TEMA 6.- La controversia Ox-Phos.

Hiptesis quimiosmtica de Mitchell e hiptesis del acoplamiento qumico. Principales

evidencias experimentales.
Los orgenes de la Bioenergtica pueden situarse en la segunda mitad del siglo XIX
cuando Louis Pasteur public los primeros trabajos en los que cuantificaba cunta
levadura se formaba por gramo de glucosa consumido. En su comunicacin en 1861 a la
Academia Francesa demostraba que la presencia de oxgeno posibilitaba un
aprovechamiento ms eficaz de la glucosa, formndose una mayor cantidad de
levadura. En el mencionado estudio Pasteur observ tambin el fenmeno ms tarde
bautizado como efecto Pasteur, al describir que el consumo de glucosa era ms lento en
presencia de aire que en su ausencia.
Desde 1861 hasta 1938 se postularon mltiples hiptesis sobre la naturaleza del
mecanismo de control por el oxgeno del consumo de glucosa, sin que ninguna llegara a
ser aceptada. La participacin directa del oxgeno como elemento regulador era una de
estas hiptesis, pero el hecho de que el 2,4- dinitrofenol provocara un aumento del
consumo de glucosa incluso en presencia de oxgeno llevaba a descartar dicha
hiptesis, incluso desconocindose el mecanismo de accin del 2,4 dinitrofenol.
A finales de los aos 30 se haban producido avances importantes en relacin a la
fermentacin alcohlica y a la fosforilacin oxidativa. Se saba que ambos procesos eran
diferentes pero que requeran fosfato. Esto llev a Feodor Lynen en Alemania, y a M.J.
Johnson en los EEUU a proponer en 1941 que el efecto Pasteur no era sino el resultado
de la competencia por el fosfato entre la glucolisis y las oxidaciones aerobias,
competencia que posteriormente se ampliara al ADP.
A la luz de lo que conocemos hoy en da resulta evidente que la competencia por el
fosfato habra justificado una menor formacin de cido lctico, o de CO2, pero en
ningn caso un menor consumo de glucosa, la cual en presencia de ATP se consume
hasta F-1,6-BisPi. Sin embargo, por aquel entonces Otto Warburg haba introducido
nuevos mtodos de medir la actividad glucoltica que cuantificaban el CO2 desprendido o
el cido lctico formado, pero se haba abandonado la determinacin del consumo de
glucosa como tal, por lo que esta interpretacin errnea del efecto Pasteur fue aceptada
sin muchas objeciones.
A lo largo de los aos 50 y 60 se fue poniendo de manifiesto lo incorrecto de la
hiptesis mencionada, plantendose nuevas posibilidades entre las que cabe mencionar:
1. Secuestro del ATP en la mitocondria y carencia del mismo para la HK (no se
obtuvo evidencia experimental que avalara la hiptesis).
2. La existencia de inhibidores Pasteur que controlaran la glucolisis, como por
ejemplo, la Glucosa-6-Pi, inhibidor de la HK (si bien en levaduras no tiene lugar
dicha inhibicin), o el propio ATP a elevadas concentraciones, que se comporta
como inhibidor de la PFK (aunque muchas clulas que muestran efecto Pasteur
no presentan variaciones en los niveles de ATP al pasar de una situacin aerobia
a una anaerobia).
3. Las anomalas mencionadas llevaron a postular la existencia de otros inhibidores
Pasteur , como el PEP, que inhibe la PFK o la Manosa-6-Pi, que inhibe la HK.

4. Adems, el Pi, cuya necesidad para la glucolisis haba sido postulada por Harden,
result actuar contrarrestando el efecto de la G-6-Pi sobre HK y del ATP sobre la
PFK, induciendo un aumento del consumo de glucosa.
Todos estos hallazgos permitieron establecer un esquema de regulacin parecido al que
hoy aceptamos.

HISTORIA DE LA FOSFORILACION OXIDATIVA

En 1925 David Keilin describe el sistema del citocromo c, al que considera un pigmento
respiratorio presente en animales, plantas y levaduras. Por su parte, Otto Warburg y
Wieland, durante la dcada de los 30 aislaron varias deshidrogenasas, flavoprotenas, y
sus correspondientes coenzimas. Ello dio lugar al concepto de cadena respiratoria que
se defina como una serie de complejos insolubles en medio acuoso que participaban de
un modo secuencial en el transporte electrnico desde los coenzimas reducidos hasta el
oxgeno. Los transportadores de electrones, de acuerdo a este concepto, estaban
exclusivamente implicados en reacciones redox.

