Dossier Microbiologia de Alimentos

CARRERA DE INGENIERIA EN ALIMENTOS
Microbiologa de
Alimentos I
Dossier Metodolgico General
2013
El texto es una compilacin de aspectos generales empleados en microbiologa de alimentos. El

enfoque bsico es didctico y no especializado. Se pretende sentar las bases generales para luego
profundizar ms en un estudio particular.
CONTENIDO:
1. Morfologa y estructura bacteriana

2. Manejo del microscopio
3. Tincin gram
4. Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia
5. Medios de cultivo
6. Cuenta en placa de bacterias
7. Mtodo para la determinacin de bacterias
coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli
por la tcnica de diluciones en tubos mltiples.
8. Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa
9. Mtodo para la cuenta de moho y levaduras en alimentos
10. Extraccin o toma de muestras para el anlisis de
Productos Alimenticios
MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA

Mara Catalina Prez.
Analizaremos algunos aspectos de la morfologa y

estructura de las bacterias, microorganismos que integran
la flora normal de las superficies cutneo-mucosas del
hombre y estn vinculadas a numerosas y frecuentes
patologas infecciosas humanas.
Importancia del tema:
En las ltimas dcadas se han hecho importantes avances
en el estudio de la ultraestructura bacteriana, logrndose
una identificacin bioqumica de muchas de las fracciones
subcelulares, estos avances han permitido ubicar
definitivamente a las bacterias en el reino Procariota.
El conocimiento en profundidad de las diferentes
estructuras y su composicin ha permitido comprender,
como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea
cuando lo hacen como integrantes de la flora normal o
cuando se comportan como agresoras para el mismo.
Ha sido fundamental poder demostrar que muchas
estructuras bacterianas bien identificadas son importantes
inmungenos, siendo posible utilizarlas para la preparacin
de vacunas que han significado verdaderos avances en la
Medicina de los ltimos aos (Ejemplo: vacunas contra
agentes causantes de meningoencefalitis supuradas:
Haemophilus influenzae tipo b).
El conocimiento de la composicin bioqumica de las
diferentes estructuras de las bacterias, asi como de su
metabolismo, ha permitido la comprensin del mecanismo
de accin de diferentes antibiticos.
De gran relevancia han sido tambin los avances en el
estudio del material gentico bacteriano cromosmico y
plasmdico que han posibilitado el desarrollo de tcnicas
con aplicaciones en investigacin y diagnstico que han

revolucionado las ltimas dcadas.
Es justo de todos modos sealar que a pesar de todas estas
innovaciones la observacin al microscopio ptico y la
reaccin de las bacterias ante las diferentes coloraciones
sigue siendo de fundamental importancia en la taxonoma e
identificacin bacteriana.
Definicin: Las bacterias o procariotas, son
microorganismos unicelulares que se reproducen por fisin
binaria (divisin simple). Muchos tienen vida libre.
Contienen informacin gentica, sistemas de produccin de
energa y sistemas biosintticos necesarios para el
crecimiento y reproduccin.
Ubicacin dentro de los sistemas biolgicos:
La gran divisin de los seres vivos se realiza segn el tipo
de clulas: eucoriota y procariota.
Como veremos en el cuadro 1, animales y plantas,
individuos multicelulares, tienen clulas
eucariotas.
Tambin poseen este tipo de clulas algas, hongos y
protozoos. (eu significa verdadero, cariota: ncleo).
Las bacterias son microorganismos unicelulares, siendo
entonces clulas procariotas. Existen dos grupos de
procariotas evolutivamente distintos, las eubacterias y las
arquebacterias.
Una clula bacteriana tpica tiene las siguientes estructuras:
Material gentico ADN, bajo forma de un cromosoma
nico que no est rodeado de membrana nuclear, esta
caracterstica es la diferencia fundamental con la clula
eucariota, la cual posee siempre membrana nuclear.
Presentan adems ribosomas, citoplasma y membrana
Cuadro 1
SERES VIVOS
Organizacin unicelular sin
diferenciacin
Clula procariota (ncleo primitivo)
Procariota: bacterias
Organizacin unicelular o colonial
Clula eucariota (ncleo verdadero)
Protistas: protozoarios, fitoflagelados
Multicelulares.
Diferenciacin celular en tejidos
Clula eucariota
Reinos: animal y vegetal
Uni o multicelular
Uni o multinuclear
Clula eucariota
Hongos, algas
citoplasmtica. Figura 1.
Por fuera est la pared bacteriana, estructura que por su
composicin bioqumica se puede decir que es propia de
las bacterias, ya que las clulas vegetales tienen una pared
celular pero est compuesta por celulosa. Algunas bacterias
como los micoplasmas, carecen de pared celular.
Las diferentes estructuras bacterianas que observamos en la
figura 1 las podemos dividir, segn sean constantes en las
clulas o no, en estructuras permanentes y variables.
Estructuras permanentes: - membrana celular
- ribosomas
- material gentico
Estructuras variables: - pared celular
- flagelo
- fimbrias o pilis
- cpsula
- esporas
Al decir estructuras variables queremos decir que estas
estructuras existen en algunas bacterias y no en todas, y
aun en un mismo grupo bacteriano o una misma cepa
bacteriana las puede presentar o no, dependiendo de las
condiciones en donde se desarrolle. Las estructuras
variables no son necesarias para la vida de la clula
bacteriana.
Tamao: Las bacterias presentan una amplia diversidad de
tamaos, que va desde 0.5 a 2 micrmetros y algunas
pueden llegar a 10 micras. No son visibles por supuesto al
ojo humano y se visualizan con microscopio ptico (MO) o
electrnico (ME).
Las bacterias pueden ser observadas al MO sin ser
coloreadas si se las coloca en glicerol o soluciones no
acuosas que aumenten el ndice de refraccin.
Las bacterias se pueden observar sin colorear utilizando la
tcnica de microscopa de campo oscuro en la que
utilizando un condensador especial se ven sobre un fondo
oscuro como cuerpos brillantes. Esta tcnica se usa para el

examen de microorganismos no teidos en suspensiones
lquidas como es el caso de Treponema pallidum, agente
de la sfilis, que se observan como espiroquetas
delgadsimas.
Forma: Al MO o ME las bacterias se presentan con una
morfologa definida que est determinada por su pared
rgida. Se pueden presentar como esfricas, ovaladas,
denominndose cocos. Si la forma es cilndrica se
denominan bacilos o bastones.
Estos bastones pueden ser rectos, curvos o con forma de
espiral, en este ltimo caso les llamamos espirilos. Figura
2.
Las clulas bacterianas pueden mantenerse unidas en
grupos despus de que se han dividido, pero conservando
siempre la independencia una clula de otra. Cocos o
bacilos pueden agruparse en cadenas, en el caso de los
cocos, cuando se presentan as agrupados, se denominan
estreptococos. Tambin se pueden presentar como
diplococos.
Si los planos de divisin son variados pueden agruparse en
ttradas o como racimos, denominndose estafilococos.
Los bacilos pueden ser muy cortos, recibiendo el nombre
de cocobacilos, otras veces pueden ser muy largos,
pudiendo tener una longitud 10 veces superior a su
dimetro. Los extremos pueden ser redondeados o rectos,
pueden presentarse aislados, en largas cadenas o pueden
agruparse en empalizadas o formando letras chinas.
La morfologa bacteriana se observa al MO sin tincin
como se seal, o utilizando diferentes tcnicas de tincin
que ayudan a su mejor visualizacin ya que son incoloras.
Las diferentes tcnicas de tincin consisten en colorear las
clulas con diferentes colorantes que tienen afinidad por
materiales celulares especficos. Hay colorantes catinicos,
de carga positiva que tienen afinidad por constituyentes
celulares de carga negativa, como los cidos nucleicos y
los polisacridos.
Algunos ejemplos de colorantes catinicos: azul de
Material gentico:
Ribosomas: La clula bacteriana presenta ribosomas libres
en el citoplasma con coeficiente de sedimentacin de 70S a
diferencia de la clula eucariota que es de 80S. Se
presentan tambin como polirribosomas que son cadenas
de ribosomas asociados a ARN mensajero y en parte en
relacin con el ADN cromosmico. Contienen todos los
componentes que permiten la sntesis proteica.
Las clulas poseen ms ribosomas si estn creciendo en
medios ricos. El alto contenido de ARN determina gran
afinidad por los colorantes bsicos.
metileno, cristal violeta, safranina.

Ms adelante analizaremos algunos detalles de la
coloracin ms utilizada en Bacteriologa, denominada
coloracin de Gram en honor a quien en 1884 la describi.
Es esta una coloracin diferencial que permite dividir a las
bacterias en Gram positivas, refirindose a aquellas que
toman el primer colorante utilizado que tie las bacterias
de color violeta y las Gram negativas, las que toman el
ltimo colorante utilizado en la tcnica como colorante de
contraste que las tie de rojo o rosado. Este tipo de
coloracin se denomina diferencial por lo que acabamos de
analizar.
Otras coloraciones simples como el azul de metileno, se
utilizan para observar simplemente la morfologa.
Analizaremos la clula desde su interior para luego
dedicarnos a las estructuras externas y apndices.
Las estructuras internas de la clula estn inmersas en el
citoplasma, solucin acuosa y viscosa, que contiene solutos
orgnicos e inorgnicos y elementos especializados como
ribosomas y grnulos de inclusin.
ADN bacteriano:Como se seal, la clula procariota a

diferencia de la eucariota carece de una membrana nuclear,
tampoco posee nuclolo, ni aparato mittico, y nunca
configura una masa cromosmica definida.
El material gentico est compuesto de una estructura
fibrilar, constituida por un ADN circular de doble cadena,
enrollado sobre s mismo. Si bien se asocia a protenas
bsicas, estas no son verdaderas histonas.
Los mesosomas son, al parecer, invaginaciones de la
membrana citoplasmtica y participan en la divisin celular
y en la replicacin de ADN. Si bien hay autores que opinan
que son artefactos de tcnica que se observan en las
microfotografas electrnicas, hay otros que han observado
que claramente el ADN se fija al mesosoma en la etapa
previa de la divisin celular.
En las ltimas dcadas se han desarrollado muchas tcnicas
que permiten estudiar el ADN bacteriano, todas ellas con
importantes aportes en la investigacin y el diagnstico.
Por ejemplo, es posible por tcnicas de secuenciacin,
conocer genomas enteros de bacterias o sectores de l que
tengan inters, ya sea porque codifican la produccin de
alguna estructura, una toxina, etc. Estos sectores de ADN,
se pueden separar del ADN total con enzimas de
restriccin para su posterior anlisis o utilizacin en
estudios de biologa molecular.
Estas tcnicas de biologa molecular estn destinadas a
identificar sectores de ADN especfico de una bacteria, por
ejemplo: las tcnicas de hibridizacin que identifican un
trozo de ADN con una sonda gentica complementaria de
ese sector y marcada con un compuesto revelador; o la
tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) que
amplifica miles de veces el sector de inters.
Plsmidos y episomas: Algunas bacterias poseen material

gentico extracromosmico, denominados plsmidos y
episomas. Los plsmidos son elementos genticos
constituidos por secuencias de ADN cortas circulares que
se replican en forma autnoma. Como se ver en el
captulo de gentica bacteriana, stos poseen genes que
codifican factores de agresin, factores de resistencia a
antibiticos, produccin de toxinas, etc.
Los episomas son elementos genticos extracromosmicos
que pueden existir en forma autnoma o incorporados al
material gentico.
Membrana celular: Estructura delgada que rodea a la

clula de 8 nm de espesor. Es una estructura vital, si se
altera, la clula pierde su vitalidad.
Composicin: es similar a al mayor parte de las
membranas biolgicas. Figura 3. Una doble capa
fosfolipdica en donde el cido graso hidrofbico se orienta
hacia el interior y el glicerol hidroflico hacia el exterior de
la clula. A diferencia de la clula eucariota no posee
esteroles (excepto los micoplasmas).
Algunos antibiticos, cuyo blanco de ataque en la clula
bacteriana es la membrana celular, actan inmediatamente
que la clula se pone en contacto con stos. Los
antibiticos de este tipo, son por su mecanismo de accin,
txicos para los tejidos humanos y poco utilizados en
medicina clnica.
Funcin: Delimita el interior del exterior celular, es una
barrera osmtica muy importante, interponindose a la
libre difusin entre el medio ambiente interno y externo.
Es una membrana con permeabilidad selectiva, a travs de
la cual ingresan los nutrientes y salen los productos de
desecho. El transporte de solutos se realiza muchas veces
por un sistema de transporte activo, como se analizar al
estudiar el metabolismo bacteriano.
En la membrana celular estn los sistemas de fosforilacin,
oxidacin y transporte de electrones (citocromos) para la
produccin de energa.
Dentro de las diversas actividades enzimticas vinculadas a
las protenas de la membrana citoplasmtica, podemos
sealar su participacin en la biosntesis del ADN, de los
constituyentes de la pared, etc.
Ya hemos hecho mencin ms arriba de los mesosomas
que son organelos que se asocian a la membrana. Se
observan al ME como sacos citoplasmticos que contienen
estructuras verticiladas, laminares, tubulares o vesiculares,
y a menudo se asocian con tabiques de septacin. Se ha
demostrado que los mesosomas
fijan el ADN
cromosmico a la membrana citoplasmtica.
Pared celular: Estructura rgida presente como ya se

dijo en la mayora de las bacterias, se sitan por fuera de la
membrana citoplasmtica. Es una estructura vital para las
bacterias que las poseen. Si sta se destruye o se impide su
formacin, la clula pierde su viabilidad.
El peptidoglicano, principal constituyente de la pared, es
un polmero constituido por unidades repetidas del
monmero formado por: dos derivados de carbohidratos,
N-acetil Glucosamina y N-acetil Murmico (N-Ac.G, NAc.M), unidas por enlaces beta 1-4 y asociados a cortas
cadenas peptdicas a travs del N-acetil Murmico. Figura
4.
El espesor de la pared en los diferentes microorganismos,
oscila entre 0,150 m y 0,500 m de (m=micra).
Podemos imaginar entonces la pared celular, como una
macromolcula gigante constituida por peptidoglicano, que
en forma de bolsa rodea toda la clula, representando del
10 al 40 % del peso de la bacteria.
Unido al N-acetil murmico se encuentra un tetrapptido
como se aprecia en la figura 4. Los tetrapptidos de una
cadena de peptidoglicano se unen con los de la otra a
travs de puentes peptdicos. Los aminocidos que forman
los tetrapptidos son los siguientes: L-Alanina, Acido DGlutmico, Acido mesodiaminopimlico (o L-Lisina) y D-
de la clula en divisin. A nivel de esas brechas o aberturas

es donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared en
formacin. Figura 5.
La mayor parte de la informacin se ha obtenido de la
sntesis del peptidoglicano de Staphylococcus aureus y la
explicacin que sigue se restringir a este organismo. En el
citoplasma se une el N-acetil Murmico a un transportador
lipdico de membrana: el bactoprenol, luego se une la Nacetil Glucosamina y, finalmente, el puente de
pentaglicina. El bactoprenol transporta el bloque formado a
travs de la membrana citoplasmtica. Una vez en el
espacio periplsmico, estos bloques son colocados en las
brechas ya formadas.
El paso final y fundamental para una correcta funcin de la
pared es la unin los monmeros de peptidoglicano entre
si.
Esta unin la realizan enzimas denominadas
transpeptidasas. A este paso se lo conoce como
transpeptidacin.
La Penicilina y sus derivados, los antibiticos ms usados
en Medicina, actan precisamente inhibiendo la sntesis de
la pared celular, llevando a la lisis de la bacteria.
La unin de los puentes peptdicos se pueden hacer como
ocurre en la mayora de las bacterias por uniones directas
transpetdicas entre la D-Alanina de un puente peptdico y
el cido diaminopimlico (DAP) de otro tetrapptido
adyacente. En Staphylococcus aureus la reaccin de
transpeptidacin se efecta mediante un puente de
pentaglicina, el cual une la L-Lysina de un tetrapptido con
la D-Alanina de otro tetrapptido adyacente.
Existen diferencias en el espesor de esta estructura bsica,
el peptidoglicano de las bacterias Gram positivas tienen
una capa gruesa de 0,02 a 0,06 m en forma de multicapas,
mientras que las bacterias Gram negativas y las bacterias
cido alcohol resistentes la tienen ms fina, de 0,01 m.
Al peptidoglicano se le unen otros componentes que son,
por lo tanto, tambin integrantes de la pared. Son
diferentes en las bacterias Gram positivas, negativas y
cido alcohol resistentes. Revisaremos algunos aspectos de
la composicin de los tres tipos de paredes. (Cuadro 2)
Alanina.
Podramos resumir de la siguiente manera la sntesis del
pptidoglicano:
En el momento de la divisin celular se debe formar la
nueva pared celular. Las autolisinas, enzimas producidas
por la propia bacteria, forman brechas en la "vieja pared"
Pared de bacterias Gram negativas:

