Pruebas Bioquimicas Enterobacterias

ENTEROBACTERIACEAE
4-2), lo cual indica que el microorganismo es capaz de

formar cido a partir de la lactosa presente en el medio.'
La diferenciacin de Enterobacteriaceae, sin embargo, se basa primariamente en la presencia o ausencia de
diferentes enzimas codificadas por el material gentico
del cromosoma bacteriano. Estas enzimas dirigen el metabolismo de las bacterias a lo largo de uno o ms caminos que pueden ser detectados por medios especiales
usados en las tcnicas de cultivo in vitro. Los sustratos
sobre los cuales pueden reaccionar estas enzimas estn
incorporados al medio de cultivo, junto con un indicador
que puede detectarse por la utilizacin de sustrato o por
la presencia de productos metablicos especficos. Mediante la seleccin de series de medios que miden las diferentes caractersticas metablicas de los microorganismos que se deben ensayar, puede determinarse un perfil
bioqumiao para hacer una clasificacin de especies.
CARACTERSTICAS DE RELEVAMIENTO
La identificacin definitiva de ls miembros de Enterobacteriaceae puede requerir una batera de pruebas

bioqumicas. Pueden evitarse un tiempo considerable y
una probable identificacin errnea si se hacen unas pocas observaciones preliminares para asegurar que el microorganismo que se va a probar pertenece a este grupo.
Si el microorganismo es un gramnegtivo de otro grupo,
puede ser necesario usar un juego de caractersticas diferentes del que se usa comnmente para la identificacin
de Enterobacteriaceae. Con unas pocas excepciones, todos los miembros de Enterobacteriaceae demuestran las
siguientes caractersticas:
Fermentadores de glucosa (vase lmina color 4-lE
y F).
Citocromo oxidasa negativa (vase lmina color 4-1 G).

Reduccin de nitrato a nitrito (vase lmina color
4-lH).
UTILIZACIN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
Es comn que los microbilogos de laboratorio se refieran a los hidratos de carbono como azcares. Esto es
conveniente en un sentido operacional, aunque se entiende que los alcoholes polidricos, como el dulcitol y el
manito!, o las sales catinicas, como el acetato o el tartrato, no son hidratos de carbono y por lo tanto no son
verdaderos azcares en el sentido qumico.
El trmino fermentacin se usa tambin en forma
algo laxa en referencia a la utilizacin de los hidratos de
carbono por bacterias, con trminos como fermentadores de lactosa o no fermentadores de lactosa. Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de xido-reduccin que tiene lugar en un entorno anaerobio, en
el que un sustrato orgnico sirve como aceptor final de
hidrgeno (electrones) en lugar de oxgeno. En sistemas
de prueba bacteriolgicos, este proceso se detecta por
observacin del cambio de color de los indicadores de
pH como consecuencia de la formacin de productos cidos. La acidificacin del medio de prueba puede ocurrir
a travs de la degradacin de hidratos de carbono por
otros caminos distintos de la fermentacin, o puede haber en algunos medios ingredientes distintos de los hidra-
173
tos de carbono que resulten en productos finales cidos.

Aunque la mayora de las bacterias que metabolizan los
hidratos de carbono son anaerobias facultativas, la utilizacin puede no ocurrir siempre bajo estrictas condiciones anaerobias, como se observa en la produccin de productos cidos por colonias bacterianas que crecen sobre
la superficie del agar. Aunque todas las pruebas usadas
para medir la habilidad de un microorganismo para degradar enzimticamente un "azcar" en productos cidos
no son "fermentativas", estos trminos sern usados por
conveniencia en el resto del texto.
Principios bsicos de fermentacin. Los estudios de
Pasteur de mediados del siglo XIX sobre la accin de las
levaduras sobre el vino proveyeron las bases de la comprensin actual de la fermentacin de los hidratos de carbono. Pasteur observ que ciertas especies bacterianas
contaminantes producan una cada del pH del vino (un
sustrato de hidrato de carbono) debido a la produccin de
una variedad de cidos. A partir de ese momento, y en
forma rpida, se realizaron descripciones completas de
los caminos fermentativos por los cuales se degrada un
monosacrido como la glucosa. Por medio de una serie
de clivajes y transformaciones glucolticas enzimticas,
la molcula de glucosa se separa en una serie de com_pue.s!o de tres carbonos, el ms importante de loscuales
eselcido pirvico. La secuencia qumica por la cual la
glucosa se convierte en cido pirvico se conoce como
va de Embden-Meyerhof (EMP; fig. 4-1). Muchas bacterias, incluidas todas las Enterobacteriaceae, fermentan
la glucosa a travs de EMP para formar cido pirvico.
Sin embargo, la manera en que el cido pirvico se utiliza vara entre las especies bacterianas. Los destinos alternativos del cido pirvico son el resultado de una variedad de caminos de fermentacin que rinden productos finales bastante diferentes (vase fig. 4-1 ).
Las bacterias se diferencian por el hidrato de carbono
que metabo1izan y por los tiJOS y cantidades de cidos
que pro ucen. Estas diferencias en la actividad enzimtica sirven como una de las caractersticas bioqumicas
ms importantes por las cuales se reconocen las especies.
Es esencial para los estudiantes de microbiologa comprender que en la formacin glucoltica del cido pirvico, la adenosina trifostato (ATP) se genera a expensas de
la reduccin del dinucletido de nicotinamida adenina
(NAD) a NADH2 . Por cada.molcula de glucosa que se
fermenta para formar cido pirvico, se consumen cuatro
iones hidrgeno a travs de la reduccin de dos NAD a
dos NADH 2 Dado que el NAD total de la clula es muy
limitado, Ja fermentacin cesara muy rpidamente si el
NADH 2 no fuera reoxidado en un metabolismo posterior
a cido pirvico. La figura 4-2 muestra la fermentacin
de tres molcula\ de glucosa por medio de dos vas alternativas. Por ejemplo, la fermentacin de la glucosa por
Escherichia coli ocurre por medio de la va fermentacin
cido mixta y resulta en la produccin de grandes cantidades de cido actico, lctico y frmico, con un~ marcada disminucin del pH en el medio de prueba. Esta es
detectada por la prueba positiva del rojo de metilo (vase fig. 4-2). Por otro lado, el grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia metaboliza el cido pirvico primariamente a travs de la va butiln-gluclica, produciendo acetilmetilcarbinoi(acetona) y una prueba de VogesProskauer positiva (VP) (vase fig . 4-2). Ntese que los
principales productos finales de esta ltima va son aleo-
174
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
Fig. 4-1. Fermentacin de la glucosa para formar piruva_to (va Embden-Meyerhof) y los destinos alternativos del
cido pirvico.
Glucosa 6-fosfato
l
l
l
Fructosa 6-fosfato
Fructosa 1,6 difosfato
Gliceraldehdo 3-fosfato
cido propinico
cido frmico - - - - Acetil -CoA
cido succnico - - Acetaldehdo
cido actico
cido lctico
Alcohol etlico
H, + CO,
Acetil-meti lcarb inol

(acetona)
cido butrico
2,3
Butilenglicol
(butanodiol)
Alcohol butlico
holes, y slo se produce una pequea cantidad de cido;

por lo tanto, la prueba de rojo de metilo en general es negativa para este grupo de microorganismos.
El gas resultante de la fermentacin bacteriana es primariamente una mezcla de hidrgeno y dixido de carbono formado por el clivaje del cido frmico . Es una regla aceptada que cualquier bacteria que forma gas en un
medio para probar hidratos de carbono primero debe formar cido, lo cual es evidente en el esquema de EMP de
la figura 4-1. El gas se detecta mejor utilizando un medio
lquido para fermentacin de hidratos de carbono en el
cual se han ubicado tubos invertidos de Durham (vase
lmina color 4-lF). En el tubo de Durham pueden ser detectadas trazas de gas que se colectan como burbujas. Algunas especies de Enterobacteriaceae carecen de la enzima frmico deshidrogenasa y no pueden formar cido
frmico y como resultado de esto no pueden formar ni siquiera trazas de C0 2 (p. ej., la mayora de las especies de
Shigella) . Por el contrario, los microorganismos que usan
la va butiln gluclica (es decir, VP positivos) producen
cantidades copiosas de C0 2 (vase fig. 4-2). Por lo tanto,
cuando se observan grandes cantidades de gas, se debera considerar el grupo Klebsiella-Enterobacter-HafniaSerratia como la identificacin probable.
La formacin de alcohol etlico por microorganismos
tiene gran importancia comercial en la manufactura de
bebidas alcohlicas y reactivos orgnicos; sin embargo,
su utilidad es limitada para la identificacin de bacterias
en el laboratorio.
La ferrrientacin <..e la lactosa es ms compleja que la
de la glucosa. La lactosa es un disacrido compuesto por
glucosa y galactosa, conectado a travs de un puente de
oxgeno conocido como enlace galactosdico. Al hidrolizarse, este enlace es daado y libera glucosa y galactosa. Para que una bacteria metabolice lactosa, deben estar
presentes dos enzimas: 1) ~-galactsido permeasa, que
permite el transporte de ~-galactsido, como la lactosa, a
travs de la pared celular; y 2) ~-galactosidasa, la enzima
requerida para hidrolizar el enlace ~-galactosdico una
vez que el disacrido ha entrado en la clula. La reaccin
cida final resulta de la degradacin de la glucosa que se
muestra en la figura 4-3.
Dado que la fermentacin de la lactosa procede en ltima instancia por medio de la degradacin de la glucosa a travs de EMP, se deduce que cualquier microorganismo incapaz de metabolizar la glucosa no puede formar cido a partir de la lactosa. Esto explica por qu la
glucosa se omite de las frmulas de los medios de aislamiento primario como agar MacConkey o agar EMB; si
no se omitiera se perdera la habilidad para detectar la
capacidad de fermentar .la lactosa. En este medio de
prueba, el punto final de la fermentacin de la lactosa es
la deteccin de la produccin de cido. Un organismo no
fermentador de la lactosa es aquel que carece de una o
de las dos enzimas requeridas para el metabolismo de la
lactosa y que carece de habilidad para atacar la glucosa.
Se cree que los llamados fermentadores de lactosa tardos son organismos que exhiben actividad ~-galactosi
dasa pero muestran baja actividad ~-galactsido permeasa.
~-galactosidasa y prueba ONPG. El o-Nitrofenil~-o-galactopiransido (ONPG) es un compuesto estructuralmente similar a la lactosa, excepto en que la glucosa ha sido reemplazada por un grupo o-nitrofenilo. Esta
(3) Glucosa
ij -
12 H
(6) cido pirvico
--- --
Fermentacin butilengliclica
(1)
(2)
(3)
]" 3
\xcmioo
,
+4H
(2) Acido ====> Alcohol
actico
etlico
co,
A<01~:0,
cido lctico
<(2)
Fermentacin cido mixta

