VALORACIN MICROBIOLGICA

DE ANTIBITICOS
Diego L. Guagliardi
Servicio Microbiologa Analtica - Dpto. de Microbiologa e
Inmunologa - Instituto Nacional de Medicamentos (ANMAT)
Tel.: 5411- 4340 0800 int. 2541
e-mail: micantib@anmat.gov.ar

Ensayo de Rectas
Paralelas

Ensayo de rectas paralelas.

Condiciones necesarias para el cumplimiento del
modelo:
1) LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS DEBEN ASIGNARSE
AL AZAR A LAS UNIDADES EXPERIMENTALES.
2) LAS RESPUESTAS A CADA TRATAMIENTO SE
DISTRIBUYEN NORMALMENTE.
3) LA DESVIACIN TIPICA, S=S2 , DE LA RESPUESTA
DENTRO DE CADA GRUPO DE TRATAMIENTO ES
INDEPENDIENTE DE LA RESPUESTA MEDIA.
4) LA RELACIN ENTRE EL LOGARITMO DE LA DOSIS Y
LA RESPUESTA PUEDE REPRESENTARSE POR UNA
LINEA RECTA A LO LARGO DEL INTERVALO DE DOSIS
USADAS.
5) PARA CUALQUIER PREPARACIN DESCONOCIDA
EN EL ENSAYO, LA LNEA RECTA DEBE SER PARALELA
A LA DEL PATRN.

Ensayo de Rectas Paralelas

En la curva Dosis Respuesta establecimos el rango de linealidad
entre el Log Dosis y la respuesta.
Rta. = Log (Dosis) +
Para el Standard
Y(DS) = Log DS+

Rta.

Para la Muestra
Y(DM) = Log DM+
LogDosis
Rango
Pot.Mtra.real (DM)

R=
Pot Mtra.Supuesta (DMsup )= Pot Std (xS)

DM = ?

Para la Muestra
DM= R.DMsup
Y(DM) = Log (DM sup .R)+
Para la Muestra
Y(DM) = Log DM sup + LogR+

Ensayo de Rectas Paralelas

Para el Standard Y(DS) = Log DS+
Para la Muestra

Y(DM) = Log DM sup + LogR+

Y(DS) -Y(DM)- = Log DS + Log DM sup LogR

Y(DS) Y(DM) = Log DS Log DMsup LogR

M = LogR = Log DS Log DM sup + Y(DM) -Y(DS)

x
x
S

R = antiLog

Y(DM) -Y(DS)

Pot Mtra.Sup (DMsup) = Pot Std (Ds)

Pot Mtra.real (DM) = R. Pot Mtra.Supuesta (DMsup)

Diseo Experimental
Es el plan formal para la realizacin de un
experimento.
Incluye la seleccin de: respuestas, factores,
niveles, tratamientos, restricciones, etc.

Diseo completamente aleatorio

Se utiliza cuando la totalidad de las unidades
experimentales parecen ser razonablemente
homogneas.

Cuando no hay evidencia que el entorno

experimental puede dar una variacin sesgada
a un grupo de repuestas.

Cada unidad experimental recibe un

tratamiento.

La asignacin de las unidades a los

tratamientos debe hacerse en forma aleatoria.

Diseo en bloque aleatorio

Cuando no hay evidencia que el entorno
experimental puede dar una variacin sesgada
a un grupo de repuestas.
En este diseo es posible segregar una
fuente identificable de variacin, como la
variacin entre placas Petri en un ensayo por
difusin.
Cada unidad experimental recibe todos
los tratamientos.

Diseo en cuadrado latino

Este diseo puede ser utilizado tanto en el ensayo
en placa como en el ensayo en tubo. Lo que lo
diferencia de los otros ensayos es la distribucin
espacial de los tratamientos.
El diseo consiste en que cada tratamiento se
encuentre una vez en todas las filas y en todas
las columnas.
S1
M1
M2
S3
S2
M3
M1
M2
S3
S2
M3

M3
S3
S2
M2
S1

S1
S2
M3
S3
M1

S2
S1
M1
M3
M2

M2
M3
S1
M1
S3

S3
M1
M2
S1
S2

PRINCIPIOS DEL ANOVA

Yijk =

i + j

+ k

N (0;)

( Yijk Ymedia) = Yerror + Ytratamientos + Ybloques/filas + Ycolumnas

PRINCIPIOS DEL ANOVA

SCtotales= SCerror+ SCtratamientos+ SCbloques + SCcolumnas

(Por sustraccin)

(N-1)

(k-1)

