TCNICAS HISTOLGICAS

La Histologa es una disciplina con ms de 100 aos de antigedad, en este tiempo los
histlogos han desarrollado gran cantidad de instrumentos, tcnicas y procesos para poder
visualizar las clulas y los tejidos. Describir todos estos instrumentos, tcnicas y procesos
sera motivo de una coleccin de libros completa.
El objetivo de este manual es introducir al estudiante en el conocimiento de las tcnicas e
instrumentos ms habituales en un laboratorio de Histologa, con el objetivo que el
estudiante entienda cmo se han obtenido las muestras que luego estudiar al microscopio
y as mejorar su proceso de aprendizaje.
Por esto centraremos el guin principal de este tema en las tcnicas e instrumentos ms
habitualmente utilizados y en la parte final explicaremos otros tipos de instrumentos,
tcnicas y protocolos, que aunque se usan en Histologa lo hacen de forma espordica, para
estudios determinados y especficos.
EL MICROSCOPIO
La Histologa se centra en el estudio de clulas y tejidos. Dado el pequeo tamao de estas
estructuras, el histlogo requiere de sistemas de aumento de la imagen, lo que conocemos
como microscopios, ya que a simple vista estas estructuras resultan tan pequeas que no
pueden ser claramente discernidas.
En la actualidad hay mltiples tipos de microscopios, aunque el microscopio ptico de
campo claro es la herramienta bsica de estudio y como tal el estudiante debe conocerlo
suficientemente.
Para empezar, hay una serie de hechos que el estudiante debe conocer:
A.- El ojo humano es capaz de distinguir cosas pequeas, pero como cualquier otro sistema
ptico, tiene un lmite; es decir, llega un momento que no es capaz de distinguir dos puntos
como elementos separados sino como un slo elemento. A esta separacin mnima que
permite reconocer dos puntos como separados se le conoce como "Lmite de resolucin".
Esto ha hecho que el ser humano haya buscado sistemas para ampliar la imagen.
B.- El desarrollo de las primeras lentes en el siglo XVII provoc la aparicin de los primeros
y rudimentarios microscopios. Desde entonces, los microscopios han evolucionado hasta los
actuales. A pesar de este desarrollo los microscopios pticos tienen un lmite de resolucin
que limita los aumentos y que viene determinado por la naturaleza propia de la luz.
C.- Hoy en da los mejores microscopios pticos no sobrepasan los 1000 - 1500 aumentos y
tienen un lmite de resolucin de 0,2 m (0,0002 mm).
D.- Se llaman microscopios simples a aquellos que tienen una, o un nico conjunto de
lentes. Es lo que coloquialmente se conoce como lupa.
E.- Se llaman microscopios compuestos a aquellos que tienen dos lentes o conjuntos de
lentes, unas se conocen como lentes objetivos y las otras como lentes oculares. Los
microscopios de laboratorio actuales son microscopios compuestos.
F.- En un microscopio compuesto es fundamental que la muestra a observar sea muy fina
para que la luz pueda atravesarla y llegar a la lente objetivo.
G.- La luz atraviesa los diferentes tejidos de un corte de forma similar por lo que resulta
casi imposible distinguir los diferentes componentes del corte. Es por eso que resulta
necesario teir los cortes para poder distinguir sus elementos componentes.
Adems hay una serie de conceptos y definiciones relacionados con la microscopa que el
estudiante tambin debe conocer para entender el microscopio y as manejarlo con ms
eficiencia.

CONCEPTOS Y DEFINICIONES:
- Aumento: Es el nmero de veces que un sistema de microscopio puede incrementar el
tamao de la imagen de un objeto.
- Poder de resolucin: Es la capacidad de un sistema ptico de mostrar como elementos
separados dos puntos muy cercanos entre s.
- Lmite de resolucin: Es la distancia ms pequea a la que un microscopio puede mostrar
dos puntos prximos como elementos separados y no como un nico punto. Este parmetro
depende de la longitud de onda de la luz (energa utilizada) y la apertura numrica del
objetivo utilizado. En trminos prcticos en un microscopio ptico convencional con un
objetivo de 100x (y ocular y lentes intermedias de 15x, es decir a unos 1500 aumentos) es
de 0,2 m. Se calcula mediante la frmula: LR=/2AN (donde representa la longitud de
onda y AN la apertura numrica).
- Apertura numrica: Es la capacidad del objetivo para dejar pasar la luz (mide el cono de
luz que un objetivo puede admitir). Es nica para cada objetivo.
- Profundidad de campo: Es la distancia entre las partes ms separadas de un objeto
(siguiendo el eje ptico del microscopio), que pueden verse sin necesidad de modificar el
enfoque. Esta distancia es mayor en los objetivos de pequeo aumento y menor en los de
mayor aumento.

El Microscopio ptico es un instrumento de precisin formado por multitud de piezas y

partes, de las que es conveniente el estudiante conozca las ms importantes. 1
- Ocular: Es el conjunto de lentes que forma la imagen final ampliada que observamos.
- Revlver porta-objetivos: Los microscopios actuales suelen llevar varios objetivos que se
disponen en una rueda llamada revlver. Para colocar el objetivo deseado hay que mover el
revlver hasta la posicin apropiada. Podemos encontrar microscopios dotados con revlver
de 3, 4 o 5 posiciones.
- Objetivo: Es el dispositivo que contiene el conjunto de lentes que captan la luz
proveniente de la muestra y generan la primera ampliacin, los hay de diferentes
aumentos.
- Platina porta-muestras: Es la superficie donde se coloca la muestra a observar.
- Sistema Keller: Permiten centrar el haz de luz en el eje ptico del microscopio. (No todos
los microscopios disponen de estos sistemas).
- Condensador: Permite concentrar el haz de luz en una zona pequea de la muestra. (No
visible en el esquema).
- Diafragma: Permite regular el contraste de la imagen.
- Control de intensidad de luz: Muchos microscopios actuales disponen de este dispositivo
de control de la intensidad luminosa.
- Ruedas de desplazamiento: Son los mandos que permiten desplazar la muestra a lo largo
y ancho de la platina porta-muestras (ejes X e Y).
- Control de enfoque micromtrico: Permite el foco fino mediante ligeros desplazamientos
(en el eje Z) de la platina porta-muestras.
- Control de enfoque macromtrico: Permite la aproximacin al plano focal mediante
mayores desplazamientos de la platina porta-muestras a lo largo del eje Z (vertical).
- Estativo: Es la carcasa metlica que sirve de soporte a todo el resto del sistema. El
estativo se acopla a la base formando un bloque slido y estable.
Diferentes conjuntos de lentes y otros elementos pticos definen la trayectoria de la luz en
el microscopio.
1.- La luz necesaria para el funcionamiento del microscopio es generada por una bombilla.

