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NOTA CIENTFICA
Resumen
El test de microncleos en cultivo de linfocitos es una prueba validada para estudiar mutagenicidad. Consiste
en detectar material nuclear interfsico daado, producto de fragmentacin cromosmica o errores de divisin
nuclear en 2000 clulas binucleadas con citoplasma definido. El protocolo estndar deriva de la preparacin
citolgica de cromosomas de sangre perifrica con solucin hipotnica, lavados de fijador y goteo de lminas.
Nosotros proponemos modificaciones para mejorar el nmero y la observacin de los microncleos. Primero
se purifica linfocitos de glbulos rojos antes del cultivo, luego de 72 horas, se elimina la solucin hipotnica y
los lavados repetidos con fijador, y finalmente se coloca las muestras en lminas por frotis en vez de goteo.
Con las modificaciones obtenemos mas clulas binucleadas bien definidas (un promedio de 8 veces ms por
lmina) mejorando la eficiencia de este test.
Palabras clave: biomonitoreo humano; Proyecto HUMN; genotoxicidad; citogentica; protocolo.
Abstract
Presentado:
11/01/2011
Aceptado:
19/06/2011
Publicado online: 25/08/2011
The micronuclei test in lymphocyte culture is a validated procedure to study mutagenicity. It consists in detecting damaged interphasic nuclear material produced by chromosome fragmentation or nuclear division errors
in 2000 binucleated cells with well defined cytoplasm. Standard protocol derives from blood chromosome
preparation with hypotonic and fixing solutions as well as preparing slides by dropping fixed cells. We modified
the protocol to improve the number and quality of micronuclei. First, lymphocytes are separated from red cells
before culture. After 72 hours, hypotonic and repeated fixer washing steps are eliminated. Cells are put onto
slides by spreading instead of dropping. With these modifications we obtained more (about 8 times per slide)
and better defined binucleated cells to help micronuclei detection.
Keywords: Human biomonitoring; HUMN Project; genotoxic; Cytogenetic; Protocol.
La iniciativa internacional The International Collaborative Project on Micronucleus Frequency in Human Populations
(HUMN), busca uniformizar el test de microncleos; all
se comparan resultados y se recopilan datos de frecuencias y
variaciones de diferentes laboratorios en todo el mundo para
establecer un protocolo estndar (Fenech 2007).
El HUMN establece ciertos criterios de seleccin para considerar una clula apta para el anlisis estadstico. Dentro de esos
criterios est el tener la membrana celular y citoplasma ntegros
(Fenech 2003). En muchos laboratorios, para la observacin
de microncleos se utiliza la tcnica estndar de preparacin
cromosmica de mamferos a partir de linfocitos cultivados
(Clouston 2001, Murli 2003). En esta tcnica se emplea una
solucin hipotnica, necesaria para abrir las metafases y mejorar
la visualizacin de cromosomas, eliminando adems los eritrocitos. Ello es seguido por fijacin de clulas y el lavado varias veces
en soluciones de alcohol y cido actico. Finalmente la muestra se deposita en lminas por goteo. El proceso de fijacin y
lavado, as como el goteo de la muestra en lminas, maltratan
las membranas celulares y producen prdida de citoplasma que
dificulta el anlisis de los microncleos. Por lo mencionado, la
preparacin citolgica clsica del protocolo de microncleos es
susceptible de optimizar.
En el presente trabajo reportamos modificaciones al protocolo
estndar que mejoran la observacin de las clulas, cumpliendo
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Tabla 2. Frecuencia de microncleos obtenidos con el protocolo modificado, expresada en porcentajes e ndice de Divisin Nuclear (IDN).
Tratamiento
Control negativo
Mitomicina C (0,16 g/mL)
Porcentaje (%)
0,89
12,05
IDN
1,6
1,3
262
263
Castillo et al.
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