Protozologa B-2015

Ubicacin subcelular de la Fosfogluscosa Isomerasa y Glucosa-6-Fofato Epimerasa 1

en Leihsmania mexicana y Trypanosma cruzi.
Camilo Araujo*
Estudiante de la Licenciatura de Biologa. Facultad de Ciencias. Universidad de los Andes
Resumen:
Los trypansomatides, en lo que se refiere a salud pblica, cuenta en su familia con miembros
reconocidos a nivel mundial, entre los que destaca los organismos de los gneros Leishmania y
Trypanosoma, los cuales son agentes causales de la leishmaniasis y tripanosiomasis americana y
africana. En su haber, tienen tantas particularidades, que prcticamente tienen la excepcin a diversas
reglas. Entre todas la particularidades, se encuentran las metbolicas, las cuales han permitido
desarrollar la investigacin para encontrar tratamientos contra ellos. En el presente estudio, se
estudiaron dos enzimas de aparente importancia en el metabolismo (Fosfogluscosa Isomerasa y
Glucosa-6-Fofato Epimerasa 1), que por los resultados presentados, podran intervenir en la
regulacin gnica y resistencia al estrs oxidativo, funciones bastante ajenas a su fin original. La
ubicacin se realiz mediante una Inmunoflourescencia Indirecta y se corrobor mediante una
permeabilizacin con digitonina.
Palabras clave: Trypanosmatides, Digitonina, PGI, Epimerasa, Estrs oxidativo

A. Introduccin.
Los trypanosmatidaes, son una familia de
organismos
eucariotas
unicelulares
exclusivamente parsitos, pertenecientes
a la orden de los Kinetoplastida, los cuales
se caracterizan por presentar una
estructura en la base del nico flagelo que
los caracteriza del resto de la orden (1).
Los miembros de esta enorme familia de
parsitos, presentan una variedad de
hospedadores alrededor del dominio
Eukarya (plantas, insectos y vertebrados)
(1),
presentando
adaptaciones
metablicas increbles
como la
compartimentalizacin de la ruta
glucoltica en un organelo denominado
Glicosoma, adems de organelos estadodependientes denominados reservosomas
cuya funcin principal es de fuente de
nutrientes (2).
Dos de los gneros ms estudiados de esta
familia son Leishmania y Trypanosoma,
Correo electrnico: camilobarabas@gmail.com

causantes de patologas tan importantes

como la Lesihmaniasis, la enfermedad
Africana del sueo (Trypanosma brucei)
y la enfermedad de Chagas (Trypanosma
cruzi), las cuales son por lo menos en
varios pases de Amrica Latina y frica,
son un problema importante de salud
pblica (2). En el caso el caso particular
de T. cruzi, las principales causante en que
sea un problema bastante serio para la
salud son su muy mimetizados sntomas
en su fase aguda (los cuales pueden ser
confundidos con un cuadro gripal
cualquiera), su prctica indetectabilidad
en la fase crnica (en la cual ya se
encuentra alojado en distintos tejidos en
su forma amastigote) y la ausencia de
tratamientos adecuados para combatirlo
(2). El mayor problema de esto radica en
que el manejo sobre la existencia de
Chagas como problema de salud pblica,
ya que ha sido descartado y relegado a su
distribucin en el medio pobre y rural

latinoamericano, cuando en la realidad la

enfermedad se ha expandido de manera
importante a lo largo del continente (3).
Por otro lado, organismos pertenecientes
al gnero de Leismania, son agentes
causales de una patologa (Leishmaniasis)
que se caracteriza en producir lesiones y
destruccin del tejido con el que entran en
contacto. Su clasificacin, depende de
dnde y cmo ataque: Cutnea, DifusoCutnea, Muco-Cutnea y Visceral,
siendo esta ltima una de las ms
peligrosas si no es tratada (2). Tanto los
agentes cuasales como los vectores,
flebotominos del gnero Phlebotomus y
Lutzomyia en el Viejo y Nuevo mundo
respectivamente,
se
encuentran
ampliamente distribuidos a nivel mundial
(88 pases entre frica, Amrica, Asia y
Europa), por lo que es considera un
problema grave de salud pblica mundial,
ya que a pesar de contar con tratamientos
efectivo (ej. Pentavalentes amoniales), el
costo de los mismos en pases como los
Latinoamericanos
dificultan
la
adquisicin por los pacientes, sumado a
ello la toxicidad que pueda presentar hacia
los tejidos (1). Se ha reportado casos de
co-infeccin de VIH (Virus de la
inmunodeficiencia humana) y Leishmania
debido a inmunosupresin de los
pacientes (1).
Actualmente, diversos grupos de
investigacin se concentran en la
compresin molecular, comportamental y
gentica, para obtener informacin
necesaria que ayude al combate a la
infeccin causada por estos. El principal
mecanismo de combate de este tipo de
enfermedad consiste en idear, disea y
probar nuevos tratmientos e idear vacunas
(1, 2, 4). Lo principal del estudio para