(n-1)
No aplicable a Diseo
Completamente Aletorizado

SCRegresin

+ SCDesvio Linealidad

(1)

+ SCDesvio Paralelismo + SCPreparaciones

h. (d-2)

YCurvatura Combinada +
(h-1)

(h-1)

YCurvatura Opuesta
(1)

(h-1)
N: nmero de respuestas totales
h: nmero de preparaciones
d: nmero de dosis
n: nmero de replicas (o bloques)
k=h x d : nmero de tratamientos

ANOVA y pruebas de validez para un diseo en bloques

Fuente variac
Preparac.
Regresin
Paralelismo
Curvatura comb.
Curvatura op.
Desv. lineal.
Tratamient.
Bloques
Error
Total

gl
1
1
1
1
1
2

SC
CM=SC/gl Fexp=CM/CMerr
2
[(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)] /6n
[(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
[(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
[(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n
[(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
SC curv. comb + SC curv. opuesta

d-1
[(S12+S22+S32+U12 +U22+U32)/n]-G2/N
n-1
(Rj2 / 6)-G2/N
(N-6)-(n-1) SC total - SC tratam- SC bloques
N-1
Y2 - G2/N

s2

k =dxh = n de tratamientos
G2/N = (yi )2 / N
n = n de respuestas de cada tratamiento (replicas)
yi = respuesta individual
N = n total de respuestas
Rj = sumatoria de todos los valores experimentales del bloque j.
SC = suma de cuadrados
CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrn
s2 = Estimador de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.

ANOVA y pruebas de validez:

Obtencin del estadstico de prueba

Para cada Fuente de Variacin que se quiere corroborar

Fcalculado= CM Fuente de variacin

CMError = S 2

Regresin
Desviacin Linealidad
Desviacin Paralelismo
Preparaciones
Bloques

F (g.l.efecto;g.l.error)

Sea o no la H0 verdadera E ( CMerror) = 2

Si y solo s, H0 es verdadera E ( CMefecto a medir) = 2

ANOVA y pruebas de validez:

Comparar contra el valor de tabla de Fisher para
una determinada probabilidad con los grados de
libertad correspondientes al CM del numerador y del
denominador
Zona de Rechazo

Si
Fcalculado > F (;1,N-d)
Se rechaza H0 con un nivel de significacin .

95%

= 0,05
= 0,01
4,242

7,77

Significado estadstico del test:

Cuando el Fcalculadoes mayor que el Ftabla se pude decir que el
termino es SIGNIFICATIVO ( la variacin del termino comparado
es mucho mas importante que la del Error Experimental).
En este caso el nivel de significacin representara:
La probabilidad mxima de equivocarme al decir que el efecto
es SIGNIFICATIVO. (probabilidad mxima de equivocarme
al rechazar H0)

95%

P< 0,01

= 0,05
= 0,01
4,242 7,77

Fcalculado

Significado estadstico del test:

Cuando el Fcalculado es menor que el Ftabla se pude decir que el
termino es NO SIGNIFICATIVO ( la variacin del termino
comparado NO es importante con respecto al Error Experimental).
P > 0,05

= 0,05

95%

= 0,01
2,92

4,242

7,77

ANOVA y pruebas de validez:

Regresin
-Es el termino que relaciona el cambio de respuesta con el
cambio de dosis.
para Log D2 > Log D1
H0 : Y2 = Y1
H1: Y2 Y1
=0
0
-El CMRegresin.da idea del valor de la pendiente del ensayo (a
mayor pendiente mayor CMRegresin.).
R
e
g
r
e
s
i

Error

Log D1

Log D2

En el caso del Fcalculado > Ftabla. =0,05

implicara que la Diferencia entre Dosis es
SIGNIFICATIVA con respecto al error
experimental.
La probabilidad de equivocarme al rechazar
H0 es menor al 5 %.
En el caso del Fcalculado > Ftabla. =0,01
implicara que la Diferencia entre Dosis es
MUY SIGNIFICATIVA.

ANOVA y pruebas de validez:

Desviacin del paralelismo
-Es el termino que relaciona la diferencia de pendientes entre las
distintas preparaciones.
H0 : Std = Mtra
H1 : Std Mtra
=Y
x

=Std - Mtra =YStd - YMtra

Error

Log D1

Log D3

En el caso del Fcalculado < Ftabla. =0,05

Implicara que la Diferencia entre las
pendientes es NO SIGNIFICATIVA con
respecto al error experimental.
En este caso no se podr rechazar H0
porque de hacerlo se realizara con un error
mayor al 5% (P> 0,05) .
En el caso de que la desviacin sea
SIGNIFICATIVA el ensayo es invalido por
incumplimiento del principio de similitud.