(1)
(3)
+4H~
Oxalacetato
(2) cido lctico
\
(3) cido frmico
H2
Acetil metil carbinol

(Acetona)
+ 6H
C02
+/"'''
+4H
cido
succnico
--------- ....--_
(3) 2,3 -Butilenglicol
Alcohol
etlico
Diacetilo KOH + aire
1-----
Naftol +
"'""'"
Complejo ro]o
(Prueba de Voges-Proskauer positiva)
Series de reacciones=====>
H2
C02
pH < 4,4 convierte al

indicador rojo de metilo
Color rojo
(prueba positiva de rojo de metilo)
Reacciones de un solo p a s o - - - - -
t;j
g:i
(}
Fig. 4-2. Vas cido mixta y butilengliclica de fermentaci11 de la glucosa.
t;j
;;:
:,,
(}
t'rj
,....
-..J
Ul
176
Fig. 4-3. Fermentacin bacteriana de la lactosa: la lactosa,

un disacrido compuesto de mol culas de glucosa y galactosa unidas por un enlace P-galactosdico, difunde a travs de
la pared bacteriana bajo la accin de la ~-galacts ido permeasa. Si la bacteria produce ~- galactosidasa , la lactosa es
hidrolizada para producir glucosa y galactosa. La glucosa es
luego metabolizada como se ilustra en la figura 4-1.
Lactosa
Unin p-galactosdica
- - p-galactsido permeasa
Glucosa
+ Galactosa
Glucosa
Pared celu lar

bacteriana
cidos mixtos
(vase fig. 4- 1)
manipulacin bastante ingeniosa de una molcula forma

las bases para Ja prueba ONPG, la cual_ se resea en ~l
diagrama 57. Esta prueba detecta la enzima ~-galactos1dasa mucho ms rpidamente de lo que lo hace la prueba de fermentacin de la lactosa previamente descrita.
Es til para la identificacin de Jos fermentadores tardos de la lactosa deficientes en ~-galactsido permeasa.
El ONPG permeabiliza la pared bacteriana ms rpidamente que la lactosa y, bajo la accin de la ~-galactos1dasa se hidroliza a galactosa y o-nitrofenol (vase diagra~a 57). El o-nitrofenol es un crom?for~ 9ue no tiene
color cuando est unido al o-galactop1ranos1do, pero es
amarillo es su forma libre (no unida) (vase lmina color 4-4A).
Las tabletas de prueba ONPG, que pueden ser fcilmente reconstituidas por el agregado de una pequea
cantidad de agua, estn disponibles comercialmente y
son convenientes para utilizar en el laboratorio. Los microorganismos con fuerte actividad de ~-galactosidas_a
ueden producir una prueba positiva en unos pocos minutos despus de la inoculacin del medio. La prueba
ONPG es ms til para Ja deteccin de actividad de ~-ga
lactosidasa en fermentadores tardos de lactosa, como al1'\ gunas cepas de E. coli en las cuales la diferenciacin d~
especies de Shigella (excepto ciertas cepas de S. somm_~i)
puede ser difcil por otro mtodo. La pr~eba es ~amb1en
til para distinguir ciertas cepas de especies de Cttrobacter y Salmonella arizanae (ONPG-positivo) de ~a mayora de las especies de Salmonella (ONPG-negat1vas). La
prueba ONPG no es un sustituto de la dete cin..d.ela fermentacion
1a 1actosa porque slo se mide la enzima ~-galactosidasa.
ACTIVIDAD CITOCROMO OXIDASA
Cualquier microorganismo que desarrolle actividad citocromo oxidasa siguiendo los procedimientos y las condiciones de prueba reseadas en el captulo 16 se excluye
de Enterobacteriaceae. La reaccin de color que se desarrolla debe ser interpretada dentro de los 1Oa 20 segundos
porque muchos microorganismos, incluidos miem~ros seleccionados de Enterobacteriaceae, pueden producu reacciones falsas-negativas demoradas. Si hubiera alguna dificultad en interpretar Ja reaccin de la citocromo oxidasa,
deben probarse tanto los microorganismos controles oxidasa-positivos como los oxidasa-negativos.
Los goteros comerciales de citocroin~ oxi?asa se usan
con gran frecuencia debido a su convemencia. Las reacciones de color son claramente visibles en 10 segundos.
Si se usan en el laboratorio asas metlicas de inoculacin
enruladas o rectas para transferir bacterias al reactivo de
oxidasa, las que son de acero inoxidable o de Nicrom
pueden producir reacciones falsas positivas, debido a ~a
presencia de trazas de xido de hierro en la superficie
flameada del metal. Este problema puede solucionarse
usando para inocular asas de plstico o de platino o palitos aplicadores de madera o hisopos pa~a llev~ a ca_bo ~a
prueba de oxidasa. El reactivo tetrametil-1:7-femle~diaJ?l
na se usa ms frecuentemente que el denvado d1met1lo,
porque el reactivo es ms estable, ms sensible y menos
txico (vanse cap. 16 y lmina color 4-lG).
REDUCCIN DE NITRATOS
Todas las Enterobacteriaceae con excepcin de ciertos biotipos de Pantoea (Enterobacter) agglomerans y
ENTEROBACTERIACEAE
ciertas especies de Serratia y Yersinia, reducen los nitratos a nitritos. Debido a que el perodo de incubacin que
se requiere para llevar a cabo la prueba de reduccin de
nitratos es variable (3 a 24 horas, segn el sistema usado), no se usa comnmente para hacer un relevamiento
previo de aislamientos bacterianos desconocidos. Ms
bien, la prueba se emplea en la mayora de los laboratorios para confirmar la clasificacin correcta de un microorganismo desconocido o como ayuda en la determinacin e identificacin de especies de bacterias. Los detalles de la prueba de reduccin de nitratos se presentan
en el diagrama 53.
Cualquier medie basal que soporte el crecimiento de
microorganismos y contenga O, 1o/o de concentracin de
nitrato de potasio (KN0 3) es adecuado para llevar a cabo
la prueba. El caldo nitrato o agar nitrato inclinado son las
formas de presentacin del medio usado ms comnmente en laboratorios clnicos. Dado que la enzima nitrato reductasa tiene actividad mxima en condiciones
anaerobias, ZoBell ha recomendado el uso de agar semislido. 129 El medio semislido tambin estimula el crecimiento de muchas especies de bacterias y provee el entorno anaerobio que se necesita para la activacin de la
enzima. El agregado de limaduras de cinc a todas las
reacciones negativas , como se muestra en el diagrama
53, debera ser un procedimiento de rutina. La mayora
de los microorganismos capaces de reducir nitratos, lo
harn en 24 horas ; algunos pueden producir cantidades
detectables dentro de 2 horas. Una prueba rpida de nitrato fue descrita por Schreckenberger y Blazevic. 283 Tanto la a-naftilamina como el cido sulfanlico son relativamente inestables, de modo que su reactividad debera
ser determinada a intervalos frecuentes mediante la prueba de los microorganismos controles positivos y negativos. El compuesto de diazonio que se forma de la reaccin del nitrato reducido y los reactivos tambin es relativamente inestable, y el color tiende a decaer; de acuerdo con esto, las lecturas deberan hacerse inmediatamente despus de que se agregan los reactivos (vase lmina
color 4-lH).
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
PARA LA DETECCIN DE FERMENTACIN
DE HIDRATOS DE CARBONO
Una variedad de diferentes medios lquidos o con agar

pueden ser usados para medir la habilidad de un microorganismo para utilizar fermentativamente los hidratos de
carbono. El principio de la fermentacin de hidratos de
carbono se basa en los estudios de Pasteur sobre bacterias y hongos, escritos hace ms de 100 aos, los cuales
afirman que la accin de muchas especies de microorganismos sobre un hidrato de carbono sustrato resulta en la
acidificacin del medio. La frmula de un medio tpico
base para la fermentacin contiene tripticasa (BBL),
10 g; cloruro de sodio, 5 g; rojo fenol, 0,018 g y agua
destilada csp 1 L.
El hidrato de carbono que se va a probar como la glucosa, se filtra, esteriliza y se agrega aspticamente al medio basal hasta una concentracin final de 0,5% a 1%. La
tripticasa es un hidrolizado de casena que sirve como
fuente de carbono y nitrgeno; el cloruro de sodio es un
estabilizador osmtico; y el rojo fenol es un indicador de
pH del medio que vira d~bajo de 6,8. La lmina color
177
4- lF ilustra las reacciones de fermentacin cida en caldo prpura. Todas las Enterobacteriaceae crecen bien en
este tipo de medio, y la frmula base usada es una cuestin de preferencia personal. Adems de producir el cambio de color al modificar el pH en medios de cultivo para fermentacin , la produccin de cidos mixta, notablemente cido butrico, genera a menudo un olor penetrante y desagradable en el medio de cultivo. Cuando se detecta tal olor, inmediatamente se debe sospechar la presencia de una de las Enterobacteriaceae (adems las bacterias anaerobias generan productos metablicos caractersticos con olores distintivos).
USO DE AGAR HIERRO DE KLIEGLERY AGAR HIERRO
TRIPLE AZCAR
En la prctica, los microorganismos capaces de fermentar l~l1,1cosa en general se detectan mediante la ob- /
servacin de las reacciones que ellos producen cuando se
cultivan en agar hierro de Kliegler (KIA) o agar hierro I
triple azcar (TSI) (fig. 4-4; vase lmina color 4- lE). Si
un microorganismo no puede fermentar la glucosa, entonces se observa la superficie inclinada alcalina y en
profundidad tambin alcalina (sin cambio) en el tubo
(vase fig. 4-4A), lo cual indica la falta de produccin de
cido y la falla del microorganismo prueba para fermentar cualquiera de los azcares presentes. Esta sola accin /
es suficiente gara excluir un microorganismo de Entero- v
bacteriaceae. La frmula de KIA se enumera en el recuadro 4-1 (la frmula de TSI es idntica excepto en que
se agregan 10 g de sacarosa).
Varias observaciones son importantes para estudiar las
frmulas de KIA y TSI. La incorporacin de cuatro derivados de protenas -extracto de carne, extracto de levadura, peptona y proteosa peptona- hace que KIA y TSI
sean nutricionalmente muy ricos. La falta de inhibidor~ /
perffiite el crecimiento de todas las especies bacterianas -V
excepto las ms exigentes (excluidos los anaerobios obligados). Por esta razn, el agar KIA y TSI pueden ser sa- cvLm
dos slo cuando se estn probando especies bacterianas p///l<
seleccionadas de una colonia nia recuperada de placas - de agar primario o selectivo. La glucosa y la lactosa (y
sacarosa en TSI) estn distribuidas por todo el tubo tan- v
to en el pico de flauta como en profundidad. Sin embargo, la factosa est presente en una concentracin 10 veces mayor que la glucosa (de modo similar, la relacin
, sacarosa a glucosa es de 10: 1 en el medio TSI). Esta re- iY/ .;)