Si observamos la pared de las bacterias Gram negativas al
microscopio electrnico podemos observar 3 zonas:
1.
La membrana citoplasmtica.
2.
El espacio periplasmtico, ubicado entre la
membrana citoplasmtica y el peptidoglicano.
3.
Una fina capa de peptidoglicano.
4.
Membrana externa que contiene fosfolpidos, el
lipopolisacrido (LPS) caracterstico de estas
bacterias y protenas (protenas de membrana
externa). Esta capa est estrechamente unida al

peptidoglicano y se la considera un componente
de la pared celular de las bacterias Gram
negativas. Figura 6.
En el lipopolisacrido se pueden distinguir 3 componentes
diferentes bioqumicamente. La porcin lipdica, el lpido
A, est inmersa en el centro de la membrana externa. En su
sector externo la porcin polisacardica, el denominado
polisacrido O, o antgeno O, est ubicado en la cara
externa. Entre estos dos componentes est el core del LPS,
que es tambin polisacardico. El antgeno O es muy
variable en su composicin entre las diferentes familias y
especies de bacterias Gram negativas, en cambio, el
polisacrido del core es constante en las diferentes
bacterias Gram negativas. El polisacrido O por su
variabilidad es utilizado frecuentemente para la
clasificacin serolgica de familias bacterianas de inters
mdico.
Al lipipopolisacrido (LPS) se le denomina endotoxina,
siendo el lpido A su la porcin txica. Como el lpido A
est inmerso en el centro de la membrana slo ejerce sus
efectos txicos cuando la clula es lisada, ya sea por ataque
del complemento y fagocitosis, o por lisis celular como
consecuencia de la accin de antibiticos.
Si se inyecta a un animal de experimentacin endotoxina,
ocurren una serie de eventos fisiolgicos, el primero es la
fiebre. La endotoxina estimula a las clulas del husped a
liberar protenas denominadas pirgenos y stos modifican
el centro termorregulador del encfalo. Pero el animal
tambin puede sufrir otras alteraciones como disminucin
de leucocitos y plaquetas en sangre, sufriendo finalmente
un estado inflamatorio generalizado que lo puede llevar a
la muerte (fenmeno de Shwartzman-Sanarelli).
Efectos similares ocurren cuando por destruccin
bacteriana hay endotoxinas en sangre. La gravedad del
cuadro clnico se sabe hoy que depende en parte de la
cantidad de endotoxinas circulantes, pudiendo determinar
desde un simple cuadro infeccioso con fiebre, a sepsis,
CUADRO 2
Composicin de la pared celular de Gram positivas y Gram
negativas
Bacterias Gram positivas
Bacterias Gram negativas
Glucopptidos 0.02 a 0.06 m
m Protenas
Glucopptido
0.01
Membrana externa:
Acidos lipoteicoicos
Lipoprotenas
Acidos teicoicos
Lipopolisacridos
Acidos teicurnicos
Polisacridos
Fosfolpidos
Protenas
Polisacridos
shock sptico o la muerte.

La toxicidad del lpido A radica primariamente en su
habilidad para activar el complemento y estimular la
liberacin de citoquinas por parte de las clulas del
husped (leucocitos, macrfagos, etc.).
El complemento y las citoquinas en condiciones normales
son parte de los mecanismos de defensa del husped, pero
si estn en altas concentraciones desencadenan un proceso
perjudicial. Desencadenan localmente un proceso
inflamatorio y una respuesta sistemtica que constituye el
shock sptico.
Entendemos por shock la serie de eventos que determinan
el colapso del sistema circulatorio que lleva a la falla de
mltiples rganos vitales y, finalmente a la muerte
(multiple organ sistem faillure, MOSF).
An hoy no es posible decir exactamente como se
desencadena este fenmeno.
Se acepta que cuando en la sangre se libera LPS de
bacterias Gram negativas lisadas, stos se unen a protenas,
denominadas protenas fijadoras de LPS. El complejo LPSprotena fijadora de LPS interacta con receptores CD14 de
monocitos,
macrfagos
y
clulas
endoteliales.
Posteriormente se desencadenan 3 fenmenos que tienen
como accin final el dao endotelial difuso y, por ende, la
falla multiorgnica.
El primero es la liberacin de citoquinas por los
monocitos, macrfagos y otras clulas tisulares como IL1,
IL6, IL8 (IL interleuquina), factor de necrosis tumoral
(FNT). Estas a su vez estimulan la produccin de
prostaglandinas y leucotrienos, que son los mediadores del
dao endotelial en mltiples rganos. En segundo lugar se
activa el complemento y en tercer lugar se activa la cascada
de la coagulacin. Figura 7.
La membrana externa contiene adems numerosas
protenas. Algunas de ellas la atraviesan de lado a lado,
constituyendo canales, denominados porinas. Estos poros
permiten el pasaje de molculas de bajo peso molecular,
como nutrientes. Las grandes molculas no atraviesan la
membrana externa, por esto estas bacterias, a diferencia de
las Gram positivas, no son sensibles a una enzima, la
lisozima que destruye el peptidoglicano. Incluso algunos
antibiticos de alto peso molecular no pueden atravesar la
membrana externa y, por lo tanto, las bacterias no son
sensibles a ellos.
Pared de las bacterias Gram positivas:
Lo primero a sealar es la gruesa capa de peptidoglicano
en forma de mltiples capas. Unidos a l se encuentran los
cidos teicoicos (del griego techos, pared). Son
polisacridos que se unen al cido N-acetil murmico del
efectos.
A la luz de las investigaciones actuales, al aparecer
fragmentos de peptidoglicano, cido teicoicos o una
combinacin de los dos, juegan un papel semejante al LPS.
Si se inyectan a animales tienen efectos similares que los
LPS.
Al peptidoglicano de la pared de las bacterias Gram
positivas, se pueden unir protenas como la protena M de
Streptococcus pyogenes (o Streptococcus grupo A) que se
vincula con la virulencia, y tambin se pueden asociar
polisacridos como el polisacrido C que permite la
clasificacin en serotipos del gnero Streptococcus (A, B,
C, D, E, F, etc.).
peptidoglicano. Algunos cidos teicoicos tienen unido un

lpido (cidos lipoteicoicos).
Los cidos lipoteicoicos estn embebidos en la membrana
citoplasmtica por su porcin lipdica. Los cidos teicoicos
tienen por funcin estabilizar la pared.
La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias
Gram positivas est usualmente cubierta de protenas. Los
diferentes grupos de bacterias Gram positivas y las
diferentes especies, difieren en la composicin de sus
protenas y cidos teicoicos, siendo esto til para la
clasificacin serolgica y la identificacin.
En la pared de las bacterias Gram positivas no existe una
endotoxina, sin embargo, la presencia de estas bacterias en
los tejidos y en la sangre determina sntomas similares al
shock sptico que ocurre ante la presencia de endotoxinas.
Las mismas citoquinas que se liberan ante la presencia de
los LPS, se sabe que son liberadas ante presencia de la
pared de las bacterias Gram positivas con sus mismos
Composicin de la pared de las bacterias cido alcohol

resistentes (AAR):
Nos referiremos como bacteria modelo de este grupo al
gnero Mycobacterium.
Adems del peptidoglicano, la pared celular de las
micobacterias contiene una gran cantidad de glicolpidos
como el complejo lipdico arabinogalactano y los cidos
miclicos, stos ltimos son slo encontrados en
Mycobacterium y Corynebacterium Spp. Esta gran
cantidad de lpidos hace que las bacterias AAR no se
coloreen o se coloreen mal con la coloracin de Gram.
Para colorearlas, se somete a las bacterias a una coloracin
con Fucsina (colorante rojo) con ayuda de calentamiento y
luego que son teidas as, resisten la decoloracin con una
mezcla de alcohol cido. Esta gran cantidad de lpidos de
la pared, 10% del total del peso de la clula de
micobacterias, protege a la bacteria de la accin deletrea
de los componentes del fagolisosoma y, probablemente,
sea esta la razn por la que las micobacterias pueden
sobrevivir dentro de los macrfagos. Los componentes de
la pared de las micobacterias tambin tienen la capacidad
de estimular al sistema inmune, tanto es as que se utiliza
para aumentar la produccin de anticuerpos cuando se
inyecta antgenos proteicos, o sea, se utiliza como
adyuvante. El adyuvante de Freund tiene como
componente bsico, la pared micobacteriana.
Despus de analizar las diferencias entre la composicin de

las paredes de las bacterias Gram positivas, negativas y
cido alcohol resistentes se puede ir comprendiendo la
importancia que esto tiene en el momento de estudiar
mecanismos de agresin, sensibilidad a antibiticos,
taxonoma, clasificacin bacteriana, identificacin, etc.
Tambin es necesario sealar que el tipo de pared celular
podra determinar el hecho de que unas bacterias se tian
con la coloracin de Gram y otras no, y por qu las que no
lo hacen sean Gram positivas y otras negativas.
Recientemente se ha demostrado que en las bacterias Gram
positivas es la gruesa capa de peptidoglicano con
numerosos cidos teicoicos unidos a ella, la que determina
que estas bacterias retengan al colorante cristal violeta
utilizado en el primer paso de la coloracin, y resistan la
decoloracin con alcohol acetona. Por el contrario, las que
lo pierden al ser descoloradas, las Gram negativas, tienen
una fina capa de peptidoglicano y la membrana externa rica
en lpidos, que podran ser solubilizados con alcohol
acetona y facilitar as la prdida del cristal violeta,
quedando finalmente coloreadas de rojo con safranina,
colorante de contraste usado al final de la tcnica.

Podramos decir que la pared bacteriana es un gran
mosaico de antgenos que son utilizados en la clasificacin
bacteriana y en la identificacin, como en el caso del
antgeno O en enterobacterias, el polisacrido C para la
serotipificacin de estreptococos, etc. Tambin antgenos
de la pared han sido ensayados como inmungenos en la
produccin de vacunas, como protenas de membrana
externa en la vacuna antimeningocccica para el grupo B.
La porcin central del LPS, que es invariable entre las
diferentes bacterias y no es txica, se ha ensayado tambin
como inmungeno.
Tambin es importante sealar la funcin que cumple la
pared celular como barrera osmtica.
Cpsula: Es una envoltura externa, ubicada por fuera de la
pared celular, mucosa, que forma un gel que se adhiere a al
clula.
Como se seal, es una estructura variable que la pueden
producir tanto bacterias Gram positivas como Gram
negativas. La gran mayora son polisacardicas.
No es una estructura vital para la clula, su prdida no se

relaciona con la prdida de viabilidad de la clula, pero s
se relaciona con cambios en la morfologa colonial y en la
prdida de la virulencia bacteriana.
La virulencia de algunos patgenos se correlaciona con la
presencia de cpsula, como por ejemplo: Streptococcus
pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b. La cpsula
protege a la bacteria de la fagocitosis, principal mecanismo
de defensa que pone en juego el husped ante la presencia
de bacterias capsuladas. Una respuesta efectiva para
defenderse de este tipo de bacterias implica la produccin
de anticuerpos que se unan especficamente a la cpsula
facilitando as la opsonizacin y la fagocitosis.
De su capacidad antignica se desprende el uso de la
cpsula para la produccin de diferentes vacunas que
estimulan la formacin de anticuerpos especficos, y han
demostrado ser efectivas (vacuna anti-neumocccica, antiHaemophilus influenzae tipo b, anti-meningocccica A y
C, etc).
Las bacterias que producen cpsula forman en los medios
slidos colonias acuosas, mucoides (M) o lisas (S), en
cambio, las cepas rugosas (R) no producen cpsula. La
prdida de la capacidad de formar cpsula por mutacin S
a R se correlaciona con la prdida de la virulencia y
aumento de la facilidad de destruccin por los fagocitos,
pero no afecta la viabilidad.
La presencia de cpsulas tambin se puede demostrar por
tincin negativa con tinta china. La tinta chino no penetra
la cpsula pero delimita un contorno refringente alrededor
del cuerpo bacteriano sobre un fondo oscuro.
Los antgenos capsulares son muy tiles en la clasificacin
e identificacin de diferentes bacterias; Streptococcus sp. ,

