estructura primaria puedell se r e~pe
ciallllellte informa tivas. Cada pro tena liene un nm f'ro y S{L
cllf' ll('ia distintivos de' res id uos aminocidos. Como veremos
en el Captulo 4, la eslrucLlU'a primaria de una pl"Olena determina la fonn8 en que se pliega en LU"'la estructur<t tric.li.Inell,sional nica y sta , a su vez, df'tC' nnina 1;1 fllnrin c!r 18 protrfna.
El r(,sto de este captulo se centra r en la estlllclUra primaria.
COllsideraremos en IJlimer lugar las indicariollf's f'mpricas sobre la est recha rela ci n elltre sec uelld a de ~1IIjll o<.;idos y fUIldn pro lf'i('a, pam ('0111 inuar d escribie nclo c mo se determina
la sec uellcia de aminocidos; finallllf'111 f', dC'snibi rC'mos los
liSOS a 105 ClIIC' Sf' pucde destina r esta info rmacin.

La funcin de una protena depende

de su secuencia de aminocidos
La bar lf'ria Esrh('nrhw coli produce ms de 3000 prote-fnas
diferentes; UII se r ItUI1l~1I10 produce de 25.000 a 35.000 prol.fnas dislin l;1S. 8n mllbos casos rada tipo ele:' protena tiene una
estructura tridimellsiollal nica Que le confiNE' una fund n
ni ca. Cada tipo de prote13 tambin tielle uw.t secuellda tle
Uninod dos nica. La intuicin sugiere qu e 1<1 seru('llcia ele aminocidos debe desempeflar UII papel fmuta llwnlal rJt la df'lr rminacin d(' la estrUClt!ra trielimcnsiorial de la protena y en
ltlluo trmi no en s u fllllcin, l)pro ps ro rrf'r la C'sl (l s\lp05i-

ci6n? Gil exame n general de las protenas y dp sus variadonf's

en la S('C II('ncia de aminocidos proporciona una se ri e de pislas empricas que ayuda n a sustanciar la importante relarin
('nI re s('('!I('ncia de aminocidos y funci n biolgica.
Primero, tal como ya helllos visto, protenas ron funciones
diferentes siemp re lienen secuencias de amino{lcidos di ferent.f'S. Spgu nno, Sf' hm, rOHf' lacionado miks Of' rn fel1llcelades genticas humanas t:on la prod uccin de vrotellas defectuosas.
Quizs UI1 preio dp C'SLas prOTenas son defectuos."lS d ebido a
un (mico cWllbio ell la ::;ecuencia de am..i..l\ojcidos; por tanto, si
sr alte ra la estructura prima ria, puede carnbia r tambin la r UlIdn de la prolela. r inalmenLe, al comparar prol.f'inas con I1mciones simila res de d iferentes especies encontramos que estas
protelas lienen a menudo secuencias de ami nocidos similares. Un caso extremo es la ubiQuitina, una prolena de 76 aminocidos implicada f'n la rf'gulacin de la degradacin d e otras
p rolenas. La secuell da de aminocidos de la ubiQuiti na f'S
id<:'ntica C'11 especies tan dispares como pueden ser la mosca
del vinagre y el ser hlllnano.
L:'"I
: sec uencia de aminocidos ele una prote na est fijada
absolutanlPl1le, es dprir, no \7tria PJ1 ahsolut.o para una prote,a
concrela? No; es posible cierta flexibilidad. Se calcula que enliT' pi 20 .Y f'130% dr las prot.('infls huma.nas so n Ilolimrli cllS,
teniendo secuencias de aminoddos que varan delllro de la
poblaci6n humana. La mayoria dp f's tas variarion('s de secuenda no tie nell ll.i.ngllJ 1 efec to, o muy pot:o, sob re la fun cin df' la
prot.ena. Adems, proremas que llevan a cabo una funcin sinular en especies dis tanlps pllfi'dpl1 c1i felir dr mane ra im po rtante en el ta mai'lo globa l y en la secuencia de aminocidos.
A pesar de QIlP la sPc lIPncia c!C' aminocidos pUNir va riar
co nsiderablemente en a lgu nas regiolles de la es tructura primaria sin afectar a la funcin bio lgica, la mayo ra de prolet3s
contie uell a menudo regiones crut:iales que son esenrialps
par<1 su f"l mC"in y ('\1)'<1 Sf'C'lI r nr ia Sf' ('l1cur ntra , por k"lnto, COIIse rvada. La 'accin de secuelH;ia gluual que es crtica vara de
protena [ prolPn<1. lo QlIf' romplira la tarca de relacionar secuellcia COl1 estruclura tridiJ llensional y estruclllra con flll1rin.
No obst.ant e, antes de poder pro fundi za r en este proble ma, he1II0S de exuminar de qu forma se obtiene la infollllacin sobre
1<1 sPcllrncia.

Se ha determinado la secuencia de aminocidos

de millones de protenas
Dos unpo n ;'lIlt~s de::;cubrunienlOs que tuvieron lugar en 1953
fllPron df' importan('ii1 r !"llrial en la histOl; a dr la bioQufmica.
EII aquel afio James D. \Valson y Frallcis Crick dedujeron la estru ctllra e n dobl e hlice del UNA y propusieron mla base
estructura l que explit:aba su precisa replicacin (Captul o 8).
Su propllrsta aclar la realidad molecular que estaba UllpUcit..a
en la idea de geJl. En aquel mismo afto, rreclel;ck Sanger rf'so lvi la secuencia de aminocidos de las cadenas peptdicas de la
hOlmona insulina (Pig. 3-24), sorprendiendo a muchos invest igadores que haball credo durante lIlucho tiempo que la elrdll(,rin de la secuencia ele aminocidos de Wl polipptido sera ulla
ta rea impOSible. Rpidamt>nt.e se hizo evidentp Q1IP la secuencia
de nucletidos e1el UNA y la secuencia de alllinocidos de las

3.4

Estructura cova lente de las protenas

97

protenas eslaucu l relacionadas de algl\ modo. Ap<,nas Wla dcada despus de estos oescuurim..ientos se revel el papel de la
sec uencia de nuc1elidos del UNA en la de terminacin de la seClI cnc.ia ele am..inocidos 0<, las molcula s protC' icas (Capit ulo
27). Actualme nte se puede d edu cir un nmero eIlo rme de secuencias proteicas de fOlllla indirecta a partir de las secueIldas
de DNA que se recogen en los bancos de dalos gen6 micos Q\lP
cr ecen I'pi damellte. No obstante, aJ\ se deducen muchas secue ncias utilizando los mtodos tradicionales de secuem:iaci6n
de protefnas.
Se han determinado las secue ncias de a minocidos de millares d e protenas de mu c ha s especies utiliza ndo los princiFrederi ck Sa nger

Cad ena A

NH,

NH,

Gly

Phe

cstn fI n uso, a unque con muchas variaciones y mejoras e n sus

detalles, Actualme nte, la secuellciacin Qufmira de prote1as

compl ementa una serie creciente de m todos nuevos, lo cua l
proporcio na mlti ples vfas para obteller da tos de s('cu encia de
aminocid os . Es tos datos son ele im portancia crtica para cua lqui e r rea de la investigacin bioqunica.

Val

Val

Asa

Glu

Gln

I
I

Gln

CYS

Cys-

I
I

His
Le u

S-

S-

Cys

Ala

Gly

Sel'

Ser

yal

10 +S

Cys

Leu

Ser

Val

Le u

Gl u

'I'y r

Al a

15

Gln

15

I
~u

Leu

Glu

fY'
Le u

Asn

Val

I
I

S-

Tyr
20

I
I

Cys-

pos desarrollados ini ci almente por Stlngf'r. Estos mtodos a n

lI e

Cadena B

"

Cys

I
I

Asll

Glu
Arg

Gly

Ph e

25

FIGURA 3- 24 Secuencia de
aminocidos de la insulina bovina,
Las dos <.:aden.s pol ipc ptdi cas estn
un ida s por cnlaces disulfuro cruzados.
La cadena A es idntica en las insu li nils
humana . de cerdo. perro, conejo
y cachalole. Las cadenas B de la vaca,
cerdo, pcrro. cabra y cil ba llo son
idnticas.

Phe

fY'
Thr
I

P ro

Lys

30

Para analizar la estru ctllfa primaria de una prote'na se utili zan diversos procedimielltos. Se dispone de divt'l'sos protocolos para marcar e identifi car ('1 residuo amino-te rm ina l (F ig.
3-25a). Sanger introdujo el reac ti vo l -tluoro-2,4-d initruuenceno ( F'DNB) co n este [m ; otros !'('activos utiliz;ados para marcar el residuo ami no- I.e rmin al, el cloruro de dansilo y e l
cloruro d<, dabsilo, dcul de rivados que se pueden cletecral' ms
f cilme nte que los de rivados dillitrofenilados. Una vez que se
ha marcado el resid110 amillo-te nninal con li no de eslos reactivos, se hidr oliza el polip ptido a sus aminocidos cons tit.uyentes y se id<,nti fica el a minocido marcado. Dado que la e ttlp<1
de hidrli sis d estruye' <,1 poli p p tido, este pror.f'd imie n to (l O
puede util i7.arsp. pa ra secuencia r un polipptido ms all el e su
resid uo a rnino-Lerminal. Si n e mbargo, puede ayudar a dete rmina r el nmero de poLip pLidos qum icamPIl Le d ifereJlLes e n

Gly

COO-

Los pOllpptidos cortos se secuencian utilizando

procedimientos automticos

Al a

COO -

e H, CH,

~
~

SOzCI

Cloru ro de dansil o

C~~~ =N~S02C I
CH, ~"=1Cloruro de dabsilo

98

Captulo 3

Aminocidos, peptidos y protenas

Polipptido

NO,

F'DNB

NO ,
NH
lI el6

Amino
cidos
libres

R'- H

t.I

(a )

COODerivado de
2,4di ni t rofenilo
d el polipptido

Se identifica el resi duo amino-tenninal del polipptido.

Derivado de 2,4
dinitrofenilo
del residuo
aminolermi na l

J
renili80tiocmnnto

r\ H

"H
N

(b )

S ('

C""N

'C~O
I

C- CH ----"-- HN - -CH

J 'R'

}.

Derivado ani linotia-

Derivado feniltio h idantona del residuo

aminocido

zoli n ona del residuo

aminocido

R2

Se ide ntifica el residuo

amino-terminal; purificacin
y reciclaje del fraf:,."IDento
peptdico resultante a travs
del proceso de Edman.

R3

Pptido
H aN - C- C- N - C- C /""'V'\... recortado
Aducto de PTC

11

H H 11

FIGURA 3-25 Pasos en la secuencia ci n de un polip ptido. (a) la

identificacin del residuo amino-tcrmilMI puede ser el primer paso de
la secuenciacin de un polipptido. Aqu se mUlo'$trd el mtodo de Sanger para iden tificar el residuo amino- Ienn inal. (b) El procedimiento
de la degradacin de Edman permite obtener la ~ecuencia c.:ompleta

de un pptido. En el caso de pptidos cortos este mtodo por s solo

da la secuencia completa , por lo que frecuentemente se omite el paso
(a). El pa so (a) resuILa til en el caso de polipptidos de gran tamao
que a menudo se fragmen tan en pptidos ms pe<lueos para su secuenciacin (vase Fig. 3-27).

una prorrfna, siempre que cada uno tenga Ull residuo aminotermimll diferente. Por ejemplo, si la insulina se somete a esle
procrdimicnto se marcaran dos residuos, Phe' y Gly ( F'ig. 3-24).
Para srcucn ciar un polip pUdo cornpl elo se uliliza norma Lmem e un mtodo qumiro clis'i'lado por Pehr I:;dmall . El
procedimiento de la degradac in de Edman marca y rlimina
slo el residuo amulo-terminal de un pptido, dejando el resto
de enlaces pcptclicos intactos (Fig. 3-25b). Se hace reaccionar
el pptido con fenilisoliocianato en condiciones alcalinas suaves, lo que convierte el aminoddo amino-I.f'rminal en un
aducto de fenilliocarbamilo (lYI'C). I~I enlace peptdico contiguo al ad ucto de P'l'C se rompe a conLinuacin f' 1l Ilna reaccin llevada a cabo por el {cido trilluoroactico anhidro, cotila
consiguiente eli..IlIi.nadn del aminocido amino-tcrminal en
forma oe anilinot iazolu"tona. El aminocido modificaoo sr rxtrae con clisolventes orgnicos, se convierte en tUl derivado fe
nilLiohidamona m:i.s estable, mediante tral:.tlllienlo co n rido

en solucin acuoS<:l, y rmalmenle se identifica. El uso ele reacciones secuenciales llevadas a cabo primero eH condiciones
bsicas y a continuacin cidas proporciona un control adecuado sobre Lodo el proceso. Cada una de las fr acciones del
aminocido arnino telminal puedc co mpletarse prcticamente
(' 11 su totalidad sin afectar a ninguno de los dems enlaccs del
pplido. Despus de la 'liminacin e identificaci611 del residuo
a mino-terminal, el n.ueru residuo amino-te rminal puede ser
marcado, e liminado e identificado a travs de la misma serie
ele reacciolles. Este procedimiento se rrpite hasta qu e se ha
determinado toda la secuencia. La degradacin de Edman se
realiza en un instrume ll to, denominado sec ue nciado r, que
rn f'zcla los reactivos en las proporciones adecuadas, separa los
productos, los identifica y registra los resultados. Estos mtodos son extraon.1.i.llarii:l.lIIente sensibles. A menlldo puede e1etenninarse la sf'cuencia aminocida completa a partir de unos
poros m.i crogramos de protena.