!acin 1O:1 es importante para entender los principios }'"'
biogumicos que se comentan ms adelante. El sulfato de /
hierro es un detector de sulfuro de hidrgeno menos sen- v
sible que otras sales fmcas o ferrosas; por lo tanto puede haber discrepancias en las lecturas de sulfuro de hidrgeno entre KIA y TSI y otros medios de prueba (vase lmina color 4-4B). El indicador rojo fenol es amarillo a pH menor que 6,8. Dado que el pH~ del med10 no
inoculado se equilibra a pH con buffer 7,4, la produccin
de cantidades relativamente pequenas de cido provocan
un cambio visible de color.
PRINCIPIOS BIOQUMICOS
Los principios bioqumicos en los que se basan' las

reacciones observadas en agar KIA y TSI se ilustran en
178
No fermentador
..q,.,_.
No
"''!),
fermentacin} <'.s
PH
= 7 '4
'' /
,()$'
02
Superficie inclinada alcalina / profundidad alcalina
;olcx
.s
No fe rmentador de lactosa
Superficie inclinada
cida / profundidad cida
Reaccin inicial
Fig. 4-4. Tres tipos de reacciones producidas por bacterias que crecen en
agar hierro de Kliegler. A. Bacilos no
fermentativos que no son capaces de
producir cidos a partir de la fermenta- !
cin de la glucosa o la lactosa; no hay
cambio en el medio (representado en
blanco) . B. Acidificacin inicial de la
profundidad y la superficie inclinada
del medio ( rea sombreada) por bacterias que fermentan la glucosa, pero la
superfi cie inclinada del medio recupera
el pH alcalino a causa de las aminas alcalinas formadas por descarboxilacin
oxidativa de pptidos (derivados de
protenas del medio) cerca de la superficie. C. Acidificacin completa permanente de la profundidad y la superficie
inclinada del tubo por las bacterias fermentadoras de lactosa.
Superficie incli nada

alcalina / profundidad
cida
B
Fermentador de lactosa (sacarosa)
Superficie inclinada cida /

profundidad cida
e
la figura 4-4. Ntese que el agar fundido se deja solidificar formando una superficie inclinada. Esta configura\/ cin o~ina dos cmai;as de reaccin dentro del mismo
porcin de la superficie inclinada es aerobia ya
tubo.
que est expuesta en toda su superficie al oxgeno atmosfrico . La porcin inferior, llamada la co a o profundidad, est protegida del aire y es relativamente anaerobia.
Es importante, cuando se prepara el medio, que la pendiente y la profundidad tengan la misma longitud, aproximadamente 3 cm cada una, de modo que el efecto de
1
estas dos camaras se preserve.
Los tubos KIA y TSI se inoculan con un asa larga extendida y derecha. La colonia prueba, bien aislada, que
fue recuperada de una placa de agar se toca con el extrem9 del asa de inoculacin, la cual luego es clavada en lo
/r
RECUADRO
4-1.
AGAR HIERRO DE KLIGLER
Extracto de carne, 3 g
Extracto de levadura,
3g
Peptona, 15 g
Proteosa peptona, 5 g
Lactosa, 10 g
Glucosa, 1 g
Sulfato ferroso, 0,2 g

Cloruro de sodio, 5 g
Tiosulfato de sodio, 0,3 g
Agar, 12 g
Rojo fenol,1
g
Agua desti.l.a da c.s:p. 1 L
pH final 7,4
Bt924
profundo del tubo, extendindose ~~ta 3 a 5 m11Lflel fondo del tubo. Cuando el asa de inoculacin se retira de la
profundidad del tubo, la superficie inclinada es estriada
con un movimiento de ida y vuelta. Los tubos inoculados
se ubican en una incubadora a 35C durante 18 a 24 horas. Las fotografas color que se muestran en las lminas
color 4- lE y 5-lA revelan las reacciones que estn descritas en el recuadro 4-2.
Por lo tanto, como se muestra eq la figura 4-4A y en la
lmina 5- lA, sin fermentacin de hidratos de carbono, /
no se forman cidos y la produccin de aminas en el plano inclinado junto con los buffers alcalinos produce un
~o de todo el medio Las bacterias que producen
co
e ste tipo de reaccin se conocen como no fermentadoras
(vase cap. 5).
Si el tubo KIA se inocula con un microorganismo fer- to'
mentador de lucosa ue no uede utilizar la lactosa, slo se puede obtener una cantidad relativamente pequea
de cido a partir de una concentrac n de )uc;osa en-el
medio de 0,1%. Inicialmente, durante J_llli__Qrimeras 8 a l",
12 horas de incubad n, aun esa cantidad de cido puede O"
-ser suficiente para convertir el color al amarillo tanto en
la parte profunda como en la superficie inclinada. En las
pocas horas siguientes, sin embargo, el suplemento de
glucosa se agota en forma completa y la bacteria comienza la degradacin oxidativa de aminocidos dentro de la
superficie inclinada del tubo, donde hay oxgeno. Esto
resulta en la liberacin de aminas que rpidamente contrarrestan las pequeas cantidades de cido presentes en
ENTEROBACTERIACEAE
la superficie inclinada; y entre las 18 y las 24 horas, la

superficie inclinada completa revierte a un pH alcalino y
el color vuelve a ser rojo. En la porcin profunda (anaerobia) del tubo, la degradacin de aminocidos es insuficiente para contrarrestar el cido formado y el medio permanece amarillo. Por lo tanto, una reaccin alcalina en la
superficie inclinada y cida en profundidad en el KIA (o
TSI) es un importante indicador inicial de un microorganismo prueba no fermentador de la lactosa (vanse fig .
4-4B y lmina color 4-lE).
Si el tubo KIA es inoculado con un microorganismo
fermentador de lactosa, entonces, aun cuando la glucosa
sea usada completamente despus de las primeras 8 a
12 horas, la fermentacin contina ya que el microorganismo es capaz de usar la lactosa (presente en una concentracin 10 veces superior que la de la glucosa). En
consecuencia, cuando se examina el tubo luego de 18 a
24 horas, la produccin de cido a partir de la fermentacin de la lactosa est ocurriendo an, y tanto la superficie inclinada como la profundidad aparecen amarillas, lo
que es consecuencia de una reaccin cida en la superficie inclinada y cida en la profundidad (vanse fig. 4-4C
y lmina color 4- lE).
Muchos microbilogos prefieren TSI a KIA porque el
agregado de sacarosa a la frmula ayuda a investigar especies de Salmonella y Shigella, ya que ninguna de stas
(excepto cepas raras) metaboliza ni la lactosa ni la sacarosa. Por lo tanto, cualquier reaccin de TSI indica que la
lactosa o la sacarosa, o ambas, han sido fermentadas , excluidas Salmonella y Shigella. Tambin debe recordarse
179 /'
que Yersinia enterocolitica.fermenta la sacarosa, pero no