2.- El dimetro del haz se restringe mediante el uso de una apertura (una placa metlica
con un agujero.
3.- Las lentes condensadoras condensan el haz sobre la muestra.
4.- El objetivo realiza una primera ampliacin de la imagen. La ampliacin depende del
objetivo elegido.
5.- Un prisma cambia la direccin de la luz para realizar una observacin cmoda en un
ngulo correcto.
6.- El ocular realiza la segunda y definitiva ampliacin de la imagen.
Como se puede observar en el esquema los elementos pticos presentes en un microscopio
son numerosos y variados y los podemos dividir en dos categoras: aquellos destinados a
generar, modular, concentrar y condensar la luz (como diafragmas, condensadores,
aperturas, etc...) y aquellos otros destinados a ampliar la imagen (objetivos y oculares).
Sin duda los ms importantes son objetivos y oculares.
- Objetivos: El microscopio suele disponer de tantos objetivos diferentes como posiciones
tiene el revlver, los ms habituales son los revlveres de 4 posiciones. La variedad de
objetivos en el mercado es grande, aunque los 4 objetivos ms habituales en los
microscopios de laboratorio suelen ser 4x, 10x, 40x y 100x, siendo este ltimo de
inmersin.
- Oculares: Todo microscopio de laboratorio convencional dispone de 1 (si es monocular) o
de dos oculares iguales (si es binocular). Los oculares ms habituales con de 10 aumentos
(10x) aunque algunos fabricantes ofertan, para trabajos especiales, otros oculares (5x
15x, por ejemplo).
Teniendo en cuenta que los aumentos totales de un microscopio es el resultado de la
multiplicacin de los aumentos parciales de objetivo y ocular podemos deducir que el rango
de aumentos de un microscopio ptico convencional va de 40x a 1.000x.
En los microscopios binoculares un o los dos oculares pueden graduarse, lo que permite
una correcta visin binocular incluso si se usa gafas, cuya correccin ptica puede
compensarse graduando los oculares. En un microscopio monocular no es necesario ni esto.
EN LA MAYORA DE CASOS NO ES NECESARIO USAR LAS GAFAS CON EL MCIROSCOPIO.
El estudiante debe aprender a operar el microscopio correctamente. 2
El primer paso es comprobar que el microscopio est correctamente conectado y la luz
funciona con la intensidad adecuada.
En primer lugar, recordar al estudiante que use gafas que debe ajustar los oculares.
Aunque parezca obvio hay que colocar la preparacin correctamente, es decir con el
cubreobjetos hacia arriba.
El estudio de cualquier preparacin debe empezar con el objetivo ms pequeo (en muchos
microscopios el objetivo 4 X). Lo ms habitual es estudiar toda la superficie de la muestra
para localizar las diferentes estructuras.
Una vez localizada la estructura que se desea estudiar cambiar al siguiente objetivo (10x) y
realizar la misma operacin, hasta llegar, si es preciso, al objetivo de mayor aumento
(100x).
Sin duda el estudiante conocer el concepto de "Difraccin de la luz", el cual se puede
resumir diciendo que la luz cambia ligeramente de direccin cuando pasa de un medio a
otro (por ejemplo del vidrio al aire). El cambio de direccin se da segn un ngulo que
depende de cada uno de los medios y que puede expresarse por un valor nico para cada
medio que se conoce como "ndice de refraccin".
Usando objetivos de poco aumento este fenmeno apenas afecta a la observacin, pero s

que se convierte un inconveniente cuando usamos un objetivo de 100x, fundamentalmente

debido a que a estos aumentos la preparacin debe estar muy cerca del objetivo y el
cambio de direccin de la luz desde el vidrio (portaobjetos) al aire y otra vez al vidrio
(lente) provoca que no pueda enfocarse correctamente la muestra. para evitar esto se debe
colocar, entre la lente del objetivo y la parte superior de la muestra una pequea gota de
un aceite especial (aceite de inmersin), el cual tiene un ndice de refraccin similar al del
vidrio, por lo que la luz no cambian de direccin en esta interface y consecuentemente se
puede enfocar sin problemas.
Si despus de estudiar la muestra con el objetivo 100x fuera necesario volver a estudiarla
con el objetivo 40x es necesario recordar que la muestra an tiene una gota de aceite de
inmersin que ensuciar este objetivo, por lo que ser necesario limpiarla con un pauelo o
trozo de papel suave empapado en solucin limpiadora.
Una vez acabada la observacin se debe retirar la preparacin limpiarla, como se acaba de
describir, al igual que el objetivo de 100x.
Al terminar el perodo de observacin se debe comprobar que tanto el microscopio (platina,
objetivos), as como las preparaciones estn totalmente limpios.
Tambin comprobaremos que el microscopio est correctamente desconectado y nos
aseguraremos de dejar colocado el objetivo ms pequeo, para facilitar el siguiente uso del
microscopio.
PREPARACIN DE MUESTRAS
Ahora que conocemos que el microscopio ptico obtiene una imagen ampliada al atravesar
la luz una muestra y un conjunto de lentes, resulta evidente que no podemos estudiar un
rgano o un trozo de un rgano al microscopio, ya que la luz no la podra atravesar. Se hace
necesario obtener muestras finas que la luz pueda atravesar y se puedan estudiar al
microscopio.
Cmo hacer para obtener muestras finas?
La respuesta es obvia, hay que realizar cortes finos del rgano a estudiar, lo cual no resulta
fcil, esto lo podr comprobar el estudiante si intenta cortar con un cuchillo muy afilado un
trozo de carne fresca, comprobar que no puede obtener lminas finas. Esto es debido a
que la carne fresca no tiene ni la consistencia ni la dureza necesaria para poder obtener
cortes lo suficientemente finos, mientras que si congelamos la carne o la dejamos secar, si
que resulta posible cortar la carne, ya que esta, en ambos procesos, ha aumentado su
dureza y consistencia..
Como los rganos a estudiar tienen una consistencia similar al trozo de carne fresca del
ejemplo se hace necesario incrementar la dureza y consistencia de forma artificial, para ello
existen diferentes mtodos, siendo el mtodo ms empleado la inclusin en parafina. No es
un proceso simple y consta de numerosos pasos. 3
1.- FIJACIN
El material biolgico, a partir del momento de la muerte, sufre un proceso de degradacin,
conocido como putrefaccin, debido tanto a causas endgenas (autolisis) o exgenas
(ataques bacterianos). Resulta evidente que esta degradacin dificulta progresivamente (a
ms tiempo ms degradacin) el estudio de las estructuras biolgicas al microscopio.
Para evitar esta degradacin se hace necesario estabilizar las estructuras y hacerlas
inasequibles a tal degradacin, para ello se utilizan sustancias qumicas conocidas como
"fijadores". La naturaleza qumica de los fijadores es variada aunque suelen ser molculas
con varios grupos activos que se unen a diferentes molculas de la clula generando una
red molecular interconectada que hace los ataques bacterianos y enzimticos sean
infructuosos, manteniendo de esta manera la estructura celular.
Para las tcnicas de microscopa ptica convencional se suelen utilizar fijadores basados en

