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Condensador
Tornillos macro y micromtrico
Brazo y Pie
Revlver
Charnela
Platina
PARTE OPTICA
Ocular
Lentes de condensador
Objetivos
Diafragma
Espejo
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PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
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PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
PRCTICA N1 Y 2 MICROBIOLOGA
PRACTICA N 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES
Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados colorantes
cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido).
En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los
microorganismos.
MATERIAL
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3. Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos
2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de
Ziehl Neelsen o tambin llamado cido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la
mayora presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis.
2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una
preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la
llama dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que
no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color
rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.
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PREGUNTAS
QU ES COLORANTE?
Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y animales. Los
colorantes se han usado desde los tiempos ms remotos, emplendose para ello diversas materias
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procedentes de vegetales (crcuma, ndigo natural, etc.) y de animales (cochinilla, moluscos, etc.)
as como distintos minerales.
En qumica, se llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas longitudes, son
sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores
fsicos/qumicos como por ejemplo: luz, lavados, gentes oxidantes, etc.
Para que un colorante funcione en su estructura qumica ha de tener unos determinados grupos
funcionales denominados cromforo, ("ceder color") que son los que hacen que la molcula
absorba en la regin visible del espectro electromagntico. Un auxocromo ("aumentar color") es un
grupo funcional que por s solo no da color a la molcula, pero que si se encuentra conjugado con
un grupo cromforo aumenta la intensidad del color.
Se da este nombre a sustancias coloreadas, las cuales son capaces de teir las fibras vegetales y
animales. Para que un colorante sea til debe ser capaz de unirse fuertemente a la fibra y por
lavado no debe perder su color. Adems debe ser relativamente estable qumicamente y soportar
bien la accin de la luz.
Denominaciones de los colorantes:
denominacin genrica
denominacin qumica
cdigo del "Colour Index 1924 (1 edicin)
cdigo del "Colour Index 1956 (2 edicin)
cdigo del Schultz
QU TIPOS DE COLORANTE CONOCE?
Clasificacin de los colorantes
Colorantes Sustantivos: Son colorantes que pueden teir directamente las fibras de
algodn.
Colorantes Mordientes: El mordiente es un producto que se adiciona a la fibra y es
absorbido por ella, pudiendo consecutivamente atraer el colorante. Este trmino se usa
principalmente para los colorantes que se adicionan usando xidos metlicos como
mordiente. Especialmente se emplean como mordientes los xidos de aluminio y cromo
por formar precipitados insolubles.
Colorantes a la Tina: Son sustancias insolubles que se pueden reducir a materiales alquilsolubles. El colorante se aplica en su forma reducida y se re-oxida en presencia de la fibra.
Colorantes Directos: Se absorbe directamente por las fibras en soluciones acuosas. Hay
colorantes cidos y bsicos de este tipo. Estos dos tipos de colorantes se emplean
especialmente en el teido de lanas y en poliamidas sintticas.
1. Los colorantes bsicos son sales amnicas o complejos formados por cloruro de cinc o
aminas. Algunos colorantes bsicos, de elevado peso molecular, son absorbidos por el
algodn y el rayn.
2. Los colorantes cidos son sales de los cidos sulfricos o carboxlicos que se precipitan
sobra la fibra.
La familia de los colorantes cidos se llama as, porque en la constitucin qumica del colorante se
encuentran molculas de grupos cidos. Son colorantes solubles en agua y se aplican
generalmente en fibras de lana, nylon y fibras acrlicas. Otros usos importantes son el teido de la
piel y papel.
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Tipos de colorantes:
cidos:
o En disolucin se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas
positivamente y no las clulas, que tienen carga negativa.
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o Sales de Na. K, Ca, in amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina cida...
Bsicos:
o En disolucin se cargan positivamente unindose a estructuras con carga negativa
como las clulas.
o Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina
fenicada o carbol-fucsina
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Principios. A pesar de que esta tcnica de coloracin se ha venido empleando desde hace ms de
un siglo, an no se ha podido determinar con exactitud la base molecular de la reaccin, existiendo
controversias al respecto. El criterio ms generalizado es que la violeta y el lugol forman un
complejo que reacciona con los componentes bioqumicos de la pared celular deshidratada,
fijndose en esta. Teniendo en cuenta que la composicin qumica de la pared, no es igual en
todos los gneros, la reaccin resultante ser obviamente diferente, lo que da lugar, que mientras
algunos gneros retienen firmemente el colorante al resultar el complejo impenetrable para el
decolorante, en otros gneros la barrera que se produce es ms permeable, lo que permite al
solvente penetrar y extraer el complejo violeta-lugol, dejando a la bacteria nuevamente incolora.
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Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la
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coloracin de contraste las clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de
contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al trmino del protocolo, las gram
positivas se vern azul-violceas y las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este
mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de
violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de
violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que
la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante.
Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo
Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y
toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y
retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin gram, podemos clasificar
a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que
mejores resultados dan en la coloracin gram. Los representantes ms usados de este grupo son
violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido
al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la
molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-prosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los
nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo
contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene
seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de
Gram.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin gram no es propia de toda sustancia viviente,
sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y
animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta
irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es
infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras
causas.
CUL ES LA INTERPRETACIN DE LAS CRUCES EN EL EXAMEN DE BK?
INFORME DE RESULTADOS.
Negativo:
no
se
observan
BAAR
en
100
campos
observados.
Positivo +: se observan menos de un bacilo por campo en promedio en 100 campos observados.
Positivo ++: se observan de 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados.
Positivo +++: Se observan ms de 10 bacilos por campo en promedio en 20 campos observados.
Es necesario encontrar como mnimo 4 BAAR en la Bac para reportarlo positiva, si se encuentran
de 1 a 3 bacilos esta es la conducta a seguir:
1. Ampliar la lectura a 200 campos.
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QU ES EL TRMINO PAUCIBACILAR?
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