la lactosa; por lo tanto, en TSI la reaccin ser cida-cida (similar a las coliforrnes corno E. coli), pero en KIA,
la reaccin ser alc alin ~ - cida (similar a los no ferrnentadori>s el-e ladosa) . En consecuencia, cuando se investigan muestras de materia fecal para Salmonella, Shigella
y Yersinia , algunos podran argumentar que KIA es preferible a TSI.
.J Para la deteccin de sulfuro de hidrgeno, que es incoloro, el medio debe incluir un indicador. El tiosulfato de
sodio es la fuente de tomos de azufre en la mayora de
los medios usados para la produccin de sulfuro de hidrgeno. Las sales de hierro (sulfato ferroso y frrico, citrato de amonio) se incorporan al medio de cultivo y
reaccionan con sulfuro de hidrgeno para producir un
precipitado negro insoluble (sulfuro de hierro). Se requiere un medio cido para que un microorganismo produzca sulfuro de hidrgeno y, por lo tanto, debe proveerse una fuente de iones hidrgeno. Dado que la profundidad de los tubos KIA y TSI se vuelve cida con la fermentacin de la glucosa (los iones hidrgeno aumentan),
a menudo el ennegrecimiento se ve por primera vez all,
particularmente con bacterias no fermentadoras de lactosa (vase lmina color 4- lE). Por lo tanto, el negro profundo debera ser ledo corno cido si el color amarillo
usual se oscurece con un precipitado negro. Los medios
KIA y TSI son menos sensibles en la deteccin de sulfuro de hidrgeno que los medios que contienen hierro, como el medio sulfuro indo! movilidad (SMI) (vase lmina color 4-4B) .
Si un microorganismo puede excluirse de Enterobacteriaceae antes de que se establezca una extensa batera
de pruebas bioqumicas se ahorra considerable tiempo y
trabajo. Se recomienda que la superficie inclinada de
KIA o TSI se utilice en todos los aislamientos que se sospecha que son Enterobacteriaceae al mismo tiempo que
se utilicen los medios de prueba diferenciales. Aun cuando se trate de un microorganismo fermentador y se sospeche que es Enterobacteriaceae, se debe llevar a cabo
una prueba de citocromo oxidasa para excluir los microorganismos pertenecientes a otros gneros de bacterias fermentadoras, como especies de Aeromonas,
Plesiomonas, Vibrio y Pasteurella, que son oxidasa positivos .
ELECCIN DE MEDIOS DE AISLAMIENTO
RIMARIO
Deben usarse medios de cultivo selectivos para recuperar las especies de bacterias importantes de las muestras que pueden alojar una mezcla de microorganismos.
Para hacer rac!onal las selecciones. los microbilogos yfAl
deben conocer la composicin de cada frmula y tlJ2ro- .
psito y la 'cocentracin relativa <le cada qumico o
compuesto que se incluye. Por ejempl~ no es suficiente
con saber que se incluyen sales biliares en las frmulas
de varios medios selectivos para inhibir el crecimiento de
grampositivos y de algunas de las especies bacterianas ~
gramnegativas ms exigentes. Por ejemplo, el agar SS/ ~:U
contiene alrededor de cinco veces la concentracin de sa-\fl
les biliar~cC onkey y es ms inhibitorio para E. coli y ms selectivo para la recuperacin de especies de Salmonella de cultivos de materia fecal.
r.
1/
180
Se dispone de tres tipos generales de medio para la recuperacin de Enterobacteriaceae de muestras clnicas
que potencialmente alojan bacterias mixtas: 1) medio no
selectjyo para aislamiento primario (~_;_
2) agar selectivo y diferencial (p. ej., agar MacConkey y
Q Hektoen entrico); y 3) caldos de enriquecimiento. En
los cuadros 4-1y4-2 se comparan los diferentes medios
~ '\\ comnmente usados en la prctica clnica. Las frmulas
son complejas e incluyen ingredientes que no slo inhiben el crecimiento de ciertas especies bacterianas (selecf vo ), sino que tambin detectan varias caractersticas
io umicas ue on im ortantes para hacer una identificacin preliminar de los microorganismos presentes en la
$'
~ferencial).
CUADRO
~
QUMICOS Y COMPUESTOS USADOS

EN MEDIOS SELECTIVOS
El recuadro 4-3 enumera los tipos generales de qumicos y los compuestos usados en medios selectivos e incluye breves comentarios acerca de la funcin de cada uno.
MEDIOS DE AISLAMIENTO SELECTIVOS
En 1905, MacConkeyl 94 describi por primera vez un

medio selectivo diferencial Cagar rojo neutro-sales biliares) que l us para aislar bacilos entricos gramnegativos de muestras que contenan mezclas de especies
bacterianas. Incorpor lactosa y el indicador rojo neu-
4-1. MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES PARA LA RECUPERACIN

DE
=
'<'
w ~~
~><
"
Formulacin
Medio
ENTEROBACTERIACEAE
'
Propsito e ingredientes
diferenciales
Se~
>'
Reacciones e interpretacin
Agar MacConkey
Peptona
17 g
(vase lmina 4-2A y B) Poli peptona
3g
10 g
Lactosa
Sales biliares
1,5 g
Cloruro de sodio
5g
13,5 g
Agar
,. Rojo neutro
0,03 g
0,001 g
Cristal violeta
Agua destilada c.s.p.
l L
pH final = 7, 1
El agar MacConkey es un medio

de plaqueo diferencial para la seleccin y recuperacin de Enterobacteriaceae y bacilos gramnegativos entricos relacionados.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento pe bacterias grampositivas y de algunas
gramnegativas exigentes.
La lactosa es el nico hidrato de
carbono.
Las bacterias fermentadoras de
lactosa producen colonias que
tienen distintos tonos de rojo,
debido a la conversin del colorante indicador rojo neutro (rojo
con pH por debajo de 6,8) por la
produccin de cidos mixtos.
Las colonias de bacterias no fermentadoras de la lactosa aparecen sin color y transparentes.
Los fermentadores fuertes de la

lactosa tpicos, como especies de
Escherichia, Klebsiella y Enterobacter producen colonias rojas
rodeadas de una zona de bilis
precipitada.
Los fermentadores lentos o dbiles de la lactosa, como
Citrobacter, Providencia,
Serratia y Hafnia , pueden aparecer sin color despus de 24 h o
rosa plido en 24-48 h.
Las especies de Proteus, Edwadsiella, Salmonella y Shigella,
con raras excepciones, producen
colonias con poco color o transparentes .
Las colonias representativas de estas varias reacciones se muestran
en la lmina color 4-2.
Peptona
10 g
Lactosa
5g
Sacarosa*
5g
Dipotsico, P0 4
2g
Agar
13,5 g
0,4 g
Eosina
0,065 g
Azul de metileno
lL
pH final =7 ,2
El agar EMB es un medio de plaqueo diferencial que puede ser

usado en lugar del agar MacConkey en el aislamiento y deteccin
de Enterobacteriaceae o debacilos coliformes de muestras con
bacterias mixtas.
Los colorantes anilnicos (eosina y
azul de metileno) inhiben a las
bacterias grampositivas y a las
gramnegativas exigentes. Se
combinan para formar n precipitado a pH cido y, de ese modo, sirven tambin como indicadores de la produccin de cido.
EMB Levine, con slo lactosa, da
reacciones ms en paralelo con
las del agar MacConkey; la frmula modificada tambin detecta
fermentadores de la sacarosa.
Las colonias de los fermentadores de la,ctosa fuertes tpicos,

notablemente Escherichia coli,
son negro verdoso con brillo
metlico.
Los fermentadores dbiles, incluidos Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Hafnia, producen colonias prpura en 24-48 h.
Los no fermentadores de lactosa,
que incluyen Proteus, Salmonella y Shigella, producen colonias
transparentes.
Yersinia enterocolitica, un fermentador de sacarosa no fermentador de lactosa, produce colonias
transparentes en EMB Levine y
colonias prpura a negro en la
frmula modificada.
Vase lmina color 4-2.
Agar eosina azul de metileno (EMB)

(vase lmina color 4-2C
hasta F)
''
*
Frmula de Holt-Harris Teague modificada. Agar EMB Levine no contiene sacarosa.
ENTEROBACTER!ACEAE
tro en el medio para proveer un medio visual para detectar la utilizacin de lactosa por el organismo prueba.
En ese momento, a todos los bacilos gramnegativos no
formadores de esporas se los denominaba an bacilos
entricos; sin embargo, los microbilogos haban reconocido que ciertas.especies eran ms patgenas para los
humanos que otras. El patrn de utilizacin de hidratos
Medio
Formulacin
5g
Agar Salmonella-Shige- Extracto de carne
lla (SS)
Peptona
5g
10 g
Lactosa
Sales biliares
8,5 g
Citrato de sodio
8,5 g
8,5 g
Tiosulfato de sodio
Citrato frrico
1g
12,5 g
Agar
0,025 g
Rojo neutro
Verde brillante
0,033 g
lL
pH final, 7 ,4
Agar Hektoen entrico

(HE)
(vase lmina color
4-3E y F)
181
de carbono de varias especies de bacterias ya era conocido a fines del siglo, y la fermentacin de la lactosa, en
particular, fue reconocida como un importante marcador para diferenciar ciertos patgenos entricos. En
1916, Holt-Harris y Teague 151 describieron un medio
para
con eosina y azul de metileno como indicad
diferenciar entre las colonias fermentdoras y no fer-
diferenciales
El agar SS es un medio altamente Cualquier colonia fermentadora de

selectivo formulado para inhibir
lactosa que aparezca se colorea
el crecimiento de la mayora de
de rojo por rojo neutro. Ciertas
los microorganismos coliformes
cepas poco frecuentes de Salmoy permitir el desarrollo de espenella arizanae son fermentadoras de lactosa y pueden parecercies de Salmonella y Shigella de
se a Escherichia coli.
muestras ambientales y clnicas.
Las altas concentraciones de sales El crecimiento de especies de Salbiliares y citrato de sodio inhimonella no es inhibido, y las coben a todas las bacterias gramlonias aparecen sin color con
positivas y muchos microorgacentro negro, debido a la pronismos gramnegativos, incluidos
duccin de sulfuro de hidrgeno.
Las especies de Shigella mueslos coliformes.
tran inhibicin variada y coloLa lactosa es el nico hidrato de
carbono y el rojo neutro es el innias sin color y sin ennegrecidicador para la deteccin de
miento.
cido.
Las cepas mviles de Proteus que
aparecen en el agar SS no se disEl tiosulfato de sodio es la fuente
de sulfuro. Cualquier bacteria
persan.
que produce gas sulfuro de hidrgeno se detecta por un precipitado negro formado con citrato
frrico (relativamente insensible).
La alta selectividad del agar SS
permite el uso de un inculo cargado.
12 g El agar HE es una formulacin re- Los fermentadores rpidos de lacPeptona

