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RECOMENDACIONES TILES
11. Como medida de seguridad controlar las llaves del mechero antes de abrir la espita
del gas.
12. Si se necesita calentar el contenido de un tubo de ensayo directamente sobre el
mechero se har con el tubo algo inclinado, agitando y con la boca del tubo dirigida
hacia un lugar donde no exista ninguna persona.
13. El material de uso comn, as como los frascos de reactivos generales se deben
colocar en su sitio inmediatamente despus de usarlos.
14. No se deben pipetear los reactivos directamente de las botellas de uso comn,
para evitar contaminaciones. Se pondr una pequea cantidad en un vaso y de ah se
pipetear.
15. Los reactivos que se hayan sacado del frasco (o botella) y no se hayan usado no
deben verterse de nuevo en el frasco, puesto que todo el contenido puede
contaminarse. Por tanto, las cantidades de reactivos que se saquen de los frascos no
deben exceder de las necesarias para la realizacin de las experiencias.
16. Cuando se tenga que diluir un cido, aadir siempre el cido sobre el agua.
17. Las reacciones en las que haya produccin de cualquier gas nocivo se llevarn a
cabo siempre en la vitrina con el sistema de aspiracin en funcionamiento. La
atmsfera del laboratorio ha de mantenerse lo ms limpia posible.
SMBOLOS DE PELIGROSIDAD
SUSTANCIAS INFLAMABLES
Se utiliza para sustancias autoinflamables, gases fcilmente
inflamables y sustancias que en contacto con el agua
desprenden gases inflamables.
SUSTANCIAS TXICAS
Productos que inhalados, ingeridos o en contacto con la piel
provocan lesiones e incluso la muerte.
SUSTANCIAS CORROSIVAS
El contacto con estos productos destruye tejidos vivos y otros
materiales.
SUSTANCIAS COMBURENTES
Productos que en contacto con otros particularmente con los
inflamables, originan una reaccin altamente exotrmica.
SUSTANCIAS EXPLOSIVAS
Productos que son ms sensibles a los golpes que el
dinitrobenceno o que pueden explotar bajo el efecto de una llama
o friccin.
1. FUNDAMENTO.
La tcnica implica la separacin de molculas de diferente tamao pasndolas a
travs de una columna de gel. El polisacrido dextrano est entrecruzado dando
pequeas porciones de un polmero hidroflico e insoluble que se hincha en agua para
formar un gel. Las molculas pequeas pueden penetrar en el gel, pero las grandes son
excluidas de la red entrecruzada. Primero, la mezcla de molculas grandes y pequeas
se coloca sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende
en la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo que recorrer
un camino ms largo mientras que las molculas grandes salen de la columna primero
y por ltimo vienen las molculas ms pequeas.
Se distinguen unas constantes que son funcin del tipo y tamao del lecho del
gel. Estas constantes son:
Ve = Volumen de elucin de la sustancia, en mL, donde sta se encuentra en
mayor concentracin. Volumen de disolvente necesario para eluir las molculas de
inters.
Vo = Volumen muerto. Es el volumen de elucin de una sustancia que es
excluida del gel, y coincide con el volumen de lquido que ocupa los intersticios que
hay entre los granos de gel en el lecho.
Vt = Es el volumen total del lecho del gel. El volumen de la columna de gel. Para
calcularlo es necesario conocer la altura y seccin de la misma.
Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo)
Kav es el coeficiente de particin entre la fase lquida y la fase gel. Esta variable
es independiente de la compactacin del lecho de gel y existe una relacin
prcticamente lineal entre los valores de Kav para diversas sustancias y los respectivos
logaritmos de sus pesos moleculares, por lo cual, conociendo Kav se puede tener un
conocimiento aproximado del peso molecular.
5
2. MATERIAL.
* Columna cromatogrfica con Sephadex G-25
* Erlenmeyer de 250 mL
* Pipetas Pasteur
* 2 Pipetas de 0.5 mL
* Probeta de 25 mL
* Tubos de ensayo pequeos y una gradilla
6
* Colormetro o espectrofotmetro
* Bao de agua hirviendo con gradilla incorporada
3. DISOLUCIONES.
* Hemoglobina 2 mg/mL
* Alanina 6 mg/mL
* Ninhidrina 5 mg/mL
* Cromato potsico 2 mg/mL
* Azul dextrano 2 mg/mL
* NaCl 10 g/L
4. DESARROLLO.
Dejad la disolucin de NaCl que est en el interior de la columna a nivel del
lmite del gel, y en este momento incorporad una mezcla (que habris preparado en un
tubo de ensayo) de 0.5 mL de cromato potsico y 0.5 mL de azul dextrano. Recoged
fracciones de unos 3 mL por tubo. En el momento que esta disolucin ha llegado al
nivel del gel se aade disolucin de NaCl con la pipeta Pasteur y luego ya se puede
conectar el cable al erlenmeyer que contiene NaCl. La velocidad de flujo debe ser
lenta. La cromatografa habr terminado cuando haya eludo todo el cromato.