S. pneumoniae, Haemophilus sp. , Neisseria meningitidis
sp, etc.
Frimbias o pilis: Las fimbrias son estructuras filamentosas
proteicas similares a los flagelos en su composicin y
morfologa, pero no participan en la motilidad y son menos
abundantes y ms cortas.
Es una estructura variable que la poseen algunas bacterias.
Las fimbrias o pilis comunes se relacionan con la
adherencia de las bacterias a superficies inertes o vivas. De
gran importancia en este sentido es la adherencia especfica
que presentan muchas bacterias a determinados epitelios,
jugando un papel fundamental en la colonizacin. Esto se
debe a que las fimbrias encuentran en las clulas epiteliales
receptores especficos para ellas.
A modo de ejemplo, las cepas de Neisseria gonorrohoeae
patgenas son aquellas que poseen fimbrias que se
adhieren especficamente al epitelio uretral del hombre o al
crvix uterino en la mujer.
Las cepas de E. coli capaces de causar infeccin urinaria
tienen fimbrias que les permiten una adhesin especfica al
epitelio del aparato urinario.
Tambin E. coli enteropatgena clsica (EPEC) tiene
fimbrias que le permiten adherirse especficamente al
epitelio intestinal para luego producir los cambios a ese
nivel que determinarn la instalacin de la diarrea.
Existen otros pilis llamados sexuales que son ms largos y
se presentan en nmero de dos o tres por clula. Estos pilis
sexuales intervienen en el intercambio gentico entre
bacterias, de all su nombre. El apareamiento de dos
bacterias y la transferencia de ADN a travs del pili sexual
se conoce como conjugacin. Se transfiere material
gentico de una clula donadora a una receptora y se
transfiere slo pequeos sectores de ADN, en general un
plsmido o una porcin de cromosoma movilizada por un
plsmido.
La clula donadora tiene un plsmido llamado conjugativo
que posee la informacin gentica para que esa clula
produzca el pili sexual que le permita la unin a la clula

receptora.
Una vez unidas los pilis sexuales se retraen, permitiendo
que las clulas se unan y pase el ADN de la clula
donadora a la receptora, formndose, al parecer, una
verdadera unin entre las membranas de las clulas que
forma un puente para el pasaje de ADN.
La clula receptora est estrechamente emparentada con la
donadora y posee un receptor especfico para los pilis
sexuales.
Flagelos: los flagelos son filamentos largos, delgados,
helicoidales, de longitud y dimetro uniforme. Son
responsables de la motilidad de las bacterias.
Presentan flagelos fundamentalmente: bacilos Gram
positivos y Gram negativos. El flagelo est compuesto de 3
partes, el filamento, el gancho y el cuerpo basal.
El filamento es externo con respecto a la clula y se une al
gancho en la superficie celular. El gancho est fijado al
cuerpo basal, que a su vez est anclado en la membrana
plasmtica. El cuerpo basal est compuesto de un cilindro
y dos o ms juegos de anillos contiguos a la membrana
plasmtica, el peptidoglicano y, en el caso de las bacterias
Gram negativas, a la membrana externa. Figura 8.
Los flagelos pueden variar en nmero desde uno, unos
pocos o varios cientos como en algunas cepas de E. coli.
Segn el nmero de flagelos y su topografa en la clula
podemos hablar de monotricas cuando tienen un flagelo
nico, lofotricas cuando presentan un penacho de varios

flagelos polares, anfitricas si los flagelos se encuentran en
ambos polos y peritricas cuando los flagelos estn
distribuidos sobre toda la superficie celular.
Esporos: algunas bacterias producen en su interior esporos
o endosporas. Estas estructuras son muy resistentes al
calor, la desecacin, la radiacin, los cidos, y los
desinfectantes qumicos. Los producen algunas familias de
bacilos Gram positivos. El esporo se forma en la clula
vegetativa en ciertas condiciones como son la escasez de
nutrientes. En lugar de dividirse la clula, sufre una
compleja serie de fenmenos que dan lugar a la formacin
de la espora.
Una espora puede permanecer en ese estado durante
muchos aos pero puede convertirse de nuevo en una
clula vegetativa y volver a multiplicarse, fenmeno
denominado germinacin de la espora.
El descubrimiento de que hay bacterias que forman esporos
fue de gran importancia para la microbiologa. El
conocimiento de que existen estas formas altamente
termoresistentes fue esencial para el desarrollo de mtodos
adecuados de esterilizacin de medicamentos, alimentos,
medios de cultivo microbiolgicos, etc. El ciclo vital de
una bacteria productora de esporos se puede ilustrar como
se ve en la figura 9.
Los esporos son impermeables a los colorantes, entonces
se pueden observar como regiones no teidas dentro de
clulas que han sido coloreadas con colorantes bsicos
como el azul de metileno. Existen adems coloraciones
especiales para teir los esporos.
Si observamos una espora al microscopio electrnico se ve
que presenta numerosas capas. La capa ms externa es una
delicada y delgada cubierta llamada exosporium. Le sigue
la cubierta de la espora, que est compuesta de una capa o
ms de una sustancia parecida a la pared celular. Por
debajo de la cubierta se encuentra la corteza y dentro de
ella, el ncleo o corazn que contiene la pared de la
bacteria que dio origen al esporo, la membrana
citoplasmtica y la regin nuclear.
Las esporas son ricas en cido dipicolnico e iones calcio y
hay evidencias que esta asociacin cumple una funcin
importante para conferir la excepcional resistencia al calor
de los esporos.
Inclusiones y productos de almacenamiento: dentro de
algunas bacterias se pueden observar grnulos y otras
inclusiones. Casi siempre su funcin es el almacenamiento
de compuestos energticos como el cido poli hidroxibutrico que se utiliza como fuente de carbono y
energa. En otros grnulos se almacena glucgeno.
Con frecuencia las inclusiones pueden verse directamente
con el microscopio de luz sin tinciones especiales.
10
PRACTICA 2
TINCION DE GRAM
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Cuando haya completado este experimento, usted debe comprender:
1. La base terica y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
2. La base qumica de la tincin de Gram.
3. El procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de bacterias: Grampositivas y Gram-negativas.
PRINCIPIO:
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se aplican en
secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tincin primaria o colorante
primario. Su funcin es impartir color a todas las clulas. Con el objetivo de establecer un
contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar
la clula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las
clulas decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de
contraste no puede ser absorbido por clulas que no han perdido el colorante primario. De esta
manera, tipos de clulas o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del
colorante que es absorbido.
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin de Gram,
llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las bacterias en dos
grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificacin y
diferenciacin de microorganismos. La reaccin a la tincin de Gram est basada en la
diferencia en la composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las bacterias Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o murena, mientras que esta capa es ms
fina en las Gram-negativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es
un polisacrido formado por dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y acido Nacetilmurmico.
Figure 1 Microfotografa de una pared celular Gram

Positiva
Figure 3 Microfotografa de pared celular de

bacteria Gram-negativa
Figure 2 Estructura de la Pared Celular Grampositiva
Figure 4 Estructura de la Pared Celular Gramnegativa
Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del
colorante primario con la clula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.
Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin:
deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol disuelve los lpidos de la parte
externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el
complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las clulas previamente
decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
EN LA MESA DE TRABAJO
MATERIALES:
Cultivos: cultivos de 24 horas en agar nutritivo en tubo inclinado de Escherichia coli, Micrococcus
luteus, Bacillus megaterium y Rhodospirillum rubrum.
Reactivos: Cristal violeta, Yodo de Gram, Alcohol Etlico 95%, Safranina.
EQUIPOS Y MATERIALES:
Mechero de alcohol, asa de siembra, cubeta de tincin, portaobjetos, papel de absorcin, papel
de lentes, y microscopio.
PROCEDIMIENTO:
1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.
2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos y, en el quinto portaobjetos prepare
un frotis de una mezcla de Micrococcus luteus y Eschericha coli. Para preparar los frotis se
sigue el siguiente procedimiento:
a. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra,
ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de
agua, que es suficiente.
b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas, una
pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota
de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin
homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la
muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el
portaobjetos.
c. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el
portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha
precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden

deformarse o romperse.
d. Para preparar el frotis de la mezcla Eschericia coli-Micrococcus luteus, coloque
una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada organismo
separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra esterilizada y
enfriada. Mezcle ambos microorganismos haciendo movimientos circulares con
el asa.
3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
4. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte durante 1 minuto.
5. Lave suavemente con agua.
6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto.
8. Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobredecolore, agregue el alcohol gota a
gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
10. Agregue la safranina para la tincin de contraste.
12. Seque la preparacin.
13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.
Tina suavemente con cristal

violeta por 1 min
Lave suavemente con agua
Aplique alcohol o acetona

gota a gota hasta que salga
claro
Tina suavemente con

safranina por 1 min
Aplique yodo o lugol

suavemente por 1 min
Seque al aire o con papel

absorbente
PRACTICA 2
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
De acuerdo a sus observaciones al microscopio, registre sus resultados en el cuadro.

1. Haga un dibujo de un campo microscpico representativo.
2. Describa las clulas de acuerdo a su morfologa y arreglo.
3. Describa el color de las clulas tintadas.
4. Clasifique el organismo como Gram-positivo o Gram-negativo.
E.coli
M. luteus
B. megaterium
Mezcla
Dibujo
de
campo
microscpico
representativo
Morfologa
celular:
-Forma:
-Arreglo
Color
Reaccin
Gram
de
Facultad de Medicina - Microbiologa Parasitologa e Inmunologa - Microbiologa e Inmunologa
ESTERILIZACIN,
DESINFECCIN Y
ANTISEPSIA
Introduccin
Las tcnicas de prevencin de la
transmisin de microorganismos patgenos han colaborado en este siglo al desarrollo de la Medicina, sobre todo en el terreno quirrgico, en el manejo de los grandes quemados y en la lucha contra las infecciones, especialmente las nosocomiales.
Entre los precursores de las tcnicas
de desinfeccin se encuentra Joseph Lister, quien introdujo en 1860 la ciruga antisptica como manera de evitar las sepsis
puerperales, tan comunes en esos tiempos, an cuando todava no se haba identificado el primer agente especfico de la
infeccin.
Por su parte, Louis Pasteur en la
misma poca, demostr que un medio de
cultivo permaneca estril si era sometido a
ebullicin y que el calentamiento de un
lquido y su enfriamiento rpido provocaban la disminucin de su carga bacteriana,
dando lugar al procedimiento tan utilizado
en nuestros das para la conservacin de
alimentos, la pasteurizacin.
Se dice que un objeto es infectante
cuando en su superficie o en su masa lleva
grmenes de alguna enfermedad transmisible; para que deje de serlo se emplea la
desinfeccin o la esterilizacin, siendo la
primera la tcnica de saneamiento que
utiliza la medicina preventiva, para destruir los grmenes patgenos, mientras
que utiliza la esterilizacin cuando no solamente se destruyen los grmenes patgenos, sino cualquier forma elemental de
vida patgena o saprfita e incluso las
formas de resistencia (esporas).
Si se trabaja con material que no posee germen vivo alguno, ni siquiera en sus
formas de resistencia (esporas), se dice que
dicho material es asptico y que se trabaja
en condiciones de asepsia.
La desinfeccin y esterilizacin, que
con la aparicin de antibiticos y quimioterpicos parecan haber perdido importancia,
tienen un inters actual extraordinario por la
aparicin en forma epidmica en establecimientos sanitarios (hospitales, maternidades, centros de prematuros, quemados) de
procesos debidos a numerosos grmenes
Proteus,
(estafilococos,
estreptococos,
Pseudomonas, Klebsiella, Serratia, etc.).
Estas bacterias que, en general, estn
representados por cepas resistentes a los
antibiticos por mutaciones, plsmidos o
exaltacin de la virulencia en pacientes de
bajas defensas biolgicas (debidas a grandes traumatismos, tratamientos con citostticos, enfermos inmunocomprometidos, etc.)
crean serios problemas de infecciones hospitalarias o nosocomiales, que exigen tomar
rigurosas medidas de asepsia y antisepsia
en personas, locales, material, ambiente,
etc., y que han llevado a la bsqueda de
desinfectantes polivalentes (viricidas, bactericidas, fungicidas, esporicidas), que rpidamente supongan una proteccin real, eficaz y definitiva, y tcnicas aplicables a material que por su composicin no puede someterse a la desinfeccin o esterilizacin por el
calor.
El conocimiento y la estandarizacin
de las tcnicas bsicas de antisepsia y de
esterilizacin, junto a la potente farmacoterapia actual, ha permitido avanzar en el tratamiento de pacientes crticos, aumentando
su supervivencia y calidad de vida. A pesar
de ello, las infecciones nosocomiales constituyen una de las complicaciones ms frecuentes del manejo hospitalario, consumiendo una proporcin importante del presupuesto sanitario de cualquier pas de
nuestro entorno.
Un objeto puede estar desinfectado, pero no esterilizado, mientras que todo

objeto estril est desinfectado.
La prevencin primaria de la transmisin de microorganismos patgenos debe

ser conocida a nivel general, no slo por el
facultativo de los grandes centros sino por
el mdico de atencin primaria.
chero Bunsen. Se utiliza para ansas de cultivo y la boca de los tubos. No se debe utilizar
el flameado de tijeras o bistures que se destemplaran y perderan su filo.
Veremos a continuacin los procedimientos y sustancias utilizados en los procesos de esterilizacin, desinfeccin y antisepsia.
ESTERILIZACIN
La esterilizacin es una tcnica de
saneamiento preventivo para conseguir la
destruccin de todos los microorganismos
y sus formas de resistencia que puedan
existir en la superficie o en el espesor de
un objeto cualquiera.
Obtiene como resultado la ausencia
de todo germen vivo consiguiendo material
estril.
Se debe considerar como inadecuados

los siguientes trminos por ser falsos:
esterilizacin por ebullicin (slo se trata de desinfeccin ya que no se destruyen las esporas);
esterilizacin por antispticos (en la piel
y mucosas no se puede conseguir esterilizacin por ellos y en cuanto a los
procedimientos de inmersin en desinfectantes son muy escasos y requieren
tiempo y pH adecuados),
y esterilizacin del intestino (slo podemos ejercer con antibiticos y quimioterpicos un efecto bacteriosttico o
bactericida de algunos de los grmenes
en l contenidos, pero no de toda su
flora bacteriana).
La esterilizacin se puede conseguir

por procedimientos fsicos y qumicos,
siendo ms usados los primeros, aunque
en los ltimos aos se estn desarrollando
los qumicos.
Procedimientos fsicos
para esterilizar
1. Flameado durante unos minutos o
mediante el rojo vivo de la llama de un me-
2. Incineracin. Se consigue mediante hornos incineradores. Se utiliza para eliminacin de residuos patolgicos (rganos,
miembros, bolsas de sangre, y todo material
contaminado que pueda desecharse).
3. Estufa de calor seco. Procedimiento ms empleado que los anteriores, se utiliza con frecuencia en hospitales, clnicas y
laboratorios. Se ha de mantener el material
cierto tiempo y sin restos de materia orgnica que protegen al virus de la hepatitis. Se
utiliza a 160C durante 1 hora o 180C durante 30 minutos.
ESTUFA DE ESTERILIZACIN
Se esteriliza principalmente el material

de vidrio, porcelana o metal. Siempre se
tendr en cuenta que cuanto ms volumen
tengan los esterilizadores por aire caliente,
ms desigual es la reparticin de la temperatura en su interior, y para evitar este inconveniente, en los grandes hospitales se insta2
lan estufas especiales en que los objetos

para esterilizar pasan sobre una cinta
transportadora a travs de una zona de
aire de 180-190 C o debajo de radiadores
de infrarrojos, que a gran vaco alcanzan
temperaturas mximas de 280 C, tiles en
clnicas de estomatologa.
4. Autoclave de vapor (Figura 1).
Procedimiento universalmente utilizado,
emplea el vapor de agua saturado calentado en recipiente cerrado para producir una
elevacin en la presin con la consiguiente
elevacin de la temperatura y tiempo preciso para conseguir la esterilizacin en
cada caso. El material se esteriliza durante
15 minutos a 121C, a 1 atm de presin.
En caso de no poseer autoclave
puede utilizarse una olla a presin de uso
domstico, teniendo la precaucin de iniciar la cuenta del tiempo a partir del momento en que el chorro de vapor que sale
por la espita es constante y sin aire.
Los autoclaves modernos son de
acero inoxidable y estn totalmente automatizados, realizando la aspiracin del aire
por vaco, y programados electrnicamente, de forma que cada fase de la operacin
queda bloqueada mientras no estn cumplidos los requisitos correspondientes de
presin, tiempo y temperatura.
Con el calor hmedo pueden esterilizarse - siempre que no sea termosensible material textil (gasas, vendas, etc.), materiales duros (instrumental, palanganas,
jeringas y agujas, vidrio, etc.), medios de
cultivo y lquidos hidrosolubles.
AUTOCLAVE
Se emplean tambin los autoclaves en

los servicios generales de los hospitales
para ropas de enfermos infectados o con
supuraciones muy peligrosas de manejar;
por ejemplo, de heridas carbuncosas, tetangenas o de gangrenas gaseosas (para
grmenes patgenos no esporulados bastan
las lavadoras que utilizan agua caliente a
65-70 C suficientes para destruirlos), o bien
para esterilizar animales muertos inoculados o medios de cultivo con grmenes
diversos.
El material metlico o de vidrio debe
ser tratado con anterioridad a la esterilizacin. Se deben cepillar y limpiar con
una solucin jabonosa fra o detergente,
se los enjuaga con agua tibia y se los
pone a esterilizar.
10
9
11
Fig. 1: Esquema de un autoclave