ANOVA y pruebas de validez:

Preparaciones
-Es el termino que relaciona la diferencia de respuestas media
entre las distintas preparaciones.
H0 : YStd = Ymtra
H1 : YStd Ymtra
-Refleja la diferencia entre las respuestas entre las Preparaciones
y por ende en sus potencias .
= YStd - YMtra

Prep Error

Log D1

En el caso del Fcalculado < Ftabla. a=0,05

Implicara que la Diferencia entre las
Preparaciones es NO SIGNIFICATIVA con
respecto al error experimental.
Si el Fcalculado > Ftabla. a=0,05 la diferencia entre
preparaciones es significativa. Esto no invalida el
ensayo pero lleva aparejado una disminucin
Log D3 considerable de la precisin.

ANOVA y pruebas de validez:

Desviacin de la Linealidad
-Es el termino que relaciona la falta ajuste ,para un modelo
lineal, del aumento de la respuesta en funcin del Log Dosis.
H0 : i = a+bxi

H1 : i a+bxi

Para evaluar la desviacin de la

Linelidad se desglosa en el
estudio de las Curvaturas.

Error
Desviacin
Linealidad

Log D1

Log D3

ANOVA y pruebas de validez:

Desviacin de la Linealidad (continuacin)
El estudio de las Curvaturas se hace a travs de las derivadas
segundas.
Para una Recta la derivada segunda = 0.
Las funciones no lineales tendrn derivadas segundas 0

f(x)
f (x)
f (x)

y = a+bx = a+y x
x
y = y2-y1 = y3-y2
x x2-x1 x3-x2
y = (y3-y2) - (y2-y1) =
= y3 -2y2 +y1 = Q

ANOVA y pruebas de validez:

Desviacin de la Linealidad (continuacin)
Estudio de curvaturas
-Curvatura Combinada: la suma de ambas curvaturas no debe ser
significativa. = Qs+ Qu
-Curvatura Opuesta: la resta de ambas curvaturas no debe ser
= Qs- Qu
significativa.

Log D1

Log D3

Log D1

Log D3

ANOVA y pruebas de validez:

Bloque
-Es el termino que relaciona la diferencia entre los distintas
bloques, independientemente de los tratamientos.
H0 : 1 = 2 = j
H1 :algun j
1=2=j=0

algun 0

En el caso del Fcalculado < Ftabla. a=0,05

implicara que la diferencia entre las bloques es
NO SIGNIFICATIVA con respecto al error
experimental.
Si el Fcalculado > Ftabla. a=0,05 la diferencia entre
bloques es significativa. Esto no invalida el
ensayo pero es necesaro reevaluar los criterios de
validez sin tener en cuenta la placa anomala.

ANOVA
Modelo de lneas paralelas

SI

Paralelismo= Signif.

NO
NO

Regresin= Signif.

SI
SI
Desv. Linealidad= Signif.

NO
Dif. e/ Preparaciones= Signif.
Error residual= grande
Descartar placa
anmala

SI

SI

NO
Dif. e/ Bloques= Signif.

NO
Aceptar el ensayo
y el clculo de Potencia

Repetir el ensayo y
ajustar la Pot. supuesta

Rechazar
el ensayo

DATOS PERDIDOS
La simplicidad del diseo equilibrado puede perderse por la
perdida de una respuesta, pero puede mantenerse
reemplazando la respuesta perdida por un valor calculado.
La perdida de informacin se tiene en cuenta disminuyendo
los grados de libertad de la SCtotal y de la SCerror.
Los valores reemplazados no deben ser superiores al 5 % de
las respuestas.
Diseo Completamente Aleatorio.
El valor perdido puede ser reemplazado por la media
aritmtica de las otras respuestas del mismo tratamiento.

DATOS PERDIDOS
Diseo en Bloque Aleatorio.
y = n B + k T - G
(n-1) (k-1)
Diseo en Cuadrado Latino.
y = k (B+ T + C) - 2G
(k-1) (k-2)
B = suma de respuestas del bloque o fila..
C = suma de respuestas de la columna.
T = suma de respuestas del tratamiento.
G = suma de todas las respuestas registradas.