el formaldehido, bien sea en soluciones tamponadas o mezclado con otras especies

qumicas (como con el cido pcrico en el caso del fijador de Bouin).
La forma de administrar el fijador a la muestra depende mucho de las circunstancias de
obtencin.
- As, en muestras humanas (y animales) obtenidas post-mortem (necropsias) u obtenidas
por extraccin directa (biopsias), el mtodo de fijacin es sencillo: se sumerge la muestra
en un recipiente lleno de la sustancia fijadora. El fijador debe difundir por los tejidos para
realizar su accin. A veces, y dependiendo de la naturaleza de los tejidos esta penetracin
no es completa y se observa un gradiente de fijacin, estando mejor fijadas las zonas
perifricas y con peor fijacin, las zonas centrales.
- En el caso de animales de experimentacin y para evitar el efecto de gradiente de fijacin
se suele utilizar el mtodo de la perfusin. La idea es sencilla: se trata de inyectar el lquido
fijador en el sistema cardiovascular para que este lo distribuya por todo el organismo y as
la fijacin sea homognea en todos los tejidos. Normalmente se suele inyectar el lquido
fijador a la altura del ventrculo cardaco o arteria aorta y se debe drenar la sangre a la
altura de la aurcula para evitar una sobrepresin del sistema que produzca rotura de
capilares sanguneos.
Sea en un caso o en el otro se deja la pieza un tiempo para que el lquido fijador concluya
su efecto. En este punto la pieza se introduce en un casete porta-muestras (una pequea
caja de plstico agujereada). Este porta-muestras permite el fcil cambio de las muestras
de unos recipientes a otros manteniendo la integridad de la pieza. Pasado el tiempo de
fijacin la pieza debe limpiarse con frecuentes baos de agua, primero agua corriente y
posteriormente agua destilada, para eliminar los restos de fijador que pudieran reaccionar
con las sustancias qumicas que debern ser usadas posteriormente.
2.- INCLUSIN
La inclusin es el proceso por el cual se incrementar la dureza y consistencia de la pieza
para permitir su corte. Esto se consigue incluyendo la pieza en una sustancia que tenga la
dureza y consistencia adecuada. La sustancia habitualmente utilizada en este proceso es la
parafina. El reto consiste en sustituir el agua que hay en el interior y exterior de las clulas
por parafina.
La parafina es una sustancia que por encima de los 600C es lquida y solidifica por debajo
de esta temperatura, esto facilita de difusin de la parafina por los tejidos cuando est
lquida, no obstante otro problema que hay que salvar es el hecho que la parafina es
altamente hidrfoba, es decir no se puede mezclar con el agua o sustancias en medio
acuoso. Por ello el siguiente paso que debe sufrir las muestras es la eliminacin del agua de
la muestra: la deshidratacin.
La deshidratacin de las muestras se consigue mediante una sustitucin progresiva del
agua por etanol. Para conseguirlo se somete a las piezas a sucesivos baos de etanol de
gradacin creciente, empezando por etanol 500 700 y concluyendo con diferentes baos
de etanol absoluto (1000), pasando por baos de etanol 960.
La pieza, ya deshidratada, an no puede ser pasada a parafina ya que el etanol no es
miscible con la parafina. Se usa un agente intermediario, es decir una sustancia que sea
miscible tanto con el etanol como con la parafina. El intermediario habitualmente usado es
el Xileno, en el que la pieza sufre varios baos para sustituir totalmente al etanol.
Con la pieza en Xileno, se suele pasar por un bao de una mezcla de Xileno-Parafina al 50%
para favorecer la penetracin de la parafina. Posterior a este bao se suceden varios baos
en parafina pura hasta conseguir que la parafina haya penetrado completamente en toda la
pieza. Todos estos baos que incorporan parafina se realizan en estufa 600C para mantener
la parafina lquida. En algunos laboratorios todo este proceso se realiza de forma
automatizada usando un dispositivo (robot), que va cambiando las muestras de un lquido a

otro mediante un programa preestablecido.

Una vez pasado el tiempo necesario para que la parafina penetre en los tejidos, la cuestin
es realizar un bloque con todo ello, que pueda ser usado en el microtomo para obtener
cortes. 4
La forma ms sencilla es usar un molde en el que se vierte la parafina y en el que se
introduce la muestra procesada y se deja enfriar para que el conjunto se solidifique. En
muchos laboratorios se utiliza una estacin a tal efecto. Estas estaciones disponen de
depsito de parafina lquida (600C), desde el que se puede dispensar parafina sobre el
molde mediante un grifo; dispone tambin de una cmara donde se guardan los diferentes
moldes a 600C y una placa caliente (600C) y otra fra (40C). La dinmica es sencilla, se
coloca el molde debajo del grifo dispensador de parafina y se llena con parafina lquida, se
coloca la pieza y se orienta, colocando, por ltimo la base del casete de inclusin. Se
desplaza con cuidado el conjunto encima de la placa fra para conseguir una solidificacin
rpida que no forme cristales y una vez solidificado se extrae el molde obteniendo un
bloque listo para cortar, tal y como se ve en el esquema interactivo.
3.- CORTE (EL MICROTOMO)
El microtomo (del griego, micros "pequeo" y tomos "seccin/parte") es el instrumento
adecuado para obtener cortes finos de material biolgico incluido en parafina.
En esencia, el microtomo consta de una cuchilla fija y de un brazo mvil, el cual adelanta y
sube y baja la muestra, para que esta incida sobre la cuchilla y as obtener los cortes. A
este tipo de microtomos se les denomina "microtomo rotatorio o de Minot". 5
El brazo es capaz de adelantar la muestra distancias muy pequeas (habitualmente de 5 a
10 m) gracias a un sistema mecnico de precisin basado en un tornillo sin fin de paso de
rosca muy fino.
En el extremo del brazo hay unja pinza en la que encajan las bases de casete utilizadas
para formar el bloque. El brazo avanza con el bloque en posicin elevada, cuando ha
avanzado la cantidad de micras deseada el brazo baja el bloque incide sobre el filo de la
cuchilla y el corte se deposita sobre ella, cuando el brazo llega a su posicin inferior, vuelve
a subir e inicia un nuevo ciclo de corte. El proceso se controla mediante una manivela
circular, que al ser accionada concluye un ciclo de corte por cada vuelta.
Las cuchillas de microtoma estn muy afiladas para conseguir cortes finos y homogneos,
en la mayora de laboratorios se suelen utilizar cuchillas intercambiables, que son
sustituidas cuando pierden filo.
Al incidir el bloque en el filo de la cuchilla, por el rozamiento, se incrementa la temperatura
lo suficiente para que el borde del nuevo corte su funda ligeramente y se una con el corte
previo, as, al realizar varios cortes, estos forman una tira sobre la superficie de la cuchilla.
4.- MONTAJE DE CORTES
Para poder observar los cortes al microscopio es necesario montarlos sobre una fina lmina
de vidrio (portaobjetos). 6
Para ello, en primer lugar se separan los cortes uno a uno o en pequeas tiras que puedan
ser montadas sobre el portaobjetos.
Los cortes salen arrugados del microtomo debido a la friccin entre la cuchilla y el bloque,
por lo que se hace necesario estirar los cortes para su correcta observacin.
Para conseguirlo los cortes se hacen flotar en un bao de agua templada (sobre los 35360C). Por efecto del calor, la parafina se dilata estirando el corte hasta dejarlo
completamente liso. Cuando los cortes ests estirados, sencillamente se pescan con el
portaobjetos. Previamente sobre la superficie del portaobjetos se extiende una fina capa de
una sustancia adherente que fija el corte al portaobjetos y evita que el corte se desprenda
en los procesos posteriores. En muchos laboratorios se usa la Poli-L-Lisina como sustancia