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tornillos para cierre hermtico

Material a esterilizar
Vaciador de la caldera
Fuente de calor
Entrada de gas
Agua
Rejilla para que el material a esterilizar no est en contacto con el agua
8. Caldera
9. Manmetro
10. Espita para salida del vapor
11. Vlvula de seguridad
5. La Tindalizacin es el empleo de
la autoclave cuya llave de purga no se cierra (espita abierta), es decir, el material no
pasa de los 100 C durante 30 minutos,
pero la operacin se repite 3 das sucesivos, emplendose para esterilizar medios
de cultivo o material que no puede sufrir
ms de aquella temperatura.
6. Radiaciones ionizantes. Otro
procedimiento fsico de esterilizacin muy
empleado en la actualidad es el que utiliza
las radiaciones gamma, con las cuales se
logra la denominada esterilizacin en fro o
radioesterilizacin.
Tiene su indicacin cuando se trata
de material que puede estropearse por el
calor, siendo el prototipo las jeringas de
uso nico, agujas, sondas y catteres
para uso intravenoso, cada vez ms utilizado por su bajo precio, por la comodidad
de su uso, ya que las agujas que portan no
sufren dao alguno a su filo y bisel (siendo
prcticamente indoloras) y porque evitan
toda posibilidad de infeccin hospitalaria y
de hepatitis infecciosa.
dad especfica de actuar a bajas temperaturas, lo que permite tener material estril que
puede quedar estropeado por temperaturas
altas, con ciclos de esterilizacin relativamente cortos, permitiendo unas tres cargas
al da.
Las mscaras de anestesia, tubos
de intubacin endotraqueales, guantes,
catteres de goma o plstico, equipos de
perfusin y transfusin, sondas uretrales,
catteres y goteros diversos, jeringas de
plstico con sus agujas, etc. pueden ser
esterilizados muy eficazmente con xido de
etileno.
Como el material ha de conservarse
estril, debe estar incluido en una bolsa de
material plstico, de polietileno o polipropileno, que se cierra por un procedimiento termoelctrico, permitiendo as su manejo y
traslado hasta tanto no se abra; es necesario que el material que se lleva a esterilizar
est totalmente limpio y seco, as como su
aireacin posterior antes de su empleo, pues
su contacto con la piel, mucosas o heridas
puede resultar irritante, por conservar restos
de glicoles.
Se trata de instalaciones de gran

rendimiento, a base de cobalto 60. Por su
poder penetrante esterilizan todo el material envuelto en envases de plstico e introducido en cajones de cartn o madera
Procedimientos qumicos
para esterilizar
Los agentes qumicos ms empleados actualmente para la esterilizacin son:
1) Oxido de etileno en forma de
gas, mezclado con fren o CO2. Tiene un
tiempo de actuacin de 3-8 horas y una
presin de 1-2 atm. Mata los grmenes por
alquilacin, o sea, sustituyendo un tomo
de Hidrgeno por un radical hidroxilo. La
cmara en la que se realiza la esterilizacin es de acero inoxidable; la marcha de
la esterilizacin es automtica y posee
dispositivos de seguridad que no permiten
abrir las puertas, mientras haya presin en
el interior de la cmara. Las estufas, cmaras o autoclaves que emplean el xido de
etileno se usan cada vez ms, por su utili-
2. Glutaraldehdo activado, generalmente potenciado con una sal de estao y

medio alcalino, para inmersin en l del instrumental y objetos que se desee. Es un
procedimiento qumico que puede destruir
tanto las esporas del Clostridium. tetani,
Clostridium welchii, etc., como los virus de
poliomielitis, hepatitis, Coxsackie, etc., y por
4
tanto conseguir una esterilizacin. Este

desinfectante es bactericida y viricida es
efectivo sobre los virus HIV, hepatitis B,
polio I, influenza A, y herpes simple I y II y
entre las bacterias, sobre micobacterias,
neumococos, estafilococos, etc.
3. Formol. La solucin de formaldehdo en alcohol de 70 es tambin esterilizante de formas vegetativas aunque no es
utilizada en la prctica por ser muy irritante
y debido a que fija las protenas, hace muy
difcil el lavado posterior del instrumental
Las esporas utilizadas en estos controles

pueden variar segn el fabricante pero algunos ejemplos son:
de Bacillus subtilis para la esterilizacin
por calor seco,
de Bacillus atrophaeus para esterilizacin con xido de etileno,
de Bacillus pumillus para esterilizacin
mediante radiaciones gamma y
de Geobacillus stearothermophilus para
la esterilizacin por vapor de agua.
Controles de esterilizacin
Los controles de esterilizacin pueden ser: fsicos, qumicos y biolgicos.
Controles fsicos. Se trata de controlar el funcionamiento mecnico mediante
termoelementos, manmetros, higrmetros
o termmetros, de los cuales estn dotados la mayora de los sistemas de esterilizacin. Tambin pueden utilizarse sustancias slidas que funden y cambian de forma cuando se alcanza la temperatura de
esterilizacin.
Indicadores qumicos. Llamados

termocromos e indicadores colorimtricos,
se trata de compuestos principalmente a
base de sales de diferentes metales que
cambian de color al alcanzarse la temperatura de esterilizacin.
Indicadores biolgicos. Son los ms

seguros. Los controles microbiolgicos
confirman si el proceso es capaz de alcanzar la pequesima probabilidad de supervivencia microbiana (10-6), considerada en
toda la legislacin internacional como garanta de esterilidad. Existen muy diversos
tipos de controles biolgicos con esporas
bacterianas, como ser:
a) Tiras de papel impregnadas de esporas bacterianas en envases individuales
b) Ampollas con tiras o discos de papel inoculados de esporas y provistas
de un medio de cultivo incorporado;
c) Suspensiones de esporas en el
propio caldo de cultivo.
DESINFECCIN Y ANTISEPSIA
Se denomina desinfeccin a una tcnica de saneamiento que tiene por objeto
destruir los microorganismos patgenos,
productores de enfermedades transmisibles,
actuando sobre el ambiente y superficies de
locales, objetos y excretas que son portadores de aqullos, evitando as su propagacin; esta accin germicida puede ser bactericida, viricida, fungicida o esporicida.
Antisepsia es una tcnica de prevencin que intenta evitar la transmisin de microorganismos patgenos actuando sobre
personas o heridas infectadas mediante
productos bacteriostticos o germicidas.
Los productos utilizados en la antisepsia forman parte tambin de la tcnicas de
desinfeccin, que pueden ser mtodos mecnicos, fsicos y qumicos. Los mtodos
qumicos son los antispticos habituales, los
cuales revisaremos brevemente.
Los mtodos qumicos se utilizan ampliamente a base de los productos denominados desinfectantes, que son aquellas
sustancias capaces de producir la muerte de
microorganismos patgenos sobre superfi5
cies inanimadas mientras que si actan

sobre superficies vivas se denominan antispticos.
Estas sustancias, tambin llamadas
germicidas de superficie, deben reunir
las condiciones siguientes:
Como no hay ninguno que sea el desinfectante o antisptico ideal, una tendencia
actual es la asociacin de dos o ms de
ellos para obtener as productos que sumen
ventajas sin por ello acumular inconvenientes.
1. alto poder germicida en bajas concentraciones,

2. gran poder de penetracin,
3. facilidad de aplicacin,
4. escaso costo,
5. estabilidad en el tiempo una vez diluidos,
6. solubilidad en el agua o alcohol,
7. no ser txicos para el hombre y los animales domsticos,
8. no tener propiedades organolpticos
desagradables, no estropear muebles,
objetos o suelos, no irritar o lesionar piel
o mucosas, etc.
La tendencia actual es la asociacin

de los desinfectantes clsicos con agentes
activos de superficie, que, por su accin
limpiante y al disminuir la tensin superficial,
favorecen la penetracin de sus asociados a
travs de la membrana celular, o bien cabe
la asociacin intermolecular de diversos desinfectantes para obtener otros ms enrgicos y rpidos de actuacin.
Segn la FDA (Food and Drug Administration), desinfectantes son aquellas

sustancias qumicas capaces de destruir,
en 10 a 15 minutos, los grmenes depositados sobre un material inerte o vivo, alterando lo menos posible el sustrato donde
residen y abarcando, en aquella destruccin, todas las formas vegetativas de las
bacterias, hongos y virus (excepto el de la
hepatitis).
Con respecto a su mecanismo de
accin los desinfectantes ms utilizados
son:
1. coagulantes, por ejemplo, el cido fnico, el alcohol y los fenoles sintticos;
2. oxidantes, caracterizndose por este
modo de actuar los clorgenos;
3. alquilantes, siendo ejemplo de ellos el
xido de etileno;
4. agentes tensioactivos o de superficie
activos, siendo ejemplo los detergentes,
en general (y en especial los derivados
del amonio cuaternario o los anfolitos,
que son aminocidos que actan por
sus cationes, aniones e iones, anfteros
cargados positiva y negativamente).
Con respecto al sitio de accin de
los agentes qumicos, en la figura 2 se
muestra un diagrama con los sitios diana
de los principales desinfectantes
Son ejemplos la asociacin de la povidona con el yodo o el alcohol etlico con yodo. Otras asociaciones pueden realizarse
con los clorobifenoles y el formol o bien con
fenlicos asociados a la clorhexidina y hexilresorcinol.
Las tcnicas generales de utilizacin
son inmersin, locin, pulverizacin, vaporizacin y fumigacin, aerosoles, brumas o
micronieblas, botellas autoeyectoras o autoproyectoras.
Los desinfectantes qumicos ms empleados son los siguientes:
1. El alcohol etlico de 70, que se
emplea para la desinfeccin de manos, instrumentos de filo y zonas de piel, requiriendo
una actuacin de unos 5 min; si se parte de
alcohol de 90, a ste se le aade agua destilada estril o clorhexidina.
2. Compuestos clorados o clorgenos muy utilizados en la desinfeccin de
piscinas, en la industria de la leche, suelos,
ropa blanca, superficies inatacables (frmica, plstico, etc). Se utiliza el hipoclorito de
sodio en concentraciones finales del 5 al
10% en agua. No debe guardarse la solucin por ms de 24 hs. ni debe utilizarse el
hipoclorito muy concentrado o puro ya que
carece de efecto en esas condiciones. Disminuye su actividad en presencia de materia
orgnica.
3. El formol, que, adems de la vaporizacin obtenida en formgenos (pastillas de formalina), se emplea en inmersiones. Se aplica en la esterilizacin de ambientes
4. Sales de amonio cuaternario.
Unos compuestos muy extendidos actualmente son los detergentes catinicos derivados del amonio cuaternario, solubles en
el agua a la que le dan el aspecto y las
cualidades de solucin jabonosa, pues son
emulsionantes, detersivos y espumantes,
desengrasando y limpiando las superficies.
Detergentes aninicos son el jabn o el
sinttico laurilsulfato de sodio. Los detergentes catinicos o agentes tensioactivos
tienen ventajas como su poder de penetracin. Estos detergentes pueden asociarse
a clorgenos, a yodforos, al aldehdo glutrico o a la clorhexidina.
Se emplean a concentraciones del
1% cuando se trata de una rigurosa desinfeccin de manos o instrumental quirrgico
y en otras concentraciones para inmersin
de ropas, tubos de polmeros de etileno o
de cloruro de vinilo, sondas, lavados de
mucosas, etc. Cuando se trata de infecciones de origen hospitalario por grmenes
resistentes a los antibiticos, resultan de
extrema utilidad asocindolos a la clor-
hexidina y a las medidas generales de asepsia e impregnando o sumergiendo en ellos

los objetos y superficies que se trata de desinfectar. Son muy recomendables para la
limpieza y desinfeccin en las mordeduras
de animales.
5. Los mercuriales orgnicos tambin son desinfectantes, pero ms bien bacteriostticos, que en disoluciones impiden la
germinacin de bacterias y esporas. Son
poco utilizados.
6. El cido fnico (fenol) y sus derivados han sido y son de los compuestos
orgnicos desinfectantes y antispticos ms
tiles; basta recordar que las soluciones
antes utilizadas al 5% destruan rpidamente
la mayor parte de las formas vegetativas
bacterianas y que se tom como tipo de
comparacin de los dems desinfectantes al
establecer el ndice fenlico, o sea, cuantas veces el desinfectante en estudio era
ms activo que l.
El cresol es un producto de destilacin
del fenol y con l se preparan jabones resinosos o creolinas y jabones comunes o saprocresoles. Se utilizan para desinfeccin de
pisos y sanitarios.
Figura 2. Sitios diana de los principales agentes qumicos utilizados como desinfectantes
7. Clorofenoles. Han sido los difenoles los reconocidos como ms tiles, por
su alto valor bacteriosttico, fungisttico y
escasa toxicidad. Los que tienen ms predicamento actualmente son los clorados y
entre ellos destaca el hexaclorofeno, que
tiene la gran ventaja de conservar sus propiedades antibacterianas incorporndolo al
jabn y ser soluble en disoluciones acuosas alcalinas y solventes orgnicos.
Cuando nos lavamos con ellos las
manos, contina el poder antisptico un
cierto tiempo, por lo que se han llamado
guantes invisibles. Tiene accin desodorante, por impedir las putrefacciones y un
gran poder tuberculicida; resulta de eleccin en la desinfeccin de mantas.
Otro clorofenol muy utilizado en la
actualidad es el gluconato de clorhexidina, aconsejndose su uso despus del
lavado de las manos en las salas de
enfermos infecciosos o en servicios
quirrgicos. Inhibe el crecimiento del estafilococo. El lavado de manos con hexaclorofeno, seguido de la aplicacin de la
crema de clorhexidina, reduce la flora en
99%.
Para las quemaduras y desinfeccin de las manos y fosas nasales, se

recomiendan cremas y lociones con gluconato de clorhexidina y neomicina. Se emplea ampliamente para lavado de cavidades mucosas, limpieza de instrumental
y lavado de manos en zonas crticas.
La clorhexidina puede emplearse en
solucin acuosa o en solucin alcohlica
etlica de 70, que es ms activa, o asociada a un detergente aninico o catinico,
que tambin puede diluirse en agua o alcohol.
8. Yodforos. Son presentacionesdel

yodo en combinacin con agentes activos de
superficie, tales como detergentes no inicos, amonio cuaternario y macromolculas,
que liberan lentamente el yodo y que son
fcilmente arrastrados por el lavado con
agua.
Los yodforos resultan de toxicidad
baja y de alto poder germicida, dndole estabilidad al yodo y perdiendo su accin irritante. Unen a dichas ventajas su accin
germicida, ms prolongada que la de las
tinturas clsicas; su polivalencia de accin
frente a bacterias, hongos (levaduras), virus
y protozoos (Trichomonas), el que su mancha se quite fcilmente lavndola con agua y
el que mantienen, en parte, su accin antisptica en presencia de sangre, suero, pus,
secreciones diversas y, en general, protenas.
Se emplea la povidona yodada al 10%,
aplicndola directamente sobre la zona en la
que ha de actuar, sea preoperatoria, traumatizada, antes de inyecciones, estomatitis, muguet, infecciones bacterianas y
micticas de la piel, etc.
Clasificacin de los germicidas

Los germicidas (desinfectantes y antispticos) se pueden clasificar en tres niveles
de actividad:
Alto nivel. Los germicidas de alto nivel, activos frente a los microorganismos,
son principalmente: el glutaraldehdo al 20
por ciento y el formaldehdo (formol al 8 por
ciento en alcohol de 70 o en solucin acuosa al 3-8 por ciento). El que ms se utiliza es
el primero.
Nivel intermedio. Estos germicidas

son activos frente a ciertos microorganismos estando representados por: alcohol
yodado, alcoholes, compuestos clorados,
compuestos fenlicos y yodforos; algunos
de estos germicidas pueden no ser activos
frente a algunos virus.
Bajo nivel. Los germicidas de bajo
nivel estn representados por compuestos
de amonio cuaternario en solucin acuosa,
clorhexidina, hexaclorofeno y compuestos
mercuriales.
(grosor, presencia de lpidos o iones, etc.).