Entonces se pasa a medir la absorbancia de todos estos tubos, los iniciales (azules) a
621 nm, y los siguientes (amarillos) a 470 nm. Se utiliza el tubo n 1 como blanco, o
bien disolucin de NaCl.
NOTA: LAS COLUMNAS SIEMPRE DEBEN TENER LQUIDO SOBRE EL LECHO DEL GEL.
A continuacin se prepara, en un tubo de ensayo, una mezcla con 0.5 mL de
disolucin de hemoglobina y 0.5 mL de disolucin de alanina. Se deja otra vez el nivel
de lquido al nivel del gel y entonces se adiciona esta mezcla con el cuentagotas
operando de igual forma que antes. La cromatografa podr haber terminado cuando
se tengan tantos tubos como en el paso anterior.
Se mide la absorbancia de estos tubos a 430 nm (el blanco tambin es el n 1
de esta etapa, o NaCl) hasta que el valor vuelva a ser 0 (entonces se deja de medir);
7
esos sern los que contengan la hemoglobina. A todos los tubos que van a
continuacin se les hace el ensayo de la ninhidrina, puesto que ser donde est
contenida la alanina.
Para ello, se aaden 10 gotas de este reactivo a cada tubo, se agita bien y se
incuba un tiempo indeterminado en un bao con agua hirviendo hasta que algunos se
tian de azul. Pasado este tiempo se dejan enfriar y donde est el aminocido habr
aparecido coloracin azulada. Entonces se mide la absorbancia de todos estos tubos a
540 nm.
Ve = A + 1/2 B
Ve
6. CUESTIONES.
1. Haced los cromatogramas de los resultados (volumen en abscisas y
absorbancias en ordenadas).
2. Mide los volmenes de elucin de cada sustancia y calcula los distintos
valores de Kav (Dimetro de la columna de gel = 1.5 cm. Hay que medir la
altura de la columna de gel)
b. Volumen muerto.
c. Volumen de elucin.
d. Volumen total.
1. FUNDAMENTO.
La casena es la protena principal encontrada en la leche. No es un compuesto
simple sino una mezcla heterognea de protenas que contienen fsforo; es una
fosfoprotena que existe en cuatro formas: alfa, beta, gamma y kappa casena, cada
una con diferente composicin.
Como muchas otras protenas derivadas de fuentes animales, por ej. carne
(miosina) y huevos (albmina) es una protena adecuada nutricionalmente. Tales
protenas contienen todos los aminocidos esenciales requeridos para un crecimiento
y desarrollo normal.
La mayora de las protenas muestran una solubilidad mnima en su punto
isoelctrico y este principio se usa para separar la casena ajustando el pH de la leche a
4.8, su punto isoelctrico. La casena es tambin insoluble en alcohol, lo que permite
extraer la grasa de las preparaciones.
2. MATERIAL.
* 2 vasos de precipitados de 250 mL
* Pipeta de 2 mL
* Embudo Buchner
y otra de 25 mL
* Quitasatos
* Varilla de vidrio
* Papel de aluminio
* Bao termosttico a 40 C
* Gasa
* Papel indicador
* Placa calefactora
* Embudo y trpode
3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Leche
* Carbonato clcico
4. PREPARACIN DE DISOLUCIONES.
* Acido actico al 10 %: 18 mL de agua destilada y 2 mL de cido actico glacial.
5. DESARROLLO.
5.1. AISLAMIENTO DE CASENA:
En un vaso de precipitados de 250 mL se ponen 100 mL de leche y se calientan
a 40 C aproximadamente. Se aade a continuacin cido actico al 10 %, gota a gota,
sin agitar, removiendo un poco el vaso para mezclar, pero lentamente. El pH final de la
mezcla debe ser aproximadamente 4.8 y se debe verificar con papel indicador. Se
produce un precipitado de casena blanco y floculoso. Cuando ya ha terminado este
proceso se enfra la suspensin a temperatura ambiente y se deja reposar 5 minutos
antes de filtrarla a travs de gasa (tres capas). Conservad aparte el suero de leche
filtrado.