3.4

La longitud de polipplido que puede secuenciarse correctamente mediante la degradacin de Edman depende de la
eficiencia de los pasos q1lmicos individuales. Consideremos un
pptido que empiece con la secuencia Gly-P ro-Lys- en su extremo amino. Si la glici na se eliminara con ulla eficiencia del
97% , el 3% de las molculas del polipptido en la so lucin
malltendran un resid uo de Gly en su extr emo arnmo. En el segundo ciclo de r~dma n, el 97% de los runinocidos liberados sera protina y el 3% glicina, mientras que un 3% de molculas
del polipptido mante ndran residuos de Gly (0, 1%) o Pro
(2,9%) en su extrerno amino. 8n cada ciclo, los pptidos que
no han rcaccionado en los ciclos anteriores aportarn aminocidos a un fondo q ue crece continuamente, haciend o fina lmente imposible deten ninar cul es el siguiente aminocido en
la secucncia peptdica original. Los secuenciadores modernos
alcanzall eficiencias superiores al 99% por cic lo, pennitiendo
secuenciar ms de 50 resid uos aminocidos contiguos de un
polipptido. La estructura primalia de la insu lina, resuelta por
Sanger y co laboradores a lo largo de un perodo de 10 ailos ,
podria ser ahora detenniuada por completo en un da o dos.

las protenas grandes deben secuenciarse

a partir de fragmentos ms pequeos
La precisin global en la d eterminacin de una secuencia de
aminocidos disminuye generalmente a medida que aume nta
la longitud del pol ipptido. Los polippt.idos eno n nemente
grandes que se encuentran en las prote tas han de rompe rse
en trozos ms pequeos para poder secuenciarlos de man era
eficiente. Este proceso consta de vanos pasos. En primer lugar

~ NH

CH,SH

99

se rompe la protena en un conjunlO de fragmentos es p ecfi <.; o~

mediante mtodos qunicos o enzimticos. Si existen puentes
disulfuro ) es necesario romperlos. A co ntilluacin se purifka
cada fragmento y se secuencia mediante el procedimiento de
Edman. f'inalmente se determina el orden en que los fragmentos aparecen en la prote ta original y se dete rmina dnde estn localizados, si es que los hay, los enlaces disulfuro.
Los puentes disul furo interfierrn
en e l procedimiento de secuenciacin. Un residuo de cistina
(Fig. 3-7) al que se cort.ara uno de sus enlaces peptdicos m e ~
diante el procedimiento de Edman podr a perlllanecer mudo a
otra cadena polipeptfdica a travs d e su puente disulfuro. Los
puentes disulfuro tambi n interfieren (' n la ro tu ra enzimtica
O qumi ca del polippticlo. En la Figura 3~26 se esquematizan
dos rntodos utili zados para romper enlar:es disulfuro d e ma nera irreversible.
Rotura de los enlaces dlsulfuro

Pueden utilizarse varios mtodos para frag.menta r la cadena polipeptfdica. Los enzimas denomi nados pro teasas catalizan la rotura hidrolitica de los
enlaces peptdicos. A!gw'\as proteasas COltan solamente los enlaces peptfcJicos adyacentes a residuos aminocidos especficos
(Tabla 3-7) y por tanto fragmentan una cadena poli peptfclica
de forma predecible y reproducible. Vatios reactivos qumicos
cortan tambin los enlaces peptdicos adyacentes a residuos
especficos.
Entre las proteasas, el enzima digestivo tripsina cataliza la
hidrlisis de tan s6lo aquellos enlaces pepldicos en los que el
grupo carbonilo est proporcionado por un res iduo de Lys o
Rotura de la cadena polipeptidica

Puente di sul furo

(cistina)

O= C

I
I

Estru ctu ra covalente de las protenas

HC- CH, - S S- CH,-CH

CHOH

CHOH

CH,SH

HN

C= O

Diti otreitol (D1'T)

~ NH

11

11

HC- CH, -S- OC~O

O= C

11

11

~NH
I
I

- O- S- CH 2 - CH

los dos mtodos ms comunes. lJ oxidacin de un residuo de cistinf

con c ido pcrfrm ico produce dos residuos de cido cislei co.
La reducc in con ditiotreitol que da lugar a residuos de Cys
se ha de completJ r co n una modificacin adicional de los gru pos
la reformacin del puente disulfuro.

-S H reactivos para imped ir

la acetilacin con yodoacetato es til en este ltimo caso.

,s

FlGURA 3-26 Rotura de puentes disul furo en protenas. Se ilustran

HC- CH2 - SH

HN

Residuos de
cido cisteico

O= C

C= O

HC-CH. -S- CH, - COO-

-~-'

- OOC- CH 2- S- CH2-C H

C= O

,s

I
HN

'
c.... uuXllllet.1'1 aCln
med ianle
yodoacetalO

~NH
I
I

HS- CH,-CH

HN
Resi duos
de cistcna

carboximct.ilados

100

Caprtulo 3

Am inocidos, pptidos y protenas

TABLA 3- 7

Especificidad de algunos mtodos

usuales de fragmentacin de cadenas pOlpeptdicas

Tratamiento (origen biolgico;'

Puntos de corte t

Tripsina
(pncreas bovino)
Proteasa de Submaxillarus
(glndula submaxilar de ratn)
Quimotripsina
(pncreas bovino)
Proteasa V8 de Staphy/ococcus aureus
(bacteria S. aureus)
Proteasa Asp-N
(bacteria Pseudomonas tragi)
Pepsina
(estmago porcino)
Endoproteinasa Lys e
(bacteria Lysobacter
enzymogenes)
Bromuro de ciangeno

Lys, Arg (C)

Arg (C)
Phe, Trp, Tyr (e)
Asp, Glu (e)
Asp, Glu (N)
Phe, Trp, Tyr (N)
Lys (e)

Si 1:'1 estl1lcLul'a primada in*

rhly(, pll('nl('s disulruro, su localizacin se determina en tu1
pitSO adidollal una vez completada la s('cuenciaciIl. De nu('vo
se corta una ll1 ueS Ll'n d(' la protf'na con un reac tivo como la
1ripsina, pero e::; la vez SiH romper los pue ntes c1 islllfllro. Los
pptidos ]'C'slllta ntes s(' separan por electroforesis y se compa*
!'fln con el co nj unto original de pp[idos generados por la u;P*
silla. Por cad a puente disulfu ro raltarn dos Of' los pplidos
origi nales, al I iempo Cjue aparf'cer un lluevo pptido lHs
gramle. Lus dus pptitl os qu e ha n o rsaparC'ddo rrprese man
Ins r('g ion ('~ del polipplido intucto que estll unidas por e l
puente disulfuro.
Localizacin de los puentes dlsu/furo

Met (e)

A excepcin del bfOmufo de ciangeno, todos los reactJvos pfoteasas, Todos pueden
obtenerse comercialmente.

tReslduos Que aportan el punto de reco JlOClmiCJlto pflm8JlO para la pfoleasa el reacLvo:
la rotura del eJllace peptfdiCO llene lugar eJl el lado carbontlo (e) o amlno (N) del t'CSlduo
aminocido indicado,

Arg, independientemente de la longiwd o Sf'C'lIf'nria Of' amino*

cidos de la cade na . De este ItlOUO pu e d ~ predeci rse el n(*
mero de ppliuos de lnenQr tarnaiio producidos po r rOl lira ('on
t ripsina a partir del n'mero rotal Of' resiollos oe Lys o Arg del
polipptiuo original, determinado a partir de la hidrlisis de
una ITIUestn1 intact:J. (F'ig. 3-27). Un polipptido COII dllco residuos de Lys y/o Arg dar lugar I\ormalmente a seis pptirlos
ms pequeii.os al se r cOl1ado po r In lripsina. "df'ms, todos ex*
r('pro lino l('nnrn IIna Lys o Arg carboxilo*le rmiltaL Lo::; fragmentos prod ucidos por accin de la tripsin:'l (11 01 ro r llzi m<l o
r('ilctivo Cjllmko) sp sC'paran a co nlinuaci lt media nl m lo*
do::; crolll:JlogrJficos o e lectrofort icos.

Todo::; los fragmentos peptdiro~

(\(' la accin de la lripsina se secuclH.:ian sevaradarneJlte 1>Or el Vrocedlntiento de 8dman.

Secuenciacin de los pptldos

rr!'mlt.n ntf'~

Ordenaci6n de los fragmentos peptdlcos

Se pxaminan las secuencia::; de aminocidos de cada frag*

I11rnt.o obtenido con lo::; dos procedimientos ele rotura con ell1
d e ncontra r p ptidos prodllrto del segundo proced imie n*
la cuyas sec uencias establezcan una co ntinu idad, deb ido al
solapami('n lo, ('lllrC' los fragmentos obtenidos pOI' el primer
procednielllo de ro lura (Fig. 3-27). Lo~ p('ptido~ solapanr ps
obtenidos a pa rtir de In segu noa fra gmpnl.acin dan el orden
rorrecto de los fragmentos pept(licos obte rudos e n la primera.
Si s e ha ide ntificado ('1 aminorid o amino-lerminal previam('nt,p a la rotura original de la prole la , se p uede utilizar sta
iJlformaci n para estclblece r c u l es e l frag mento que proviene
del extremo amino. S(' pllf"df'n ('omparar los dos conj wltos d e
fn1g mpnt.os para delectar posibles e rrores al determinar la
::;t'cuencia el e aminocidos de cada fragment.o. Si el segundo
procedimiento de rotura no eOllsig ue establ ecer co ntin uidad
elllre texlos los pptidos d(' la pl;mera rotura, deber utilizarse
un !'rrcero o incluso un cuarto , mtodo ele rotura para obtener
UII conjun to de pptidos que pueda proporcio nar los solapa*
mientas n('r('&11;OS.

Ahora debe' c!rtrrmi*

narse el orden de estos "fragmentos dp tripsina" PIl la cadena
polipe ptdica original. Se corla otra mue::;trct del polipplido inta cto en fragmentos milizando un rnzima o rp3('tivo oifereme,
q1le corte enlaces peptdicos en puntos diferentes a los co rtados pOI' la tri psina. Por ejemplo. ('1 bromllro op cia n ~pno slo
rompe aqll('lIos pnl a('ps pppt.d icos P Il los qu e el grupo carbonilo es aportado por .\1c l. Los fragmcntos r('slllt a l11('s d(' f's lr
s('gundo pro('('dim ipnt o SP spparan y sec llpndan igual que lo::;
allteriOJ'es.

Las secuencias de aminocidos se pueden deducir

tambin mediante otros mtodos
1:1 mrtodo ('sCju('l11a l izado anterionnellle 110 es la (mica forma
de deterwiJ\a r sec uencias d e aminoridos. N 11('VOS mptodos
basados e n la es pecll'OI11Nra dC' masas permiten la secuencia*
rin d(' poliptsp l idos cortos (20 a 30 res iduos arninociclos) e n
::;lo unos pocos minutos (J{c('undro ~ *2). Adems, el desarro*
110 dC' m{-todos rpidos para la secueuciacin de DNA (Ca ptulo 8), el de,c ifrado de l cdigo gentico (Captulo 27) y pi
c!eslrrollo ctC' tt"rnkns pa ra eJ aislanuento de genes (Capt uJo
9) permit.en deducir la secuencia de un polippt ido m('diantC'
lI dcte l'minnrin df' la spcuencia de l1ucletido::; deJ gen que lo
codifica (Fig. 3-28) . Las tc nicas utilizadas pnrl of'termillar
sc(' u e n cin~ d(' prol.f'nas y DNA son complementarias, Cuando
sr d ispone del gen , la ::it!cuenciacin del DNA pu ede ser ms
rpida y ms precisa que la secuenciacin de la protena. La
mayorn nf' protpnas SE' secuencian actualmente por esta va
imli recLa. Si no se ha ais lado el s('n es nf'('esm;a In secuenr ia*
rin dirf'r la <ir los pptidos y sta vuec.le proporcional' infol'*
wacil1 )or ejemplo, loca lizarin df' los pu('nt('s d isu lfuro)
que no puede ser aport ada por la secuencia de DNA. Adems,
('1 co nocimien to de la secuencia de a minocidos, o in cl uso de
LUla parte de un pol ippticlo, p1l('(1(' faci li tar mucho e l aisla*
mirnto rlpl gPIl correspolllliente (Captulo !J).

3. 4

Proce dimiento

s- s\

A 5
C 2
D 4

E 2
~'

se hoce rcncdonar
con 1' DNBj hidrlisis:
separacin de IOfi a minocidos
se reducen los
enlaces disulfuro
(si loe hay)

G 3

Polipptido

H
1
K
L

El polipptido Liene
38 residuos aminocidos.
La tripsina cortar tres
veces [en una R (Arg) Y
dos K (Lys dando cu atro
fragmentoH. El bromuro
de ciangeno corta r en
dos 1\1 (M et) dando t.res
rragmentos.

R 1
S 2
l' 1
V 1

3
2
2
M 2
P 3

101

Conclusin

Resultado

hldrliAiAj separacin
de los aminocidos

HS

Estructura covalente de las protenas

Y 2

Se detecta 2-4d.initrorenilglutamato

E (G lu ) es el residuo
amino-terminal .