Adems de esta resistencia intrnseca, las
bacterias pueden adaptarse frente a un
compuesto qumico (variacin fenotpica) o
seleccionarse espontneamente mutantes
resistentes (resistencia genotpica).
Por otra parte, la resistencia puede
estar codificada en plsmidos y ser transferible por conjugacin o transduccin. Se han
detectado plsmidos en Pseudomonas aeruginosa que determinan la resistencia a los
metales pesados y a ciertos compuestos
fenlicos.
Valoracin de desinfectantes
NOCIONES DE BIOSEGURIDAD
Cuando se desea conocer la verdadera
actividad bactericida de un agente qumico
a utilizar como desinfectante, se puede
recurrir a numerosas tcnicas, en las cuales se enfrenta el agente a estudiar con
ciertas bacterias patgenas. Describiremos
a continuacin dos de los mtodos ms
utilizados:
Se denomina bioseguridad al conjunto

de medidas tendientes a minimizar el riesgo
de adquisicin y transmisin de enfermedades infecciosas entre el personal de salud y
los pacientes, entre pacientes y hacia la
comunidad
Medidas a aplicar
a) Determinacin de la concentracin
inhibitoria mnima (CIM): se realiza una
serie de diluciones decrecientes del desinfectante en caldo nutritivo a la cual se le
adiciona una suspencin bacteriana. Tras
la incubacin a 37C durante 24 hs se observa cul es la mnima concentracin del
producto que inhibe el desarrollo bacteriano (ausencia de turbidez).
b) Determinacin del coeficiente fenol:
compara la eficacia del producto con la del
fenol, mediante diluciones en tubo de ambos y determinando la dilucin que es capaz de matar una cepa bacteriana en 7,5
minutos pero no en 5 minutos. Si el coeficiente letal del fenol es por ejemplo, 1/80 y
el de la sustancia problema de 1/240, el
coeficiente fenlico ser de 240/80 = 3, o
sea que el producto es tres veces ms
efectivo que el fenol.
Resistencia a los desinfectantes
La mayor o menor sensibilidad de
una microorganismo frente a un agente
qumico est dada en primer lugar por la
naturaleza del producto y del germen, principalmente, en la estructura de su pared
Uso de material perfectamente esterilizado.

Desinfeccin adecuada de ambientes y
mobiliario.
Asepsia apropiada de piel y mucosas.
Lavado de manos.
Uso de elementos de barrera (guantes,
barbijos, etc).
Eliminacin adecuada del material contaminado.
Correcta manipulacin de instrumental
contaminado.
Existen actualmente tres supuestos de
actuacin en clnica humana relacionados
con la bioseguridad en instituciones de salud:
1. Cuando se trata de actuar sobre
grmenes que se eliminan por excreciones
intestinales o urinarias - como las disenteras, fiebre tifoidea, clera, poliomielitis, etc. tanto las heces como las orinas deben recogerse en recipientes que contengan soluciones desinfectantes (pero sin olvidar que las
ropas y manos estn contaminadas y que
las moscas, por ponerse en contacto con las
defecciones o con las ropas, requieren de9
sinsectacin), como la leja o fenlicos que

son recomendables para recipientes e inmersiones, y para las manos se emplearn
yodforos con frecuencia.
2. Si se trata de actuar sobre grmenes que se eliminan por exudados rinofaringobronquiales, aparte la lucha contra los
insectos, desinfeccin de manos y uso de
mscara protectora, ser necesario recoger y desinfectar esputos y exudados y
desinfectar ropa de cama, pauelos, etc
3. En aquellas afecciones cuyos
grmenes se eliminan por la piel y mucosas o existen en pstulas, conjuntivitis,
otitis, tias, etc., es recomendable la asociacin de detergentes catinicos, que
humedezcan la piel y arrastren suciedad y
microorganismos, con productos que eviten la desecacin y dispersin de los exudados, seguida de los yodforos, crema de
clorhexidina y colirios con antibiticos y
antispticos; la desinfeccin de ropas es
fundamental, por hervido, inmersin o autoclave.
El Comit de Infecciones debe establecer una poltica y desinfectantes, procediendo en la lucha contra la infeccin hospitalaria, aspiracin que debe ser inculcada
a todos los departamentos y servicios, as
como a todo el personal tcnico, auxiliar
sanitario y de asistencia, mediante charlas
o conferencias de educacin sanitaria.
Lavado de manos
Entre las medidas de bioseguridad
que siempre deben tenerse en cuenta est
el lavado de manos.
El lavado de manos reduce la morbilidad y mortalidad por infecciones intrahospitalarias de los pacientes internados y puede
clasificarse en social, antisptico y quirrgico.
Lavado de manos social
Objetivo: Remover la flora transitoria y
la suciedad de la piel de las manos.
Ocasin: antes del contacto con los
pacientes y cuando se van a realizar procedimientos no invasivos, como control de signos vitales, baos completos o higienesparciales, etc.
Agente: se realizar con soluciones
jabonosas comunes.
Lavado de manos antisptico
Objetivo: Remover y destruir la flora
transitoria de la piel de las manos.
Ocasin: antes de realizar procedimientos invasivos (colocacin de catteres,
sondas vesicales, asistencia respiratoria
mecnica, puncin lumbar, etc.)
Agente: solucin jabonosa antisptica
el gluconato de clorhexidina al 4% o soluciones alcohlicas (geles).
Lavado de manos quirrgico
Objetivo: Remover y destruir la flora
transitoria y reducir la flora residente.
Ocasin: antes de una ciruga y debe
repetirse entre ciruga y ciruga.
Agentes: antispticos de accin residual (gluconato de clorhexidina al 4%, iodopovidona jabonosa al 5%),
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MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo I: Microbiologa Ambiental I

Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S.
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CAPITULO 6
MEDIOS DE CULTIVO
6.1. OBJETIVOS:
Conocer la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios

de cultivo.
Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparacin del

medio de cultivo en la prctica microbiolgica.
Adquirir prctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus

componentes individuales.
Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios de

cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de
microbiologa.
6.2. INTRODUCCIN
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn
por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie
bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la
misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos
examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los
principios del aislamiento.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que
permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica
de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin
lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el
ambiente natural en el que se desarrollan.
Las caractersticas de los microorganismos a tener en cuenta al momento de
preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:
Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los

cuales se los clasifica en auttrofos, hetertrofos, quimiotrofos (litotrofos u
organotrofos) y fottrofos.
Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos.
Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el

microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrfilos,
mesfilos y termfilos.
Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias

oscila entre 6,6 y 7,2.

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6.3. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU ORIGEN

Los medios de cultivos pueden clasificarse en:
Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo,
agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.
Artificiales: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el

hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en
sintticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composicin
qumica se denomina sinttico o qumicamente definido; puede ser una simple
solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos
compuestos orgnicos. Un medio no sinttico o complejo es aquel del que se
desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de
tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con
exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo
nutritivo.
6.3.1. Clasificacin de los Medios ARTIFICIALES COMPLEJOS segn su

Finalidad
I. Comunes
Medios Artificiales
Complejos
II. Especiales
II.a. Enriquecidos
II.b. Selectivos
II.c. Diferenciales
I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos,

como el caldo carne y agar carne.
II. Medios especiales: se los clasifica segn su finalidad.
II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio comn, con
el agregado de elementos nutritivos elegidos segn las necesidades. tales como
sangre, albmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos
exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el
agar sangre y el agar chocolate.
II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para
que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo
tiempo inhiban la proliferacin de la flora acompaante. Para esto ltimo se busca
establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el
agregado de inhibidores.
El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el
desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayora de las
bacterias.
Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde
brillante), los antibiticos, el alcohol fenil etlico y la azida de sodio.
II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en los que los
microorganismos crecen en libre competencia, vindose favorecidos aquellos para los
cuales las condiciones de desarrollo son las ms apropiadas, no llegndose a inhibir
totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra as la multiplicacin
de los microorganismos que se desea identificar, hasta un nmero suficiente tal que
sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados.

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II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos slidos, se utilizan
para sembrar directamente con la muestra incgnita o a partir del medio selectivo para
enriquecimiento.
II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que
coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o ms tipos de
microorganismos pueden crecer en este medio, algn elemento presente en l permite
diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna
propiedad bioqumica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este tipo es el agar
con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter
aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias.
Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color
blanco grisceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son
oscuras y con brillo metlico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con
un centro azul y rara vez presentan brillo.
En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado
de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-diferenciales resultan
muy tiles para el aislamiento de un microorganismo separndolo de la flora
acompaante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se
desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado
provenientes de la flora acompaante.
6.4. CARACTERSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO
Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los
nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de
sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no
contenga sustancias inhibidoras.
Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin

adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo
en el hbitat natural.
La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona
directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los
microorganismos.
En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y slidos. En
el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo
caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo.
En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los
microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin
del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al
autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables,
como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por
separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado
cuando se haya enfriado a 50 C.
En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como
inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

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6.5. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la
preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso
alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin.
Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.
Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan
algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en
polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma
un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su
grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de
incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es
empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 1218 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3
%.
Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales

(por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y
posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos
preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de
medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el
caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas,
minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del
grupo B, nitgeno y carbono.
Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales

minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina,
casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero
pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas,
peptonas, polipptidos y aminocidos.
Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero

sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo
de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser
obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos
corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin
con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano.
Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su
crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o
bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH.
Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de

cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.
Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se

aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo
de los grmenes microaerfilos o anaerobios.
Agentes selectivos. La adicin de determindas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de
cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico,

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antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos

frente a determinados microorganismos.
6.6. PREPARACIN
En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad
deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del
fabricante y luego esterilizarlo.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un
medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una
receta que deber respetarse estrictamente.
Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van
incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran.
Generalmente figura en primer trmino el compuesto que acta como tampn, como
puede ser el PO4H2K, que adems provee fsforo y potasio.
Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a
uno antes de agregar el siguiente.
Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea
el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).
6.6.1. Preparacin de medios de cultivo
Materiales:
- Erlenmeyer
- pipetas de 10 ml
- tubos de ensayo con sus tapones
- gradillas
- tiras de pH
- drogas correspondientes a cada frmula
- balanza
- autoclave
A. Caldo nutritivo (Caldo carne)
Es el medio complejo ms comn para el cultivo de microorganismos.
Frmula:
Peptona............................................. 5 g
Extracto de carne.......... 3 g
Agua c.s.p................. 1000 ml
pH.................................. 7,2
Preparacin:
1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente.

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2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden.

3) Llevar a ebullicin agitando peridicamente con una varilla de vidrio.
4) Completar el volumen hasta 1000 ml.
5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M.
6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volmenes apropiados en frascos.
7) Tapar, colocar capuchn de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.
B. Agar nutritivo
Frmula:
Agar........................... 20 g
Caldo nutritivo........ 1000 ml
Preparacin:
1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente.
2) Agregar el agar calentando a bao mara agitando hasta disolucin total.
3) Ajustar pH hasta 7,2.
4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo.
5) Esterilizar.
Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar caldo estril, la esterilizacin se
lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado.
Se prepararn tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello se
colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera
del autoclave, cuando estn an lquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto
ngulo hasta que solidifiquen.
Se prepararn tambin tubos con agar para puncin. En este caso, una vez que los
tubos fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posicin vertical.
Por ltimo se prepararn cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizar
medio de cultivo recin esterilizado y todava lquido, o bien medio solidificado y
fundido a ebullicin en Bao Mara. Se deja enfriar el agar hasta 45 C, luego se lo
vuelca aspticamente en caja de Petri estril, teniendo la precaucin de flamear
previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en
posicin horizontal.
6.7. BIBLIOGRAFA
-
Madigan, M. T.; Martinko G. M. ; Parker J. Brock, Biologa de los Microorganismos.