Se lava el precipitado con un poco de agua destilada y se suspende en 30 mL de
etanol al 96 %. Se filtra la suspensin a travs de papel de filtro sobre un embudo
Buchner colocado sobre quitasatos haciendo vacio. Se lava el precipitado anterior con
otros 25 mL de etanol y se seca manteniendo el vaco.
Se extrae con una esptula el polvo blanco formado y se coloca en un trozo de
papel de aluminio para permitir la evaporacin total del disolvente (si es posible,
dejadlo unos minutos en la estufa).
gafas de proteccin en este paso. Se contina la ebullicin hasta que queden apenas
unos 20 - 25 mL de lquido. Tras retirar el vaso de la placa (TOMAR PRECAUCIONES
PARA NO QUEMARSE),
6. CUESTIONES.
1. Pesad la casena obtenida y calculad el rendimiento obtenido en su
extraccin.
2. Por qu se utiliza preferentemente leche desnatada?
3. Pesad la lactosa obtenida y calculad el rendimiento.
4. Por qu se debe aadir el carbn activo?
5. Al separar la casena de la lactosa, por qu se aade carbonato clcico en
polvo a la lactosa?
6. Qu efecto tiene el etanol sobre la lactosa una vez que obtenemos el
jarabe?
7. Qu principio de las protenas se utiliza para aislar la casena en la prctica?
12
1. FUNDAMENTO.
La catalasa es una enzima presente en todas las clulas vivas (con algunas
excepciones, como entre microorganismos anaerobios), pero est especialmente
abundante en sangre e hgado. Se ha preparado en forma cristalina de ambas fuentes.
La enzima es altamente especfica y actuar slo sobre el H2O2, que hace de sustrato,
aunque utilizar perxidos alqulicos como dadores de electrones. Cataliza la siguiente
reaccin:
H2O2 H2O + O2
La azida o los iones cianuro forman complejos muy estables e inactivan enzimas
que contienen iones frricos, pero slo tienen un pequeo efecto en enzimas que
contienen iones ferrosos. Los citocromos, catalasa y perxidos contienen la forma
frrica y, por lo tanto, estn fuertemente inhibidos por azida o cianuro.
2. MATERIAL.
* Bandeja de plstico
* Hielo
13
* 3 erlenmeyers pequeos
* Pipetas de las siguientes medidas: 110 mL, 22 mL, 21mL, 10.5 mL
* Lanceta estril
* Probeta de 50 mL
* Bureta de 25 50 mL
* Propipetas
* Varios vasos de precipitados
3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Sangre humana
* Tampn fosfato sdico 20 mM, pH 7.0
* H2O2 (aprox. 50 mM) en tampn fosfato sdico 20 mM de pH 7.0
* Azida sdica 5x10-5 M
* KMnO4 2.5 mM
* H2SO4 6 M
4. DESARROLLO.
Como fuente de enzima se utiliza sangre fresca en una dilucin de 1:500. Para
ello, se colocan 25 mL de agua destilada fra en un erlenmeyer de 50 mL que est en la
bandeja de plstico con agua fra y hielo. Se obtienen dos o tres gotas de muestra de
sangre de la punta del dedo pinchando con una lanceta estril. Se descarga la sangre
en el erlenmeyer que contiene el agua fra, y se agita el erlenmeyer para conseguir una
mezcla homognea. Se mantiene la sangre diluida en fro a lo largo de todo el
experimento para minimizar la inactivacin por calor.
Se preparan los erlenmeyers pequeos como se indica en la tabla siguiente,
aadiendo las cantidades correspondientes a cada uno de ellos. La reaccin debe
realizarse en fro, con el bao de hielo. Despus de cada adicin al erlenmeyer hay que
agitarlo bien.
Para parar la reaccin, al cabo de 5 minutos de estar reaccionando en fro la
enzima se aaden 2 mL de H2SO4 6 M al erlenmeyer correspondiente.