3g
ciente diseada como un medio
Extracto de levadura
tosa (como E. coli) son inhibidos moderadamente y producen
Sales biliares
9g
de plagueo indirecto para mu;12 g
tras fecales para incrementar el
Lactosa
colonias naranja brillante a rosaSacarosa
12 g
rendimiento de especies de Saldo salmn.
} Salicina
2g
monella y Shigella a pattir de
Las colonias de Salmonella son
azul-verdosas, tpicamente con
Cloruro de sodio
5g
flora normal nuierosa.
centros negros de gas sulfuro de
Tiosulfato de sodio
5 g L alta concentracin de sales biliares inhibe el crecimiento de
hidrgeno.
Citrato frrico de amonio 1,5 g
Fucsina cida
0,1 g
todas las bacterias grampositivas Shigella aparece ms verde que
Salmonella, y las colonias paliAzul de timol
0,04 g
y retarda el de muchas cepas codecen hacia la periferia.
14 g
liformes.
Agar
1 L Pueden producirse cidos a partir Las cepas de Proteus son inhibipH final, 7 ,6
de hidratos de carbono, y la fuc das en cierta forma; las colonias
que desarrollan son pequeas y
sina cida, al reaccionar con el
azul de timol, produce un color
transparentes, y de aspecto ms
amarillo cuando baja el pH.
brillante o acuoso que el de las
El tiosulfato de sodio es una fuenespecies de Salmonella o Shigella. Vase lmina color 4-3.
te de sulfuro, y el gas sulfuro de
hidrgeno se detecta mediante
citrato frrico de amonio (relativamente sensible).
(Contina)
182
CUADRO 4-2. MEDIOS ALTAMENTE SELECTIVOS PARA LA RECUPERACIN DE ENTEROBACTER/ACEAE A PARTIR DE MUESTRAS
(C NTINUACIN)"
GASTROINTESTINAL
e
Medio
'
Agar xilosa li sina

desoxicolato (XLD)
(vase lmina color
4-3A a D)
,e
diferenciales
Formulacin
Xilosa
Lisina
Lactosa
Sacarosa
Cloruro de sodio
Extracto de Levadura
Rojo fenol
Agar
Deoxicolato de sodio
Tiosulfato de sodio
Citrato frrico de amonio
Agua destilada c.s.p
pH final, 7,4
3,5 g El agar XLD es menos inhibidor

del crecimiento de bacilos coli5g
formes que el agar HE y fu e di7,5 g
seado para detectar shigellae en
7,5 g
heces despus de enriquecimien5g
to en caldo para gramnegativos.
3g
0,08 g Las sales biliares en concentracin
13,5 g
relativamente baja hacen que el
2,5 g
medio sea menos selectivo que
los otros dos incluidos en este
6,8 g
cuadro.
0,8 g
1 L Tres hidratos de carbono estn
disponibles para la produccin
de cido, y el rojo fenol es un
indicador de pR
Los microorganismos lisina positivos, como especies de Salmonella, producen colonias inicialmente amarillas debido a la utilizacin de xilosa y colonias rojas
retardadas por la descarboxilacin de Ja lisina.
El sistema de deteccin de sulfuro
de hidrgeno es similar al del
agar HE
mentadoras de lactosa. Se incluy sacarosa en el medio

para detectar aquellos miembros del grupo coliforme
que fermentan la sacarosa ms rpidamente que la lactosa.
Los agares MacConkey y EMB son solamente mode_radamente inhjbjtorjqs y fueron diseados en principio
para evitar el crecimiento de bacterias grampositivas a
partir de cultivos mixtos. Muchas especies de microorganismos gramnegativos exigentes son inhibidas del mismo
modo; sin embargo, todas las Enterobacteriaceae crecen
bien. En el cuadro 4-1 se comparan las frmulas , ingredientes inhibitorios y caractersticas claves diferenciales
para los agares MacConkey y EMB.
La decisin de usar agar MacConkey o EMB es ante
todo una cuestin de preferencia personal, dado que las
especies bacterianas que utilizan lactosa pueden ser diferenciadas por ambos. El agar MacConkey contiene rojo
neutro como indicador de pH y, como resultado, las colonias que metabolizan lactosa aparecen rosadas a partir
de la produccin de cidos mixtos (vase lmina color
4-2A y B). Las bacterias que son fuertes productoras de
cido, como E. coli, forman colonias rojo oscuro. Las
bacterias productoras de bajas cantidades de cido forman colonias rosado plido o colonias que son claras en
la periferia y tienen centros rosados. Sobre agar EMB,
las bacterias que son fuertes productoras de cido forman
colonias con brillo metlico (vase lmina color
4-2C y D). La apariencia brillante es causada por la precipitacin del colorante sobre las colonias, y es altamente indicativa de E. coli, aunque otros fuertes productores
de cido, corno, Yersinia enterocolitica, pueden tener
apariencia similar.
'
Los microorganismoss como
E coli y especies de KlebsiellaEnterobacter pueden usar ms de
un hidrato de carbono y producir
colonias amarillo brillante. Las
colonias en muchas especies de
Proteus son tambin amarillas.
La mayora de las especies de
Salmonella producen colonias
rojas, con centros negros de gas
sulfuro de hidrgeno.
Shigella, Providencia y muchas
especies de Proteus no usan ninguno de Jos hidratos de carbono
y producen colonias transparentes .
Colonias de Citrobacter son amarillas con centros negros; muchas especies de Proteus son
amaiillas o transparentes con
centros negros; las de Salmonellae son rojas con centro negro.
Vase lmina color 4-3.
MEDIOS DE AISLAMIENTO ALTAMENTE SELECTIVOS

USADOS PR INCIPALMENTE PARA MUESTRAS
GASTROINTESTINALES
Los medios se hacen altamente selectivos mediante el

agregado de una variedad de inhibidores a sus frmulas,
generalmente en concentraciones ms altas que en agar
MacConkey o EMB. Estos medios son usados primariamente para inhibir el crecimiento de E. coli y otros coliformes , pero permiten el crecimiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras de materia fecal.
Aqu se comentan varios medio~ selectivos formulados
para su utilizacin en laboratorios clnicos. Los ms comnmente usados son el agar Salmonella-Shigella (SS),
el agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y el agar Hektoen entrico (HE). stos se describen en el cuadro 4-2.
La decisin respecto de cul de estos medios usar para la recuperacin de patgenos entricos de muestras fecales depende de la preferencia personal y de las especies
que van a ser seleccionadas. En general, estos medios se
emplean en el laboratorio clnico para la recuperacin de
especies de Salmonella y Shigella de muestras de materia fecal diarreica, o en laboratorios de salud pblica para investigar una posible contaminacin fecal de suministros de agua y comida. Virtualmente todas las especies
crecen bien en presencia de sales biliari;!s, lo cual explica
por qu la vescula biliar a menudo sirve como reservorio en los seres humanos portadores. Se agregan sales biliares al medio selectivo debido a que otras especies de
bacilos entricos, incluidas algunas de las cepas de Shigella ms exigentes, crecen poco o no crecen. El agar SS
y el HE contienen concentraciones relativamente altas de
ENTEROBACTERIACEAE
RECUADRO 4-4. SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO

PARA MUESTRAS FECALES O HISOPADOS RECTALES
l. Inocular la muestra directamente en placas de agar
MacConkey o EMB para aislamiento primario de todas

las especies de bacilos entricos gramnegativos.
2. Inocular directamente o en placas de agar XLD o HE
para la investigacin ~e lectiv a de especies de Salmonella o Shigella.
3. Enriquecer una pequea porcin de la muestra mediante inoculacin cargada de caldos selenito o GN. Si se
usa selenito, subcultivar a agar HE dentro de las 8 a
12 horas; si se usa GN, subcultivar dentro de las 4 horas. Nota: en el laboratorio del autor este paso no es llevado a cabo de rutina a menos que se investiguen pacientes asintomticos para detectar la presencia de un
estado portador.
4. Incubar todas las placas de cultivo a 35C durante 24 a
48 horas. Seleccionar colonias sospechosas para la
identificacin bioqumica definitiva o para pruebas serolgicas.
Para muestras distintas de heces o hi sopados rectales,

una combinacin de agar MacConkey o EMB y de agar
sangre es en general suficiente. No se requieren medios
con mayores propiedades inhibidoras de modo rutinaro
ya que la concentracin de la flora comensal o microorganismos contaminantes es relativamente baj a en la mayora de las muestras no entricas. Puede efectuarse un
subcultivo a un medio ms inhibidor en los casos en que
parezca necesario.
Para muestras fecales e hisopados rectales es necesario seleccionar slo un medio de cada uno de los grupos
listados en los cuadros 4-1 y 4-2. Se sugiere la aproximacin reseada en el recuadro 4-4.
CARACTERSTICAS DIFERENCIALES
DE IDENTIFICACIN
Aunque la identificacin preliminar de Enterobacteriaceae se basa posiblemente en las caractersticas de las
colonias y las reacciones bioqumicas en medios de aislamiento primarios, otras tcnicas de identificacin de
especies requieren la determinacin de caractersticas fenotpicas adicionales ue refle an el cdigo entico la
1 entidad nica de los microor anismos que se prueban .
sta discusin tiene el propsito de revisar os echos sobresalientes de las pruebas que miden estas caractersticas fenotpicas y que son usadas comnmente en laboratorios clnicos. Esta orientacin es necesaria para que el
personal del laboratorio pueda comprender los principios
que se encuentran detrs de estos procedimientos con el
fin de reconocer y corregir cualquier inconsi stencia bioqumica, problemas con cultivos mixtos y fallas en las
tcnicas. No es posible comentar la variedad de diferentes pruebas y numerosos esquemas disponibles para la
identificacin final de especies de Enterobacteriaceae.
Sin. embargo, en el recuadro 4-5 se enumeran varias de
185
las pruebas ampliamente usadas en los laboratorios clnic9s para medir las caracter:sticas metablicas por las
cuales pueden identificarse todas las especies de Enterobacteriaceae con excepcin de unos pocas especies raras
y atpicas. La utilizacin de hidratos de carbono y la actividad ONPG ya han sido comentadas.
PRODUCCIN DE INDOL
El indo] es uno de los productos de degradacin del

metabolismo del aminocido triptfano. Las bacterias
que poseen la enzima triptofanasa pueden clivar el triptfano, y de este modo producir indol, cido pirvico y
amonio. El indo] puede detectarse en un medio triptfano de prueba mediante la observacin del desarrollo de
color rojo despus de agregar una solucin que contiene
p-dimetilaminobenzaldehdo (p. ej., Reactivo de Ehrlich
o de Kovac). La bioqumica y los detalles de la prueba de
indol se ilustran esquemticamente en la figura 4-5 y el
diagrama 40, respectivamente. Se muestra una reproduccin color en la lmina color 4-4C.
La eleccin entre los reactivos de Ehrlich o Kovacs depende de la preferencia personal. El reactivo de Ehrlich
es ms sensible y se prefiere cuando se prueban bacilos
no fermentadores o anaerobios en los cuales la produccin de indo] es mnima. Dado que el indo] es soluble en
compuestos orgnicos, debera agregarse xileno o cloroformo al medio de prueba antes del reactivo de Ehrlich.
Este paso de extraccin es menos crtico en el caso del
reactivo de Kovac porque se usa alcohol amlico para diluir (con e l reactivo de Ehrlich se usa alcohol etlico).
PRUEBA DEL ROJO DE METILO
En la figura 4-2 se ilustra un esquema simplificado que

muestra slo dos caminos alternativos (cido mixto y butilengliclico) para el metabolismo del piruvato formado
a partir de la fermentacin de la glucosa. Las bacterias
que siguen en primer trmino la fermentacin cido mixta a menudo producen suficiente cido para mantener el
RECUADRO 4-5. PRUEBAS USADAS PARA MEDIR LAS