Ed. Pretice Hall. 8 edicin. 2004.
Laboratorios Britania. http://www.britanialab.com.ar
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Cuenta en placa de bacterias

OBJETIVOS
Realizar adecuadamente la tcnica de cuenta en placa para diversos grupos

microbianos de importancia en alimentos.
Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus
implicaciones en la calidad del alimento.
GENERALIDADES
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no
pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de
cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten
seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes
alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias, o mesfilos aerobios
son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en una
muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto.
Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero
para algunos productos, tambin es importante determinar la presencia de
bacterias termoflicas, psicroflicas y/o psicrotrficas para predecir la estabilidad
del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La tcnica bsica es
la misma, pero cambian las condiciones de incubacin, medios de cultivo y
algunos otros detalles, que se mencionan en la tcnica. Si se modifican las
condiciones de incubacin o se somete la muestra a algn tratamiento previo, el
mtodo puede aplicarse tambin a la deteccin de otros grupos como anaerobios
o esporulados, desde luego, con la adecuada seleccin de medios de cultivo.
El mtodo permite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables,
pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante
apegarse a la tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
FUNDAMENTO
La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC
presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que
desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de
incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Qumica,
UNAM
las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones

decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la
tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin de
muestras de alimentos para su anlsis microbiolgico.
NOTAS
El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en

bao de agua regulado a 45 C, durante el tiempo suficiente para que alcance
esta temperatura, y hasta su utilizacin.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no
debe exceder de 20 minutos.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solucin

amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.
4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.
6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 250 mL) de
agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estndar) fundido
y mantenido en bao de agua a 45 1.0 C (para tcnica de vertido en placa) a.
6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de
levadura (agar cuenta estndar) estriles o el medio requerido en la tcnica a.
MATERIAL Y EQUIPO
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista

con termmetro calibrado a.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador b.
Registrador mecnico o electrnico b
Microscopio ptico b
Bao de agua con termmetro, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C a
Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a
Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo
superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a.
Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior
(las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a.
Varillas de vidrio estriles (en escuadra o L) a.
Pipetas Pasteur estriles a
8 a 12 cajas Petri estriles a
UNAM
Stomacher (homogeneizador peristltico) a

Bolsas estriles para stomacher a
NOTAS
a
b
Material necesario al inicio de la prctica

Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica

UNAM
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de
1.0 mL
10-1
Adicionar de 15 a 20 mL de agar
triptona extracto de levadura
fundido y enfriado a 45C en
la
agar
10-2
10-3
Homogenizar
con 90.0 mL de
solucion
diluyente
Pesar 10 g de
muestra en
condiciones
de asepsia
Homogeneizar
muestra y el
mediante
1.0 mL
1.0 mL
10-4
Depositar 1.0 mL de cada dilucin en

cajas de Petri estriles por duplicado
Incubar las cajas en

posicin invertida
A 37 C por 24 a 48 h
Contar aquellas placas que

tengan entre 25 a 250
colonias y reportar como
UFC/g o mL de muestra
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Qumica, UNAM
PROCEDIMIENTO
1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de
Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico.
2. Tcnica de vertido en placa.
1. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la
inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y
libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de
inocular.
2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja,
mediante pipeta estril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido
a 45 C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6
de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la
completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la
cubierta de las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento
en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el
medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
3. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.
4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura
que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate,
como se indica en el cuadro 1.
3. Tcnica de extensin superficial en placa.

1. Distribuir las cajas con el medio estril en la mesa de trabajo de manera que la
inoculacin se pueda realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las
cajas con los datos pertinentes antes de inocular.
2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja,
mediante pipeta estril. Para distribuir de manera homognea, extender el
inculo utilizando una varilla de vidrio estril (en forma de escuadra o L)
haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo,
hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el
inculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera
aproximado de 10 minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la
UNAM
muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio

de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
3. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.
4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura
que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate,
como se indica a continuacin.
CUADRO 1.
Condiciones de incubacin para cuenta en placa de diferentes grupos
Grupo Bacteriano
Temperatura
Tiempo de Incubacin
Termoflicos
55 2C
48 2 h
Mesoflicos
35 2C
48 2 h
Psicrotrficos
20 2C
de 3 a 5 das
Psicroflicos
5 2C
de 7 a 10 das
5. Despus de la incubacin, contar todas las colonias desarrolladas en las

placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que
es una colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar
por microscopa), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo
extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del
mtodo, aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopa
para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las
partculas pequeas de alimento. Utilizar el registrador para contar las colonias.
RESULTADOS
La seleccin de las cajas que se toman en cuenta para los clculos es muy
importante para la confiabilidad de los resultados; a continuacin se especifican
las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la seleccin
de cajas obedece a criterios:
lgicos (elegir las que estn en rango),
estadsticos (considerar los duplicados y el mayor nmero posible de datos) y
funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores disponibles).

UNAM
Las reglas para seleccionar las cajas para los clculos son las siguientes:
1. Se consideran representativas las cajas que tienen un nmero de colonias
dentro del rango de sensibilidad del mtodo, en este caso, entre 25 y 250
UFC.
2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se
aplica el factor de dilucin, que es el inverso y se redondea el nmero a 2
cifras significativas (o dgitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dgito del
promedio es 4 o menor, se omite dejando el nmero de 2 cifras significativas .
Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X
101, porque el tercer dgito es 2 y se redondea al segundo dgito. Cuando el
tercer dgito es 5 o superior, el segundo dgito se redondea al siguiente, por
ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportar como 20 x 101
UFC, porque el tercer dgito es superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el
promedio es de 237.5 en la dilucin 10-3, por lo que se reportar como 24 x
104 UFC.
3. Cuando las 2 placas de una dilucin contienen un nmero de colonias
caractersticas dentro del rango de sensibilidad del mtodo, se promedian los
nmeros y se multiplica por el inverso de la dilucin.
4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran sta ni su
duplicado.
5. Cuando una de las 2 placas de una dilucin es representativa y la otra no, se
consideran ambas y se promedian.
6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se
promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se
aplica el factor de dilucin a cada una y luego se promedia nuevamente.
7. Si en las placas no hay colonias (o no son caractersticas del grupo en
estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la ms baja
utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilucin ms baja fue 10-2 < 1 / mL si la
muestra se sembr directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda:
valor estimado.
8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un nmero menor de
UFC., se consideran las de la menor dilucin y se agrega valor estimado.
9. Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en
aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de
colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja
y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden
contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100
mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Agregar
la leyenda "valor estimado".
10. Se cuentan como una sola colonia:
Cadenas o pequeos grupos no separadas claramente entre s, que parecen

ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias y que estn
separadas de otras colonias o cadenas.
UNAM
Colonias extendidas como pelcula entre el fondo de la caja y el agar y que se

diferencian claramente de otras.
Colonias como pelcula en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.
11. Se considera crecimiento extendido el que se presenta cuando las colonias

abarcan ms del 50 % de la superficie de la caja, con o sin inhibicin de
crecimiento; en ese caso, y/o cuando la inhibicin exceda el 25 % de la
superficie de la caja, se considera que las placas no son representativas y
por lo tanto no se toman en cuenta.
El Cuadro 2, ejemplifica la aplicacin de estos lineamientos; consultarlo para

seleccionar las cajas a considerar en los clculos.

UNAM
CUADRO 2.
Ejemplos para el clculo de resultados de cuenta en placa, utilizando ensayos por duplicado.
(Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias)
Serie
Ejemplo duplic.
Diluc iones
10-2
10-3
10-4
> 250
B
A
> 250
> 250
178
190
Resultado
UFC. / g o mL
16
18 x 104
Si estn dentro del rango, se promedian los datos de la

dilucin 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104)
17
25
23 x 104
En este caso se promedian datos de diluc. 10-3 (= 179 x

103,pasa a 180 x 103 18 x 104). Por otra parte se promedia
datos de dilucin 10-4 (= 27 x 104). Finalmente se promedian
los resultados de ambas diluciones y se redondea el
resultado final
Se promedian datos de diluc. 10-2 ; aunque estn fuera de
rango, son los ms cercanos. Se anota valor estimado
Se toma la ms alta que se pueda contar, aunque sea en
cuadrantes o cuadrcula y se anota valor estimado.
Se ignora la dilucin 10-4 por el crecimiento extendido; se
promedian los datos de 10-3, se redondea 237.5 a 240.
220
3
4
5
B
A
B
A
B
A
B
> 250
18
14
> 250
> 250
> 250
> 250
138
2
0
> 250
> 250
240
235
A
B
A
B
A
B
0
0
> 250
> 250
> 250
> 250
0
0
240
268
216
262
Observaciones
28
0
0
512
495
34
Crecim
extend.
0
0
24
19
23
42
16 x 102
valor estimado
50 x 105
valor estimado
24 x 104
< 100
valor estimado
25 x 104
Se reporta como < 1 en la dilucin ms baja que se utiliz,

en este caso 10-2. Se registra como sensibilidad del mtodo.
7
Se promedia el nico dato que est dentro del rango (240),
con su duplicado, aunque ste salga del rango (268).
4
8
28 x 10
Se consideran las placas que estn dentro del rango y se
promedian con sus duplicados, aunque stos salgan.
Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones
4
9
A
> 250 215
20
23 x 10
Se promedian datos de 10-3 , se promedian datos de 10-4
B
> 250 235
26
se realizan los clculos como en el ejemplo 2
Las cifras sombreadas son las que se consideran adecuadas para realizar los clculos.
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Reportar como se indica a continuacin, con
potencias de 10:
dos
cifras significativas
Bacterias mesoflicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura

incubadas por ____ h. a _____ C: _______ UFC / g ( / mL) de muestra.
Sustituir mesoflicas por termoflicas, psicroflicas psicrotrficas, segn
corresponda, anotando el tiempo y la temperatura correspondientes.
Si se analiz un alimento para el cual existe norma y existe especificacin
sobre el grupo estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no
con la norma.
BIBLIOGRAFA
Secretara de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimiento
para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y
Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma
Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la
cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.
Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) Culture Methods for
Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 53-67.
International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005)
Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD) de la Facultad de Qumica, 10

UNAM
Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes

fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo
mltiple (Nmero ms Probable o NMP)
OBJETIVOS
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.
GENERALIDADES
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral
utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin
embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse
fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme
mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar
frente a una contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat
primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
1
grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,

Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas
capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a
44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms
prominente es Escherichia coli.
La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas
selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado
dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como
comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay
algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas
E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de
virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente.
Las propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las
toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli
enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal
de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin
fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y
afecta principalmente a los nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una
toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y
funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable
y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de
ebullicin hasta por 30 minutos.
La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales
frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos
la dosis infectiva puede ser ms baja.

2
Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los

lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere
a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia
favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin
por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en
ocasiones puede ser crnica.
Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es
codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plsmido, ambas protenas permite su unin a los enterocitos y la destruccin de
las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la
dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado
con mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados
mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H
(flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra
estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de
pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,
en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias.
Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y
destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as
por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de
monoverde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La
ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y
con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia
renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina
tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas
de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la
verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas
es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba
de MUG.
3
La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco

cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los
casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la coccin completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por
las cepas de Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli
patgenas
ETEC
EPEC
EHEC
EIEC
Toxina
Lbil/estable Shiga o vero
Invasiva
Enterohemolisina -
Aspecto de las
heces
Presencia de
leucocitos en
heces
Fiebre
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
baja
Intiminas
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
Varios
O111 y otros
varios
FUNDAMENTO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
4
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa

como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de
24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las
pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
1. Para anlisis de agua
Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de
muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.
5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o

caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durhama.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham
o caldo EC MUG con campana de Durham b.
2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de
Simmons (opcional)e
2. Para anlisis de alimentos

1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin
amortiguadora de fosfatosa
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin
amortiguadora de fosfatosa

5
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio

concentracin sencilla o caldo lactosado concentracin sencilla con campana
de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana
de Durhamb.
2 cajas Petri con agar para mtodos estndard
2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de
Kosere
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace

Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Balanza granatariaa.
Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio pticod
Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclavea
6
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c
d
e

7
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

37C
24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato

de sodio (CLSS) triple concentracin (3X)
CLSS + 20.0 mL de muestra
2 a 3 asadas/tubo
Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

positivos (produccin de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo
44.5C
37C
24 48 h
Tubos con 10.0 mL de

Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
Lectura de tubos positivos en

tablas. NMP de coliformes
totales /100 ml de muestra
24 48 h

Caldo EC o EC-MUG

fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en

placas de Agar EMB para la
bsqueda de Escherichia
coli

8
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS

Pesar 10.0 g de muestra
en condiciones de asepsia
Homogenizar la muestra
con 90.0 mL de solucin diluyente
Realizar 2 diluciones decimales ms en

tubos con 9.0 mL de solucin diluyente
1.0 mL
1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilucin en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1
10-2
10-3
35C
24 - 48 h
10-1
10-2
10-3
10-1
10-2
Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

positivos (produccin de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
Tubos con 10.0 mL de CLSS concentracin

sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra
35C
44.5C
24 - 48 h
10-1
10-2

Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
10-3
24 - 48 h
10-1
10-2
10-1
10-2
10-1
10-2

Caldo EC o EC-MUG
fecales /g de muestra.
totales
de muestra
Versin
para/g
Administrador
de Manuales y Documentos
9
Siembra de tubos positivos en
agar Mac Conkey para
bsqueda de Escherichia coli
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de

los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio
INOCULO
(mL)
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
VOLUMEN DE CALDO LAURIL

MEDIO MAS
TRIPTOSA
INOCULO
REQUERIDO g/L
(mL)
CONCENTRACIN
10 o ms
11 o ms
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
137,1
3.5 X
100
20
120
213,6
4X
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..

10
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)

y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y

produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:

Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con
morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y
sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa
microscpica y pruebas bioqumicas.
Incubar las placas a 35C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos.

11
1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

a. Produccin de indol (I)
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 h.
Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera una

prueba positiva.
b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM)
Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color

amarillo es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 0.6 mL de solucin VP1 y 0.2 mL de solucin VP2 y agitar.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilizacin del citrato (C)
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
Incubar a 35C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
12
Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el

reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil-
-D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de
gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.

13
2. Alimentos
2.1 Preparacin de la muestra.
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estriles y

mezclar.
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en

reposo de 2-3 minutos.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de
trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2 y 5 C.
2.1.1 Prueba presuntiva.
Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35-37C durante 24-48 h.
Los tubos despus de la incubacin, se registrarn como positivos si presentan

crecimiento y produccin de gas.
2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y

produccin de gas, despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el

nmero ms probable de organismos coliformes totales por mL.
2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

14

presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes fecales por mL.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas

con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar
McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba
confirmativa.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales
biliares.
Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias.
Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.
Todos los cultivos que:
Fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C.
Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (+--) son consideradas como Escherichia coli.
Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de los tubos positivos de
caldo EC.

15

Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al
procedimiento sealado en la tabla 1, (que se muestra a continuacin y es utilizado para
el anlisis de agua), para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias
coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas.
Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar
volmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en
10 tubos, utilizar las siguientes tablas:
TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Inferior
Superior
0
3,0
0,05
6,3
0,3
9,6
0,8
14,7
1,7
26,4
4,0
Infinito
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Inferior
Superior
0,0
3,0
0,03
5,9
0,26
8,1
0,69
10,6
1,3
13,4
2,1
16,8
3,1
21,1
4,3
27,1
5,9
36,8
8,1
59,5
13,5
Infinito

16
BIBLIOGRAFA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos
troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones
y especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la
densidad microbiana por la tcnica de nmero ms probable.
CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica
del nmero mas probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y
Escherichia coli por el nmero mas probable
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
2006, pp 935-936
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edicin 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of
Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)
Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.