adherente.
Cuando tenemos los cortes situados sobre el portaobjetos se dejan secar (habitualmente en
una estufa a 35-360C).
5.- TINCIN
El material biolgico cortado fino es, bsicamente, transparente, por lo que no se puede
distinguir nada al observarlos al microscopio.
Es por esto que se hace necesario teir las muestras para poder distinguir las clulas y los
tejidos.
Los protocolos de tincin se realizan mediantes baos secuenciales de distintos colorantes
y reactivos. Hay diferentes formas de hacer esto:
- Se pueden poner los portaobjetos sobre una rejilla dispuesta en una bandeja y mediante
una pipeta se van colocando los diferentes colorantes y reactivos.
- Se pueden teir varios portaobjetos colocados en cestillas especiales de vidrio las cuales
se van pasando de una cubeta a otra, conteniendo cada cubeta el colorante o reactivo
pertinente.
- Este mismo proceso de tincin en cestillos se puede realizar de forma automatizada
mediante un robot que va cambiando automticamente el cestillo de cubeta mediante un
programa de tiempos predeterminado.
Sea cual sea el mtodo empleado, el protocolo (secuencia de pasos) de tincin a emplear
depender de aquello que se quiera mostrar de los tejidos procesados.
De protocolos (tcnicas) de tincin se han escrito numerosos libros ya que son muy
numerosos y variados. Al final de este tema haremos una resea de las tcnicas ms
habituales utilizadas en Histologa.
Entre todas las tcnicas de tincin hay una que destaca sobre las dems ya que es con
mucha diferencia, la ms utilizada en todo el mundo, se trata de la tcnica de la
Hematoxilina-Eosina. 7
La hematoxilina es una mezcla colorante (existen diferentes variantes) que tiene un
carcter bsico por lo que se une a sustancias cidas. En las clulas, la zona ms cida es
el ncleo ya que est repleto de cidos nuclicos (ADN), por lo qu el ncleo se teir con
la hematoxilina de un color azul-violceo.
La eosina es un colorante de tonalidad rosa-rojo que se disuelve en etanol y tiene un
carcter cido, por lo que se une a las estructuras bsicas (pH alto) de los tejidos. Las
estructuras con mayor pH de los tejido son las protenas, debido a los puentes de Azufre y
Nitrgeno que tienen. Es por eso que en muestras procesadas con esta tcnica, se tien de
color rosa, preferentemente, el citoplasma y la matriz extracelular, ambas estructuras ricas
en protenas.
Todo proceso de tincin se puede dividir en tres fases:
- La primera fase consiste en el desparafinado e hidratacin de los cortes. Para desparafinar
se baan los cortes con Xileno, el cual disuelve la parafina y la hidratacin se realiza con
una secuencia de pasos inversa a la de la deshidratacin.
- Con la muestra en un medio acuoso se procede con el protocolo de tincin elegido. El
protocolo suele constar de una secuencia de baos con los colorantes, limpiadores y
reactivos, que es propio de cada tcnica.
- La tercera fase tiene como objeto el montaje permanente de las muestras para su
observacin al microscopio. Para montar y proteger los cortes se coloca encima de ellos un
medio de montaje: una sustancia lquida que con el aire cristaliza (polimeriza) y una lmina
muy fina de vidrio (cubreobjetos), que forman un conjunto estable y duradero. El medio de
montaje suele ser una sustancia hidrfoba, por lo que los cortes antes de ser montados han
de ser deshidratados, siguiendo un protocolo similar al utilizado durante la inclusin.
La preparacin montada se deja secar unas horas y se guarda en oscuridad para evitar que

la luz degrade los colores.

ESTUDIO DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO
Con todo lo explicado hasta ahora el estudiante se puede hacer una clara idea del proceso
que se realiza hasta obtener las preparaciones que estudiar al microscopio.
Ahora, sera conveniente que el estudiante tuviese en cuenta algunos conceptos necesarios
para el estudio de las muestras al microscopio. 8
- En primer lugar, el estudiante ha de entender que las estructuras biolgicas son
estructuras tridimensionales, y habitualmente complejas, de las cuales, al microscopio,
solamente se pueden ver secciones planas (en dos dimensiones). As, por ejemplo, los
tbulos renales son tubos cilndricos, con lo que cabria esperar que al microscopio estos
tbulos se vieran como anillos (la seccin de un cilindro). La cuestin es que estos tubos no
son rectilneos y presentan muchos giros (como otros tubos del organismo, p.ej. el
intestino), as que en un mismo corte y de un mismo tbulo se pueden ver numerosas
secciones tal y como muestra el esquema. Es decir el estudiante deber tener en cuenta
que una misma estructura cortada en diferente orientacin puede mostrar secciones
diferentes.
- Abundando en este mismo tema de la tridimensionalidad, otro hecho que hay que tener
en cuenta es la profundidad del corte. Este problema se ilustra perfectamente en el
esquema adjunto donde se toma como ejemplo un huevo (que en esencia es una clula).
Este huevo an cortado en el mismo plano puede mostrar secciones diferentes
dependiendo de la profundidad a la que se haya hecho el corte.
Es importante que el estudiante entienda ambos conceptos para poder interpretar
correctamente las estructuras que observar al microscopio.
Por otra parte el estudiante debe adoptar una dinmica correcta de observacin de
muestras para el mximo aprovechamiento de cada sesin de estudio.
Nuestro consejo es:
- Empezar por observar la preparacin a simple vista colocndola sobre una superficie
blanca. En muchos casos el estudiante podr localizar los elementos anatmicos ms
destacados del rgano a estudiar.
- En segundo lugar, colocar la preparacin en la platina y observarla con el objetivo ms
pequeo (4x) y navegar por toda la preparacin localizando las reas de inters y
elementos singulares.
- Por ltimo, y con las reas de inters localizadas, ir utilizando progresivamente los
objetivos de mayor aumento, en cada una de estas reas, hasta distinguir los elementos
estructurales, tejidos y tipos celulares propios de la muestra estudiada.
Hasta ahora hemos descrito los procedimientos, instrumentos y procesos de tincin ms
usuales en el estudio convencional de la anatoma, ahora daremos un breve repaso a otros
tipos de instrumentos, procesos de inclusin y protocolos de tincin, que tambin se suelen
utilizar en Histologa.
OTROS TIPOS DE MICROSCOPIO
Aparte del microscopio ptico de campo claro, que es el ms utilizado en cualquier
laboratorio de Histologa, existen otros tipos de microscopios cuyos resultados (imgenes)
el estudiante probablemente usar durante su aprendizaje, aunque es poco probable que
los use directamente ya que suelen ser escasos, complejos de uso y caros. 9
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET)
El microscopio electrnico de transmisin es un instrumento de estudio que utiliza la misma
estructura conceptual que un microscopio ptico convencional, pero que usa un haz de