CARACTERSTICAS METABLICAS DE ENTEROBACTERIACEAE
Utilizacin de hidratos de carbono

Actividad de
o-nitrofeni l-~-D-galactopiransido
(ONPG)
Produccin de indol
Rojo de metilo
Prueba de Voges-Proskauer (produccin de acetil-metilcarbinol [acetooa])
Utilizacin de citrato
Produccin de ureasa
Descarboxilacin de la lisina, Ja ornitina y la arginina
Produccin de fenilalanina desaminasa
Produccin de sulfuro de hidrgeno
Movilidad
186
Fig. 4-5. Formacin de indo! por bacterias productoras de triptofanasa que crecen en medios de cultivo que
contienen triptfano. El indo! es uno de los productos
de degradacin inmediata (adems de cido pirvico y
amonio) que resultan de la desaminacin del triptfano. El indo! puede ser extrado de la fase acuosa del
medio mediante cloroformo y detectado por la adicin
de reactivo de Ehrlich (dimetilaminobenzaldehdo).
Xileno
p-Dimetilaminobenzaldehdo
(color rojo)
Indo!
Medio triptfano
Caldo triptfano
Pi ruvato
Agar sulfuro-indol-movil idad

(SIM}
Triptfano
Agar movilidad-indol-orn itina

(MIO)
Bacteria
pH por debajo de 4,4. La prueba del rojo de metilo proporciona caractersticas valiosas para la identificacin de
especies bacterianas que producen cidos fuertes a partir
de la glucosa.
Los detalles de la prueba del rojo de metilo se muestran en el diagrama 48. La prueba, como se describi originalmente, requiere .48 a 72 horas de incubacin antes
de que pueda obtenerse un resultado vlido, una cantidad
de tiempo inaceptable para la mayora de los laboratorios
de microbiologa clnicos. Barry y col., 22 describieron
una modificacin que puede leerse entre las 18 a 24 horas. Se emplea una alcuota de caldo de 0,5 mL con un
inculo relativamente cargado para probar el microorganismo. Despus de 18 a 24 horas de incubacin a 35C se
agregan 1 o 2 gotas de reactivo rojo de metilo, el desarrollo de color rojo indica prueba positiva (vase lmina color 4-4C). La modificacin de Barry es tan certera como
la prueba originalmente descrita y ahorra una cantidad
significativa de tiempo.
PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Los detalles de la prueba de Voges-Proskauer se ilustran en el diagrama 75; esta prueba se basa en la conversin de acetil-metil-carbinol (acetona) a diacetilo a travs de la accin del hidrxido de potasio y el oxgeno at-
mosfrico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo

bajo la accin cataltica del a-naftol y la creatinina (vase lmina color 4-4D).
Ntese, en la figura 4-2, que la formacin de acetona y
butilenglicol es un camino alternativo para el metabolismo
del cido pirvico. Las bacterias que usan este camino, como ciertas cepas dentro del grupo de Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia, producen slo pequeas cantidades de cidos mixtos, que pueden ser insuficientes para
disminuir el pH del medio rojo de metilo lo suficiente para producir un cambio de color. En consecuencia, la mayora de las especies de Enterobacteriaceae Voges-Proskauer
positivas, con raras excepciones, son rojo de metilo negativas y viceversa (vase lmina color 4-4C y D).
UTILIZACIN DEL CITRATO
El principio de la prueba de utilizacin del citrato (diagrama 12) es determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato de sodio como nica fuente de
carbono para el metabolismo y el crecimiento.
La frmula original, descrita por Koser en 1923, consista en un caldo que contena fosfato de sodio y amonio, fosfato monopotsico, sulfato de magnesio y citrato
de sodio. Se omitieron las protenas y los hidratos de carbono como fuentes de carbono y de nitrgeno. El punto
ENTEROBACTERIACEAE
final de la prueba de Ko'Ser era la presencia o Ja ausencia

de turbidez visible despus de la incubacin del microorganismo prueba; este punto final es en realidad una medida de la capacidad del microorganismo de utilizar el
carbn del citrato de sodio y producir un crecimiento suficiente para volverse visible. Sin embargo, se reconoci
rpidamente que poda ocurrir turbidez no especfica en
el medio de Koser.
Simmons287 resolvi este problema con el agregado de
agar y azul de bromotimol a la frmula de Koser, lo cual
provee un punto final ms sensible. El agar citrato de
Simmons se vierte en un tubo de prueba y se inclina. Se
estra un inculo liviano de una colonia de crecimiento
del mi croorganismo prueba sobre la superficie oblicua
del agar. Si el inculo es muy cargado, los compuestos
orgnicos preformados dentro de las paredes celulares tle
bactefias moribundas pueden liberar suficiente carbon9 y
nitrgeno para producir una prueba con resultado false
positivo. Cuando se inocula una serie de tubos de medio
de cultivo diferencial con un microorganismo desconocido, es importante que el medio citrato sea estriado primero para prevenir el arrastre de protenas o hidratos de cf'=
bono de otro medio.
La produccin de color azul en el medio de prueba
despus de 24 horas de incubacin a 35C indica la presencia de productos alcalinos y un resultado positivo de
la prueba de utilizacin del citrato (vase lmina color
4-4D). Si se utiliza el carbn a partir del citrato de sodio,
el nitrgeno se extrae del fosfato de amonio contenido en
el medio, con lo cual se libera amonio. En ocasiones se
detecta un crecimiento visible a lo largo de la estra antes de la conversin del medio al color azul. El crecimiento visible tambin indica una prueba de resultado
positivo. El malonato, el acetato y el mucato son otros radicales aninicos comnmente empleados para determinar la capacidad de las bacterias para usar estos compuestos simples como nica fuente de carbono.
El acrnimo IMVIC (indo! , rojo de metilo, VogesProskauer y citrato) era utilizado por los sanitaristas y
epidemilogos para referirse a las pruebas necesarias para detectar contaminacin fecal en el agua y la comida.
Escherichia coli ha sido usado durante muchos aos por
profesionales de salud pblica para indicar contaminacin fetal. Enterobacter aerogenes produce colonias en
medio de aislamiento primario que a menudo no pueden
ser distinguidas de las de Eschericla coli. Sin embargo,
la recuperacin de E. aerogenes a partir de la comida y el
agua potable no necesariamente indica contaminacin
fecal porque el microorganismo est ampliamente distribuido en el suelo, los pastos y el material vegetal. Por lo
tanto, se necesita un conjunto de caractersticas bioqumicas para diferenciar los dos microorgani smos. Las
pruebas IMVIC fueron adoptadas para servir a este propsito. La mayora de las cepas de E. coli fueron indo!
rojo de metilo positivas y Voges-Proskauer citrato negativas. E. aerogenes tpicamente produce reacciones
opuestas (vase lmina color 4-4C y D). Aunque las caractersticas individuales incluid<is en la batera IMVIC
an se emplean para la identificacin bacteriana, con poca frecuencia se las utiliza como un conjunto de pruebas
especficas.
En vista de la complejidad para diferenciar entre las
ms de 100 especies de Enterobacteriaceae que se presentan en Ja prxima seccin de este libro, es interesante
187
saber que en un tiempo las ms important~ s decisiones

en microbiologa eran relativamente simples y podan ser
hechas sobre la base de cuatro pruebas bioqumicas sencillas.
PRODUCCIN DE UREASA
Los microorganismos que poseen la enzima ureasa hidrolizan la urea, con lo cual se libera amonio y se produce un cambio de color rosado-rojo en el medio (vase lmina color 4-4E) . Los detalles sobre Ja prueba de ureasa
se muestran en el diagrama 72.
Deben destacarse las diferencias imr r antes entre el
caldo urea de Stuart y el agar urea de C1ristensen. El caldo urea de Stuart es fuertemente tamponado con sales de
fosfato a un pH 6,8. El microorganismo prueba debe formar cantidades importantes de amonio antes de que el
sistema tampn sea vencido y el pH del medio se eleve
por encima de 8 para producir un cambio de color en el
indicador. El caldo de Stuart, por lo tanto, es virtualmente selectivo para especies de Proteus.
El agar urea de Christensen 72 es menos tamponado que
el caldo urea de Stuart y contiene peptonas y glucosa. Este medio enriquecido soporta el crecimiento de muchas
especies de bacterias que no pueden crecer en caldo de
Stuart y la capacidad tampn disminuida permite la deteccin de pequeas cantidades de amonio. Los microorganismos que producen menos ureasa, como ciertas especies de Klebsiella, Enterobacter, Brucella y Bordetella
bronchisepsica, pueden probarse con el agar urea de
Christensen. Para muchas de estas especies, una reaccin
de ureasa positiva se detecta primero por un cambio de
color rosado a rojo en la porcin inclinada del agar (vase lmina color 4-4E). Al comienzo la superficie inclinada se pone roja porque la reaccin alcalina, que resulta de
la dispersin de pequeas cantidades de urea, aumenta
por las aminas formadas provenientes de la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos en la regin del medio
expuesta al aire.
DESCARBOXILACIN DE LA LISINA, LA ORNITINA
Y LA ARGININA
Muchas especies de bacterias poseen enzimas que