14
N erlenmeyer
(temperatura)
(inhibidor)
10
10
10
0.5
--
--
--
0.5
0.5
0.5
--
0.5
--
--
0.5
--
1 (control)
10
H2O2 (mL)
Agua (mL)
-5
5. CLCULO DE LA ACTIVIDAD.
La actividad de la catalasa puede expresarse como moles de H2O2
descompuestos por la accin de la enzima en 5 minutos a 0 C por mililitro de sangre:
15
6. CUESTIONES.
1. Completad la siguiente tabla:
1
17
1. FUNDAMENTO.
NOTAS SOBRE ESPECTROFOTOMETRA:
Muchos experimentos bioqumicos incluyen la medicin de un compuesto o
grupo de compuestos que forman parte de una mezcla y, por tanto, la medida de la
absorcin de la luz por una sustancia en solucin es un mtodo importante en el
anlisis bioqumico. Quizs la tcnica ms usada para determinar la concentracin de
dichos compuestos es la colorimetra. El fundamento de la tcnica consiste en que si se
pasa luz blanca a travs de una solucin coloreada, algunas longitudes de onda se
absorben con preferencia sobre otras.
La cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentracin de la sustancia
en solucin, o dicho de otra forma, la intensidad de color es proporcional a la
concentracin del compuesto. La absorcin vara con la longitud de onda de la luz,
debiendo efectuarse la medida usando luz de longitud de onda de mxima absorcin
(max), que es caracterstica de cada sustancia. Las sustancias coloreadas tienen una max en la regin visible del espectro. Otras sustancias absorben luz de otras regiones
del espectro (por ejemplo, las protenas absorben luz ultravioleta) y no son detectadas
por el ojo humano.
Para conocer la concentracin de una sustancia coloreada en solucin se utiliza
un aparato, el espectrofotmetro, que mide la cantidad de luz que atraviesa una
solucin.
Ley de Lambert-Beer:
La fraccin de luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda
determinada es proporcional al espesor de la capa absorbente (paso ptico) y a la
concentracin de sustancia absorbente. Estos dos parmetros estn combinados en la
ley de Lambert-Beer:
log I0/I = cl = A
I0: intensidad de la luz incidente.
I: intensidad de la luz transmitida.
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El espectrofotmetro:
El espectrofotmetro es un aparato que mide la cantidad de luz que pasa a
travs de una solucin. Est compuesto por las siguientes partes:
FUENTE DE ENERGIA: lmpara que emite un haz luminoso que contiene un rango de
longitudes de onda.
MONOCROMADOR: se llama tambin selector de longitud de onda. Consiste en una
red de difraccin que separa las diferentes radiaciones procedentes de la fuente y
selecciona la longitud de onda requerida.
RENDIJA: es un dispositivo que sirve para seleccionar un haz fino de radiacin que ser
el que incida sobre la muestra, evitando que la atraviese la luz difusa.
COMPARTIMENTO DE MUESTRA: en l se coloca la solucin problema, que va a
absorber un haz fino de luz monocromtica.
DETECTOR: es un sistema que transforma la energa luminosa que atraviesa la muestra
en energa elctrica. Posee adems un amplificador de la seal elctrica recibida que
posibilita su medicin posterior.
MEDIDOR: traslada la energa elctrica producida en el paso anterior hasta un monitor
donde se analiza la lectura digital obtenida.
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BIURET
UREA
REACCIN DEL BIURET
20
Violeta-prpura
Complejo protena - Cu (II)
2. MATERIAL.
* 1 pipeta de 2 mL, 1 de 5 mL, 1 de 0.5 mL y 2 de 1 mL
* 1 vaso de 50 mL
* Tubos de ensayo grandes, y 1 gradilla
* Bao de agua a 37 C
* Colormetro o espectrofotmetro
3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Solucin estndar de albmina de suero bovino de 2.5 mg/mL.
* Solucin problema de protena.
* Reactivo de Biuret (ya preparado): Contiene CuSO4.5H2O, tartrato sdicopotsico y NaOH.
4. DESARROLLO.
Preparad nueve tubos de la forma siguiente:
N tubo
Agua
destilada
Albmina
2.5 mg/mL
Disolucin
Problema
1.6
1.2
0.8
0.4
1.5
0.5
0.4
0.8
1.2
1.6
--
--
--
--
--
--
--
--
--
0.5
1.5
21
6. CUESTIONES.
1. Construye la recta de calibrado, representando las absorbancias (en
ordenadas) frente a la concentracin de la solucin patrn de albmina (en
abscisas).
2. Calcula la concentracin de protena en los tubos problema: tubos 7, 8 y 9
Deberan ser iguales?
3. Por qu es necesario teir la protena para determinar la concentracin?
4. Teniendo en cuenta la Ley de Lambert-Beer, qu representa la pendiente de
la recta de calibrado?