SH
\

T 1 GASMALlK
se corla con p 11 : se separon
los fragmentos; 8e secuencia
, d, adaci6n de Edman

T 2 colocado en el extremo
amino porque em pieza
por E (G lu),

EGAA YHDFEPLDPR

3} colocado en el extremo
carboxilo porque
no acaba en R (Arg)
o K (Lys),

'1'-;1) DCVHSD
'1' I

se corta con bromu ro ele c iLlIllgcno; se

separa n los fragm entos; se secuencia
por dcgradllcin d~ Edman

se clltablece
la secuencia

@
@
@

YLIACGPM1'K

EGAA YHDFEPlDPRGASM

se solapa con

T f y T f , pe rmitien do

1'KDCVHSD

ordenarlos.
ALIKYLIACGPM

'1 1

Extremo
amino

I~

EGAA YHDFEPLDPRGASMALlKYLIACGPMTKDCVHSD
11

'

,1

Ext remo
ca rboxilo

hay dos residuos de Cys () por lo

FIGURA 3-27 Fragmentacin de las protenas, secuenciacin yorde-

con eficiencia. En este ejemplo, slo

namiento de los fragmentos peptdicos. Se determina en primer lugar la

que slo hay una posibilidad de loca li zacin del puente disulfuro. En

composicin de aminoci dos y el residuo N-terminal de una muestra

los polipptidos con tres o ms residuos de Cys, la posicin de los puen-

intacta. A continuacin se rompen los puen tes disulfuro presentes an tes

tes di sulfuro puede determinarse tal como se describe en el texto. (Los

de la fragmen taci n de forma que la secuenciacin pueda transcurrir

smbolos de una letra para los aminocidos aparecen en la Tabla 3-1.)

El cOlljWlto de mtodos disponible actualmente para analiwr tanto las proleas como los cidos nucleicos cst.:"I dando
origrn a una nueva disciplina: la "bioqumica de la clula compIPLa". La secuencia completa del ONA de un urganismo, Sil
genoma, est actualmente disponible para organismos que
a ha rcall desde virus o bacterias a e ucariotas mullicelularcs
(vase Tabla 1-4) . Se estIl descubriendo millolles de genes, inc1uy('ndo muchos que codifican prot.elas sin ningwm [wlCin
co nocida. Para dC'scribir el complemento proteico ente ro codificado por el DNA de un organismo, los investigadores han
acuflado el t rmino proteoma. Tal como se comenta en el Capftulo 9, las nuevas discip linas de la genmica y la protem..ica
complementan las invesligaciones realizadas sobre el met.1bo-

lismo cel ular intennediario y el metabolismo de cidos nuc1eicos,

generando una visin nueva y ms completa de la bioqumica, a
nivel celular e incluso a nivel de organismos cnt,f'ros.

Secuencia de aminocidos (protena)

Secuencia de DNA
(gen )

Gln -Tyr- Pro- 'fhr- Ile-Trp

""---'.-----.'---'r----lr---J""---'

CAG'I'ATCCTACGAT'ITGG

FIGURA 3-28 Correspondencia enlre las secuencias de DNA y de

aminocidos. Cada am inocido est codificado por una secuencia espedfica de tres nuc!etidos en el DNA. El cdigo genlico se descri be con detalle en el Captulo 27.

102

Ca ptu lo 3

Aminocidos, pptidos y proteina s

RECUADRO 3-2

Investigacin de las protenas mediante

la espectrometria de masas
El espectrmetl'O de masas ha sido desde hace tiempo una
herram.ienta indispensable en qufmica. Las molculas qUE" se
deben analizar, a las que se hace referf'ncia como Rna litos,
se ionizan en primer lugar en el vaco. Cuando las nll cvas
mo lculas cargadas se introducen en un campo elctricu y/o
magntico, sus trayectorias a travs del campo son fllncin
de su relacin lIIasa-carga, n/z. Le'} med ici n de esta propiedad de las especies ionizadas puede utilizarse para deducir
la masa CM) del analito con una precisin muy elevada.
Aunque la espectrome tra df' masas CMS) se ha utili:t.auo
durante muchos aos, no poda aplicarse a macromolculas
tales como las protems y los ridos nucleicos. Las medidas
de m/z se realizan sobre molculas en fase gaseosa y la C<1 Iefaccin u olros tratamientos necesarios para llevar Wla mac romolcula a la fase gaseosa causa ban normalmente su
rpida descomposicin. En 1988) se desarrollaron dos tcnicas diferentes para superar este problrma. En una de ellas)
las protenas se colocan dcntro de W1a matriz que puede absorber luz. Con W1 pulso corlo de luz de lser, las proteinas
S(~ ionizan y a continuacin se desorben de la mar riz hacia el
sistema de vaco. Este proccso, conocido como esp ecuome tra de masas de desorcinlionizac i n po r lse r
as istida por matriz o MALD ' MS, se ha utilizado con
xito para medir la masa de una gran variedad de maeromolculas. En 1m segundo proceso, que da los mismos bu ('nos
resultados, las macromol cuJas en diso lucin so n forladas a
pasar de la fase liquida a la fase gas directamente. Una solucin de analitos se hace pasar a t ravs de una aguja ca rgada
que se mantiene a un elevado potencial elctrico, dispersando la solucin en una fina niebla de microgol.;'lS cargadas.
El disolvf'nte que rodea las macromolculas se ('vapora rpidamente y los iones co n mltiples cargas resultantes se
int roduccn de esta fonna en la fase gas de manC'ra no destructiva. Esta tcnica sr denomina eSllectrome tra d e
masas de ionizacin por e lectros pray, O ES J MS. Los
protones aadidos durante el paso a travs de la aguja proporciollan carga adiciona l a la macromo lcula. l..a l1VZ de la
molcula pucde analizarse en la cmara de vaco.
L.::'} MS proporciona una gran cantidad de in fo rmacin
para la investigacin en protemk:a, enzimologa y qumica de
las prote1as en general. Las tcnicas requieren solamente
cantidades minsculas de muestra, de fonna que pueden apli carse fcilmellte a las pequeas cantidades de prote\a que
pueden f":\traerse de un gel electrofortico bidimensional. La
precisa determinacin dc la masa molecular de li la protela
es uno de los parrneLros crLicos para su identificacin. Una
vez Que se conoce con precisin la masa de W1a protena, la
MS es un mtodo conveniente y preciSO para detectar cambios de masa debidos a la presencia de cofaclores unidos, iones metlicos unidos, modificaciones covalentes, elc.

BIOQuMICA PRCTICA
El proceso para determinar la masa molecular dE' una
protefw.l med iante ESI MS sr ilustra e n la F'igura 1. Al ser
inyC'ctada cn la fase gas, una protena adquiere 1In nmero
variable de proLones, y por t...'lnt.o de cargas positivas, del rusolvcnl"c. ~sto crea un es pectro de especies con diff'rcntcs
relaciones masa-carga. Cada pico sucesivo corresponde a
una especie que se derencia del pico contiguo P OI' una dife-

Capilar

Solucin

de vidrio de muestra

Alto
voltaje

Interfaz
de vaco
(a)

47.342

100

50+

>

'"

1!

".;
"o

50

al

47.000

40+

75

50

100

48.000
MT

30+

.::
25

~U

800

\~
1000

,
1200

1400

II

I
I

1600

miz
(b )

FIGURA 1 Espect ro de masas por eleclrospray de una prote na .

(a) Una solucin de protena se dispersa en microgolas fuertemente
cargadas medianle el pClSO a Iravs de una aguja bajo 1<1 influencia
de un campo elctrico de allo voltaje. l as microgotas se evaporan y
los iO nL"5 (en este caso con protones adicionados) en tran en el e5pectrmClro de masas para medir mIz. FI espectro generado (b) es
una familia de picos, en la que cada pico sucesivo (de derecha a izquierda) corresx:mde a una especie cargada aumentada en I tanto
en masa como e n carga. En e l inserto se muestra una transformacin de esle espa.1ro generada por ordenador.

3.4

renda ele ca rga de 1 y una diferencia de masa de 1 (1 pro

ln). La masa de la protela puede determinarse a partir de
cualquier par de picos contiguos. La miz medida para un
pico es
(mlzh =

M + nzx

donde M es la masa de la protena, n2 es el nLunero de car

gas y X es la masa de los gnlpos aadidos (en este caso protones). De modo similar, para el pico contiguo,
M
(mJz) , =

+ (n , +
/l.2 + 1

1)X

Te nemos ahora dos incgnitas CM y 11,2) Y dos ecuaciones.

Podemos resolverlas primero pa ra n2 Y despus para M:

n, =

(miz), - X
(mJz), - (miz),

Estructura covalente de las protenas

103

mente un valor de M incluso ms preciso. 8xisten algoritmos de ordenador que transforman el especlro de miz en un
pico nico que proporciona tambin una medida de la masa
In.uy precisa (Pig. lb, inserto).
La espectrometra de masas puede utilizarse tambin
para secue ncia r segmentos cortos de un polipptido, un a
aplicacin que se ha establecido como una lterrarnienk1. muy
valiosa para la identificacin rp ida de protenas desconocidas. La informacin secuencial se extrae ulilil.ando una tcnica denominada MS en tndem, o MSIMS. Una disolucin
que contiene la protena que se est investigando se trata en
primer lugar con lma prol.easa o un reactivo qunico para reduci.rla por rotu ra hidrolitica a una mezcla ele pptidos ms
cortos. La mezcla se inyecta enLOnces en un dispositivo que
consiste ese ncialmente en dos espectrmetros de masas en
tndem (Fig. 2a, arriba). En el primero de ellos se separa la
mezcla de pptidos y los fragmentos ionizados se manipulan

(coulina en la pgina siguiente)

M = n2 [(miz), - Xl

Este clculo que utiliza los valores de miz para cualquier par de
picos de un espectro como el que se muestra en la Figura ] b
proporcionar normalm ente la masa de la protela (en este
caso, aerolisi na k; 47.342 Da) con un error de solamente
O,O I %. Generando varios COlUWltOS de picos, repitiendo el
clculo y promediando los resultados, se obtie ne general-

MS- l

1'\lT8-2

~:::.=..:=----.

D etector

J@)

,--~J
lon izaci6n por Separacin Fragmentacin
clectrospray

FIGURA 2 Obtencin de informacin secuencial de una protena

O~

por espectrometra de masas en tndem. (a) Tras hidrli sis p roteol-

R' O
I 11
H
H R'
I 11
II. N-C-C-N -C-C-N-C -C
:.'.
H
H
I
11
H

tica, una solucin de protena se i nyecta en un especl rmetro de

masas (MS-l l. l os diferentes pptidos se separa n de manera que

R2 O

slo se selecciona uno para su anlisis posterior. El ppt ido seleccio-

H
H R'
I
-90
N-C-C-N-C-C
H I
IJ
H
' 0Rol O
Y

nado se fragmenta de nuevo en una cmara entre los dos espectrmetros de masas y se mide miz pa ra ca da fragmento en el segun do
espectrmetro de masas (MS-2). Muchos de los iones gener;;dos du-

Rl

11

11

HN -C-C -N-C - C- N-C-C-

11

rante esta segunda fragmentac in resultan de la ro tura del enlace

He.

Ha O

11

H
H I
~O
-N-C-C-N-C-C

R' O

I 11
R' O

peptdico, en la forma most rada. Estos iones se denomi nan iones

tipo b o tipo y, dependiendo de si la carga se mantiene en el lado

(a )

ami no- o carboxiJo-term ina l, respectivamen te. (b) Un espectro tpico con picos que representan los fragmen tos peptdicos generados
a partir de una muestra de un pptido pequeo (10 residuos). los
picos marcados son iones l ipa y. El pico alto cercano a y50 es un
ion con ca rga dob le

y no es parte del conj unto y. los picos sucesi-

vos difieren en la masa de un determinado aminocido del pptido

original. En este caso, la secuencia deducida fue Phe-Pro-Gly-Gl n(llelleul-Asn-Ala-Asp-(l le/Leul-Arg. Obsrvese la ambigedad entre
los residuos de Ile y l eu, puesto que tienen la misma masa molecular. En este ejemplo, el co njunto de picos p rocedente de iones de

tipo y predomi na y como resu ltado el espect ro queda muy simplifi cado. Esto es debido a que existe un res iduo de Arg en el extremo

100

y,"

75

>

.~

ya"

- 50

".

o 25
~

Yo

y,

"O

y "

II.U:.L,
200

.~3
400

"Ir I:
600
miz

carboxilo-terrn inal del pptido y la mayora de las ca rgas positivas

quedan retenidas en este residuo.