pueden descarboxilar aminocidos especficos en el medio de prueba. Las enzimas descarboxilasas remueven
una molcula de C0 2 de un aminocido para formar aminas reactivas alcalinas. Los siguientes son los aminocidos ms comnmente probados y las aminas producto de
su degradacin:
Lisina -7 cadaverina
Ornitina -7 putrescina
Arginina -7 citrulina
Se han descrito numerosos sistemas de prueba para
medir esta propiedad, basados en la deteccin de un cambio a pH alcalino en el medio de prueba o en la medicin
directa de los productos de la reaccin. Por ejemplo, las
aminas que resultan de la reaccin de descarboxilacin
pueden ser detectadas con el reactivo ninhidrina despus
de la extraccin del caldo de cultivo con cloroformo. sta es la relativamente sensible reaccin de Carlquist, 46
usada con ms frecuencia para detectar Ja actividad des-
ENTEROBACTERIACEAE
CUADRO
4-4.
MEDIO PARA LA DETECCIN DE SULFURO DE HIDRGENO
Medio
Fuente de sulfuro
Indicador de H2S
Sulfito de bismuto
Peptonas ms sulfito
Sulfato de hierro
Agar sulfuro citrato
Tiosulfato de sodio
Agar desoxicolato citrato
Peptonas
Citrato frrico
Agar lisina hierro
Tiosulfato de sodio
Agar hierro de Kligler
Tiosulfato de sodio
Sulfato ferroso
Agar hierro triple azcar
Tiosulfato de sodio
Sulfato ferroso
Agar ~cetato de plomo
Tiosulfato de sodio
Acetato de plomo
Agar.Salmonella-Shigella
Tiosulfato de sodio
Citrato frrico
Medio sulfuro-indol-movilidad
Tiosulfato de sodio
Hierro peptonizado
Xilosa-lisina-desoxicolato o Hektoen entrico
Tiosulfato de sodio
~ ~Cj!n
'
189
los sis~nas de deteccin de H2 S, el punto final es

su1fil~ , unnrilar'pesadQ insoluble que produce un precipitado negro en el medio o en la tira de papel de filtro .
Dado que debe haber iones hidrgeno disponibles para la
formacin de H 2 S, el ennegrecimiento se observa primero en la zona del medio de prueba en la cual la formacin
de cido es mxima, esto es, a lo largo de la lnea de inoculacin, dentro del agar profundo e inclinado o en el
centro de las colonias que crecen sobre la superficie de
~~
MOVILIDAD
Otra caracterstica importante para hacer la identificacin final de especies es la movilidad bacteriana. Las
bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo nmero
y localizacin varan entre las diferentes especies. Se dispone de tinciones flagelares para su determinacin (vase cap. 5).
La movilidad bacteriana se puede apreciar directamente ubicando una gota del caldo de cultivo sobre un portaobjetos y observndolo microscpicamente. Se dispone de cmaras de gota pendiente de modo que la preparacin se pueda ver bajo mayor aumento sin peligro de
bajar los objetivos hasta la gota contaminada. Esta tcnica se utiliza en primer lugar para detectar la movilidad de
es ecies bacterianas ue no crecen bien en a ar senus~ m em argo, ntero acterzaceae crece bien, y los
tubos que tienen agar semislido son los que se emplean
ms comnmente.
RECUADRO
4-6.
CMO SE PRODUC E
El medio para movilidad tiene una concentracin de

agar de 0,4% o menos. A altas concentraciones, el gel es
demasiado firme para permitir que los microorganismos
se diseminen libremente. Las combinaciones de medios,
como medio SIM 195 o agar MI0 92 han encontrado amplio uso en los laboratorios de microbiologa clnica porque se puede medir ms de una caracterstica en el mismo tubo. Primero se debe interpretar la prueba de movilidad, porque la adicin de un reactivo de indol puede
oscurecer los resultados. Dado que el medio SIM y el
agar MIO tienen una leve turbidez de fondo, las interpretaciones pueden ser algo difciles con especies bacterianas que crecen lentamente en estos medios. En estos
casos se recomienda el medio para la prueba de movilidad (recuadro 4-7) porque soporta el crecimiento de la
mayora de las bacterias exigentes y tiene apariencia de
cristal claro.
La prueba de movilidad se interpreta haciendo un examen macroscpico del medio pai:_a detectar una zona di- 1
I fusa de crecimiento que se proyecta sob!_ nea de inoClacin (vase lmina color 4-4H). Se ha postu a o e uso de sales de tetrazolio en medios de movilidad como
una ayuda para la deteccin visual del crecimiento bacteriano. Las sales de tettazolio son incoloras pero se convierten en complejos rojos de formazn insolubles por
las propiedades reductoras de las bacterias en crecimiento. En un medio para la prueba de movilidad que contiene tetrazolio, el desarrollo de este color rojo ayuda a seguir la diseminacin de la bacteria desde la lnea de inoculacin; sin embargo, estas sales pueden inhibir a ciertas bacterias exigentes y no pueden ser usadas en todos
los casos.
H2S'?
1. Liberacin de sulfuro de la cistena o el tiosulfato por

la accin de enzimas bacterianas.
2. Acoplamiento de sulfuro (S 2) con ion hidrgeno (W)
para formar H2S.
3. Deteccin de H2S por hierro, bismuto o plomo que
producen sulfuros de metales pesados que aparecen
como precipitados negros.
RECUADRO
4-7.
MEDIO DE PRUEBA DE MOV ILIDAD
(EDWARDS Y E WI NG)
Extracto de carne, 3 g
Agar, 4 g
Peptona, 10 g
Agua destilada, c.s.p. 1 L
Cloruro de sodio, 5 g
pH final 7,3
t.
Protocolos
1385
P rotocolo 1-3
P r u e b a d e l a c o a g u l a s a e n p o r t a o b j e t o s ( c o n t.)
pueden servir de control positivo y negativo, respectivamente. Cada frasco de plasma de conejo con EDTA reconstituido debe probar
se con cultivos de 18 a 24 horas de las cepas control.
IV. Procedimiento
1. Prueba en portaobjetos (coagulasa unida): colocar dos gotas de agua o solucin fisiolgica estriles dentro de dos crculos dibu
jados con un lpiz de cera en un portaobjetos de vidrio. Emulsificar suavemente material de colonias del microorganismo por
identificar en el lquido que se encuentra dentro de cada uno de los crculos. Agregar una gota de plasma para la prueba de la
coagulasa a la suspensin en uno de los crculos y mezclar con un palillo de madera. Colocar otra gota de agua o solucin fisio
lgica en el otro crculo, como control. Rotar el portaobjetos hacia adelante y atrs, buscando aglutinacin en la suspensin de
prueba.
2. Prueba en tubo (coagulasa libre): emulsificar una pequea cantidad de la colonia del microorganismo en un tubo que contenga
0,5 mL de plasma para la prueba de la coagulasa. Incubar el tubo a 35 C durante 4 horas y observar si se forma un cogulo incli
nando suavemente el tubo. Si en ese momento no se observan cogulos, reincubar el tubo a temperatura ambiente y leer otra vez
despus de 18 horas.
V. Resultados
A. Interpretacin
1. Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detectar dentro de los 10 a 15 segundos de mezclar el plasma con la suspensin
por la formacin de un precipitado blanco y la aglutinacin de los microorganismos de la suspensin. La prueba se considera nega
tiva si no se observa aglutinacin en el trmino de 2 minutos. El control con solucin fisiolgica debe permanecer uniforme y
lechoso. Si la suspensin control tambin se aglutina, la prueba no puede leerse. Todas las cepas coagulasa positivas pueden
informarse como Staphylococcus coagulasa positivo o, con menor precisin, como Staphylococcus aureus. Todas las cepas que
producen pruebas negativas en portaobjetos deben ser probadas mediante la prueba en tubo.
2. Prueba en tubo: la prueba de la coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier grado de formacin de cogulos.
El tubo debe inclinarse con suavidad y no agitarse, ya que la agitacin puede deshacer los cogulos parcialmente formados. Las
fibrinolisinas producidas por los microorganismos tambin pueden disolver los cogulos poco despus de su formacin. Los
tubos que son negativos despus de 4 horas deben incubarse a temperatura ambiente durante la noche y leerse despus de 18
horas.
P rotocolo 1-4
Prueba
d e l in d o l
I. Principio
El indol. un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que tienen la enzi
ma triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano. con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produc
cin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos, de particular utilidad en
la diferenciacin de Escherichia coli (positiva) de los miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter-Hajhia-Serratia (la mayora nega
tivas).
La prueba del indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehido del
p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el producto qumico activo de los reactivos de Kovac y de Ehrlich. Debe utilizarse un medio
rico en triptfano. En la prctica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para
motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato. Las pruebas rpidas en mancha, utilizando tiras de papel de filtro impreg
nadas con el reactivo p-dimetilaminocinnamaldehdo, son tiles para la deteccin sistemtica de bacterias que producen indol con
rapidez.
II. Medios y reactivos
A. Caldo triptfano (triptfano al 1%)
P e p to n a o d ig e rid o p a n c re tic o d e c a s e n a (trip tic a s a )
C lo ru ro d e s o d io
A g u a d e s tila d a
B. Reactivo de Kovac
A lc o h o l a m lic o o is o a m ilic o p u ro
p -d im e tila m ln o b e n z a ld e h d o
H C I c o n c e n tra d o
150 m L
10 g
50 mL
2 g
0 ,5 g
10 0 m L
1386
Protocolos
P rotocolo 1-4
P rueba
d e l in d o l
(cont.)
B. Reactivo de Ehrlich
p -d im e tila m in o b e n z a ld e h d o
A lc o h o l e tlic o a b s o lu to
H C I c o n c e n tra d o
2 g
19 0 m L
40 m L
III. Control de calidad