electrones en lugar de un haz de fotones (haz de luz). 10

La longitud de onda del electrn es menor de 1nm, es decir aproximadamente unas 500
veces ms pequea que la longitud de onda de la luz (aprox. 400-600 nm), por lo que con
un microscopio electrnico de transmisin se pueden conseguir aproximadamente 500.000
de aumentos.
El hecho de utilizar electrones en un microscopio comporta una serie de problemas:
- Primero, hay que tener en cuenta que los electrones estn cargados elctricamente por lo
que si estos electrones, en su trayectoria, se encuentran con tomos, por electrosttica, las
nubes de electrones de esos tomos desviarn a los electrones del haz, haciendo imposible
la obtencin de una imagen coherente. Por esto en el interior de los microscopios
electrnicos debe hacerse el ms completo vaco.
- En segundo lugar, hemos de tener en cuenta que para que un microscopio se comporte
como tal, es necesario disponer de unas lentes, que modifiquen la trayectoria del haz. El
problema es que las lentes pticas no sirven para este propsito, as que hay que dotar al
microscopio electrnico de otro tipo de lentes. La forma de modificar un haz de electrones
es mediante el uso de un campo magntico, es por esto que las lentes de un microscopio
electrnico son bobinas electromagnticas que generan esos campos magnticos.
- En tercer lugar est el grosor del corte. Si utilizamos un corte de los utilizados para
microscopia ptica (de 5 a 10 m de grosor), la cantidad de material biolgico comprendida
en este grosor es tal que la imagen sera incomprensible. Es por esto que el grosor de los
cortes para este tipo de microscopa han de ser mucho ms finos, oscilan entre los 40 y 50
nm. (0.04-0.05 m). Adems tampoco se pueden utilizar portaobjetos de vidrio (por muy
finos que sean) ya que el haz de electrones no lo atravesara, es por esto que se suele
utilizar como portaobjetos una fina rejilla metlica (cobre), el corte reposa sobre los
filamentos de la rejilla quedando suspendido en los espacios entre filamentos.
- Luego debemos resolver el problema del contraste (tincin). Las muestras biolgicas
presentan un contraste frente a los electrones muy similar entre si y en general muy bajo,
por lo que se hace necesario incrementarlo. En microscopia electrnica no sirven los
colorantes usados en microscopia ptica (apenas ofrecen contraste frente a los electrones),
por lo que es necesario usar otro tipo de sustancias contrastadoras. Se usa bsicamente,
Acetato de uranio, esta molcula se une qumicamente al material biolgico y con la gran
cantidad de electrones del tomo de Uranio, hace que all donde haya una acumulacin de
material biolgico (con acetato de uranio adherido qumicamente) los electrones no
atraviesan la muestra, al ser desviados por la nube electrnica, mientras que all donde
haya una baja concentracin de material biolgico, los electrones atravesarn la muestra
ms fcilmente. Esto provoca que la imagen final se componga mediante la presencia o
ausencia de electrones. LAS IMGENES DE LOS MICROSCOPIOS ELECTRNICOS SON
SIEMPRE MONOCROMTICAS (BLANCO Y NEGRO).
- El ltimo problema que se ha de solucionar es la obtencin de la imagen. El ojo humano
no es capaz de ver electrones, por lo que es necesario idear un sistema para obtener una
imagen visible. El sistema utilizado es una placa de fsforo. El fsforo tiene la propiedad
que al ser alcanzado por un electrn libera un fotn, as se consigue la imagen. Aparte, los
electrones tambin pueden impresionar una placa fotogrfica convencional, e incluso con la
ayuda de un captador digital de electrones, se puede obtener una imagen en un monitor de
ordenador.
Procesamiento de muestras para el MET
En esencia el procesamiento de las muestras para el MET es similar al usado en
microscopa ptica convencional, teniendo en cuenta las peculiares propias del MET.

- En primer lugar hay que tener en cuenta que al observar a ms aumentos se hace
necesario que la conservacin de las estructuras biolgicas sea mucho ms fiel y precisa
que para la microscopa ptica. Es por ello que se suelen usar fijadores mucho ms
potentes, tales como el Glutardialdehido, e incluso se suele hacer una postfijacin con
Tetraxido de Osmio (OSO4), que tiene cuatro grupos activos, que forman redes mucho ms
tupidas del material biolgico de la muestra.
- Luego hay que tener en cuenta, que como hemos dicho el corte ha de ser mucho ms fino
(40 - 50 nm = 0,04 - 0,05 m), se les denomina cortes ultrafinos. Para ello resulta obvio que
necesitaremos un microtomo de mayor precisin (ultramicrotomo). Adems las piezas
debern incluirse en un material ms duro que la parafina para obtener cortes de tal grosor.
El material ms utilizado son las resinas sintticas poli-componente, que requieren de un
procesamiento similar al de la parafina, con la diferencia que estas resinas son lquidas a
temperatura ambiente y que polimerizan a ciertas temperaturas.
- El ultramicrotomo funciona en esencia como el microtomo rotatorio de Minot con la
peculiaridad de que su mecnica es mucho ms precisa, lo cual permite los
desplazamientos tan pequeos que se requieren para obtener cortes ultrafinos. Otra
peculiaridad de este tipo de microtoma radica en la naturaleza de las cuchillas, las cuales
han de ser de un material extremadamente duro para poder cortar los bloques de resina.
Habitualmente estas cuchillas son de un vidrio especialmente tratado que permite la
obtencin de una serie de 30 o 40 cortes, despus de los cuales la cuchilla ha de ser
reemplazada ya que ha perdido el filo. En ocasiones determinadas se pueden emplear
cuchillas con filo de diamante, que como el estudiante entender son poco habituales dado
su elevado precio. Se adosa a la cuchilla una pieza de plstico al efecto, la cual forma una
cavidad la cual se llena de agua donde flotan los cortes, una vez realizados, y donde son
capturados con las rejillas porta-muestras.
- Las rejillas con los cortes adheridos se pasan por los reactivos necesarios para realizar el
contraste (acetato de uranio y otros), luego se dejan secar y ya se pueden observar al MET.
A diferencia del procesamiento con parafina, en esta tcnica no se elimina el medio de
montaje (resina).
Con el ultramicrotomo tambin se pueden obtener cortes ms gruesos (1 - 2 mm) para su
estudio en microscopa ptica convencional (de campo claro), a estos cortes se les conoce
como "semifinos".
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB / SCANNING)
El microscopio electrnico de barrido (scanning), utiliza, tambin, un haz de electrones y
utiliza bobinas electro-magnticas como lentes, pero ah acaban las similitudes. 11
Este microscopio se utiliza para el estudio de superficies, no para el estudio de los
componentes ntimos de tejidos y clulas.
Para ello el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que unas bobinas deflectoras
realizan un barrido de la superficie de la muestra.
Procesamiento de muestras para el MEB
La muestra, para este tipo de microscopia, no es un corte fino sino que se trata de una
muestra completa (o casi completa), as con esta tcnica se pueden estudiar pequeos
organismos enteros, como por ejemplo, los insectos.
La preparacin de la muestra tambin es diferente a la que se realiza para el M.E.T. Para el
M.E.B. no se realizan cortes sino que la pieza, (una porcin de tejido, un insecto, etc...) Se
deshidrata y se recubre con una capa fina (mono-molecular) de un metal conductor
(habitualmente oro).