17
Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa

OBJETIVOS
Comprender y realizar adecuadamente la determinacin de coliformes totales en

un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas.
Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.
GENERALIDADES
La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos
microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas,
aunque algunos pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como
Citrobacter y Serratia, respectivamente.
La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto
digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las
heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la
materia fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la
microbiologa de alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas.
Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre
coliformes totales y coliformes fecales. Esta prctica se refiere a coliformes totales.
El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de

los alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia
no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de
origen no-fecal.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo.
La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las
diferentes reas del procesamiento de alimentos.
La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas
selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo
violeta (ABRV).
FUNDAMENTO
Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se
desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona
el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las
colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales
biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa.
La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin,
como se explic en la tcnica de preparacin de diluciones.
NOTAS
Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de
coliformes, debe considerarse lo siguiente:
Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos
pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias
semejantes a las de coliformes.
El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes
de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar
en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.
Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han
solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas
para los coliformes.
El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de
incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la
formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos.
El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de
sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con
las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.
1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solucin amortiguadora de

fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a
2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9.0 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a
5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta
c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a
MATERIAL Y EQUIPO
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con
termmetro calibrado. a
cuadrculada y lente amplificador. b
Registrador mecnico o electrnico b
Microscopio ptico b
Bao de agua con termmetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45
1.0 C. a
Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a
Propipetaa
Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior
(las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones). a
Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior.
(las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a
Pipetas Pasteur estriles a, b
4 a 8 cajas Petri estriles, de 15 x 100 mm. a
Stomacher (homogeneizador peristltico). a
Bolsas estriles para stomacher. a
NOTAS
a
b
Material necesario al inicio de la prctica

Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica
DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de
1.0 mL
10-1
1.0 mL
10-2
1.0 mL
10-3
10-4
Homogeneizar
la muestra con
90.0 mL de
diluyente
Pesar 10 g de
muestra en
condiciones de
Depositar 1.0 mL de cada dilucin en

cajas de Petri estriles por duplicado
bilis rojo violeta fundido y
enfriado a 45C en cada placa
Homogeneizar la muestra
con el agar haciendo
movimientos rotatorios
Incubar las cajas

en posicin
invertida
24 h/ 37C
Contar aquellas placas que tengan

entre 15 a 150 colonias y reportar
como UFC/g o mL de muestra
PROCEDIMIENTO
1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de
Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis
Microbiolgico. Recordar que el rango de sensibilidad del mtodo es de 15
a 150 colonias por placa.
2. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la
inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y
libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes
de colocar el inculo.
3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja,
mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido
y mantenido a 45 1.0C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la
preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio
de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
4. Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio, mediante seis
movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las
manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las
manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y
nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre
una superficie horizontal fra. No permitir que se mojen las tapas de las
cajas.
5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 5
mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 C, no permitir que se mojen
las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el
crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.
6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la
esterilidad.
7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a
35C, durante 24 2 h.
8. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias.
Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias
tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de
un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo
claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un
dimetro de 0.5 a 2.0 mm.
9. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango
de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en el inciso de
RESULTADOS de la prctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso
del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir
las colonias de las pequeas partculas de alimento.
Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la prctica Cuenta
de Bacterias en Placa.
UNAM
Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y

potencias de 10.
Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a
35 C: _____ UFC / g (o / mL) de muestra.
BIBLIOGRAFA
Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y
Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma
Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodos para
la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial
Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la
Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of

UNAM
Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

OBJETIVOS
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de
mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al

consumo humano.
Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994.
Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y
cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos.
GENERALIDADES
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en
equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la
elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la
descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el
crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles
de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la
irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lcteos
fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias,
etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos
como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar
problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), (b) resistencia
al calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin y (c) habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar
malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos.
El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos
multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer
fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado.
Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La
identificacin y clasificacin de los mohos se basa en observaciones macroscpicas y
microscpicas.
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Hifas y micelio. El talo de los mohos est formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamndose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas
pueden ser sumergidas o areas. Tambin se pueden clasificar en hifas vegetativas o
en crecimiento, las cuales se encargan de la nutricin del moho, y en hifas frtiles o
hifas que producen los rganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos:
septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no
septados cenocticos, cuyas hifas estn formadas por cilindros sin tabiques
transversales. Este tipo de hifas posee ncleos diseminados a lo largo del cilindro y se
les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados
rganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o anclajes de los
gneros Rhizopus o Absidia, la clula basal del gnero Aspergillus y la ramificacin
dicotmica, o en forma de Y, del gnero Geotrichum.
rganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por
medio de esporas asexuales. Algunos mohos tambin producen esporas sexuales. A
tales hongos se les denomina perfectos, los cuales se dividen en Oomycetes y
Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son
septados, en contraposicin a los mohos imperfectos, Fungi Imperfecti, los cuales slo
poseen esporas asexuales.
Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin. Se diseminan fcilmente por la
atmsfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos
principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3)
esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas frtiles
denominadas conidiforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro
de ningn receptculo, en contraposicin a las esporangiosporas, las cuales se
encuentran dentro de un esporangio o receptculo, situado en el extremo de una hifa
frtil, el esporangiforo. Las artrosporas se forman por fragmentacin de una hifa. El
extremo engrosado del esporangiforo se denomina columnela y adopta formas tpicas
en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios
comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una clula
especializada, el esterigma o filide situada en el extremo del conidiforo.
Propiedades fisiolgicas. En comparacin con la mayora de las levaduras y de las
bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible.
Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en
algunos frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los
mohos podran considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a
temperaturas normales. La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor
de los 25 a 30C, aunque algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son
aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los
alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo
de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son
capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos.
Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que algunos se utilicen para la produccin
industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
Algunos gneros de mohos importantes en alimentos.

Mucor. Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin
de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de
quesos y para la fabricacin de algunos alimentos orientales.
Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la
alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.
Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen
en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad
para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial
de cido ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin
de ciertos alimentos orientales y en la obtencin de enzimas.
Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos
txicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las
denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la
ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina
producida principalmente por A. versicolor; el cido ciclopiaznico producidas por A.
flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y cido peniclico tambin son producidas por
especies de Aspergillus, las txinas tremorgnicas son producidas por A. terreus
(territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina).
Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se
producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren
a los colores de flurescencia por sus nombres en ingls ( azul y verde, respectivamente)
observados bajo longitudes de onda en la regin UV, y los subndices 1 y 2 se refieren a
sus patrones de separacin cromatogrficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por
la hidroxilacin de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el
carcingeno de hgado ms potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina
A y la citrinina afectan la funcin renal. Las toxinas tremorgnicas afectan el sistema
nervioso central.
Penicillium. Es otro gnero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los
alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P
italicum producen la podredumbre de frutas ctricas. Las especies P. camemberti, P.
roqueforti se utilizan en la maduracin de quesos.
Se han reportado ms de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas.
Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la funcin del
heptica o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por
Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, cido ciclopiaznico, citreoviridina,
penitremo A, toxina PR y roquefortina y el cido secalnico. De stas la ocratoxina A es
sin duda la ms importante, es un carcingeno renal y es producida por P. citrinum, P.
viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o
trigo, o a travs de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es

posteriormente consumida por humanos.
Se recomienda consultar la bibliografa para conocer otros gneros de mohos con
importancia en los alimentos.
Levaduras y hongos levaduriformes.
El trmino levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son
filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por
gemacin o por fisin.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benficas o perjudiciales.
Las levaduras se utilizan en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, vinos,
vinagre y quesos, tambin se utilizan en la obtencin de enzimas y alimentos
fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin del
sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las
carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin
microscpica. Su forma puede ser desde esfrica a ovoide, alimonada, piriforme,
cilndrica, triangular e incluso alargada. La mayora se reproducen asexualmente por
gemacin multicelular o por gemacin polar. Unas pocas especies se reproducen por
fisin.
En los cultivos en placas de agar es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las
colonias bacterianas; la observacin microscpica de los microorganismos es la nica
forma segura de diferenciarlas. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son
hmedas y algo mucosas; la mayora de las colonias son blancuzcas, aunque algunas
tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad
metablica es a la vez de ambos tipos.
La mayora de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No
obstante, crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contienen
elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es
decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayora de las levaduras necesitan mayor
humedad que los mohos. Para la mayora de las levaduras la Aw mnima de crecimiento
oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de
los mohos, con una temperatura ptima en torno a los 25 a 30C y una temperatura
mxima en torno a los 35 a 47C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de
tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los
azcares son la fuente energtica ms apropiada para las levaduras, aunque las
oxidativas, pueden oxidar los cidos orgnicos y el alcohol.
Algunos gneros de importancia en alimentos son:

Schizosaccharomyces. Levaduras de este gnero se han encontrado en frutas
tropicales, en la melaza y en la miel.
Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias
alimentarias, como en la fermentacin del pan, fermentacin de la cerveza,
fermentacin de los vinos, en la produccin de alcohol, glicerol e invertasa.
Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la
obtencin de productos lcteos por su capacidad de fermentar la lactosa.
Zygosaccharomyces. Las levaduras de este gnero son importantes por su capacidad
para crecer en medios con elevadas concentraciones de azcar (osmfilas), intervienen
en la alteracin de la miel, jarabes y melazas, y tambin en la fermentacin de la salsa
de soya y de algunos vinos.
Pichia. Crecen en la superficie de los lquidos formando una pelcula. P.
membranafaciens produce una pelcula en la superficie de las cervezas y vinos.
Debaromyces. Forman pelcula en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en
la superficie de los quesos y de los embutidos.
Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limn y crecen en los zumos de
frutas.
Torulopsis. Originan problemas en las fbricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la
lactosa, alterando productos lcteos. Otras especies alteran la leche condensada
azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos cidos.
Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtencin de protena unicelular para
incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La
especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lcteos. C.
lipolytica produce alteracin de la mantequilla y margarina.
Brettanomyces. Producen grandes cantidades de cido e intervienen en la
fermentacin de la cerveza belga de tipo lambic, de las cervezas inglesas y de los
vinos franceses.
Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrndose en
las fbricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada.
Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas
en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color
rosado en el sauerkraut.
FUNDAMENTO
El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de
cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de
utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos
compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La
sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al
inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin
permite la eliminacin de la mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de
aerobiosis y la incubacin a una temperatura de 25 1 C da como resultado el
crecimiento de colonias caractersticas para este tipo de microorganismos.
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril a.

3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos
de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a.
4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa .
4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a.
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y
cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya
que es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo
microbiano.
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b.

Colorantes para tincin de Gram b.
Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a.
MATERIAL Y EQUIPO
Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomachera.

Motor para licuadora o Stomachera.
Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a.
Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn a.

Pipetas Pasteur estriles a, b
Propipetaa, b
Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) a.
Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas,
tenedores, etc. a
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251C a.
Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a
451C a.
Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b.
Microscopio ptico b.
Asa bacteriolgica y asa micolgicab.
cuadriculada y lente amplificador b.
NOTAS
a
b
Material necesario para el inicio de la prctica.

Material necesario para los 3, 4 y/o 5 das despus de iniciada la prctica.
DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solucin diluyente
1.0 mL
Homogenizar
con 90 .0 mL de
solucin
Pesar 10 g de
muestra en
condiciones
de asepsia
10-1
10-2
1.0 mL
10-3
10-4
Depositar por duplicado 1.0 mL de

cada dilucin en cajas de Petri
estriles
papa dextrosa y/ agar extracto
de malta acidificados con 0.3
mL cido tartrico 10 %
enfriado a 45C en cada placa
Homogeneizar la
muestra con el agar
mediante
movimientos
rotatorios
1.0 mL
Incubar las cajas en

posicin invertida
Contar aquellas placas que tengan

entre 10 a 150 colonias de hongos
y/o levaduras y reportar por
separado como UFC/g o mL de
muestra, indicando tiempo de
incubacin
3,4 5 das
/
28C y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
Versin para Administrador de Manuales
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz
Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de
fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora
estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0
seg en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el
Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria.
3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo
de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de
pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean
necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin.
NOTA
Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o
de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de
UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de
la muestra (a mayor tiempo de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las
hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner
especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneizacin citados en
esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para
este grupo microbiano.
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las
diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril.
5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de
agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y
mantenerlos a 45C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0
mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en
membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos.
Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y
mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en
la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de
agregar el medio de cultivo.
7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como
testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un
potencimetro.
8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa
dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y
mantenidos a 45C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las
diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de
exceder de 20.0 min.
9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a
izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido
contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM 9
cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir

que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una
superficie horizontal fra.
10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en
una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa
acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin
estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias.
11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C.
12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin.
Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y
150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de
mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la
cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso,
se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis.
13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul
de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de
los mohos que se hayan desarrollado.
14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las
levaduras obtenidas.
15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das
de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente).
16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las
adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin.
17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o
mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a
251C durante 5 das.
18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de
los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.
19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es
difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos
a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar
el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.
Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a
continuacin se expresan:
ANLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben
seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias
(representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y
calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se
puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro
dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM10
multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el

inverso de la dilucin correspondiente a esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos
y/o levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la
dilucin correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el
resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL
(Sensibilidad del Mtodo)
Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de
incubacin en el que se realiz la cuantificacin.
Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el
resultado de la cuantificacin de hongos y de levaduras.
Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes
tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es
posible reportar el o los gneros probables.
BIBLIOGRAFA.
Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo
para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiologa de los Alimentos. 4. ed.
Acribia, Espaa. 23-50.
Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) Yeasts and Molds. In: Compendium of
Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological
Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M.
Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.
Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology.
Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.)
ASM Press. USA. 451-465.
Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology.
Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.)
ASM Press. USA. 467-480.

Extraccin o Toma de Muestras

para el anlisis de Productos Alimenticios
Definiciones
Toma de muestras Es el acto de separar de una partida determinada, una muestra

representativa, a efectos de determinar mediante anlisis organolptico y/o de
laboratorio la aptitud o no del alimento puesto a consideracin. Plan de muestreo Es un
criterio de aceptacin del punto de vista microbiolgico para un determinado lote de
alimento. Para elegir un plan de muestreo se tiene en cuenta:
1.
2.
3.
4.
la peligrosidad del microorganismo.

la cantidad de microorganismos presentes en el alimento.
las condiciones que ser sometido el alimento antes de consumir.
la poblacin que va a consumir ese alimento.
Anlisis sanitario Es la determinacin bromatolgica para establecer la calidad de

aptitud o no del alimento, tendiente a preservar la salud pblica o individual del
consumidor, realizado de acuerdo a los mtodos y las tcnicas analticas legales
nacionales o supletorias internacionales reconocidas.
Lote Cantidad determinada de alimento envasado de una misma procedencia y
clasificacin, de condiciones presumiblemente uniformes, en envases del mismo tipo,
medida y peso.
Partida Cantidad determinada de alimento envasado, comprendido en un solo envo.
Extraccin o toma de muestras para anlisis de rutina

Procedimiento del muestreo Las muestras extradas deben ser representativas del total de
la partida. Siempre que sea posible, se recomienda realizar el muestreo de envases cerrados,
para evitar el riesgo de contaminacin. Si ello no fuera posible, ya sea por el tamao del envase
o la cantidad de muestra, se debe transferir aspticamente una porcin representativa
(tomando alcuotas de distintas partes) a un recipiente estril, debindose registrar todos los
datos que permitan la fcil identificacin de la muestra. Los materiales utilizados para el
muestreo deben ser esterilizados. Se deben usar cucharas de acero inoxidable, pinzas,
esptulas y tijeras que puedan ser acondicionadas en el mismo establecimiento donde se
efecta el muestreo, por lavado, secado con toalla de papel y flameado con propano seguido de
un enfriamiento adecuado antes de utilizarse nuevamente. No debe usarse alcohol, pues los
instrumentos no alcanzan la temperatura suficiente para quedar esterilizados. Para recolectar la
muestra, se recomienda utilizar envases limpios, secos, con cierre hermtico, de boca ancha,
esterilizados y de un tamao adecuado, siendo preferibles los envases plsticos. En caso de
ocurrir un brote de infeccin o intoxicacin alimentaria se deben recoger todos los restos de los
alimentos sospechosos y, si es posible, los envases originales de los mismos. Tambin es
importante disponer de muestras clnicas de las personas implicadas (materia fecal, vmitos y
suero). Se deben utilizar tcnicas aspticas para la toma de muestras, aunque stas no hayan
sido manipuladas adecuadamente hasta ese momento. En el momento de la extraccin de la
muestra, para que tenga marco legal, se proceder de la siguiente manera:
1. Se tomarn 3 muestras, las que sern representativas del lote o partida del
producto a analizar. sta puede estar constituida por materia prima, productos en
fase de elaboracin o productos terminados.
2. Toda muestra destinada al Laboratorio de Anlisis deber ser empaquetada,
segn corresponda rotulada, precintada, lacrada y sellada, en forma tal que no
halla posibilidad de hacer sustitucin de ninguna clase.
3. Las 3 muestras debern ser iguales, estableciendo que pertenezcan a igual

partida, ao de elaboracin, establecimiento elaborador, etc.
4. De estas 3 muestras, una ser considerada original y ser la que se emplear

5.
6.
7.
8.
para el anlisis en primera instancia.