nuevas drogas y vacunas es encontrar

diferencias significativas entre los
organismos que parasitan y los
parasitados, sin eso, cualquier esfuerzo de
hallar agentes efectivos contra los
primeros sern en vano. Existen una
particularidad de reciente descripcin
(1980) de protenas que cumplen
funciones ajenas a las que les fueron
descrita desde un principio, a estas se le
denomina
enzimas
moonligthing
(pluriempleo, sera su traduccin literal),
que Piatigorsky la defini como protenas
especiales que son multifuncionales y
cuyas funciones son independientes una
de la otra (5).
Aun no se sabe con certeza como
aparecieran tipo de enzimas, pero se
consigue en distintas ramas del rbol de la
vida, entre ellas, la de los organismo
unicelulares parasitos. La explicacin
para este caso, se debe a la reduccin
drstica de los genomas y perdida de
funciones metablicas importantes la
adaptacin a este tipo de maquinaria
enzimtica (6). En trypanosmatides la
mayora de enzimas de comportamiento
muntifuncional estn relacionadas con la
ruta glicoltica encerrada en los
glicosomas (7).
Gmez-Arreaza y colaboradores en 2014,
hicieron una revisin y descripcin de las
funciones extracelulares de enzima que
intervienen en la glicolisis. La enolasa, es
una de las que ha dado pie para el estudio
a fondo de enzimas moonligthing en
trypanosmatides, ya que ella se ha
encontrado que interviene en la evasin de
la respuesta inmune, estando en la
superfice de T. cruzi y Leishmania
mexicana, e interactuando con la plasmina
(4).

Recientemente se ha encontrado, que la

fosfoglucosa isomerasa o PGI (por
phosphoglucose isomerase), ha sido
visualizada en un reciente trabajo de tesis
(informacin recopilada de manera
personal) a nivel de ncleo, lo que hace
pensar que posiblemente tenga funciones
en esta organela. En el siguiente trabajo se
realizar una ubicacin subcelular
mediante Inmunoinfluerencia Indirecta
(IFI) y permeabilizacin con Digitonina.
Otro medio para combatir a los parasitos,
es el ataque hacia los mecanismos de
defensa de evasin se estrs oxidativo, en
los cuales se basa principalmente en la
generacin de NAPDH y reduccin de
especies reactivas de oxgeno, mediante
mecanismos mitocondriales y la via de las
pentosas fosfato. Una enzima identificada
en levaduras, la glucosa-6-fosfato
epimerasa 1, cataliza la interconversin de
los anmeros de y glucosa y ha sido
purificada e identificada en T. brucei. Se
ha observado que la deplecin mediante el
uso de ARN de interferencia, disminuyen
la supervivencia de los parsitos ante la
presencia la especies reactiva de oxgeno
(8). La misma secuencia se ha encontrado
para T. cruzi y de hecho, se ha hecho
anteriormente una visualizacin en los
parsitos (informacin recopilada de
manera personal). En el siguiente
procedimiento experimental, y de igual
manera que la PGI, se realizar ubicacin
subcelular de la enzima en T. cruzi

1.2.

1.3.

1.4.

1.5.

B. Materiales y mtodos
1. Ubicacin

subcelular

mediante

Inmunoinfluerecencia Indirecta (IFI).