Al bombardear la muestra con un haz de electrones (electrones primarios) la capa metlica

reacciona emitiendo un electrn por cada electrn que recibe. Estos electrones emitidos
(que se llaman electrones secundarios) tienen la caracterstica que se emiten en un ngulo
que depende del ngulo de incidencia de los electrones primarios con respecto a la
superficie de la muestra.
Los electrones secundarios son recogidos por un captador de electrones dividido en una
matriz de celdillas, luego un sistema informtico se encarga de generar una imagen en un
monitor, en la base de: un punto de luz por cada electrn detectado.
Como los electrones secundarios indicen en la matriz en diferente nmero en cada celdilla,
debido al ngulo en el que son generados, la imagen muestra claros y oscuros, que reflejan
la superficie tridimensional de la muestra, dando una informacin adicional de los tejidos a
aquellas que se puede obtener con un Microscopio ptico convencional o incluso con un
MET.
OTROS MICROSCOPIOS PTICOS
En este apartado vamos a hacer una breve resea de otros microscopios pticos (que usan
luz), que se utilizan en el estudio histolgico, aunque en ciertas circunstancias.
Microscopio de contraste de fases:
Este tipo de microscopio se basa en la propiedad ptica del cambio de fase de un haz de luz
al atravesar un objeto compuesto de materiales de diferente ndice de refraccin. Mediante
esta tcnica se pueden observar materiales sin teir y resulta especialmente til para el
estudio de material vivo (cultivos celulares, etc...)
Dispositivo de campo oscuro:
Este dispositivo hace que la luz no incida perpendicularmente a la muestra, sino
tangencialmente, por lo que es refractada por la muestra hacia el objetivo, en las zonas en
las que no hay material se ve todo negro, de ah el nombre de campo oscuro.
Microscopio de fluorescencia:
Este microscopio utiliza luz ultravioleta en lugar de luz blanca. Esta luz provoca
fluorescencia en ciertas sustancias (fluoro-cromos) que son las que se utilizan como
colorantes. En este tipo de microscopio el fondo queda negro y las estructuras marcadas
con el fluoro-cromo emiten su propia luz (que es la que se ve).
Microscopio confocal:
El microscopio confocal es un microscopio ptico de caractersticas especiales y reciente
aparicin.
Las prestaciones de este microscopio son singulares, as por ejemplo, se pueden observar
muestras gruesas, de las que el microscopio obtiene imgenes no de todo el grosor de la
muestra, sino de secciones de pequeo grosor (al estilo de la tomografa axial
computerizada) que luego, mediante programas informticos, puede reconstruir en una
estructura tridimensional que se muestra en una pantalla de ordenador.
Tambin permite el estudio de muestras vivas (cultivos celulares) a lo largo del tiempo, lo
cual lo hace idneo para la comprensin de ciertos procesos biolgicos.
Es un microscopio de reciente aparicin, no por la complejidad ptica de sus construccin,
que ya estaba en funcionamiento en los aos cincuenta, sino por la complejidad del
hardware y software informtico necesario.
El microscopio confocal dispone de varios emisores lser, que son las fuentes de luz
utilizadas.
Cada uno de esos los lseres es de longitud de onda diferente e incide sobre la muestra

donde excita a los foto-cromos (que son los colorantes) que responden, cada uno a una
longitud de onda determinada, permitiendo la realizacin de marcajes mltiples en una
misma muestra, revelando distintas estructuras en diferentes colores.
OTRAS TCNICAS DE TINCIN
En el apartado "TINCIN" se ha comentado la tcnica de la Hematoxilina-Eosina, que es, sin
duda, la tcnica ms utilizada en Histologa, pero obviamente hay muchas ms tcnicas de
tincin. En este apartado haremos la resea de otras tcnicas, entre muchas, que tambin
se utilizan en Histologa, aunque con mucha menos frecuencia que la H-E y siempre para
mostrar caractersticas especficas de tejidos y/o tipos celulares. 12
TCNICAS QUMICAS GENERALISTAS (CONVENCIONALES)
Estas tcnicas tienen como objetivo mostrar las caractersticas generales, especialmente la
topografa, de tejidos y rganos. La base de estas tcnicas es una reaccin qumica (cidobase, oxidacin-reduccin) entre los colorantes y los elementos estructurales de los tejidos.
Estas tcnicas son muchas y muy variadas, que pueden ser clasificadas atendiendo al
nmero de colorantes, en: monocrmicas, bicrmicas y tricrmicas.
En este apartado deberamos incluir la tcnica de la Hematoxilina-Eosina (bicrmica),
explicada anteriormente.
Tcnicas monocrmicas
Estas tcnicas utilizan un slo colorante que tie todos los tejidos de forma semejante y la
diferenciacin se consigue gracias a la diferente naturaleza de los tejidos, as un epitelio
formado por una lmina continua de clulas se tie ms intensamente que el tejido
conectivo donde conviven fibras (que se tien menos) con algunas clulas.
Entre estas tcnicas cabe mencionar:
- Azul de Anilina
- Azul de Toluidina
- Hematoxilina de Hedienhain
- Rojo neutro
Estas tcnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
Tcnicas tricrmicas
Como su nombre indica, estas tcnicas utilizan una combinacin de tres colorantes. Una
caracterstica propia de estas tcnicas es que suelen teir el tejido conectivo de forma
diferencial, ya que uno de los colorantes suele tener afinidad por las fibras (colgenas) de
la matriz extracelular de este tejido.
Estas tcnicas se suelen utilizar, al igual que la hematoxilina-eosina, para el estudio
topogrfico de rganos, con el valor aadido de la facilidad de reconocimiento del tejido
conectivo.
Las tcnicas tricrmicas ms usadas son:
- Tricrmico de Masson
- Tricrmico de Mallory
Estas tcnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
TCNICAS QUMICAS ESPECFICAS
Se engloban en este apartado aquellas tcnicas que se basan en una reaccin qumica
convencional entre algn colorante y un elemento especfico propio de tipos celulares,
fibras extracelulares, etc...

A continuacin se exponen unas pocas de estas tcnicas que suelen usarse en los
laboratorios de Histologa.
Tcnica de PAS-H
Esta tcnica se basa en el uso combinado del cido Perydico junto con el reactivo de
Schiff.
Esta combinacin tie de forma selectiva mucopolisacridos. Estos componentes se
encuentran en las lminas basales de epitelios, secreciones mucosas o el glicoclix de
microvellosidades, por lo que estos elementos se tien selectivamente de color rosa-rojo.
Se suele combinar con la hematoxilina, la cual tie los ncleos de color azul-violeta y
permite localizar mejor los elementos teidos con el PAS.
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
Tcnica de PAS - Azul Alcin
Esta tcnica combina la reaccin del PAS con el azul alcin. El azul alcin tie
especficamente los mucopolisacridos de carcter cido en contraposicin del PAS que tie
mucopolisacridos de carcter neutro.
Por esto esta tcnica se usa preferentemente en el estudio de las secreciones mucosas del
tracto digestivo diferenciando secreciones mucosas neutras (rosa-rojo) de las secreciones
mucosas cidas (azul).
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
Tcnica de la Orcena Picro-ndigo-Carmn
Esta tcnica est especialmente recomendada para el estudio del sistema cardiovascular,
ya que tie de color rojo-marrn las fibras elsticas (por ejemplo las de las arterias elsticas
o las del endocardio auricular), mientras que tie de azul-verdoso plido las fibras
colgenas (por ejemplo las de la adventicia arterial o venosa o las del epicardio cardaco).
Estas tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
Tcnica de Gordon-Sweets
Est tcnica est basada en el uso de sales de plata, las que en combinacin con los otros
reactivos usados en esta tcnica, tie selectivamente de negro las fibras reticulares del
tejido conectivo.
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.
Tcnica del Sudn IV
El Sudn IV es un colorante liposoluble, por lo que resulta muy adecuado para teir
elementos grasos, tales como los adipocitos.
Para poder realizar esta tcnica, durante el procesamiento de los tejidos no se debe usar
ningn disolvente orgnico, ya que disolvera los elementos grasos que se pretende teir;
esto imposibilita el incluir las muestras en parafina, as que las muestras se suelen cortar
por congelacin, en un grosor de aproximadamente 30 m realizados con el criostato.
TCNICAS HISTOQUMICAS E INMUNOHISTOQUMICAS
Estos tipos de tincin no se basan en reacciones qumicas bsicas sino en reacciones ms
especficas tales como la actividad enzimtica o inmunolgica.
El tipo de reacciones que se aprovechan en estas tcnicas son variadas.
As podemos encontrar reacciones de alta especificidad entre molculas como en el caso de
la tcnica de la lectina de tomate.