(b )

800

1000

'0-

104

Captulo 3

,Am inocidos, pptidos y protenas

RECUADRO 3 - 2

BIOQuMICA PRCTICA (continuacin de la pgina anterior)

de fOlma que slo uno de los diversos tipos de pptidos p roducidos por la fra gmentacin sale por e l otro ex lremo. La
mu estra del p ptid o seleccionado , cuyas molculas tie nen
todas carga en alg n PWllO de su longi tud , viaja elltonces a
travs d e w la cmara de vado entre los dos espectl'metros
d e masas. En esta cmara de coUs in, el pptido vu elve a
fragrneJllarse por impa cto de elevada enC'rga con un "ga::; de
colisin", una peq uena cantidad de tUl gas noble tal como el
heti o o el argn qUf' se deja enuar en la cmara de vaco. Este
procedi miento est disefmdo para fragmentar nuchas de las
molculas de pptido de la muestra , siendo en promedio cada
pptido individual Fragmentado slo en un sitio. La mayor
parle de las fragmentaciones se dan en los enJaces pep! d icoso Esta fragmentacin no irnplica la adi cin d e agua (se
Ilf'Ya a cabo casi el I el vacfo) de fonna que los productos pueden inclui r iones radicales moleculares tales como radicales
ca rbonilo (Fig. 2a, abaja). La carga del pptido OJiginal es relenida por uno de los fmgmentos generados a parLir de ste.
El seg ulldo espectr6rnctro d e masa ~ mide enton ces las
relaciones mIz de todos los fragmen tos cargados (los fragmentos sin carga no se d etect.an ). Esto genera uno o ms
conj untos d e picos. Uno de los conjtmtos de picos ( Fig. 2b)
cons is te en todos los fragmentos cargados que se han gellerad a mediante la rotura del mismo tipo de enlace (pero e n
pun tos di Ferentes del pptido) y proceden de la rotu ra del
enlace en el mismo lado, sea el carboxilo ~te lTnil1 al o el aminote rminal. Cada piCO sucesivo en un conjWllO d eterminado
t iene WI aminocido menos que el pico ante rior. La Clifel'eHda de masa el e pico a pico identifica el amin ocido que se ha
percUdo en cada caso, revelando as la secuencia del pptido.
Las nicas ambigedades implican la leucina y la isoleuci na ,
que tie nen la misma masa.

Pueden slntetlzarse qumicamente pptidos

y protenas pequeas

La carga del pptido p uede pennaneccr en e l fragmento

carboxilo- te n ninal o en e l ami no-ternnal, y pueden rom pe rse otros e nla ces adems de los pepldicos en el proceso
de fragme ntct cin, lo Qu e da corno res ultado que se generen
mltipl es conj untos de picos. Los dos conjW1tos pred ominantes consisten generalmente en los fragme ntos cargados
que proced en de la rotura d e los enlaces pcptdicos. El co njunto fonnado por los fragm emos carboxilo-terminales puede
distinguirse sin ambigedad del fom13do por los fragrnentos
anuno-terminales. Dad o que las roturas d e enlace generadas
entre los espectrmelros (en la cmara d e COlisin) no producen grup05 carboxi lo y amino completos en los puntos de
rotura, los nicos grupos a -ami no y a-ca rboxilo imactos en
los rragmentos peptfelicos son los de los extremos (Fig . 2a).
Los d os conjuntos de fragmentos pued en as id entifi carse
gracias a s us peq uefms dife rencias d e masa res ul tan tes. Le'l
secuencia de ami nocidos obtenida a part ir d e un conj wlto
pu ed e confi rmarse a partir de l otro, mejorando as la conHauza en la informacin secuencial obtenida.
Incluso una secuencia con;'1 es a menudo suficiente para
pe nnitir la asociacin de W1a protE:!-.a con su gen sin ambigedades, si la secuencia riel gen es co nocida. La secuenciacin
mediante espectrometra de masas no puede ree mplaza r el
procewntiento de d egrada cin d e Edman para la sC'cuenciacin de polipptidos largos, pero ('s ideal para la in vestigacin
prote6mica rliligida a catalogar los cientos de protcfnas celulares Que pueden separarse en W1 gel bidimens ional. En las prximas dcadas, se dispo ndr de datos df' secuencia genmica
detallada de cientos, y en ltimo tnuino nliles, de organismos.
La capacidad de asociar rpidamente protenas con genes utilizando la e::;pectromct lia de masas facilhar en0n11ementc la
explOk'lcin de esta extraordina!ia fuente de iJo!"lllJcin.

para pptido::; de ms rlf' 4 o [) aminocidos. Un problema J'esioC' e n la dilicuJtad de pudfkar f'1 producto desp us de carla
paso.

Mu('hos pptidos son potencialmente tiles como ageJ1[es

fa rmacolgicos, por lo qu e s u prodUCCin ("s de impo rtancia
comercial cons iderable. Ex isten tres mane ra de obtene r un
pptido: ( 1) por purificacin a partir del tejido, tarea a menud o dific ultada por las concentJ'a ciOl les extremadamf'nte pequenas de algunos p ~ ptid os; (2) medianlf' ingenie ra gentica
(CaptuJo 9); o (3) por s lll.csis qumica dirE:!cta. Gracias al desarrollo de tcnicas potentes, la snt.f'sis qumica directa es actualmente wla opcin atra ctiva en ltIucllos casos. Ade ms ele
las apli caciones comerciales, la sntesis de secuencias espC'cficas de pptidos procedentes de protenas ms grandes constituye \Ina herramienta cada vez ms importante para el esturlio
de la estructu ra y funcin de protelas.
Debido a la complej idad de las pro tenas, las f'SI rategias
s inl,~ti cas tradi cionales de la qumica orgn ica 110 son prcl ieas

~j l principal avance en eSla lf'cn ologa fue protagonizado

por R. Bruce r\!lerri fi ("ld ('n I !J62. Su uUlovacin implica ba la
sntesis de un p ~ p tid o qUE:! se mantena IIn ido por un extremo a
WI ::;oporte sli do. El soporte es WI polmero insolu ble (resin a)
contenido demro de w la column;, si milar a las utiliwdas en los
procedi.mielllos crom<l t ogrficos. El pptido se construye sobre
estf' soporte, adiciollkllllio aminocido a ami.nocido y uti li ZHJldo Wl conjllnto estndar de reaccionf's que siguen W1 ciclo
repetitivo (F'ig. 3-29). r.n cada paso sucesivo del ricio, grupos
qum iCOS protectores bloquean las reacciones no deseadas.
l::n la jctualidad, la tf'cnologfa pa ra la sltesis qum ic.:'l de
ppl.idos se ha automatizado . Al igual que en las reacciones df'
secuen ciaci lI ya consideradas, la limitacin ms importante
d!'1 proceso estriba e n la pfi cic ncia el e cada ciclo qumi co, tal
como puerlf' \('I"se al calcular los rendimif'ntos globales de pp-

3.4

l id os de difere ntes longitud es cuando el rendil1lieJlLO por adicin de cada nuevo aminocido es de 96,0% en lugar de 99,8 %
(Tabla 3-8) . I,a reaccin ulc.;ompleta en un paso pLl~ d e llevar a
la fo rmacin de ulia irnpureza (en forma de un ppticlo ms
corto) en el siguient.C'. Los proc.;edinuentos qumi cos se han op-

tunizaclo hasta permitir ia sntesis de protenas de una longitud de 100 res id uos anunocidos en u nos pocos das con un
rendimienlO razonabl('. Sr' ut.iliza un enfoq ue muy similar en la

sntesis de cidos nudeicos (vase 'g. 8-38). Vale la pena resait.ar que esta tecnologa, an siendo uupres ionante, cmpali-

Las reacciones (f) a @ son necesarias para la formacin de cada enlace pcptdico.
[ 1grupo 9-f1uorenil melox ica rbonilo (Fmoc) (sombreado en azul) impide reacciones

1
11
11
CH - O- C- N- CH- C- O2
1
H

""'"

105

AGURA 3-29 Sntesis qumica de un pptido sobre un sOIJOrle polimrico insoluble.

R'

-"""

Estructura covalente de las protenas

no deseadas del grupo Q'-amino del resid uo (s oml")((~ aclo en rojo). La srntes is qumica
transcurre desde el extremo carboxilo-Ierminal al extremo ami no-term ina l,

,/

la direccin inversa a la di reccin de 1<1 sn ll..'sis proteica in vivo (Captu lo 27).

Residuo
aminocido

Fmoc

-0--0

CI- CH2

R'

Aminocido 1 con el grupo

a-amino protegi do
por u n grupo Fmoc

N-6H-~-O-

Fmoc

de la resina

Fmoc

11

- N- CH- C- O-

o-NC~N-o

El aminocido 2
con el grupo
o-amino protegido
es activado en IIU
grupo cnrboxiln
por la DCC.

Di ciclohexilcurbodiimida

(DCC)

R2
Fmoc

-N-6H-~-O-CH,-0-\) .-
-

Fmoc

R'

- N- 6 H

R'

11

El grupo protector 1.'11 eliminado

por tratam ie nto con unu d rl!olucI6n
que contiene uno bUl:IC nrgnica dbil.

H3 N- CH- C- O-CH 2

El grupo a-ami no dcl urni nncido I

ataca e l grupo cnr boxr ln activad o
del aminocido 2 punl formar un
enlace peptidico.

O- C
11

O~-~-~-O
H
H

Subproducto dicicl() h ~x.ilul"ca

R1

-N-6H-~-N-H-~-O-CH,~ --

F'moc

\,,~

1-1
HF

R'
+

R'

1I

O
1I

H 3 N- CH- C- N- CH- C- OR. Bruce Merrifield

de

policstireno

Unin del urn ino:\cido carbox(oterminal (l un grupo rcud ivo

R'

Partculu
i nsol uble

El pptido completo
..e desprotege como
en In reacci6n
el 1I F
ludroliza e l enlace ster
entre e l pptido y la resina

+ F- C H 2~

0:

"

'''''"''

106

Captulo 3

Ami nocidos, pptldos y protenas

TABLA 3- 8 Efecto del rendimiento de cada paso

sobre el rendimiento global en la sntesis de pptidos

Nmero de residuos en
el polipptido final

11

21
31
51

100

Rendimiento global
del pptido final (%) cuando
el rendimiento de cada paso es:
96,0%

99,8%

66
44
29

98
96
94
90
82

13
1,7

dece al compararla con los procesos biolgicos. La mis ma protena de 100 aminocidos se ra sintetizada eDil ulla firl f'lirlao
exquisiLa en unos f> s('gundos po r una clula bacterialla.
Diversos mtodos nuevos para la li~aci 6 n f'fk ipnl,f' dp
pptidos han hecho posible la combinacin de pptidus sintticos para formar protelas mayores. Con estos mtodos pueden crearse nuevas fo rmas de protenas con grupos qumicos
situados de manera precisa, incluyendo aquellas qu~ PU~d~ ll
no e nco ntrarse fcilmell te en las protenas ('elularf's. Estas
nuevas formas proporrionan nuevas man eras de ensayar teoras sobre cat.lisis enzimlica, de crear protenas con nUf'VlS
propiedades qumi cas y de disear sec uelll:ias pro t.~ i cas que
se plieguen en de terminadas est ructmas. ESI-a ltima apli cacin proporciona la prueba definitiva pa ra nues tra creciente
capacidad de relacionar la estructura primaria de un pptido
con la estructura tridime nsional que adopta en diso lll rin.

La secuencia de aminocidos proporciona

informacin bioqumica importante
F~l conocimiento de la secuencia de aminocidos de lUla protena puede proporcionar dato~ acerca de s u estructura tridimensional y fUIH..:i n, s u localizaci n cplular y su evo lu cin.
Gran parte d(' ('stas deducciones provienen de la bsqueda de
si rnHitud es COIl olras secuencias cono<'idas. Sf' ('onoc(' n act.ualmente milf's de secuencias que estn d is ponibles en bancos de dat.os acc~s ibl es a travs df' inlf'rnf't . La comparacin
dc una secuencia recin obtenida COIl est~ gnm vaneo de secuencias alrnacpnadas r('ve la a menudo rela ciones que pueden
ser a la vez sorprenclelltes e iluminadoras.
No se conocc con deta lle el modo en que la sec uencia de
aminocidos determuw la es tructura tridimensional , ni pllf'd r
predeCirse siempre la funcin a P:utu de la s~c u ~lH..: ia . SUl embargo, existen familias de protf'nas qll(' Tienen algunas caracterstk as estructurales y fun cio nal es coltlpanidas qu~ pu ed~ ll
identificarse rpidamente sobre la base df' la similitud df' las
ser;uen<'ias de aminocidos. Las protelas uu.viduales se asignan a fWllilias PII funcin del grado de similitud de su secuencia
de aminocidos. Los miembros de una familia son SPlleralmentf' idntir;os en un 25% o ms de s us sec uencias y las protenas de es tas familias suelen compan ir, al menos, algunas

ca m.r:tf'rfsti cns C'stru cturales y funcionales. No obstaute, aIguHas familias se cle finf'n por df'nt ioades que implican solamente
a un pequei\o nmero de residuos aminocidos que son ctr;os
para algw la fwcin. Diversas subf'stl1lctmas similar('s (que se
dr finirn como "dominios" en el Captulo 4) se llallall presentes
eH 1II111..: has proLe nas no relacionadas fun cio na lmente. ~ stos
domi nios se pliegan a me nudo daHdo co nfiguraciones estm eIll ral('s qllC' tienen un grado de estabilidad excepc..:iollal o que
estn especializadas para lUl de terminado entamo. OC' las simjlillldf's ('S I nlct.urales y func ionales dent.ro de las familias de
prte las es J,>osible deducir tambin relaciones evo lutivas.
Cir r1 s secue ncias de aminocidos sU'ven con frecuencia
de seal qUf' oel rrmina Jl loca li 7..'lci6n ce lular, la modillcacill
qu(rnica y la vida media d ~ W ia prolela. Secuencias sef'tal especiales, nonnalmf'ntf' sitnarlas ('n el extremo amino, son utilizadas para di rigir ciertas prote tas ha cia la exportacin
exuace lu lar, mi f' nl ras <111f' otras protcfnas son d irigidas pa ra
su dist ribuciu hada el n deo, la s uperficie celu lar, f'1 citoso l
y 01 ras localizarion('s c('11113r(>s. Ot ras secuencias actan como
sitio d~ all daj ~ para grupos prostticos, tales como los gnlpos
3ztJcar en las glu coprotdnas y los lpidos en las poprotenas.
Algunas de f's tas sf'alf's f'st n hif'!l caracteri7..adas y son reconocidas f.k illll elll~ si se presel11 an en la secuencia de una protena recin descubierta (Captulo 27).