La idea de fosforilacin oxidativa puede atribuirse a Engelhardt quien en 1930 describi

un proceso aerobio en eritrocitos nucleados que estaba ligado a la fosforilacin. Sin
embargo, fue Herman Kalckar quien en 1937, trabajando en preparaciones libres de
clulas obtenidas de tejido renal, public que el transporte electrnico estaba ligado a la
formacin de ATP y que dicho proceso estaba fsicamente separado del de formacin de
ATP que tena lugar durante la glucolisis. Lo dicho para la fosforilacin oxidativa result
igualmente vlido para la fotofosforilacin. Todo ello despert el inters por desentraar
cmo se produca el acoplamiento entre el transporte electrnico y la sntesis de ATP.
La dcada de los 40 supone el inicio de los clculos cuantitativos referentes al proceso
de fosforilacin oxidativa. Fritz Lipmann y el propio Kalckar sern los que introduzcan el
concepto de intermediarios de alta energa, concepto que ha resultado especialmente
controvertido pero cuya utilidad difcilmente puede ser puesta en tela de juicio.
Severo Ochoa (1943) fue de los primeros en llevar a cabo estimaciones de la
denominada razn P:O, es decir, del ATP producido por O2 consumido. Tras clculos
cuidadosos y llevando a cabo mltiples controles, lleg a la conclusin de que la
oxidacin aerobia del piruvato a CO2 y H2O estaba asociada a una razn P:O = 3. Los

experimentos de Ochoa dirigieron la atencin hacia la termodinmica del proceso y

adems, dieron pi a postular que la oxidacin del NADH (obtenido en la metabolizacin
del piruvato) tendra lugar por pasos, en concreto en tres pasos, cada uno de los cuales
estara ligado a un proceso de fosforilacin oxidativa. Es interesante constatar hasta qu
punto un clculo no del todo exacto (hoy en da sabemos que dicha relacin ha sido
revisada a la baja) impulsaba a los investigadores del campo a proponer hiptesis
basadas en la veracidad absoluta de dicha evaluacin cuantitativa. Un programa de
investigacin se abra, encaminado a localizar los tres sitios de fosforilacin.
Varios laboratorios contribuyeron posteriormente al avance en este campo. Entre ellos
cabe mencionar a los siguientes:
Albert Lehninger (aos 50) demostr que el NADH es el autntico sustrato de la
fosforilacin oxidativa, proceso que tena lugar en la mitocondria. Tambin describi la
oxidacin del ascorbato a travs del citocromo c la cual estaba ligada a la formacin de
ATP. Adems, introdujo un ensayo de alta sensibilidad para medir la fosforilacin
oxidativa, empleando 32P. Su laboratorio contribuy a identificar los denominados tres
sitios de fosforilacin junto con los grupos de Chance, Green, Hunter y Lardy, sitios que
quedaron establecidos tal como aparecen en los textos clsicos de Bioqumica.
Sitio I, oxidacin del NADH y reduccin del citocromo b
Sitio II, oxidacin del citocromo b y reduccin del citocromo c
Sitio III, oxidacin del citocromo c y reduccin del Oxgeno a H2O

Albert Lehninger (1917-1986)

El laboratorio de Briton Chance (1955) desarroll una tcnica polarimtrica para mediar
la fosforilacin oxidativa y estableci los estados clsicos de la respiracin (estado 3,
estado 4, etc..).

El grupo de David Green (1957) fue el primero en desarrollar preparaciones a gran