1.1. Sensibilizacin de las lminas de Polylisina. Se agreg 10 l de Poly-lisina
previamente diluida en agua destilada en

1.6.

cada pozo de la lmina, dejndola incubar

depus durante toda la noche.
Obtencin de los parsitos del medio de
cultivo. Se cosecharon los parsitos por
medio de centrifugacin a 4500 rpm,
durante 10 minutos y a 4C.
Fijacin de los parsitos con
formaldehdo. Se realiz 2 lavados de las
cluals con 10 ml de PBS isosmtico
(PBSi) durante 10 minutos a mxima
velocidad, se descart el sobrenadante
(SN), el pellet se resuspendi en 1 ml de
PBSi y se agreg un volumen adecuado de
formaldehido para obtener una solucin al
4% (stock al 37%). Se agit suavemente
durante 1,5 minutos e inmediatamente se
centrifug durante 1,5 minutos a 5000
rpm, se realizaron lavados con PBSi
centrifugando a mxima velocidad
durante 5 minutos con el fin de eliminar
todo el formaldehido, se resuspendieron
en 1 ml de PBSi y se realizaron diluciones
hasta obtener 5-10 parsitos/campo.
Fijacin de los parsitos a la lmina
sensibilizada con polilisina. Se utilizaron
10 l de clulas para cada pozo y se dej
secar a temperatura ambiente al menos
durante dos horas en cmara hmeda,
luego se lav cada pozo con 20 ml de
PBSi.
Permeabilizacin de los parsitos
fijados. Se agregaron 10 l de Tritn X100 al 0,1% en PBSi y se incub durante
20 minutos, se lavaron los pozos con la
misma solucin de Tritn X-100 tres
veces, finalmente se lav con 20 ml de
PBSi y se dej secar.
Bloqueo de la lmina. Se agregaron 10 l
de solucin de bloqueo (Cloruro de
amonio 50 mM + BSA 3% en PBS) y se
dej incubando en cmara hmeda a 4C

durante toda la noche, luego se lavaron las

lminas con 20 ml de PBSi y se dejaron
secar.
1.7. Incubacin con anticuerpos. Se
agregaron 100 l de anticuerpo primario
en 1/40 l de solucin de incubacin (1%
BSA en PBSi) y se incub durante 1 hora
en cmara hmeda a 37C. Luego se
agregaron 10 l de anticuerpo secundario
1/50 en solucin de incubacin y se
incub durante 45 minutos a 37C en
oscuridad y cmara hmeda. Finalmente
se agregaron 10 l de DAPI diluido 1/10
y se dej incubar durante 30 minutos en
oscuridad. Entre cada paso se realizaron
lavados con 20 ml de PBSi y se dejaba
secar.
Anticuerpos primarios: Anti PGI
producido en conejo,
Anti G6P1E
producido en conejo, Anti PPDK
producido en ratn.
Anticuerpos secundarios: Anti IgG conejo
acoplado a Cy3, Anti IgG ratn acoplado
a FITC.
1.8. Visualizacin al microscopio. Se agreg
en cada pozo 10 l de DABCO 5%,
glicerol al 90%, se coloc el cubreobjetos
y se observ al microscopio.
2. Permeabilizacin de parsitos con
digitonina
Se emple la digitonina, un agente no
inico para la permeabilizacin selectiva
de las membranas citoslicas, cuyo efecto
selectivo depende de la concentracin de
esteroles en cada membrana. Partiendo de
100 l de un cultivo de epimastigotes de
T. cruzi, se realiz la permeabilizacin, se
recolectaron
los
parsitos
por
centrifugacin y se lavaron dos veces con

tampn Normal (Tris-HCl 70 mM pH:

7.4; NaCl 140 mM; KCl 100mM). Se
centrifug a 6.000 rpm durante 20
minutos a 5C, el sedimento se
resuspendi en tampn Normal y se
determin la concentracin de protenas
por el mtodo de Lowry, usando la
albmina de suero bovino como protena
estndar.
En tubos eppendorf se colocaron alcuotas
de parsitos correspondientes a 1mg de
protenas, ms concentraciones crecientes
de digitonina (solucin inicial 5mg/ml en
tampn Normal), completando hasta un
volumen final de 1ml con buffer Normal.
Las distintas muestras se incubaron por 20
minutos a temperatura ambiente con
agitacin suave y espordica. Se
centrifug por 14.000 rpm durante 5 min
a
temperatura
ambiente,
los
sobrenadantes se separaron de los
sedimentos, y estos ltimos se lavaron dos
veces con tampn Normal, centrifugando
nuevamente. El sedimento se resuspendi
por sonicacin en sampler buffer (Trisbase 62 mM, 2% SDS, 10 % glicerol, DTT
50mM, azul de bromofenol y agua).
Finalmente se midi la actividad
enzimtica de la Hexokinasa (HK),
Enolasa y la PGI, de las muestras
obtenidas de los sobrenadantes. Por otra
parte se realiz un Western Blot con
muestras de los sobrenadantes y los
sedimentos.