RESUMEN 3,4 Estructura covalente de protenas

Las d ifrrf'ncias ('n la funci n proteica son el resultado

de diferencias en la secuencia y en la composicin de
aminocidos. Para una determinada protena se
permiten alguJlas variaciolles ~ lIla secuencia sin
qll(' la fun cin se vea a l"ecl<'lda.

Las secuencias de aminocidos se deducen a parLir de

la fragmf' ntacin de los polipptidos en pptidos ms
pequef'los mediante el uso de reactivos es pecficos
para ciert.o tipo elr enla('f's peptrlicos, seguida por la
determinacin de la secuencia de cada fragme nto
mediante degradacin automtica ele Edman y por
la ordenacin de la secuencia filial mediant.e la
localizacin dI"' zonas ele solapamiento entre
fragmenLos ge n~ rados po r reactivos diferentes.
Tambit'>n es pOSible dedu cir la secuencia el e las
prolelli,l a parl ir de la sf'cue ncia dE' nUc!f'tid os
el e s u gen curr~spo n d i~ lIte en el DNA.

Es po::;ible SUlt.elizar qu l li caJll elll~ pptido::; y

prOTf'nas pl"'<1l1f'fias (dI"' hasta lOO residuos
aminocidos). El pptido se construye, residuo a
rC'sid uo, mie nl ras permanece unido a Wl soporte
slido.

3.5 Secuencias de protenas y evolucin

La sencilla cadena de letr.:ts que denota la secuencia de aminocidos de una protena determinada no reOeja la gran cantidad
de iIlfonnacin co ntenida en d icha Sf'Cll r nria. Uno de los prin
ci pa lcs empei'los de los bioqumicos ha sido el desarrollo de

3.5

mtodos cada vez ms poteates para la extraccin de informacin a pa rtir del cada vez mayor nmero de secuencias disponibles. La flrncin de todas las protenas reside en su estructu ra
tridimensional que, por su parte, viene determinada en gran
meclida por su estructura primaria. De este modo, la informacin dedu cible de wm ::;ecuencia proteica slo es t lillutada
por nuestro grado de com prensin de los principios estructurales y funcionales. Desde otra perspecLiva, las secuencias de
protenas estn empezando a aportar datos acerca de la evol ucin de las propias prol"enas y, en ltimo trmino, de la evolucin de la vida en el planeta.

las secuencias de protenas permiten deducir

la historia de la vida en la Tierra
La paternidad del campo de la evol ucin molecular se suele
adjudicar a Emile Zuckerka.lldl y Linus Pauling, cuyos trabajos
de mediados de la dcada dc 1960 fue ron pioneros ell el uso
J e secuencias de nucletid os y protenas para el estudio de la
evo lucin. El punt.o de par tida es engailosamente simple: si
dos organ ismos estn estrec hamente empmcntados, las sccuencias de sus genes y protenas deberan ser muy similares;
las secuC'ncias ::iQn cada vez ms dive rgentes al a umentar la
distancia evolutiva entre dos organismos. Este punto de vista
elnpez a da r sus frutos e n los aflos setenta, cuando Cad \Voese utiliz sec uencias d E' RNA ri bosmico para definir las arquebact.el'ias como un gr upo de organismos distint.os de ot ra.<;
bacterias y de los eucariotas (vase Fig. 1-4). Las secuencias
de protenas ofrecen la opo rtun idad de reftnar mu chsimo la
info rmacin dis ponible. Gracias a los proyectos genoma que
investi gan o rganismos que abarcan de bacterias a humanos,
el nmero de secuencias disponibles crece a una velocidad
enorme. Esta informacin sirve para trazar la historia biolgica; el reto consisl.e en aprender a leer el jeroglfico gentico.
La pvolucin no ha Lomado un camino lineal simple. En
cualquier inte nto de extraer la informacin evolutiva contenida en secue ncias de protena::; abu ndan las com plejidades.
Los resid uos aminocidos esenciales para la actividad de una
determi nada protena se conservan a lo largo del tie mpo evolutivo. Aquellos resid uos menos importantes para la funcin
pueden sufr ir ciertas va riaciones -es decir, puede haber sustituciones de aminocicJos- y estas va riaciones pueden proporciollar la infonnacin ne cesaria pa ra trazar el camin o
evolutivo. Si.n embargo, las sustituciones de aminocidos no se
produce n siempre de forma aleatoria. En cjc rt~'ls posiciones dC'
la estruc tllra primaria, la necesidad de manLener la funcin
puede implicar que tan slo sean tolerables alglUlas S11Slituciones particlllares tle anunodclos. Algunas protena~ tie nen mayor nme ro de rf'sid u o~ (l(nmociclos variables que otras. Por

Secuencias de protenas y evolucin

107

sta y otras razones, las protemas pueden evo luciona r a velocidarles distintas.
Otro fac tor que compli ca la deduccin de la historia evolutiva es la poco I'recuente transferencia de Wl gen o glllpo de
ge nes de lUl organi slIlo a otro, segn Wl proceso que se denoHuna transferencia gnica late ral. Los genes transferidos
pueden se r bast.ante sirnilares a los genes de los que procedan en los organismos de partida, mie nt ras que la mayor
parte de los dems genes de los mismos dos organi smos pueden tener relaciones evolutivas muy distantes. Un ejemplo de
tra nsferencia gnica lateral se encuen tra en la reciente rpida
ex tensin de ge nes de resistencia a los antibiti cos eJLtre las
poblaciones bacterianas. Las protenas procedentes de estos
genes tl'ansfetidos no seran buenos candida tos para el estudio
de la evolucin bacte riana porque compart.en tan slo una histori a evol utiva muy limiLadlJ co n sus orgarusll1os "husped".
El estudio de la evolu cin molet:u1al' suele centrarse generalmen te en familias de pl'Otelas estrecharneJ lte relacionadas.
En la mayora de los casos, las fa milias escogidas tienen fWlcioHes esenciales en el metabolismo celular qlle debieron de estar
present.es en la clulas viables ms primitivas, reduciendo de
este modo la pOSibilidad de que hubieran sido introducidas recientemente por transfe rencia gnica laleral. Por ejemplo, una
protena denominada 1:; 1<'-la es t implicada en la sntesis de
protenas en todos los eucariotas. En bacteri.as se encuent ra
otra protefna similar, EF-Tu, con la misma funcin. Las similitudes en secuencia y funcin indican que EF-l a y EF-'I\I son
miembros de una familia de protenas que comparten UII ancestro comn. Los miemb ros de las familias de prolelas son
protenas homlogas u hom logos. Se puede refi nar ms el
concepto de homlogo. Si dos proLelas de ulla misma familia
se encuentran en la misma especie, nos referirnos a ellos como
IJarlogos. Los homlogos de especies diferentes se denominan ortlogos (vase "lg. 1-37). El proceso de reconstruccin
de la evolucin implica la previa identificacin de familias adecuadas de protemas homlogas para tl sarlas a continuacin (' 11
la recoJlslruccin de los carninas pvolutivos.
Los homlogos se identificall utilizando programas dI"' orde nador cada vez ms potentes que son capaces de comparar
directamente dos o ms secuencias seleccionadas o de buscar
en vo IUln.i..nosas bases de datos para encontrar parientes evolutivos de Wla secuencia seleccionada. El proceso de bsqueda
elec trnica puede imaginarse corn o el deslizamie nto de 1Ina
secuencia sob rC' otra hasta que se encuentra el mejor apareamiento. En el alineami('nto secuencial se asigna un valor positivo a cada posicin en la qu e los resid uos aminocidos son
idnticos -estos valores varian de W t programa a otro-, lo que
proporciona una medida de la calidad del alineamiento. El procedimient.o no est exento de complicacio nC's. En algunos ca-

E. coli T GNR T I AV YDLGGGT PO I SI l E 1 DEVOGE KTF EV LA T NGO TH LGG E DFD S RL I HY L

B. subtilis DEOQ T ILL YDLGGGTFD VSI L EL GDG

TFEV RS T AGO NR LGG OOFD QVI I DH L

L-.J
Hueco
AGURA 3-30 Alineamiento de secuencias proteicas con el uso de
huecos. Se u,!uestra aqu el alineami en to de secuencias de una corta
seccin de la protena EF-Tu de dos especies baclcri;:m as, E. coli y Ba-

cillus subtilis. l a introduccin ele un hueco en 1<1 secuencia de 8. subOlis permite un mejor al ineamiento de lo~ residuos aminocidos a ambos lados del hueco. los am inoJcidos idnticos est.: n sombreados.

Capitulo 3

108

Aminocidos, pptidos y proten as

sos las protelils comparadas ~e aparean bien, por ejemplo, 1"11

dos segmentos secuenciaks, mientras que estos sl"gmentos e~
tn coneclados por secuencias menos relacionadas y de longitudes diferentes. Por t.anto, lo~ dos segmentos coi.ncidentes no
pueden ser al.i neados al mismo tiempo. Para salvar I"sle 0 1)51,.::1culo, el programa informtico iUlroduce '"huccos' en lUla de las
secue ncias para volver a coloca r los segm ell t.os aparl"<l bles en
regist.ro ( Fig. ~-30). Como es nat.ural, prcticament.e todos los
posib les pares de secuencias podra n se r alin eados de alguna
forma si se introdujera W I ntlmf' ro de huecos suficie ntl". Para
evitar alineamientos no informat.ivos, los programas incluyen
penalizaciones para cada hlleco introducido, lo que di.sminuye
el vaJor o la puntllacin del alineamiento global. A travs de II n
proceso de ellsayo y ('rrol' electrnico el programa selecciolli:.l
el alineami'nfo con la pWltuacin ptima que muximi7.a I"lnmero de resid uos am inoflc idos idllticos, a l ti' mpo que nnimi:t.a la inlrod11('cin de huecos.
I.os amino{lcidos icl 'nticos resul lan a mpnlldo inadecuados pa ra la identificacin de protenas relacio nadas o, ms
i.mporla nLe todava, para dete rminar cutin ce rcanas son las
prot'inas en WIU escala nc tiempo evo lutiva. L.a conside racin
de las propiedades Qumicas dp los aminocidos slIslituirlos
permite es tablecer 1111 i1nlisis ms til . i\'l uchas de las susLiwdonf's dC' aminocidos obsf"rvadas en una familia df" protdnas
pueden ser df' lipa conservador es dec ir. aquellas en las qUf'

A
Ala
A

4
e

e
ey.
O
9
D

D
A !:lp

-2
-3
6
E

E
Glu
- 1

-.

2
5

F
Phc
2
-2
3
-3
6
G

G
Gly
O

Hi s
-2
-3

- 1

- 1

2
-3
6
H

O
- ]

-2
8

II e
-1
- 1
-3
-3
O

un residuo nminocido est reemplaz..1.do por otro t:on propied<ld es qumj t:as similarf's~. Por ejemplo, un res idu o de GIl!
puede s ustituir en una proten a UIl O de Asp ellcoll trado en
ot ra pro tena de la misma familia; runbos amin ocidos est n
t:argarl os J1C'gativ3Illellle. Esta sustitucin cOllservadora debe
obtener lgicameme' una mayor PlUlt.uucin en e l aJineamieuLo
fi lial flt1e' otra de tipo n u cOllsf'rvad or, ta l corno 1<:1 s ustitucin
de W I residu o oC' As)) por Wl re~ iduo hid rofbico de Phe.
Para dete nrnar flIIP pun tuaciones asignar a todas las posibles sustituciones de amino;kidos, Stevr!1 Henikoff y Jorja Heniko f!" exarnillaron los alill C'a mientos de LUI amplio nme ro de
prot.enas di lerentes. No anal.i7.amn secllcncias ent.eras sino que
se concenlraron en miles de bloq ues corlos conservados en los
flU ' la fraccin de 31l1inoftcidos id nticos era alt.a y los alineamientos eran por tanto fia bles. Observand o los bloques secuencia l ('~ alineados, los Henikoff ana li7.aron aquellos aminocidos
no idlllicos. Adjlloicaron mayores punt.uaciones a las sLlstitucio!lrs no id nticas que aparf'can con mayor fret:uencia que a
las que lo hacan ms raramel lte. Ind llso los residuos idnticos
recibieroll valores difr)"emes en vir tud de su frecuencia de susti lucin, de modo que aqullos ron propiedades qumicas ni cas (Cys y Trp) rrcibfan punluadones mayores que los Que
('n1 n sustituidus de mane ra ms co nservadora (como por ejemplo en f'1 ('aso de Asp y Glu). El result..1.do de este sistema de
puntuacin es una ra hla Hlosum (blocks subs titut ion 111,a tri.x