escala de mitocondrias, lo que posibilit la purificacin de los componentes individuales
de la cadena transportadora de electrones, as como de los diferentes complejos
respiratorios y de la propia ATPasa, esta ltima llevada a cabo por Efraim Racker (1960)
de la Universidad Cornell del estado de New York. Estos hallazgos permitieron
establecer el papel de la ATPasa mitocondrial en el acoplamiento entre oxidacin y
fosforilacin.
El laboratorio de Henry Lardy contribuy enormemente al esclarecimiento de la accin
del dinitrofenol, y a establecer el papel de la oligomicina como inhibidora de la ATPasa y
de la fosforilacin oxidativa.
En 1951 Efraim Racker postul un mecanismo para la fosforilacin a nivel de sustrato
que tena lugar en la glucolisis en la reaccin catalizada por la Gliceraldehido-3-P DH,
mecanismo que inclua la formacin de un tioster de alta energa entre la enzima y el
sustrato. Esto llev a Slater en 1953 a postular para la fosforilacin oxidativa un
mecanismo similar. Slater propona que el transporte electrnico daba lugar a la
formacin de un intermediario de alta energa XY que por fosforlisis se transformaba
en XP, siendo el fosfato transferido posteriormente al ADP para formar ATP. No
obstante, y a pesar de la abundante literatura respecto a la identificacin de
intermediarios de alta energa, ninguno de ellos pudo ser relacionado con el proceso de
la fosforilacin oxidativa ligada al transporte electrnico. Entre 1956 y 1972 se
describieron 17 intermediarios diferentes que apoyaran la teora del acoplamiento
qumico. La hiptesis del acoplamiento qumico fue dando paso poco a poco a otra
formulacin que podramos denominar acoplamiento conformacional (Paul Boyer)
segn la cual la ATPasa estara directamente acoplada a los complejos de la cadena
respiratoria y al producirse el transporte electrnico, mediante algn tipo de cambio
conformacional, se producira la estimulacin de dicha ATPasa.

Un aspecto que haba pasado desapercibido era el hecho de que la insolubilidad acuosa
de los transportadores de las respectivas cadenas mitocondrial y fotosinttica no era
sino consecuencia de su localizacin en membrana. Esto s despert el inters de
Mitchell que estaba interesado en buscar los principios del acoplamiento entre
metabolismo y transporte.

Paul Boyer (1918)

LA HIPOTESIS DEL ACOPLAMIENTO QUIMIOSMOTICO

La teora quimiosmtica fue propuesta por primera vez por Peter Mitchell en 1961 en la
revista Nature. Los puntos esenciales de la propuesta incluan ya toda una serie de
aspectos que son aceptados en la actualidad. Las caractersticas del modelo podran
resumirse en los siguientes puntos:
El acoplamiento es quimiosmtico; no existen intermediarios de alta energa. La
ATPasa se encuentra localizada en la membrana y posee una estequiometra
caracterstica y definida en lo que a H+ / ATP formado concierne
Las cadenas transportadoras de electrones mitocondrial y fotosinttica son
asimtricas, y generan un transporte vectorial de protones hacia el exterior de la
matriz mitocondrial, o hacia el interior del tilacoide. Tambin poseen una
estequiometra concreta entre H+ movilizados y electrones transportados.
En la membrana existen tambin sistemas transportadores de metabolitos acoplados
al transporte de protones.
El transporte de protones da lugar a la formacin de un gradiente electroqumico o
fuerza protn-motriz, que consta de dos componentes: el gradiente qumico de
protones como tal (pH), y el gradiente elctrico generado por su transporte vectorial.

En 1966, cinco aos ms tarde, Mitchell public toda la evidencia experimental que
haba obtenido hasta el momento para sustentar su hiptesis. Aunque la naturaleza
asimtrica de la cadena de transporte electrnico fue puesta de manifiesto rpidamente,
la bsqueda de un potencial de membrana y de un gradiente de pH en la mitocondria
haba sido infructuosa, lo que desfavoreca los postulados de Mitchell.
En 1966 la hiptesis quimiosmtica recibi un espaldarazo gracias a los experimentos
de Jagendorf y Uribe en cloroplastos de espinacas, en los que observaron que un
gradiente de pH artificial induca la sntesis de ATP en ausencia de luz. No obstante,
para el caso de la mitocondria las cosas no estaban tan claras, puesto que un gradiente
de K+ tambin era capaz de inducir la sntesis de ATP. La conclusin era que ambos
gradientes, de pH o de K+, se canalizaban hacia la formacin de un intermediario
qumico de alta energa conforme a los postulados de Slater. Lo cierto es que los
experimentos de Jagendorf y Uribe canalizaron la atencin hacia el estudio de los
gradientes de pH, y los partidarios del acoplamiento qumico comenzaron a plantear

experimentos para refutar los hallazgos de sus oponentes y no slo para confirmar sus
propias teoras.