CLCULO DE POTENCIA
u =(U1 +U2+U3) / 3 n
M

s = (S1 +S2+S3) / 3 n
b =[(S3- S1)+( U3 - U1)] / 4 n I
I=log 2da dosis - log 1ra dosis

Log D1

Log D3

log R (relac de pot.) = M (log de la pot.) = (u - s) / b

R = antilog M
P = R x Psupuesta

CORRECCION POR PESADA

Potstdreal x pesorealstd x fdilucin = Potmtrasup x pesorealmtra x fdilucin
Vreal
Vreal
Potstdteor x pesoteorstd x fdilucin = Potmtrateor x pesoteormtra x fdilucin
Vteor

Vteor

Potstdreal x pesorealstd

Potstdteor x pesoteorstd
Potmtrasup

Potmtrasup x pesorealmtra
Potmtrateor x pesomtrateor

pesorealstd x Potmtrateor x pesomtrateor

pesoteorstd x pesorealmtra

Preal = R x Psup = R x Potmtrateor x pesomtrateor

pesorealmtra

pesorealstd
pesoteorstd

CLCULO DEL INTERVALO DE CONFIANZA

Ms
CxM

V (C - 1) (C x M

+ c' I2)

MI
C = E/E-s2 t2
E = SC regresin
S2 = Estimador de la varianza por el CM del error en el ANOVA.
t = Estadstico de Student.
M = Logaritmo de la relacin de Potencias.
c' = 4/3 h
h = n preparaciones
I = Logaritmo de la relacin entre dosis adyacentes.
Rs = antilog Ms
RI = antilog Mi

Ps = Rs x Pot. supuesta
PI = RI x Pot. supuesta

Ls= (Ps- P)/Px100

Li= (P - PI)/Px100

ANOVA y pruebas de validez para un diseo

completamente aleatorio
Fuente
Preparac.

gl
1

SC
[(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n

Regresin

[(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n

Paralelismo

[(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n

Curvatura comb.

[(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Curvatura op.

[(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Desv. lineal.

SC curv. comb + SC curv. opuesta

Tratamient.

k-1

Error

(N-k)

Total

N-1

CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr

[(S12+S22+S32+U12 +U22+U32)/n]-G2/N
SC total - SC tratam
Y2 - G2/N

k = n de tratamientos
n = n de respuestas de cada tratamiento (replicas)
N = n total de respuestas
G2/N = (yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados
CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrn
s2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.

s2

ANOVA y pruebas de validez para un diseo

completamente aleatorio
Fuente
Preparac.

gl
1

SC
[(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n

Regresin

[(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n

Paralelismo

[(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n

Curvatura comb.

[(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Curvatura op.

[(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Desv. lineal.

SC curv. comb + SC curv. opuesta

Tratamient.

k-1

Error

(N-k)

Total

N-1

CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr

[(S12+S22+S32+U12 +U22+U32)/n]-G2/N
SC total - SC tratam
Y2 - G2/N

k = n de tratamientos
n = n de respuestas de cada tratamiento (replicas)
N = n total de respuestas
G2/N = (yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados
CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrn
s2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.

s2

ANOVA y pruebas de validez para un diseo

completamente aleatorio
Fuente
Preparac.

gl
1

SC
[(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n

Regresin

[(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n

Paralelismo

[(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n

Curvatura comb.

[(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Curvatura op.

[(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Desv. lineal.

SC curv. comb + SC curv. opuesta

Tratamient.

k-1

Error

(N-k)

Total

N-1

CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr

[(S12+S22+S32+U12 +U22+U32)/n]-G2/N
SC total - SC tratam
Y2 - G2/N

k = n de tratamientos
n = n de respuestas de cada tratamiento (replicas)
N = n total de respuestas
G2/N = (yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados
CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrn
s2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.

s2

ANOVA y pruebas de validez para un diseo

completamente aleatorio
Fuente
Preparac.

gl
1

SC
[(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n

Regresin

[(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n

Paralelismo

[(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n

Curvatura comb.

[(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Curvatura op.

[(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n

Desv. lineal.

Tratamient.

k-1

Error

(N-k)

Total

N-1

CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr

SC curv. comb + SC curv. opuesta

[(S12+S22+S32+U12 +U22+U32)/n]-G2/N
SC total - SC tratam
Y2 - G2/N

k = n de tratamientos
n = n de respuestas de cada tratamiento (replicas)
N = n total de respuestas
G2/N = (yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados
CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrn
s2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.

s2

Bibliografa:
Farmacopea Argentina Sptima Ed <770>
Real Farmacopea Espaola.
Elementos de Bioestadistica. Ctedra de matemtica (FFyB - UBA)
Farmacopea Europea.
William Hewitt Microbiogycals Assay.

Muchas Gracias!