K
Lys

L
Leu

-1
-3

- 1

- 1

-4

-3
-2

-3

- ]

'1
K

3
5
L

-.
1

O
4
-3
2
-2
4
M

M
Met
- 1
1

-3

N
Asn

-2
-3
1

P
Pro
1
-3
1

2
O

- ]

-3
2

-4
-2
-2

1
1

-3
O
-3
2
6
P

2
5
N

3
- 1

-3
-2
-2
7

Gln
- 1
3
O

Arg
- 1

2
-3
2
O
-3

2
O
O
- ]

5
R

-3
-2
O

-3
-2

S
Ser
1
- 1
O
O
- 2
O

T
Thr
O
- 1
1

- 1

- 1

2
-2
-2

-3
2
-2

-2

- 1

- 1
- 1

- 1
O
-2
1

-2
1

1
O
-1
4
T

- 1
1
1

5
V

Val

Trp
-3
2

O
- 1
-3
-2

-.
-3

y
1'yr
-2
-2
-3
-2

- 1

-3
-3
3
-2

-2
- 2
-3
-3
-2
-1
-4

-3
2

1
3
-2
-2
-3
-2
O
4
IV

-,

2
-3
-3
-2
-3

- 1
-2

-1
- 1
-2
- 3
- 1
- 2

-2
-2
- 1

11
Y

2
7

AGURA 3-31 La tabla Blosum62. Fsta tabla de sustituci n de bluques

se comparan (I. diago nal sombrcada desde la parte superior iz-

se crt.."() comparando miles de bloques cortos de secucncias illineadas

quierda hast<l la parte in ferior derccha de la ma triz) reciben valores

que eran idnti cas en al mcnos el 6:'Yo de sus residuos 'IIn i n (j,k i d()~. A
los resi duos no rdnficos se les as ignaron valores basados en la fre-

basJdos en 1.1 frccuend . con que so n reernpl altldos, de tal manera

fl ue 105 aminojcidos con propiedades qumic<ls ni cas (p . ej., Cys y

cuenci a con que era n reemplazados por cada tr rro de los o tros arn ino:it:idos . Cada sustit ut..i n contribu ye al valor que se da a un

Trp) reciben valores superiores (9 y 11, respectiva mentc) que los que
son rccrnp lr7i1dos mJs f.:'ci lmentc po r sust it uciones conservado ras Ip.

alineamiento pJrticular. l os nmeros positivos (sombreados (-!n amari-

ej., Asp (6) y Glu (5 ). M uchos programas info rm ticos utili za n Bl o-

llo) <e su man al valor de un alinea miento dado; los nmeros negati-

surn62 p<1ra asignar va lores a nuevos ali neam rentos de secucm..ias.

vos !oc rest<l n del valor. Los rc!o idum idnticos en las sccuc nt..ias que

3.5

Secuencias de protenas y evol ucin

109

Firma secuencial
Arquebaderias

Eucariotas
Bacteria gram-positiva
Bacteria gram-negativa

HalObOderiUm. halobium
Sulfolobus sulj"alaricus
Saccharomyces cereuisiae

H omo sa piel/.s

Badllus subtilis
Escherichia coli

IGHVD HGK S TMVG L LYET GSVPEHVIEQH

IGHVD H GK S T LVGR L LMDR G FID EKT~KEA
IGHVD S GK S T TTGH L IYKC GGIDK RTI EKF
IGHVD S GK S T TTGH L IYKC GGIDKRT I EKF
IGHVD HGK S T MVGR
I TTV
ITTV
IGHVD HGK TT LTAA

FIGURA 3-32 Una firma secuencia l en la familia de las protenas

que las secuencias de la s inserciones son muy distinta s para los dos

EF-la/ EF. Tu. La firma secuencial (enmarcada) es una in sercin de ' 2

grupos. la variaci n en 1<1 firma secuencial refleja la divergencia evo-

aminoc idos cerca del ex tremo arn ino de la secuencia. Los residuos

lutiva significativa que ha tenido lugar en este sitio desde que apare+

que se ali nean en todas las espec ies aparecen sombreados en amari-

ci por primera vez en un ancestro comn de ambos grupos.

llo. Tanto las arquebaclerias como los eucariolas tienen la firma, aun-

-tabla de sustitucin de bloques- ). La tab la de la Figura 3-3 1

se gener a partir de secuencias idnticas en al menos un 62%
de los res idu os, por lo que se conoce como Blos um62. Se han
generado tablas similares para bloques de secuencias homlogas que son idnticas en un 50% o en un 80%. Si se requieren
niveles mayores de identidad, es posible sobrerrepresentar las
sustituciones ms conservadoras, pero ello limita la utilidad de
la matriz en la identi ncacin de homlogos cuya relacin sea
algo distante. Se ha comprobado que la tabla Blos um62 proporciona los alineamie ntos ms fiables en LUla amplia gama de familias de protelas y es la tabla rutinariamente ms utilizada en
muchos programas ele alineami ento secuencial.
En la mayora de los mtodos de bsqueda de homologfas
y explo racin de relaciones evolutivas, las secuencias de protenas (obtenidas por secuenciacin directa de la protela O por
secuenciacin del DNA que la codifica) son superiores a las secuencias no gnicas de cidos nucleicos (las que no codifican
una protena o un RNA fun cional). Para un cido nucleico,
compuesto po r cuatro tipos de resid uos, lffi alineamiento al
azar de secue ncias no homlogas dar gene ralmente coin cidencias en al menos Wl 25% de las posiciones. La introduccin
de un limitado nmero de huecos puede aumentar fcilme nte
la fraccin de residuos coincidentes hasta el 40% o ms, con lo
que la probabilidad de obtener alineamientos de secuencias no
relacionadas aumenta mu cho. Los 20 arninocidos d iferentes
de las prote1as reducen considerablemente la probabilidad de
obtener alineamientos no informativos de este tipo.
Los programas usados para la generacin de alineamientos secuenciales se comple mentan con mtodos que
co mpru e ban la fiab il idad de esos alin eamientos. Un ensayo
compute rizado habitual consiste en desordenar la secuencia
de aminocidos de una de las protenas comparadas con el Fin
de obtene r una secuencia al azar para hacer que a continuacin el programa alinee la secuencia as "revuelta" con la otnt
secuencia no modificada. Se asignan puntuaciones al nu evo
alineam iento y se repite el proceso muchas veces. El alineamiento original obte nido antes del desordenamiento de una
de las secuencias debera tener una puntuacin signi ficaLi vamente mayor que la de cualquiera de los alineami entos hechos con secuencias al aza r; con ello, aumenta la confianza de
q ue el a lineamiento secuencial haya ide ntificado una pareja
de homlogos. Obsrvese que la ausencia de una pun tuacin
significativa para W1 determinado alineamiento no significa necesariam ente que no exista. una relacin evolu tiva entre dos
protelas. Tal como veremos en el Captulo 4, las si militudes

en estructura tri dimensioual ponen a veces de manifi esto rela ciones evolutivas en casos en los que la homologa secue ncial
ha sid o borrada con el paso del tiempo.
Para realizar estudios evo lutivos a partir tic LUla familia de
protenas es necesaria la idemificacin de miemb ros de esta
familia con fun ciones similares en la gama ms amplia posible
de organismos. La infor macin extrada de la familia de protenas puede usarse para trazar la evolu cin eJ (, esos organ.is mos.
A partir del anlisis de la divergencia secuencial en familias de
prot.enas seleccionadas es posible segrega r los organismos en
clases basadas en su relacin evolutiva. Esta infonnacin debe
ser comparable a la obtenida a partir de los exmenes clsicos
sobre la fisiologa y la bioqumica de estos organismos.
I~s posible ellcontrar cicrtos segmentos de la sccuencia de
Wla protela en organismos de un grupo ta.XOIlmiCO y no en
otros grupos; estos segmentos pueden lIsarse como firmas secuenciales de l gmpo eH el que se hallen. Un ejemplo de filma
secuencial es la insercin de 12 aminocidos cerca del ext.remo
N-terrninal en las protenas EF+la /EF_rl\1 en todas las ar quebacterias y en los eucariotas pero no en otros tipos de bacterias
( F'ig. 3-32). La firma secuencial es Wla de las muchas pruebas
bioqumica') que pueden ayud ar ~n el establecimiento de las relaciones evolutivas de eucariotas y arque bacterias. Por ejemplo,
los principales taxones bacterian os pueden dist.ingui rse mediante fu-mas secuenciales en varias protenas diferentes. Las
proteobacterias t3 y y tienen firmas secuenciales en las familias
de las proLenas I-lsp70 y DNA girasa (impl icadas, res pectivamente, en el plegamient.o de protenas y en la replicacin del
DNA) que no se hallan presentes en ningwla otra bacteria, inclujdas ot.ras proteobacterias. Los otros tipos de proleobacte rias
(0' 113, 6), jlmto con las protcobacterias t3 y 6, poseen \Ina firma
secuencial distinta en las Hsp70 y otra en la alanil-tRNA sin tetasa (un enzima de la sltesis de prot.elas) que no se e ncuentran en otras bacterias. La preseucia de firmas seeuellciales
nicas en las proteo bacterias f3 y y sugiere que las proteobact.enas a , 6 ye aparecieron antes que sus primas fj y y.
Tomando en conside rac in la totalidad de la secuencia de
una protena, los investigadores pueden ahora const.mir rboles evolutivos ms elaborados que incl uyan muchas es pecies
en cada grupo taxonnuco. La F'igma 3-33 presenta un rbol
de es te tipo para bacterias, basado en la d ivergencia !:iecuencial de la protena GroEL (present.e en todas las bacteri as y
que inlerviene en el proceso de plegamiento prot.eico). El rbol puede refi narse en virtud de las secue ncias de mltiples
protenas y mediante la adicin de datos sobre propiedades

110

Captulo 3

Aminocidos, pptidos y protenas

bioqumicas y fi siol gicas nicas de cad ;} especie. Existe un

gran nmero de mtodos para la generacin de rboles, cada
uno el e ellos con sus ventajas e inconvenieuLes, y muchas maneras de representar las relaciones evolutiva::; resultantes. En
la Figura 3-33 los puntos finales libres de las lnf'as reciben el
nombre de "nodos externos"; cada uno de ellos represenla lUla
especie existente, escrita a cOlllinuaci n. Los puntos de interseccin de dm; lneas, los "nodos inLernos", r epr('~r ntan
especiC'5 ancestrales extintas. En la mayor pa rte de representaciones (incluida la Fig. 3-33), las longitudes de las lnf'as qll('
coneNan los nodos 5011 proporcio nales al nm ero de s ustilUciones de aminocidos que separan Wla especie de 01 ra. Si podemos asimilar dos especies existe ntes a tUi Ilodo interno
comn (que representa el ancestro comn rtf' las dos especies), la 10ngiLud de la rama que conecta clnouo externo con
el intemo representa el nmero ele sustil urionC's de aminocidos que separa cada llIla de las especies existentes d I" S il a ncestro. La swna de las longitudes de rodos los segmentus lJue
conectan una especie existen te con otra a travs ele un ancestro comn refleja e l nmero de sustituciones que separa la~
dos espC'cies. El rbol debe calibrarse a Ir:W(>5 elC' la comparacin co n informaciones sobre e l regist ro fsil y otras fuentes
con ('1 fin de determinar el tiempo n('c('~nrio para la dive rgencia de las diferC'ntes especies.
Al ir disponiendo progresivamC'nte de mayor informacill
secuencial en las bases ele datos podemos generar rholC's ('1,10lutivos basados en una vari{'dad de prorelas diferentes. AIgu-

C}[amydia /r(J.clwmalu
.
[
Chlamydw pllitlacI
[ PDrph)'romDnnll ginl!iooli,

nar-; protenas evolucionan m:ls rpido que OLras o cambian rns

rpido en un gfllpO de especies que en olro. Una protena de
gran tamafto, con murhos rC'siduos variables, puede presC'ntar
algunas diferrllcias incluso eal re UDS especies {'sI rcehamcnte
relacionadas. Otra protC'na ms pequea puede ser idntica a l
rom parar las mismas dos especi"s. Exist('n mu chas razoues
jJ1:lra qUE:' algllnos ele los detalles de un rbol evolutivo basado
en las secuencias de \lna protena d ifieran de lo~ de un Mbol
basado C'n las secuencias de otra protena. El perfcccionamiento ele los a nlisis InE:'rtiantp. ('1 uso de secuencias de muchas prol C'nas diJerentes puede proporcionar \Ina imagcn muy
detallada y exacta de las fplaeiones evolutivas. ste es w \ proceso en marcha en el que las p regllnt.as Que se formulan SOl1
[wldamenLalps para rlC'tinir la fo rma en que los se res humanos
SC' contcmplan a s mismos y conlemplan cl mundo que les rodea. El campo rI" la {'volucin mol cular promete convertirse
en Wla de las [rontems cientficas mt.s excitantes del siglo XXI.