Andre T Jagendorf

Por aquella poca Mitchell abri un laboratorio privado, el Glyn Research Laboratory, en
Cornwell, y all, con un equipamiento ms bien modesto (esencialmente un electrodo de
pH) y utilizando preparaciones de mitocondrias aisladas, logr demostrar junto con su
colaboradora Jennifer Moyle que las mitocondrias al respirar expulsan protones hacia su
exterior, tal como predeca la teora quimiosmtica. Los laboratorios de Slater en
Amsterdam y de Chance en Philadelphia se centraron nuevamente en rebatir dichos
resultados. Aunque el transporte de protones result ser una realidad, los oponentes de
Mitchel argumentaron, basndose en estudios cinticos, que dicho transporte no poda
estar implicado en el proceso de fosforilacin oxidativa. Mitchell por su parte intentaba
demostrar que dichas medidas estaban ml diseadas y que no contradecan en modo
alguno sus postulados, lo que a la postre result convincente para la mayora.
El planteamiento de Slater parta de la idea de que el que se generara un gradiente de
protones no implicaba que ste fuera la causa de la fosforilacin oxidativa, sino que
existan otras muchas posibilidades, como por ejemplo, que se tratara de un proceso
secundario inducido por el intermediario de alta energa. Por consiguiente, dichos
experimentos resultaron no ser concluyentes.
Otro aspecto interesante en esta controversia estaba en la explicacin proporcionada
sobre el efecto de agentes como el dinitrofenol, que inhiban la fosforilacin sin detener
la respiracin. En su propuesta de 1953 Slater atribua al dinitrofenol y dems agentes
desacoplantes la capacidad para destruir los intermediarios qumicos de alta energa.
Por su parte, Mitchell en 1961 propuso que los desacoplantes simplemente colapsaban
el gradiente electroqumico de protones (aumentando la permeabilidad de la membrana
a los mismos). Esto ltimo fue confirmado por el propio Mitchell en 1966. No obstante,
dicha demostracin tampoco eliminaba la validez de la hiptesis qumica: si los
desacoplantes incrementaban la permeabilidad a los protones, stos podran destruir los
intermediarios de alta energa como propona Slater. La cuestin segua sin decidir.
En la dcada de los 60, adems de los trabajos con mitocondrias aisladas se llevaban a
cabo estudios en los que se empleaban mitocondrias sonicadas que producan
partculas submitocondriales (vesculas de membrana mitocondrial interna). Dichas
partculas eran capaces de llevar a cabo la fosforilacin oxidativa y tenan la
particularidad de estar del revs, es decir, que el interior mitocondrial se dispona hacia
el exterior de la partcula submitocondrial. Esto proporcion una nueva ocasin a Mitchell
para comprobar su hiptesis ya que en dichas partculas el flujo de protones se produca

en sentido contrario (de dentro a fuera). Estos hechos demostraban la asimetra

funcional de los transportadores electrnicos tal como postulaba la hiptesis
quimiosmtica.
Otro de los rasgos propios de la hiptesis quimiosmtica era la distincin fsica entre
transportadores de electrones y actividad ATPasa. El laboratorio de Racker consigui
aislar dicha ATPasa, pero no consigui que sintetizara ATP en disolucin. Alrededor de
1970 el grupo de Racker empez a considerar el problema desde la perspectiva
quimiosmtica, prestando atencin a la cuestin de la integridad de la membrana. Para
los defensores de la hiptesis qumica la membrana no era sino una especie de soporte
mecnico en la que se situaban los componentes de la cadena respiratoria, mientras que
para Mitchell su integridad era esencial. En el marco de esta nueva perspectiva el grupo
de Racker procedi a reconstituir la ATPasa en liposomas (vesculas lipdicas),
comprobando que sintetizaban ATP y que en las mismas se promova un transporte de
protones dependiente de ATP. Posteriormente fue posible reconstituir tambin los
diferentes componentes de la cadena respiratoria en liposomas, as como
conjuntamente con la ATPasa. No obstante, estos experimentos no descartaban la
hiptesis conformacional de Boyer que postulaba una interaccin molecular directa entre
los componentes de la cadena transportadora y la ATPasa como forma de transferencia
de la energa procedente de la oxidacin del NADH. Sin embargo, el laboratorio de
Racker, en colaboracin con Stockenius, fue capaz en 1974 de reconstituir vesculas de
membrana conteniendo la bomba de protones dependiente de luz (bacteriorrodopsina) y
la ATPasa mitocondrial, dos componentes cuya interaccin era ms que improbable,
pero que daban lugar a la sntesis de ATP dependiente de luz.
Puede considerarse que ese fue el punto final de la controversia ox-phos. En el volumen
de 1977 del Annual Review of Biochemistry aparece un artculo firmado conjuntamente
por todos los grandes de esta historia, Boyer, Chance, Ernster, Mitchell, Racker y Slater,
que certifica la claudicacin de los partidarios de la teora qumica y el apoyo de los
postulados de la teora quimiosmtica.