5. Escribe la ecuacin de la recta de calibrado obtenida.
6. Cul es la concentracin de protena problema original?
22
1. FUNDAMENTO.
Los textos de prcticas de Bioqumica son una fuente excelente de
experimentos de Enzimologa. La mayora permiten al estudiante obtener extractos de
una enzima, ensayar su presencia en la disolucin y estudiar la cintica enzimtica.
Pocos experimentos ofrecen la oportunidad al estudiante de aplicar todas estas
tcnicas al estudio de una enzima. En este caso se ha escogido la enzima
polifenoloxidasa o tirosinasa, estudiando su extraccin, actividad y cintica. Se ha
elegido esta enzima por diversas razones: 1) Puede ser rpidamente extrada de varias
fuentes vegetales, tales como champin, pltanos y patatas; 2) se dispone de un
ensayo espectrofotomtrico sencillo; 3) el cofactor metlico permite estudios de
inhibicin; 4) es importante en la qumica de la alimentacin, pigmentacin y medicina
clnica.
La enzima polifenoloxidasa se presenta tanto en clulas vegetales como
animales. Su actividad en presencia de oxgeno es la responsable del ennegrecimiento
de las plantas cortadas o daadas. La tirosinasa en clulas de mamfero parece que
tiene un papel especfico en el metabolismo de la tirosina.
Cataliza la conversin de Dopa a dopacromo, segn la reaccin:
POLIFENOLOXIDASA
O2
DOPA
DOPACROMO
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2. MATERIAL.
* Probeta de 50 mL
* Espectrofotmetro o colormetro
* Cuchillo
* Pipetas:
1 0.5mL, 3 1mL, 2 5mL
* Mortero
* Embudo y trpode
3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Patatas
* Tampn fosfato sdico 20 mM, de pH 7.0.
* DL--3,4 dihidroxifenilalanina (Dopa) 2 mg/mL disuelta en tampn anterior
(preparada en el da).
* Inhibidor: azida sdica 50 mM.
4. DESARROLLO.
a) Extraccin:
Se pela una patata y se corta en pequeos trozos. Con rapidez se pesan unos
10g de patata, se trituran al mximo en el mortero y despus se mezclan con 50 mL de
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b) Determinacin de Km y Vmx:
Disponed cuatro tubos de ensayo en una gradilla a los que se les aade tampn
y Dopa con arreglo al siguiente esquema (las cantidades estn en mL):
N tubo
Tampn
2.4
1.9
0.9
Dopa
0.5
2.9
25
N tubo
Tampn
0.9
0.8
0.6
Dopa
Extracto
0.1
0.2
0.4
d) Estudios de inhibicin:
Puede investigarse la evidencia de que un in metlico est implicado en la
reaccin enzimtica mediante la observacin del efecto de agentes quelantes sobre la
actividad enzimtica. Agentes quelantes del cobre, como los mencionados antes, son
potentes inhibidores de la actividad tirosinasa o polifenoloxidasa. Para esta prctica se
emplear la azida.
Para investigar este efecto, se prepara una serie de tubos mediante el
procedimiento habitual:
N tubo
Tampn
0.9
0.5
0.1
Dopa
Inhibidor (azida)
0.4
0.8
Extracto
0.1
0.1
0.1
5. CUESTIONES.
1. Calcula las velocidades iniciales de reaccin de cada ensayo representando
los valores de absorbancia (ordenadas) frente al tiempo (abscisas).
2. Calcula los valores de Km y Vmx mediante la representacin de LineweaverBurk. Para poder realizar la grfica, completa previamente la siguiente tabla:
N tubo
v0 (min-1)
[Dopa] (mg/mL)
1/v0 (min)
1/[S] (mg/mL)-1
1
2
3
26
v0 (min-1)
1
2
3
N tubo
v0 (min-1)
[inhibidor] (mM)
% inhibicin
1
2
3
27
1. FUNDAMENTO.
Los cidos nucleicos, debido a su carcter macromolecular, resultan bastante
difciles de separar de las protenas y polisacridos por mtodos suaves, y los
tratamientos drsticos alteran profundamente su estructura y sus caractersticas. Las
clulas procedentes de archaeas haloflicas necesitan concentraciones salinas elevadas
para mantener su integridad celular; este hecho se ha utilizado para aislar su DNA ya
que pueden ser fcilmente lisadas si se tratan con agua. Las clulas son resuspendidas
en agua, y el lisado se extrae con fenol. El fenol y el agua son inmiscibles, las protenas
se extraen en la fase fenlica y se separan de los cidos nucleicos que se quedan en la
fase acuosa. Adicionando dos volmenes de etanol a la fase acuosa, los cidos
nucleicos de alto peso molecular precipitan como un material fibroso blanco. Si la
precipitacin se produce como un material gelatinoso incoloro indica que todava hay
protena unida a los cidos nucleicos.