RESUMEN 3.5 Secuencias de protenas y evolucin

Las secuencias de protpnas constituyen lUla rica

fUPIlIC' (le in formacin sobre la es tructura y ftrnci n
de las protenas, as como sob re la evoludll de la
vida en el plaJH~ ta . Se estn desarrollando mtodos
refutados para lrl7....'\r la evolucin mediante el anlisis
de los lentos cambios que ~e producen e n la
sec upncias dC' nminocidos de prorelas homlogas.

lJorrelia bllTg(/or(eri

Chlamydia

Bacteroides
&le

] Spimch aetes
uptospira il1terrogufl8

[ Ht:liCOOaclcr pylDri

I..eRumella plleumophilu

] bajo

'rhermophilic bactuium PS-3

lJaciLIlI'8r bti l."
Yersillia ellterocolilicu
SulmDnclln typhi ~_ _-~"
E.'lChf'richia coii

Staphy!ococclfB al/reUB

=----;C;:I~:'~ridjllm rlcrtobutylicum

,)'lJ1.--.~_---"",==:;=- C/cnlndium pe.rfrmgcns

SlntplumyceJl roe/jea/or
~_ _ _

My(>oooctcrium ICPrM
Mycobacterium tuberculosis
Streptum)'nos a/bll.! [genJ

Ifrad)'rhizobilur JOpon ;ca '"

tWroboc/erium tIImi'faciet/8
Zymullwnu;

ltJ

con
te.

Gn1doC
+

alto

conten.ido
G+

';

1E
~
't
<l)

IIwbili.~

<':yanidium co.ldori!l/lI el.

Rici'IW comnumis d.

0.1 !lulltitucioncsl,.itio

FIGURA 3- 33 rbol evolutivo generado a partir de la comparacin de secuencias aminocidas. rbol evolutivo
bacteriano basado en la divergencia de sccuem.. ias observada en la fami lia de protenas GroEl. Tambin se inclu)'en
en este . rbol (pa rte inferior de recha) los eloropl<lSIOS (el) de .1lgllnas especies no bactC'rianas.

Cianobactenas
y cloroplastos

Captulo 3

Bibliografa

111

cloque isoelctrico

93

Palabras clave
Los trminos en negrita estn definidos en el glosario.
aminocidos 75
protela Sf,
grupo R 76
enlace peptdico 85
centro quiral 76
oligopptjdo 85
enantill1cros 7G
polipptido 85
protena
configuracin
absoluta 77
oligomrica 87
si~ t,(' m a D, L 77
protmero 87
protena conjugada 88
polaridad 78
grupo prost tico 88
zwitterion 81
estructura primaria 88
absorbancia , A 82
I)H isoelctrico ( punto
estructura
isoelctrico, pi) 84
seClUldaria 88
estructura terciaria 88
p ptido 85

estructura
cuaternaria 88
extract.o crudo Fi9
fraccionamiento 89
dilis is 89
cromaLogral'a
en colulTUla 89
cromatografa lquida
de alta resolucin
(HI'LC) 90
e lectroforesis 92

c10d ccil sulfa to sdir.o

(SDS)

92

degradacin df>

Eclman 98
protcasa s 99
prot.eoma 101
t.ransf{'rencia gnica
lateral 107
prote,n as
homlogas 107
homlogo 107
par logo 107
ortlogo 107
fuma secuencial 109

Bibliografa
Aminocidos

Estructura covalente de las protenas

Duugherty, O. A. (2000) Un nalural amino acids as probes of

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Discusin sobre los mtodos usados pru-a la fabricac in de
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El palwl crftico de los mtodos bioqumicos cl::;itos en una
nueva (-' ra.
Scopcs , R,K. (Hm4) P"Otoin Purification: Principles Gnd
PUdlre, 3. M ed ., Spri nger-Verlag, New York.

Una bW!1a fuent,e para descripciones ms complC'tas de los

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Koonill , E.V. , Tatusov, R.L. & Gal l,c rin , M.Y. ( IDOS) 13cyond
complete genomes: frOIll scquence to 51ructure and fl lllction . CU1'T
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Una bueHa djscusin sobre los posibles li SOS de la enOn ll('
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of syn llletic pcptides: fur the love of hasics or jUSl ror lhe tcclmology
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112

Capitulo 3

Aminocidos, pptidos y protenas

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C haUc ll ~(:,s

for prolcin

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Este artfcuJo y el de :\1ayo dcs('I'ihen cmo sintcti/.ar pt'plidos y
combinarlos con el fin de disponer de herralUit' lIt~JS para est lidiar
UII gmn nmero de prohlemas bioqum icos

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Biochcm. 57, 1-28.
Un amPliO relato histrico sobre el desarrollo de los mtod os
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evo lllC'i lI , con 13 introd llcd n de muchas ide'as inleres::mtes y

basada en detalladas ('OITlparaciones sccuellciaJes.
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en texto de f:kil le{'tUfa en e l que se d escriben las mc tod()lo~as

usadas ('11 ('1 anlisis de secuencias d e protenas y cidos
nuclclcos. 81 Capitulo G p roporciona una de las mcjorps
descripl:IOIIPS exjstentcs sobrl! la conslnlccin de rbolf'R
evollltl\'US a partir de datos st'{'lle nciales.

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del uso d., las secuencias de' proteinas en la lIIV(>stigadn de la

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La manera en que la ('urnp<tracin d e sec ue ncias de mltiples
protenas puede gPllerar ilonnacin i'\'oIUliva precisa.
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Considerado por muchos el <trI k lllo rundaeional en el cunpo de
la c"oJudIl moJecuJar.

Problemas
1. C onfigu_racin absoluta d e la citr ulin a La citml ina
ais lada de la sanda tie ne la esLructura que se muest ra a con
(inuacin. Es IIn amino(cido 1) o L? I~xplique por qu.

---- , (V)

CH 2 (C H 2 ),NH- C - N H 2

,
11
H- 9 - N H,
O

- - - - - - - : (IV)

COD

2. Relacin entre la curva de titulacin y las propieda

des cidobasc d e la glicina Una solucin df' 100 mL ele
glicina 0,1 M a pH 1,72 se tilu16 ('on llna sulucin ne NaO l1 2 M.
Se regisLr ('1 p I! Y los result;lrlos se represP nI :lron en una
grfica , tal romo se ltluestrl a la derecha. Los plintos clave de
la lilll lacin se sealan como I el V Para ('aria una de las afir
maciones siguie ntes , Ca) a (o), !l1,tijique e l punto rlave
adecuado d E' la titulacin y jusf1j"ique s u eleccin.
(a) La glicina f'SI ...' presenLe prenom in antemente e n la
forma t H:lN-(; II:!-COOH .
( h) 1..,1 ca rga neta 1nprlia de la glicinn l"S +}.
(e) La miwd de los grupos f1mino es lJl ionizarlos.
(d) ],;1 pH es igllal 01 pK., del g r1lpo cal'boxilo.
Ce) El pH es igual al pKI riel grupo amino protonado.
(f) La glicina til" nl" su l1uixillla capnridad talllpona nt l".
(g) La. rarga net.l lrwr!UJ de la glicina es igual a cero.
Ch) El grupo carboxilo ha sido ('ompletalllellLe litll lad o
(primer punto ele equivalen cia).
(i) La glirina eSl Lotailnen ll" tilulada (segundO plmto de
equiva lencia).
U) La esp<'cic predolllillant(> <,s "' 11:jN-CH.!-COO-.
(k) 1...,'1 carga nela media de la Rlicina <'5 - l .
O) La glicina est presf'nt (' pJ'C'donllilallt.en1P1l1 p romo LUla
mezcla 50:50 de + H"N-Cl lo-CODH y + II"N-CH, -('OO
(m) Corresponde al pUIlIO isoeIet rico.
(n) Corresponde al final de la titll ]arin.
(o) RepJ'C"sentaH las peor,..') regiones de p H ('n r ua nLo al
pod('l' tamponanlP.

pH

______ - (m )

Q.~7

_2.3L

,1(11)

(1)

1,5

1,0

0.5

2,0

OH - (equiva len tes)

3. Cuanta ala.nina est presente como es pecie completame nte sin carga? A un p ll ig ual a su punto isoelcLrico, la carga Ilela de la a lflnina es ce ro. Se pu eden d ibujar
dos ('st ru ct uras co n un., rarga lleLa de ('(>fO, pero la forma
pr('donlli.lllte de la al:lIl ina a su pi es zwirt ('linica.
CH ,

CH,

O
,f'

C- C

"O

Zwitteln iea

,;-

H N - C- C
2

"-

OH

Sin carga

(a) Por qllP ('s la a la nina predominantemente zwi ltC'rinica y 110 comp lf'tamenLe sin carga f' 1l su pi?
(b) Qu fra rcin de .. lanina est presente pn su pI
como forma completarnellLe sin ('arga'! J ustifique sus suposi
dones.

Capitulo 3

4. Estado d e ionizacin de los aminocidos Cada gl1.lpo

ionizable de UH aminocido puede existir en uno de dos cstados posibles, cargarl o o neutro . La ca rga elctri ca d el grupo
funciona l viene dete rminada por la relacilI ell tre su pKa Y el
pI-! el e la solucin. Esta relacin viene descrita por la ecuacin
de He nclel'so n-J lasselbalch.
(a) La histictina tiene tres grupos fWlcionales ionizables.
Escriba las ecuaciones de equilibrio pertinentes para s us tres
ionizaciones y asigne el pKI ;deeuado de cada ionizacin. Dibuje las estructuras de la histidina en cada estado de ionizacin. Cul es la carga neta d e la molc ula de ltisLidina en
cada estado de ionizacin?
(b) Dibuje las es tructuras d e los est actos de ionizacin
de la hi stidina predominantes a p I-! 1,4, 8 Y 12. Observe que
el estado de ionizacin puede obtenerse de forma aproximada
tratando independientemente cada grupo ionizable.
Ce) Cul es la carga neta de la histidina a pH 1, 4,8 Y
12? Cuando se coloca en un campo e lct.rico a cada lin o de
estos val ores de pH, se desp lazar la hi stid ina Ilacia el nodo
(+) o hacia el ctodo (-)?
5. S e paracin de aminocidos por cro matografa de
intercambio inico El anlis is de mezclas de aminocidos
empieza separando la mezcla en sus compone ntes mediante
cromatografa de intercambio inico . En lUla colunma con
Wla resina de intercambio catinico que contiene grupos sulfonados (vase Fig. 3-18a) los aminocidos fluye n a l.ravs de
la columna a diferente velocidad debido a dos facto res qu e influ yen sobre Sil movimiento: (I) la atraccin inica entre los
residuos -SO;- de la columna y grupos fun cionales ca rgados
positivamente en los aminocidos y (2) las interacciones hiclrof6bicas entre las cadenas laterales de los aminocidos y el
esque leto fuertemente hiclrofbico de la resina de polie5tireno . Para cada par de aminocidos sealados , determine
(;1.16.1 ellli rft antes en \lila columna d e intercambio ini co con
un tampn a pH 7,0.
(a) Asp y Lys
( b) Mgy Mel
(e) Glu y Val
(el) Gly Y Leu
(e) Se r yA la
6. Nome nclntu.ra d e los estereoismeros de la isoleu-

cilla

La estructura del amlocido isolew:;ina es:

COOH N- C- H
3

H - CI CH..
CH,

H,
(a) Cuntos centros quiralcs tiene?
(b) Cuntos ismeros pticos?
Ce) Dibuje fnnulas de perspecliva de lodos los ismeros
pticos rl C' la isoleucina.
7. C OIll!>araci n d e los valores d e pKI1. de la a lanlna y
poUal a nina La curva de titulacin de la alanina rnuestra la
iOlli:(lcin de dos grupos fLUlciollal es co n valores de pK:J de
2,34 y 9,69, correspondientes a la ionizacin de los grupos
carboxilo y amino protonado, respeclivamentc. La titu lacin
de di-, tri- y oligopptidos mayorcs de la alanina tambin

Problemas

113

muestra la ionizacin ele slo dos grupos funci onales, aunque

los valores experimentales de pKa so n diferentes. La tendencia de los valores de pKn se resumc en la tabla.
Aminocido o pptido

pK,

pK,

Ala
Ala-Ala
Ala-Ala-Ala
Ala-(Alal,-Ala. n 2 4

2.34
3.12
3.39
3,42

9.69
8.30
8.03
7.94

Ca) Dibuje la estru ctura de Ala-Ala-Ala. Identifiqu e los

grupos funcionales asociados con pK] y pK2 .
(b) Por q u aumenta el va lor de pK en cada adicin
de Wl residuo de Ala al oligopptido de Ala?
Ce) Por qu disminuye el va lor de pK:;! en cada adicin
de un residu o de Aja al oligopptido de Aja?

8. Tamaiio de las protenas C ul es la masa molecular

aproximada de una protena de 682 residuos aminocidos en
Wla nica cadena polipeptdica?
9. Nmero de residuos d e tript fano e n la albnDa de
suero bovino Un anlisis cuantitativo de aminocidos indica que la albmina de suero bovino (BSA) contiene 0,58%
en peso de lriplfano (M,204) .
Ca) Calcule la masa molecular mni'lruJ, d e la BSA (e~ decir, suponiendo qu e haya Wl solo resid uo de triptfano por
molcula d e prote1a).
(b) La fil t racin en gel de la ESA da Wla estimacin de
masa molecular de WlOS 70.000. Cunt.os residuos de tiptfano hay en una molcula de albmina de suero?

10. C arga e lctrica neta d e los p !>tidos

tiene la secuencia

Un pptido

Glu- His-Trp-Ser- Gly-Leu- Mg- Pro-Gly

(a) Cul es la carga neta de la molcula a pH 3, 8 y 11 ?
(Utilize los valores de pKa para las cadenas laterales y grupos
amino- y carboxilo-terminales dados en la Tabla 3- 1.)
( b) Estime el p i de este pptido.