La segunda, considerada duplicado, ser reservada por la Autoridad sanitaria
para eventual pericia de control.
La tercera, considerada triplicado, quedar en poder del responsable del
establecimiento inspeccionado quien podr disponer de ella o presentarla para su
anlisis, en el caso de efectuarse la pericia de control de contraverificacin.
Se realizar la toma de una cuarta muestra en caso de que sea necesario anlisis
microbiolgico.
Las muestras deben ser acondicionadas e identificadas correctamente, debiendo
consignarse en el labrado de las Actas correspondientes:
nombre del producto
marca del producto
datos de la firma elaboradora
fecha y hora de extraccin de la muestra.
datos del rtulo (RPPA,RPE, N de Lote,)
hacer constar la cantidad existente en cada muestra
condiciones en las que se extrae la muestra
fecha de elaboracin y vencimiento
temperatura en el momento de la recoleccin.
forma de traslado de la misma
firma de inspector/es y dueo o responsable
Es importante destacar que una extraccin de muestra mal efectuada puede originar serios
inconvenientes e invalidar el procedimiento.
Mantenimiento y envo al laboratorio
La remisin de las muestras se efectuar evitando toda demora en la recepcin del Laboratorio,
en envases y mtodos de conservacin que aseguren una idntica calidad, sanidad y
temperatura a la verificada en el momento de extraccin de la misma. Los alimentos
refrigerados y congelados deben mantenerse en esas condiciones hasta la realizacin de los
anlisis correspondientes. Por ello, se debe disponer de reas para refrigeracin (0 a 4,4C) o
congelamiento.
(-20C). Los productos desecados o enlatados no requieren refrigeracin. El traslado de las
muestras se realizar a travs del Inspector, salvo en los casos en los cuales el Laboratorio se
encuentre a distancias alejadas donde se deber extremar las medidas de seguridad e
inviolabilidad. Es responsabilidad del Inspector que las muestras lleguen a destino tal como se
retiraron, no debiendo producirse ningn cambio organolptico, fsico, qumico y/o biolgico
imputable a un manejo deficiente.
Protocolo de Anlisis
El Protocolo de Anlisis es el documento legal, que acredita el resultado y conclusiones del
anlisis efectuado por el Laboratorio, y tiene el carcter de documento pblico, debiendo
encontrarse subscripto por el profesional responsable y el jefe del laboratorio y contener todos
los datos y especificaciones tcnicas del anlisis realizado.
Notificacin del interesado y contraverificacin
Dentro de los 3 das de realizado el anlisis, el Laboratorio que lo hubiera efectuado, por
carta certificada con aviso de recepcin o personalmente, notificar su resultado a la
firma propietaria del o los productos con entrega del duplicado del pertinente protocolo.
El original se agregar al expediente si existiera y el triplicado quedar en poder del
Laboratorio.
Tamao de la muestra
El tamao de la muestra debe ser determinado con sumo cuidado, aplicando principios
estadsticos que aseguren que la misma sea representativa para cumplir con los
objetivos propuestos por el Laboratorio. Si el tamao del lote a muestrear es grande,
para obtener una muestra representativa, se deber retirar un nmero igual al resultado
de la siguiente formula:
siendo x el nmero de unidades del lote. El resultado se redondea al numero entero

superior. Para algunos alimentos, la legislacin establece los procedimientos de
muestreo. En el caso de la leche y productos lcteos se deben seguir los procedimientos
recomendados en la norma FIL 50B : 1985, tal como figura, por ejemplo, en la
Resolucin Mercosur 82/83 Reglamento Tcnico para la Fijacin de Identidad y Calidad
de Leche en Polvo En algunos alimentos de origen vegetal, la legislacin establece la
cantidad mnima de unidades a muestrear segn el nmero de unidades que componen
el lote. Por ejemplo, la Resolucin Mercosur 74/93 Reglamento Tcnico Mercosur para
la Fijacin de Identidad y Calidad de Cebolla en su punto 6) Toma de muestras dice lo
siguiente: La toma de muestras en el lote se har de acuerdo a la siguiente tabla:
Nmero de Unidades que componen el
lote
001-010
011-100
101-300
301-500
501-10.000
Ms de 10.000
Mnimo de Unidades a muestrear

01 unidad
02 unidades
04 unidades
05 unidades
1% del lote
Raz cuadrada del nmero de unidades del
lote
6.1. Conformacin de la muestra conjunta y anlisis:

6.1.1. En caso de obtenerse un nmero de unidades de muestreo entre 1 y 4, se
homogeinizar el contenido de las bolsas y/o cajas extrayndose 100 bulbos elegidos al
azar, que conformarn la muestra a analizar y otros 100 bulbos para formar una
contramuestra.
6.1.2. Para 5 o ms unidades, se retirar como mnimo 30 bulbos de cada unidad, se
homogeinizar y se formarn 2 muestras de 100 bulbos cada una para anlisis y
contramuestra, respectivamente.
6.1.3. Los restantes bulbos sern devueltos al interesado, incluyndose la muestra de
anlisis en caso de ser solicitada.
6.1.4. La contramuestra deber ser mantenida en poder der organismo oficial hasta el
vencimiento del plazo de validez de la solicitud de reconsideracin, que ser de 24 horas
contadas a partir de la hora de emisin del dictamen.
Muestreo segn estado fsico del alimento
Lquidos: la extraccin de las muestras se realizar utilizando frascos de vidrio,

bien limpios, de cierre perfecto, para evitar las prdidas de liquido y/o la
contaminacin con cualquier material extrao.
Semislidos:
La extraccin de las muestras se debe realizar empleando frascos de boca
ancha, con tapa esmerilada o con cierre de plstico. Para pequeas
cantidades de sustancias, se debe emplear el mtodo del cuarteo. Para
ello se emplear un cuchillo de acero inoxidable con filo. Previa separacin
de la capa superficial, se realizar la operacin, mediante dos cortes
perpendiculares. Dos de las porciones opuestas se mezclan. Para grandes
cantidades de sustancias se proceder a extraer, de diferentes sitios,
pequeas porciones mediante un sacabocado. Estas porciones una vez
reunidas y homogeneizado el total, constituirn el material a dividir,
convenientemente en tres muestras.
Cada muestra deber llenar por lo menos la mitad del envase utilizado, el
que deber cerrarse hermticamente y guardarse al abrigo de la luz hasta
el momento de practicar el anlisis.
Slidos: la extraccin de las muestras se realizar empleando sobres de material
impermeable e inerte, con cubierta de papel grueso que permitan un cierre
hermtico. Si se tratase de un producto pulverulento, que se presenta en
volumen grande, se proceder a efectuar la operacin de cuarteo.
A
C
1. La muestra se extiende formando un cuadrado que se divide en otros

cuadrados. Los cuartos B y C se rechazan y los cuartos A y D se mezclan
para dar 2
2. Se opera de manera anloga a 1, rechazando las partes F y G. E y H se
mezclan para dar 3
3. Se repite el proceso, se rechazan J y K, se mezclan I y L, y se continua as
hasta obtener la cantidad adecuada de muestra.
Pautas generales para la extraccin y remisin de muestras
4.
Siempre que sea posible, se debern enviar al Laboratorio muestras contenidas en
envases o piezas originales, en formas de unidades completas.
5. Toda muestra obtenida por fraccionamiento de otras, debe ser
representativa del total de las mismas.
6. De las muestras para el estudio microbiolgico, se deben tomar piezas que
sean representativas, en forma correcta de una sola tanda o partida de
fabricacin.
Durante el muestreo, si es necesario abrir un envase "in situ", esta operacin debe
efectuarse en lugares sin corriente de aire y polvo, con todo cuidado y precauciones de
asepsia, comenzando siempre por una correcta higienizacin (agua y jabn o detergente
de ser posible) y desinfeccin (alcohol 70 %) de la parte externa del envase, tapa y
proximidades de la abertura. Homogeneizar con precauciones de asepsia. Cuando sea

necesaria la utilizacin de elementos para la extraccin de muestras como ser cucharas,
cuchillos, pinzas, esptulas, sacabocados, etc., estos elementos deben ser debidamente
esterilizados en estufa a aire caliente durante 1 hora a 170C o, en su defecto, deben
ser calentados a llama directa momentos antes de su utilizacin, dejar enfriar o enfriar
en porciones del mismo producto que no se tomar como muestra. El recipiente donde
se introducir la muestra debe ser de capacidad adecuada, mayor que el volumen a
introducir, boca ancha, buen cierre y estar esterilizados. En de caso de piezas chicas
(salamines, manteca) se tomarn unidades ntegras. Cuando se trate de piezas grandes
(jamones, salchichones, mortadelas), si bien lo aconsejable para un anlisis
bacteriolgico es tomar muestras ntegras, de ser necesario pueden fraccionarse con
elementos adecuados, de forma que la muestra tenga un tamao suficientemente
grande para evitar la contaminacin externa en su interior. En el caso de muestras
lquidas o semislidas en grandes envases (leche, helados a granel) se tomaran 150 a
200 gramos o mililitros. La toma de muestra se tomar con pipeta u otro elemento
esterilizado, previo mezclado cuidadoso del alimento. En el caso de harinas, azcar,
leche en polvo a granel, se tomarn muestras de varios sitios distintos. Para el muestreo
de material heterogneo (productos con crema o alimentos preparados con diferentes
constituyentes: emparedados, arrollados) la muestra debe tomarse de tal manera que
incluya las diferentes fases que la componen. Durante el transporte de la muestra para
anlisis microbiolgico, es necesario tomar todas las precauciones para mantener el
estado original de la muestra hasta el momento en que se realice el estudio. El
transporte de sustancias perecederas debe realizarse en envases bien tapados y, de ser
posible, en bolsas de polietileno. Se colocan en recipientes de buen aislamiento
(telgopor) manteniendo una temperatura de 1 a 4C. Los alimentos congelados deben
transportarse en ese estado. En todos los casos el tiempo entre la toma de muestra y el
anlisis debe ser el mnimo posible.
4.
En general, se evitar tocar las muestras con las manos y, en el caso de
sustancias untuosas, se evitar tambin el contacto con papel comn, cartn y otros
materiales que pudieran alterar la composicin de la misma.
Bibliografa
4.
Cdigo Alimentario Argentino (Ley No 18284, Decreto No 2126/71). Seccin Mercosur.
Marzochi Ediciones.
5. Curso de Epidemiologa de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos.
Instituto Nacional de Epidemiologa. Dr Juan H. Jara. Mar del Plata
6. Lerena, C. A. 1998. Manual de Procedimientos del Inspector y Auditor
Bromatolgico. Assistance Food.
7. Toma de muestra.Productos Lcteos.Norma Iram 14002.
Identificacin comercial de alimentos
Objetivo: verificar y comprender las normas establecidas en el pas y evaluar su
cumplimiento El tema de identificar, rotular y publicitar alimentos no es un tema menor
dentro de la Bromatologa e Higiene alimentaria. Esto est claramente establecido en el
CAA en el captulo V:
Normas para la rotulacin y publicidad de los alimentos, que se adjunta. Para citar
un ejemplo, el Artculo 220 dice: Se entiende por rotulacin toda inscripcin, leyenda o
disposicin que se imprima, adhiera o grabe a un producto o a su envase o envoltura de
presentacin comercial, que identifique al mismo de acuerdo a las normas del presente
Cdigo. [...], quedando as resuelto, y sin lugar a dudas, que es lo que debemos
entender por rtulo. En el presente Trabajo Prctico se realizar una evaluacin de
diferentes tipos de alimentos envasados para lo cual trabajaremos con el mencionado
Capitulo del CAA. Bibliografa: Cdigo Alimentario Argentino Actualizacin Acumulada

Ley 18284 Texto actualizado. Marzocchi Ediciones.

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CARRERA DE INGENIERIA EN ALIMENTOS

El texto es una compilacin de aspectos generales empleados en microbiologa de alimentos. El

1. Morfologa y estructura bacteriana

MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA

Analizaremos algunos aspectos de la morfologa y

con aplicaciones en investigacin y diagnstico que han

Clula procariota (ncleo primitivo)

Organizacin unicelular o colonial

Clula eucariota (ncleo verdadero)

Protistas: protozoarios, fitoflagelados

Reinos: animal y vegetal

oscuro como cuerpos brillantes. Esta tcnica se usa para el

metileno, cristal violeta, safranina.

ADN bacteriano:Como se seal, la clula procariota a

Plsmidos y episomas: Algunas bacterias poseen material

Membrana celular: Estructura delgada que rodea a la

Pared celular: Estructura rgida presente como ya se

de la clula en divisin. A nivel de esas brechas o aberturas

Pared de bacterias Gram negativas:

externa). Esta capa est estrechamente unida al

shock sptico o la muerte.

peptidoglicano. Algunos cidos teicoicos tienen unido un

Composicin de la pared de las bacterias cido alcohol

Despus de analizar las diferencias entre la composicin de

colorante de contraste usado al final de la tcnica.

No es una estructura vital para la clula, su prdida no se

e identificacin de diferentes bacterias; Streptococcus sp. ,

produzca el pili sexual que le permita la unin a la clula

nico, lofotricas cuando presentan un penacho de varios

Figure 1 Microfotografa de una pared celular Gram

Figure 3 Microfotografa de pared celular de

Figure 2 Estructura de la Pared Celular Grampositiva

Figure 4 Estructura de la Pared Celular Gramnegativa

precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden

Tina suavemente con cristal

Lave suavemente con agua

Lave suavemente con agua

Aplique alcohol o acetona

Tina suavemente con

Lave suavemente con agua

Aplique yodo o lugol

Lave suavemente con agua

Seque al aire o con papel

De acuerdo a sus observaciones al microscopio, registre sus resultados en el cuadro.

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Un objeto puede estar desinfectado, pero no esterilizado, mientras que todo

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La prevencin primaria de la transmisin de microorganismos patgenos debe

Se debe considerar como inadecuados

La esterilizacin se puede conseguir

Se esteriliza principalmente el material

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lan estufas especiales en que los objetos

Se emplean tambin los autoclaves en

Fig. 1: Esquema de un autoclave

Tornillos para cierre hermtico

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Se trata de instalaciones de gran

2. Glutaraldehdo activado, generalmente potenciado con una sal de estao y

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tanto conseguir una esterilizacin. Este

Las esporas utilizadas en estos controles

Indicadores qumicos. Llamados

Indicadores biolgicos. Son los ms