La concentracin del DNA obtenido puede determinarse usando la absorbancia
(o densidad ptica) a 260 nm. Una solucin, en agua, de DNA de 1 mg/mL produce una
A260 de 20.
Cuando se prepara DNA ste debe ser de alto peso molecular y no debe estar
roto en pequeos fragmentos. Se puede comprobar, para cada muestra de DNA
obtenida, si es de alto peso molecular realizando una electroforesis en un gel de
agarosa al 0.8 %.
Por otro lado, transcurrida la electroforesis, el DNA se visualizar mediante luz
ultravioleta gracias al reactivo Red Safe que se une especficamente al DNA de doble
cadena y emite fluorescencia al ser excitado a 537 nm.
2. MATERIAL.
* Bao termosttico a 65 C
* Tubos eppendorf
* Transiluminador
* Microcentrfuga
* Micropipetas
* Pescador de DNA
* Gafas de seguridad
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3. DISOLUCIONES.
* Clulas de Haloferax mediterranei en su medio de cultivo
* Agua ultrapura
* Fenol (produce quemaduras)
* Etanol absoluto
* Agarosa en tampn TAE (Tris - Acetato- EDTA)
* Red Safe
* Tampn de carga 6x
4. DESARROLLO.
Para evitar la contaminacin con nucleasas es necesario realizar la extraccin
con guantes. Todo el material que se va a utilizar debera estar autoclavado
(esterilizado). Los tratamientos hay que realizarlos con sumo cuidado para evitar el
que el DNA se fragmente lo menos posible y obtenerlo de alto peso molecular.
4.1 Extraccin:
Clulas procedentes de un cultivo reciente de archaeas haloflicas (Haloferax
mediterranei) se cosechan primeramente para eliminar todo el medio de cultivo. Una
vez tenemos el precipitado de clulas seco, se lisan adicionando 400 L de agua
ultrapura a ese precipitado. Despus se aaden 400 L de fenol (saturado con tampn
Tris), se mezcla por inversin y la mezcla se incuba a 65 C durante 10 minutos.
Posteriormente, las fases se separan por centrifugacin a temperatura ambiente. Se
transfiere la fase acuosa (superior) a un tubo eppendorf limpio, se aaden 800 L de
etanol absoluto y se agita suavemente para mezclar. El precipitado de DNA debera
ser visible en esta etapa. Este precipitado es pescado o centrifugado. Se disuelve de
nuevo en 100 L de agua ultrapura, que se aaden a un tubo eppendorf limpio, y se
incuba a 37 C durante un tiempo.
agarosa est disuelta. Cuando la agarosa se haya enfriado, sin llegar a solidificar, se
aaden 2 L de Red Safe y se coloca en el molde del sistema, se sita el peine para
fabricar las calles y se deja solidificar.
4.2.2. Realizacin de la electroforesis: Se rellena el tanque de electroforesis
con tampn 1xTAE; se coloca el gel en el tanque y el gel debe estar cubierto con
tampn al menos 1 cm. Para preparar las muestras de DNA a cargar en el gel se
pipetean 15 L de DNA y 3 L de tampn de carga 6x. Se cargan las muestras en las
calles del gel; en una de las calles se pueden poner marcadores de peso molecular
conocido. Se realiza la electroforesis aplicando 120 V (50 mA). Las muestras corren
desde el electrodo negativo (ctodo) al positivo (nodo). Transcurrida la electroforesis,
el DNA puede visualizarse mediante luz ultravioleta en el transiluminador, CON LAS
GAFAS DE PROTECCIN.
5. CUESTIONES.
1. Cundo se considera que el DNA obtenido es de alto peso molecular,
cualitativamente?
2. Qu caracterstica se observa para considerar si estaba fragmentado?
3. Cmo se calculara la concentracin del DNA obtenido, de forma
cualitativa?
4. Y cmo se calculara la concentracin del DNA obtenido, de forma
cuantitativa?
5. En qu etapa del aislamiento de los cidos nucleicos es visible el DNA? a
qu es debido?
6. Por qu vemos fluorescencia en el DNA cuando lo observamos con el
transiluminador?
7. El mtodo descrito para aislar el DNA de Haloferax mediterranei, se podra
emplear para aislar los cidos nucleicos de cualquier microorganismo?
Razona tu respuesta.
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