3. Western Blot
Las muestras obtenidas de los
sobrenadantes y los sedimentos se mezcl
con tampn de carga (62 mM Tris-Base,

2% SDS, 10% Glicerol, 50 mM DTT, azul

de Bromofenol y agua) en una relacin de
2:1 y se hirvi por 5 min. Se realiz una
electroforesis en gel de poliacrilamida al
12 % en condiciones desnaturalizantes
(SDS-PAGE) de acuerdo con el mtodo
de Laemmli, 1970.
El gel de poliacrilamida y la membrana de
nitrocelulosa fueron sumergidos en
tampn de transferencia (24,7mM TrisBase; 186,5mM glicina y 20% metanol) y
las protenas separadas por SDS-PAGE
fueron transferidas a dicha membrana,
empleando un semi-dry transfer unit
(Amersham Biosciences, USA) a 45 mA,
1h y 30 min. La membrana se bloque a
4C con una solucin con PBS, 5% leche
descremada y 0,1% Tween 20. Se
realizaron tres lavados con PBS y 0,1%
Tween 20, durante 3 min cada vez.
La membrana se incub por 1h en
agitacin a temperatura ambiente con una
dilucin
1:1000
de
anti-G6P-1Epimerasa, 1:2000 de anti-HK de T. cruzi
y 1:2000 de anti-PGI de T. brucei como
anticuerpos primarios diluidos en
solucin de incubacin (PBS y 0,1% leche
descremada). Se lav 3 veces con PBS y
se incub por 45 min en agitacin a
temperatura ambiente con una dilucin
1:5000 de anti-IgG de conejo conjugado
con peroxidasa, como anticuerpo
secundario. Despus de 3 lavados con
PBS, la membrana se sumergi en
solucin
de
revelado
(10
mg
diaminobenzidina, 50 l CoCl2 y 20 l de
H2O2 al 3% en 20 mL de PBS) y se detuvo
la reaccin lavando con agua corriente.

C. Resultados
1) Observacin de la IFI.

Al realizar los revelados mediante

microscopia de influrescencia, notamos
unos problemas en la detecin de los
anticuerpos (FITC)
para la PPDK
(Piruvato Phosphate Di-Kinase) (9), la
cual funge como enzima marcadora
gicosomal y DAPI, el cual funge como
marcador del ADN mitocondrial y
Kinetoplasto,
en
la
muestra
correspondiente de L. mexicana, ya que el
revelado de estos dio negativo (imagenes
no mostradas), lo que hace pensar algn
error durante la incubacin o adicin de
los anticuerpos. Pero a pesar de ello, se
logr obtener seal para la PGI (figura 1.),
que con certeza pertenece a ella, pero que
despus de todo si los resultados control
no se puede certificar completamente que
se trate de ella, aunque observando que
comparte la misma ubicacin reportada
anteriormente (informacin recopilada de
maneral personal). Se puede observar

claramente una seal fuerte y que esbozan

figuran ovaladas, las cuales por su
posicin y dimetro coinciden claramente
con el ncleo.