Tcnica de la Lectina de tomate

Las lectinas son protenas que se unen selectivamente a ciertos azcares, as la lectina de
tomate se combina con la N-acetilglucosamina, que en el hgado, por ejemplo, se encuentra
en los macrfagos (clulas de Kupffer) y en las paredes endoteliales de los vasos
(sinusoides).
En Histologa se usa la lectina de tomate combinada con una molcula marcadora, (como la
biotina). La biotina luego puede ser puesta de manifiesto en un proceso de revelado. El
proceso es sencillo: se coloca la lectina marcada sobre el corte, se espera un tiempo
suficiente para que la lectina se una al azcar y luego se revela para que se vea al
microscopio.
Esta tcnica se puede realizar, tanto sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por
congelacin en el criostato, tanto en cortes de 5 a 10 m en parafina.
Las tcnicas Histoqumicas (Histoenzimticas) se basan en reacciones enzimticas de
molculas (enzimas) presentes en los tejidos de la muestra.
La mecnica general se basa en colocar un sustrato adecuado al enzima a estudiar, sobre
el corte histolgico, para que se produzca la reaccin enzimtica y posteriormente detectar
alguno de los productos de esa reaccin.
Un ejemplo de este tipo de tcnicas es la tcnicas de la NDPasa.
Tcnica de la NDPasa
La NDPasa es un enzima que se encuentra, entre otras en las clulas de microgla del
Sistema Nervioso Central y en la pared de los vasos sanguneos.
Para poner de manifiesto las estructuras que contienen este enzima en cortes histolgicos,
lo que se hace es colocar sobre el corte un producto que este enzima degrada, en este caso
Inositol-fosfato. Se deja tiempo para que se produzca la reaccin enzimtica cuyo resultado
es la formacin de precipitado en el lugar donde la reaccin se produce. Posteriormente se
amplifica el marcaje mediante un tratamiento del precipitado con sulfuro y sales de plata,
lo cual le proporciona un color pardo muy oscuro. Se hace un contraste con azul de
toluidina para localizar las clulas no marcadas.
Las clulas marcadas (microgla) aparecen al microscopio de un color marrn oscuro, al
igual que los vasos sanguneos, mientras que el resto de tipos celulares quedan teidos de
azul claro.
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por
congelacin en el criostato.
Las tcnicas Inmuno-histoqumicas se basan en el fenmeno natural del reconocimiento
especfico de una molcula (antgeno) por parte de otra (anticuerpo), esto se conoce como
reaccin inmunitaria. Si usamos un anticuerpo marcado el resultado es que la marca se
ver all donde se encuentre el antgeno (dada la especificidad de la reaccin antgenoanticuerpo).
En la actualidad la bioindustria ofrece gran cantidad de anticuerpos marcados especficos
contra una amplia variedad de antgenos.
Tcnica de la GFAP
La GFAP es una protena que se encuentra exclusivamente en los astrocitos y clulas de su
mismo linaje.
En esta tcnica inmuno-histoqumica lo que se hace es colocar sobre el corte una solucin
del anticuerpo marcado para que el anticuerpo localice y se una selectivamente a la GFAP.
Posteriormente se revela, con lo que se consigue que solamente aparezcan coloreadas las

clulas que contienen esa protena, es este caso los astrocitos.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por
congelacin en el criostato.
TCNICAS ESPECFICAS PARA EL ESTUDIO DEL SISTEMA NERVIOSO
Las neuronas (junto con las clulas gliales), son las clulas propias del sistema nervioso, y
como el estudiante conoce, tienen un cuerpo o soma celular del que parten, tanto dendritas
como axn. Esta peculiaridad hace que el tejido nervioso presente una estructura especial
en la que se entremezclan dendritas y axones (parnquima nervioso / neuropilo) y en el que
se localizan los somas neuronales.
Esta caracterstica peculiar junto con el inters que despierta el estudio del Sistema
Nervioso ha provocado el desarrollo de numerosas tcnicas de tincin propias de este
tejido. En este apartado comentaremos algunas de las tcnicas ms utilizadas.
Tcnica de Nissl
Esta tcnica se utiliza habitualmente en el estudio del tejido nervioso en lugar de la
Hematoxilina-Eosina. Es decir es una tcnica topogrfica, que nos muestra la distribucin
de los somas neuronales en el neuropilo.
El colorante utilizado en esta tcnica es el Azul de toluidina, que se aplica despus de un
tratamiento previo en Dicromato potsico. En algunas variantes se utiliza como colorante el
Violeta de Cresilo.
Los somas neuronales aparecen teidos de azul oscuro mientras que el parnquima
aparece casi blanco. Las clulas gliales (sus cuerpos celulares) se tien tambin de azul
oscuro y se pueden llegar a distinguir los diferentes tipos por su forma y localizacin. En
cortes los suficientemente finos (de hasta 5 7 m de grosor), a grandes aumentos (400 1.000 x) se ven en el citoplasma del cuerpo neuronal (soma) unos acmulos que se
conocen como cuerpos de Nissl, los cuales corresponden a apilamientos de cisternas de
retculo endoplasmtico rugoso.
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.
Tcnica de Klver-Barrera
La tcnica de Klver-Barrera se utiliza apara el estudio topogrfico del Sistema Nervioso de,
tanto los somas neuronales, como de los paquetes de fibras (axones) mielnicos.
En esta tcnica, adems del Azul de Toluidina (para la tincin de los somas neuronales), se
usa el Luxol fast blue, que tie selectivamente la mielina que rodea a ciertos axones
(axones mielnicos).
Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.
Tcnica de la Plata reducida de Cajal
Esta tcnica se utiliza, fundamentalmente para el estudio de paquetes de axones
amielnicos (no mielinizados).
Esta tcnica se basa en una impregnacin argntica del tejido nervioso y una posterior
reduccin qumica. Este proceso tie de marrn oscuro neurofilamentos y neurotbulos, por
lo que pone de manifiesto axones amielnicos (en los mielnicos el Nitrato de Plata no puede
atravesar la vaina de mielina), dendritas y el cuerpo celular, no el ncleo (que no se tie).
Esta tincin se realiza en bloque, es decir se tie el cerebro completo (o una porcin), y una
vez teido, el tejido se incluye en parafina, se corta (en un grosor de 10 m) y se monta en
el portaobjetos.
Tcnica de Golgi