1l. Punto isoelctrico d e la pepsina Se da el nombre de

pepsina a varios e nzimas digestivos secre tados (en forma
de protenas precursoras mayores) po r las glndulas Que recubren el estmago. Estas glndulas sec retan tambin cido
clorhdrico, que di suelve la materia en fo rma de parlculas de
la comida, pe rmitiendo a la pepsina cortar enzimticamenle
molcula s d e protena individuales. La mezc:la resultante el e
comida, HCl y enzimas digestivos se d enomina quimo y tiene
Wl pH cercano n 1,5. Qu pI predecira para las protenas d e
tipo pepsina? Qu grupos ftmcionales han ele estar preselltes
para proporcionar este pI a la pepsina? Qu aminocidos
pueden aportar ta les grupos a k"lS protenas?
12. PWlto isoe lctrico de las ltistonas Las histonas SOll
protenas que se encue ntran en el ncleo de las clulas eucttiti cas, fu ertemente unidas al ONA, el cual tiene muchos
grupos fosfato. El pI de las h..istonas es muy elevado, de alrededor de 10,8. Qu residuos alU..illo.:iddos d eben es tar presentes el! nmero relativamente elevado en las ru stonas? En
qu forma contlibuyen estos residuos a la fuerte unin ent re
las histonas y el DNA?

114

Captulo 3

Aminocidos, pptldos y protenas

13. Solubilidad de los polip ptidos Un mlodo utilizado

en la separacin de polippl idos se basa e n sus !-iolubilidacles
dif('rpnciales. La sol ubili dad ('n agua de los poli pptidos gran ~
des d<'pe nde de la pola rid ad relativa de su::; gru pos R, cSP('cia lmente del nmero de grupos ionizado::;: cuantos ms
grupos ionizados haya, ms soluble ser el polipptido. De los
pares de polipptidos siguiente::;, cul es ms soluhle al pH
indicado?
(a) (GlY)2o o (G lu),o a pll 7,0
(b) (Lys-AJah o (Phe-Met):, a p H 7,0
(e) (Ala -Ser-G ly), O (Asn-Scr-H is) a pH 6,0
(n) (A la-Asp-G ly), o (As n-Se r- His)" a p H 3,0
14. Purificaci6 n d e un e nzima Un bioqumico dcscllbrp y
pUrifica un enzima nuevo generando la siguie nte tlbla de purificacin:

Php Y Leu, ms
proporcin 1:2.

tUl

lripptido que cont('na Tyr y Gly en una

16. Estructura de IDI antibitico peptdico de BaciU'-Is

IJ,.ev;s Los extract.os de la bacteria Ba.cillus fJrevis cont ie-

l1('n 1m pptido con pl'opiC'Ctades :JIlLibiticas. ~-: st<' ppLido

fOll1l3 complejos C;OIl iones metlicos y, aparentemente, interfiere en el transpone inico a travs de las membranas celulares de ciertas especi('s bacleliml3S matndolas. La est ructura
del pptid o se ha detC' rminado I parti r dr las siguientes ousf' rVadolles.
(a) La hidrlisis icida com pleta del pptido spg llida de
anlisis de amiJlocidos produce cantkl(ldes equirnolecllla res
de Leu. Om, rh e, Pro y Val. Orn es ornilina, un aminocido
que no se ha lla prcs('nte en las prote(nas pr ro qu(' se encuelltra en alglUlos pptioos. Tiene la eSU'UClllra

Protena
Procedimiento
1. Extracto crudo
2. Precipitacin (sal)
3. Precipitacin (pH)
4. Cromatografa de intercambio inico
5. Cromatografa de afinidad
6. Cromatografa de exclusin molecular

lolal

AcOvidad

(mg)

(unidades)

20.000
5.000
4.000
200
50
45

4.000.000
3.000.000
1.000.000
800.000
750.000
675.000

(a) A partir de la inforll11cin dada en b tabla , calcule la

actividad especfi ra de la solucin enzimtica d('sp\1('s de
cada procedimiento de pu rificacin.
(h) Cul de los procedimientos ele p1lrificacin utilizados con es te enzima es elllls efectivo (es d('rir, produce el
mximo in cremento en purt~za)?
(e) Cul d(' los procedimielltos de purifirnrin ps el menos efectivo?
(el) Hay algu na indic..1.cin en los result~dos de esta UlhIn de que el enzna sea ya puro tras ('1 paso 6? Qu ms se
podrfa hacer para estimar la pureza de la preparacilI ellzntica?

15. De t e rminac in de la secuencia de l p l)tido ce re bral

leucina-ence falina A pa rtir de tejido ce reb ral normal s('
hn aislado un grupo de pptidos que influYPI1 sobre la transmisin nerviosa en cie rtas partes del cere hro. Estos pptidos
se cono('C' n como opioides debido a que se tijnJ1 a receptores
qu e se un en tam bi'n a drogas opiceas, ta les ('omo la morrUla o la naloxona. De es te modo los opioicles imi tan algunas
de las propiedades de los op iceos. Algullos iltvestigador('s
consideran que estos pptidos son los in hibidores del dolor
propios del ce rebro. Utilh:ando la informacin que se da el
con tinuacin, determ ine la secuencia d(' ami nocidos del
opioicl c leucina-encefalina. Explique por quP S1l eslruc;tura
est de acuerdo con todos los dalos apork1dos.
(a) La hidrlisis completa por HCI6M a 110 oC seguida
de anlisis de anlinocidos indica la presencia de Gly, Leu,
Php y 'I'yr en Wla proporcin molar 2: 1: 1: l.
(b) El tra tamiento de l ppticlo con l -fluoro-2,4-dinilrobe nceno seguido de hidrlisis compl eta y cromatografa illdic la presencia de l 2,4-dinitrofenil derivado de la tirosina.
No se encontr tosina libre.
(e) La digestin completa de l pptido con peps iuI seguidrl de cromatografa dio lugar a un dipplido que contela

H"N- CH 2 - CH 2 -CH 2 - C

coa

- NH,
(b) La masa mol('rlllar del pptido se calcul en alredenor de 1200.
(e) Cuando se trat con el e nzllu c<Huoxipeptidasa, el
pptido no experiment hidrlisis nlglllla. Este e nzima cataliu l la hiclrlisi:'i de l residuo carbox ilo-t(,J'l1linal d(' un polipplido a mc nos que el res iduu ::;ea Pro o por <l lg1lna razn no
contellga un grupo carboxilo libre.
(d) El lralam.iemo del pptiel o intacto COII 1~ nuol'O-2, 4d initrobenceno, seguid o de hidrlisis rom pleta y cromatografa, dio s610 aminocidos libres y el siguiente drrivado:

r-<0'

O,N V _ 'NH- CH, - CH,

C H,-C-COO~
' NH,

(Sugerelicia: observe qu<, el 2,-I-dinitrofen.i1 derivado implica

C'I Ampo amiuo de una C<1c1ena latPral y 110 el grupo a-amino.)
(e) La hidrlisis parcial del p('plido seguida de sepa raci n rromatogrfica y alllisis de seCIl f'nC'ia d io lugar a los tliy tripptidos sigllientes (el aminoci do amino-l.C'rminal siempre se encuentra a la izqlliC'rda):
Leu-Phe

Phe-Pro

Val-Orn- L(,II

Orn- Leu

Phe-Pro-Val

Val-Orn
Pl'o-Va l-Om

Dada la informacin antcrior, dC'elllzca la ::;ec.:uencia de aminocidos del antibilicu peptctico. I';xpongl sus rawnamielltos.
Cuando haya ll egado a ulIa estructura, dC'l11upsl re que es <.:u~
he re ntc con cada una. de las observacion('s ('xperimentales.
17. Eficiencia e n la secuenciacin de ll lltidos Un pplido con la estructura primaria L,Ys-Arg-Pro-Leu- lle-Asp-GlyAla :'ie secue ncia por el procedimi('nt.o de EUlllau. Si cada
c iclo dC' Edman tuviera lUla eficiencia 0('1 00%, ,qu porcentaje de los aminocidos liberados e n e l rllarlO C'iclo sena leucum? ll aga ('1 clrlllo de llu evo, suponiendo ell esta ocasin
ulla eficiencia del 99% para cada dclo.

18. Protocolos de bioqulnka: s u primera purificacin

de protena SiC'ndo el estudiante ms nuevo y menos experimentado de un laboratorio de investigacin bioqumica ,

Capitulo 3

usted pasa sus primeras semanas lavando rnaterial de vidrio y

etiquetando tubos de el Lsayo. A con! inuadn se grada para
prepa rar tampon es y solucio nes madre para su utilizacin en
d.ive rsos procedimie ntos dC' laboratorio. r inalmC'nte, le dan la
responsahilidad de purili car una protel3. Se t.rata de W I enzima del ciclo del cido cftri co, la citrato sinlaSa, localizado en
la lIIatriz mit"ocondrial. Siguiendo un protocolo de purificacin, lleva a cabo los pasos que se ('Xpli Cilll a contin uacin.
A lo largo del trabaj o, un estudiante con ms expe riencia le
pregunta acerca de la base de cada procedimiento. Dele las
respuestas. (Sugerencia: I('a en el Ca pftulo 2 infoffil3cin sobre la osmolarida<.l; co nsul te en la p. 6 info rmacin sobre la
separacin de o r~ nulos de clulas.)
(a) Recoge 20 kg de corazn de buey eH W1 matadf'ro
cercano. Transporta los corazones en lucio y realiza todos los
pasos de la purificacin en una cmara fra o so bre hielo. Homogenei7.a el tejido de los corazones de buey en un medio que
contie ne sacarosa 0,2 M, tamponado a pH 7,2. Por qu utiliza. tejida de cm-azn de bu.ey y ('n lar gran cantidad?
C11.l U:i el p ropsito de' m.a:nten.er el fejl oIr io y suspenderl() ('11 SaCll1t/::;fL 0,2 M, a. pH 7,2? Qv le pa.sa al lejido al
hom.ogf"l7.arlo?

(b) Somete el homogcnado de cora:tn resultante, que es

denso y opaco, a ulla serie de pasos de centrifugacin diferencial. Qu con<;if/ue con esto?
(c) Prosigue con la purificacin utUi7.ando la fraccin del
sobrC'nadante que conti enf' mayoritariamente mitocondrias intactas. A continuacin lisa osmticamente las mitocondrias. El
Iisado. que es lIIellOS denso que el hOlnoge nado , pero a (m
opaco, consiste principalmente en membranas nutocondriales
y pi contenido interno de las mitocondrias. AHade sulfato amnico allisado, Wla 5<11muy soluble, a lUla concentracin determ.inada. Centrifuga la solucin, decanta e l sobrenadant,e y
desC<1.rt.a e-I sedimento. Ai\adc ms s ulfato runnico al sobrenadante, que es ms trans parente que ellisado. Centrifuga wla
vez ms la mu rslra, pero esta vez SP queda con el sedimento,

Problemas

115

puesto que contiene la protela de inters. Cul e:i la lgico,

que aconseja la ad.icin de sal en dos pasos?
(d) Solu biliza el seclirncnto de sulfato amnico que contiene las protelas mit oco ndriales y lo dializa l lo largo de una
noche [rellte a vo lmC'nes g randes de una solucin tamponada (p H 7,2) . Por qu P no incluye SUljhfO amn..'ico en el
tampn de d i lUiis? Por qu ut'ili.za solucin lmnponado,
en lugar de agua?

(e) Pasa la soluciu dializada a travs de Wla columna de

cromaLOgrafia ele exclusin molecular. Siguiendo el protocolo,
recoge la primera fraccin de proteina qllf' sale de la colwnna
y descarta el resto de fracciolles que eluyen dp la colwIUl3 posterionnente. Detecta la prot.e-na midienclo la absorcin en el
UV Ca 280 nm) de las fracciones. Qu le dice sobre la prott:-'ina el heclw de recoger La pri1nerafrcu:cin? Por qu es la
absorcin c..rr el UV a 280 mn una buenajorma de segu
la presuncia de proteinn ('n lasfmcciO'nes rl1Lidas?

Cf) Coloca la fraccin r('cogida en (e) e n una rolwlUla de

cromatografa de interca mbio catinico. Despus oe descartar la fraccin inicial que sale de la col umna , aade una solucin de lavado de pH mayor a la col wnna y rpcoge la fraccin
proteica que eluye inmedia tamente. J::xpliquc Lo que est

haciendo.
eg) Analiza Wla pequc li a muestra de su fraccin, que
ahora tiene un volw'IIen muy reducido y es bastante transparente (awlque tei\ida de rosa), en un ge- l de eloque isoelctrieo. Cuando se t.iiiC', pi gel llIuestra tres bandas finas. De
acu erd o con el prot.ocolo, la protena dC' int.prs es la que
tiene lll1 pI de 5,6, pero dpcide realizar ot,ro ensnyo de la pureza el e- la prote la. Corta la banda de pi 5,6 y la somete a
electroforesis e n gel de poHacri.lamida con SOS. La protena
se resuelve como una nica banda. Por que; no estaba seguro ele la pureza de la banda, de protena "nica " en su
gel de enfoque isoelctrico? Qu le dicen los resu ltados
del gel con SDS? Por q11R es irnporlaate ealizar la electroforesis en gel con SDS dC's pus del enJoque isoelctrico?