Luego se procedi al revelado para la PGI

para T. cruzi, lamentndolo mucho, para
este resultado en todas las pruebas de
inmunoinflourescencia fueron negativas.
Debido a esto, se procedi el anlisis de
los resultados obtenidos en un

procedimiento anterior. En el recuadro A

de la figura 2, se puede observar figuras
ovaladas que emiten una fuerte seal
desde ellas, adems por los criterios
explicados anteriormente, se infieren que
estas estructuras coinciden claramente
con el ncleo. Adems de ello tambin se
pueden observar los recuadros (B) y (C),
que corresponden: la primera con la seal
emitida por PPDK (FITC) y el DAPI
respectivamente.
Al
observar
la
sobreposcin de las imgenes en el
recuadro E, se percibe una coloracin
violeta, origen de la combinaciones de la
flourescencias de DAPI y Cys3 de la PGI,
lo que corrobora la presencia de dicha
protena en el nucleo.
En el caso de la ubicacin de la Glucosa6-Fosfato epimerasa 1, se obtuvo que la
ubicacin es difusa a lo largo del

citoplasma, aunque se observar ligeras

concentraciones en el mismo (Figura 3,
recuadro
A).
Al
realizar
la
sobreposiciones de imgenes en el
recuadro E, se puede observar la
combinacin de la seales de la PPDK y
Glucosa-6-Fosfato epimerasa 1, que se
mezcla las seales de ambas, suponiendo
que tiene presencia en los glicosomas y
adems de la estar mezclada la Glucosa6-Fosfato epimerasa 1 con algo de la seal
de DAPI, haciendo pensar que puede ser
que tenga presencia en mitocondria,
kinetoplasto y/o ncleo.
2) Permeabilizacin con Digitonina.
En el anlisis Western Blot (figura 4) para
el sobrenadante de la permeabilizacin
practicada para la extraccin de de PGI,
podemos observar un patrn de liberacin

de Hexokinasa y PGI a partir de 0,08

mg/mg de digitonina, aunque en la
cuantificacin de la actividad enzimtica,
mediante reaccin acoplante, se comienza
a percibir una alta actividad de la PGI, a
partir de la concetracin 0,02 mg/ml de
digitonina (figura 7), en el cual se percibe
una actividad de aproximadamente 17 %,
lo que indica un perfil alto de liberacin.

Aunque, en el perfil para el pellet (figura

5) para la misma protena coincide un
poco mas con lo obtenido en el grafico de
liberacin. Cabe destacar que la mayor
bandeo para ambas se encuentra en el
perfil del sobrenadante (coincidente con
el patrn de liberacin obtenido, mostrado
en la figura 7).

Siguiendo el patrn de liberacin antes

expuesto, podemos observar que tanto las
curvas de Hexokinasa (marcador
enzimtico de glicosoma) y la PGI se
comportan de manera similar, muestra
que ambas por lo menos, estn
compartimentalizadas dentro de la clula

o por lo menos, se encuentran encerradas

dentro de una membrana.
Para el perfil de liberacin de la Glucosa6-Fosfato epimerasa 1, si se cuantificara
su nivel de actividad comparada con el de
la Enolasa (mostrada en la figura 7),
podramos decir que ambas tienen un

comportamiento similar, pero intriga

saber que comparada con el IFI
anteriormente hecho, esta presente un
comportamiento
de
liberacin
desconcertante.

entre las distintas seales, se obtuvo la

ubicacin anteriormente nombrada, con la
adicional ubicacin en el nucleo (ver
figura 2), lo cual causa intriga en cuanto a
su funcionamiento y naturaleza.

D. Discusin.
1) Ubicacon subcelular mediante IFI.

En los trypanosomatides, se ha reportado

enzimas que pueden tener mas de una
funcin en el organismo (4), pero hasta
ahora, solo se ha reportado funciones
como factor de virulencia (4). Pero es
primera vez, por lo menos, que la PGI es
reportada en el ncleo y en estos
organismos. La presencia de esta protena
aqu, se deba tal vez alguna funcin en la
regulacin
gnetica,
como
el
silenciamiento
post-trascripcional
mediante ARN pequeo de interferencia y
metilacin del ADN hecha por el
complejo Argonauta 4 en Arabidopsis sp.,
o con funciones de represin y clivaje
como el represor I-TevI del fago T4 (13).
Se debern realizar nuevos ensayos
moleculares, para descirbir una posible
funcin.