La tcnica de Golgi es, quizs, la ms paradigmtica de las tcnicas de tincin empleadas

en el estudio del Sistema Nervioso.
Esta tcnica tiene como objetivo el poder estudiar neuronas completas, incluyendo soma,
dendritas y axn. Como el estudiante conoce, las neuronas son clulas con prolongaciones
(dendritas y axn) arborizadas que ocupan un gran volumen de tejido, un poliedro que
incluya una neurona "tipo" puede tener 100-200 m x 100-200 m x 100-1000 m de
aristas.
Esto implica varias circunstancias a tener en cuenta:
- En primer lugar resulta obvio que no se podrn observar neuronas completas en un corte
de 5, 10 o 30 m de grosor, y ser necesario realizar cortes ms gruesos (100 - 150 m).
- En segundo lugar, solamente se deben teir una pequea proporcin de neuronas, ya que
si tieran todas, al teir todos sus elementos, no se podran distinguir unas neuronas de
otras.
Ambas circunstancias se dan en la tcnica de Golgi, en la que se impregna en bloque el
tejido nervioso con una solucin de Nitrato de Plata, despus de una induracin, con
Dicromato potsico. Este proceso consigue impregnar una muy pequea proporcin de total
de neuronas (aproximadamente el 0,03%). Hoy en da, an es motivo de discusin el
mecanismo por el cual unas neuronas se tien y otras no.
La tcnica de Golgi se realiza en bloque, es decir con el cerebro completo (o una porcin de
este). Los cortes han de ser gruesos (100 - 150 m), por lo que la pieza no se incluye en
parafina ni se corta con un microtomo rotatorio. La pieza impregnada con la tcnica de
Golgi se puede incluir en celoidina (un colodin purificado), o sencillamente encastrar en
gelatina o incluso en parafina. Para cortar se suelen utilizar otros dispositivos menos
sofisticados, tales como un vibrtomo, un microtomo de deslizamiento o incluso una
sencilla cuchilla de barbero sobre un microtomo manual.
Como resultado de esta tcnica, al microscopio so observan neuronas completas de las que
se puede seguir el sinuoso recorrido de sus dendritas, usando el control del desplazamiento
de la platina y el mando de enfoque. Como el Nitrato de Plata no puede atravesar la vaina
de mielina, solamente se vern los axones no mielinizados.
Tambin se pueden ver clulas gliales y vasos sanguneos.
OTROS INSTRUMENTOS, PROTOCOLOS Y PROCEDIMIENTOS
Como se ha apuntado en los apartados anteriores, en Histologa, adems de los explicados,
se usan otros instrumentos, protocolos y procedimientos, atendiendo a los resultados que
se pretende obtener.
As por ejemplo se usa una variedad de aparatos para cortar: 13
OTROS MICROTOMOS
Adems del microtomo rotatorio o de Minot para el corte en parafina, que ya se ha
explicado, en la prctica habitual en Histologa para el desarrollo de tcnicas especficas.
Ultramicrotomo
En esencia este instrumento sigue el modelo mecnico del microtomo rotatorio, pero con
una considerablemente mayor precisin, para obtener cortes mucho ms finos (40 - 50 nm)
para ser usados en microscopa electrnica de transmisin.
En este microtomo se utilizan otro tipo de cuchillas de mayor dureza, hechas tanto de vidrio
especialmente tratado como, incluso, con el filo de diamante.
Criostato
El criostato es, en esencia, un microtomo rotatorio en el interior de un arcn refrigerado.

Obviamente se usa para cortar muestras a bajas temperaturas, para tcnicas que requieren
el mantenimiento de la actividad biolgica en las muestras, por ejemplo, las tcnicas
histoenzimticas y las inmunohistoqumicas.
Las muestras congelan, previo tratamiento con un crioprotector, y se cortan, montando los
cortes sobre portaobjetos, sobre los que se suele hacer el tratamiento histoqumico o
inmunohistoqumico.
Vibrtomo
El vibrtomo, como su nombre indica, se basa en un brazo vibrtil que realiza cortes no
demasiado finos (entre 25 y 500 m). Se suele utilizar para tcnicas histoenzimticas e
inmunohistoqumicas ya que no es necesario incluir en parafina las piezas, aunque en la
actualidad se usa ms el criostato para estas tcnicas.
Ocasionalmente se ha utilizado el vibrtomo para realizar cortes con la tcnica de Golgi.
Microtomo de mano
Es el ms sencillo de los microtomos y simplemente es un tornillo sin fin que levanta la
muestra sobre una superficie plana, sobre la que se desliza una afilada cuchilla de barbero
para obtener los cortes.
SU rango de corte oscila entre los 20 a los 150 m y es muy utilizado en Histologa vegetal.
En histologa animal se suele utilizar para obtener cortes gruesos en la tcnica de Golgi.
ARTEFACTOS DE TINCIN
Como el estudiante ha podido comprobar la tcnica es compleja y comprende muchos
pasos, por lo que puede suceder que en alguno de estos pasos se produzca alguna
distorsin o pequeo fallo, que luego se detecta durante el estudio de la muestra al
microscopio, es lo que se conoce como artefactos de tincin. 14
En s mismos los artefactos no tienen ningn valor histolgico, pero al encontrrselos
durante el estudio de las preparaciones el estudiante puede llegar a confundirlos con
elementos propios del tejido lo que hace conveniente que el estudiante tenga conciencia de
su existencia.
La mayora de los artefactos producen alteraciones microscpicas que son totalmente
invisibles a simple vista por lo que resulta muy difcil que el histlogo pueda evitarlos.
En las pginas siguientes el estudiante encontrar diferentes ejemplos de los artefactos
ms habituales que pueden encontrarse en el estudio de preparaciones histolgicas.
BANDEADO
El aspecto bandeado que muestran algunas preparaciones se suele producir por un ngulo
de incidencia de la cuchilla incorrecto.
En algunas otras ocasiones se produce un bandeado al intentar cortar demasiado fino un
tejido que no tiene la dureza y/o consistencia suficiente.
BURBUJAS
Algunas preparaciones muestran pequeas burbujas de aire atrapadas en el medio de
montaje.
Este artefacto se suele dar cuando el medio de montaje es muy denso y solidifica de forma
rpida.
INCLUSIONES Y MANCHAS DE COLOR
A veces, durante el proceso de preparacin de muestras, preferentemente durante el
montaje final, se cuelan sobre el corte motas de polvo, pequeos pelos y otros elementos

del ambiente que se fijan en la preparacin al utilizar el medio de montaje.

Tambin estas inclusiones pueden ser precipitados de color debidos a pequeos cristales
colorante.
MELLAS
Las mellas se producen por pequeas imperfecciones del filo de la cuchilla a la hora de
cortar en el microtomo.
Estas mellas provocan un arrastre y destruccin de una banda recta de tejido cuyo ancho
coincide con la anchura de la imperfeccin del filo de la cuchilla y que ocupan todo el tejido
en la direccin del corte.
PLIEGUES
Los pliegues se suelen producir durante el montaje del corte sobre el portaobjetos.
A veces se trata de una simple ondulacin del tejido, a veces se trata de un gran pliegue
que se dobla sobre s mismo.

Tenemos el convencimiento que la lectura de este tema ayudar al estudiante a

comprender el procesamiento histolgico necesario para obtener los cortes que estudiar al
microscopio y ello redundar en una mejor comprensin de las clulas tejidos y estructuras
que observar durante el estudio.