La fosfoglucosa isomerasa o PGI, es una

enzima de la ruta glicoltica y que a su vez
participa en la ruta de las pentosa fosfato
(10-11), que cataliza la reaccin de
Glucosa 6-fosfato a Fructosa-1,6bifosfato. Su distribucin en T. cruzi, se
reconoce ser amplia, abarcando el citosol
y los glicosomas, pero como es sabido, la
reaccin glicoltica no tiene cabida en el
citosol de los trypanosmatides ya que esta
se encuentra secuestrada en el glicosoma
(10). Se piensa que esta puede intervenir
en la ruta de las pentosas fosfato, de la
cual se reconoce la presencia de varios de
sus integrantes en el parsito (8-12), pero
aun no es ubicado por completo en la
constitucin somtica del mismo (12).
Al estudiar los IFI obtenidos para la
localizacin de epimastigotes de L.
mexicana y T. cruzi, obtuvimos en el
primer caso, resultados poco alentadores,
ya que los marcadores enzimticos
citoslicos, glicosomales, nucleares y
mitocondriales, los cuales sirven como
referencia para la ubicacin dentro de la
clula, no se unieron o su seal fue nula.
Esto se deba ha algn error durante el
procesamiento de la muestra. Aunque
cabe destacar que la ubicacin (aunque no
confiable) se establece en el nucleo.
Ahora en el caso de los IFI para T. cruzi,
se obtuve que al hacer el solapamiento

Ahora, en el caso de la ubicacin

subcelular de la Glicosoma-6-Fosfato
epimerasa 1 mediante IFI, se ve que se
encuentra tanto en el citosol, como en los
glicosomas y aparentemente, en la
mitocondria (ver figura 3). Se carece de
informacin de dicha enzima, pero los
pocos estudios que se han hecho establece
que en T. brucei (8) tiene funciones dentro
de la aun no establecida ruta de las
pentosa fosfato (12), y de resistencia ante
el estrs oxidativo. Se ha reconocido la
existencia de una secuencia homloga en
T. cruzi (8), pero no se ha realizado
ninguna investigacin formal que
reportar. La posible presencia de esta

enzima en la mitocondria tal vez est

relacionada con las funciones de
resistencia de las cuales an no se conoce
del todo (14), y que al parecer involucra a
la ruta de las pentosas fosfato, como lnea
defensiva (8).
2) Permeabilizacin con Digitonina y
Western Blot.
Al analizar los resultados en ambos
ensayos y compararlos entre s y con los
ensayos de inmunoflourescencia, se
puede corroborar diversos resultados.
Para el caso de los Western Blot de la PGI
(pellet y sobrenadante), la presencia de
una seal atenuada en ambos geles, podra
causar que a la hora de confirma el
alojamiento de dicha enzima, exista
contradiccin de los datos. Sin embargo,
el patrn de liberacin de la PGI, el cual
es un anlisis cuantitativo de la actividad
en una serie de fracciones de purificacin,
permite realizar una aproximacin de su
lugar de residencia. Complementando los
anlisis de liberacin de la PGI, que
presenta un comportamiento similar al de
la Hexokinasa, una enzima de la ruta
glicoltica secuestrada en el glicosoma, la
cual es una organela carente de ADN (1),
pero con mayores patrones de actividad,
permite inferir que la concentracin de
dicha protena es mayor, y debe
encontrarse
alojada
en
otras
organelas.Lastimosamente, la ausencia de
marcador enzimtico de nucleo, no nos
permite corroborar por completo la
informacin.
Para la epimerasa, a partir del Western
Blot, y cuya intensidad de bandeo, es la
nica forma de que nos permite

corroborar de que ella se encuentra en la

organelas observadas en el IFI. Es
necesario para ambas enzimas, continuar
los ensayos, ya que este primer
acercamiento solo nos introdujo ms
dudas en cual ser la funcin especfica de
dichas enzimas y el por qu ellas se
encuntran donde se lograron localizar en
esta experiencia.
Aunque los resultados no son del todo
concluyentes permite, realizar una
aproximacin a la maginitud de los
ensayos posteriores.
E. Agradecimientos.
Al Laborario de Enzimologa de Parsito,
por ceder los materiales biolgicos y
reactivos para este ensayo, a la Br. Raquel
Parada Puig, preparadora del laboratorio
de Tnicas Analticas, a los Profesores
Ender Quintero Toconis y Juan Luis
Concepcin, por la paciencia cedida
durante la realizacin del ensayo y mis
compaeros Jos Daniel Fili Garca y
Martha Licen Rujano.
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