Cada lote nuevo de medios o de reactivos debe ensayarse con pruebas negativas y positivas para indol. Los siguientes microorganismos
son tiles como controles:
A. Control positivo: Escherichia coli.
B. Control negativo: Klebsiella pneumoniae.
IV. Procedimiento
Sembrar el caldo triptfano (u otros medios apropiados para indol) con el microorganismo por probar e incubar a 35 C durante 18 a
24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza
el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.
V. Resultados
A. Interpretacin
El desarrollo de un color rojo fucsia brillante en la interfaz del reactivo y del medio lquido (o de la capa de xilol) segundos despus
de agregar el reactivo indica la presencia de indol y constituye una prueba positiva (vanse lminas en color 6-4C y 7-2C).
VI. Bibliografa
Blazevic DJ, Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:63-67.
Isenberg HD, Sundheim LH. Indole reactions in bacteria. J Bacteriol 1958;75:682-690.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:173-183.
Miller JM, Wright JW. Spot ndole test: Evaluation o f four reagents. J Clin Microbiol 1982;15:589-592.
Vracko R, Sherries JC. Indole-spot test in bacteriology. Am J Clin Pathol 1963;39:429-432.
M E C A N IS M O D E LA R E A C C I N D E L IN D O L
CHO
H 20
B
N (C H 3)2
In dol
p -N ,N -d im e tila m n o
-b e n z a ld e h d o
C o m p u e s to q u in o id a l ro jo v io l c e o
d i[4 -(in d o l-3 -il-m e tile n )-2 ,5 c ic lo -h e x a d ie n -1 -ilid e n o ]-d im e tilsal a m n ic a
(R o s a -ro jo )
A gua
Protocolos
1393
P rotocolo 6-2
R e d u c c i n d e n i t r a t o s : a p l i c a c i o n e s g e n e r a l e s ( c o n t.)
V. Resultados
A. Interpretacin
El desarrollo de color rojo dentro de los 30 segundos despus de agregar los reactivos de prueba indica la presencia de nitritos y
representa una reaccin positiva para reduccin de nitratos (vase lmina en color 6-1H). Si no se observa color despus de agregar
los reactivos de prueba, esto puede indicar que no se han reducido los nitratos (reaccin realmente negativa) o que han sido reduci
dos a productos diferentes de los nitritos, como amonaco, nitrgeno molecular (denitrificacin), xido ntrico (NO) u xido nitro
so (N ,0 ) e hidroxilamina. Como los reactivos de prueba slo detectan nitritos, los ltimos procesos dan resultados falsos negativos.
Por lo tanto, es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de cinc a todas las reacciones negativas. Los iones cinc reducen
los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo despus de agregar el polvo de cinc indica la presencia de nitratos residuales
y confirma que la reaccin es verdaderamente negativa.
VI. Bibliografa
Finegold SM, Martin WJ. Scott EG. Bailey and Scotts Diagnostic Microbiology, 5a ed. St. Louis: Mosby, 1978:490.
MacFaddin JE Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:236-245.
Wallace GI, Neave SL. The nitrite test as applied to bacterial cultures. J Bacteriol 1927;14:377-384.
P rotocolo 6-3
R o jo
d e m e t il o
I. Principio
El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los cidos
es mucho msibajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriolgicos. Por lo tanto, para
provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de cido del sustrato de hidratos de car
bono que se utilice.
La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la produccin de cido, que requiere que los microorganismos positivos
produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) de la glucosa a travs de la va de fermentacin cida mixta (vase fig. 6-2). Como
muchas especies de la familia Enterobacteriaceae pueden producir suficientes cantidades de cidos fuertes que pueden detectarse
mediante el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubacin, slo los microorganismos que pueden mantener este
pH bajo despus de incubaciones prolongadas (48 a 72 horas), superando el sistema buffer del medio, pueden ser llamadas positivas
para rojo de metilo.
R E A C C I N D E L R O J O D E M E T IL O
C H 2O H
.
H /l
V\ O H
H Ol
OH
H
COOH
de E m b d e n -M y e rh o ff
V a d e c id o s
--------------------- c id o s m ix to s +
m ix to s
2 C 02
OH
a -D -g lu c o s a
O
2 H 3C C,
V a m e ta b lic a g lu c o ltlc a
c id o p ir v ic o
Ip H
D i x id o d e c a rb o n o
R o jo d e m e tilo ----------------------------------------------------------------------------------------------------- R ojo d e m e tilo

(A m a rillo )
(R o jo )
pH 6 ,0
pH 4 ,4 o m e n o r

El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR/VP) segn la frmula de Clark y Lubs.
Este medio tambin sirve para realizar la prueba de Voges-Proskauer.
1394
Protocolos
P rotocolo 6-3
R o jo
d e m e t il o
(cont.)
A. Caldo VP/RM
P o lip e p to n a
G lu c o s a
F o s fa to d ip o t s ic o
A g u a d e s tila d a , es p
pH fin a l = 6,9
III.
IV.
V.
VI.
79
5g
5g
1 L
B. Indicador de pH rojo de metilo.

Rojo de metilo, 0,1 g en 300 mL de alcohol etlico al 95%.
Agua destilada, 200 mL.
Control de calidad
Realizar controles positivos y negativos despus de la preparacin de cada lote de medio y luego de hacer cada lote de reactivos. Los
controles sugeridos son los siguientes:
A. Control positivo: Escherichia coli.
B. Control negativo: Enterobacter aerogenes.
Procedimiento
1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 C durante 48 a 72 horas (no
menos de 48 horas).
2. Finalizada la incubacin, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de fenol directamente al caldo.
Resultados
A. Interpretacin
El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente produccin de cido como para disminuir el pH a
4,4 y constituye una prueba positiva (vase lmina en color 6-4C). Como otros microorganismos pueden producir pequeas canti
dades de cido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prue
ba positiva.
Bibliografa
Barry AL. et al. Improved 18-hour methyl red test. Appl Microbiol 1970:20:866-870.
Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:75-77.
Clark WM. Lubs HA. The differentiation of bacteria of the colon-aerogenes family by the use o f indicators. J Infect Dis 1915; 17:160.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:209-214.
P rotocolo 6-4
P rueba
de
o g e s-P r o sk a u er
I. Principio
Voges-Proskauer es un epnimo doble, en honor de dos microbilogos que trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores
fueron los primeros en observar la reaccin de color rojo producida en medios de cultivo adecuados despus del tratamiento con hidr
xido de potasio. Luego se descubri que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil car
binol, producto de la va del butilenglicol.
El cido pirvico, el principal compuesto formado durante la degradacin fermentativa de la glucosa, se metaboliza ms tarde a tra
vs de diferentes vas metablicas, segn los sistemas enzimticos que tengan las diferentes bacterias. Una de esas vas da como resul
tado la produccin de acetona (acetil metil carbinol), un producto final de reaccin neutra. Los microorganismos del grupo KlebsiellaEnterobacter-Hafnia-Serratia producen acetona como producto metablico final principal del metabolismo de la glucosa y forman
cantidades pequeas de cidos mixtos. En presencia de oxgeno atmosfrico e hidrxido de potasio al 40%, la acetona se convierte a
diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.
Protocolos
1395
P ro tocolo 6-4
P r u e b a d e V o g e s - P r o s k a u e r ( c o n t.)
V a g lu c o ltic a
----------------------------------- 2 H 3C C
d e E m b d e n -M y e rh o ff
x COOH
. OH H
Va del
-
.O
HO C C
b u tile n g lic o l
2 C 02
"C H 3
CH3
OH
a -D -g lu c o s a
c id o p ir v ico
A c e to n a (A M C )
D i x id o d e c a rb o n o
04 -o f --- ^ ---- ^,C-<0 CH,

I
CH,
Xc '
on,
A c e to n a
D ia c e tilo
H3C ~ c f
ch3
NH
II
HN C N H 2
C o n d e n s a c i n
P ro d u c to ro s a a rojo
II
O
D ia c e tilo
G ru p o g u a n id in o
(a rg in in a )
C o lo ra n te

A. Medios
1. El medio es el caldo MR/VP descrito en el protocolo 6-3.
B. Reactivos
1. oc-naftol al 5%. intensificador de color
a -n a fto l
A lc o h o l e tlic o a b s o lu to
5 g
100 m L
2. Hidrxido de potasio al 40%, agente oxidante

H id r x id o d e p o ta s io
A g u a d e s tila d a e s p
40 g
100 m L

Deben hacerse controles negativos y positivos despus de la preparacin de cada lote de medio y de cada lote de reactivos. Los con
troles sugeridos son los siguientes:
A. Control positivo: Enterobacter aerogenes.
B. Control negativo: Escherichia coli.
IV. Procedimiento
Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar 24 horas a 35 C. Finalizada la incuba
cin, transferir 1 mL del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 mL de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 mL de KOH al 40%. Es
esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejar
el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
1396
Protocolos
P ro to c o lo 6-4
Prueba
de
V o g es-P r o sk a u er
(cont.)
V. Resultados
A. Interpretacin
El desarrollo de color rojo 15 minutos o ms despus del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el produc
to de oxidacin de la acetona, constituye una prueba positiva (vase lmina en color 6-4D). La prueba no debe leerse ms all de
una hora despus de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que
se puede interpretar como un positivo falso.
VI. Bibliografa
Barritt MM. The intensifcation of the Voges-Proskauer reaction by the addition of a-naftol. J Pathol Bacteriol 1936;42:441-454.
Barry AL, Feeney KL. Two quick methods for Voges-Proskauer test. Appl Microbiol 1967; 15:1138-1141.
Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley. 1975:105-107.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:308-320.
Voges O, Proskauer B. Beitrag zur Ernhrungsphysiologie und zur Differential-diagnose der Bakterien der hmorrhagischen
Septicaemia. Z Hyg 1898;28:20-32.
P rotocolo 6-5
t il iz a c i n d e l c it r a t o
I. Principio
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que se encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de
los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes distintas de la fermentacin de los
hidratos de carbono, con el citrato como nica fuente de carbono. La medicin de esta caracterstica es importante para identificar
muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilizacin del citrato por las bacterias que
se van a probar debe carecer de protenas e hidratos de carbono como fuente de carbono.
La utilizacin del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la produccin de subproductos alca
linos. El medio contiene citrato de sodio, que es un anin, como nica fuente de carbono, y fosfato de amonio como nica fuente de
nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amo
naco (NH+), lo que produce la alcalinizacin del medio por conversin del N H ;\ a hidrxido de amonio (NH4OH). El indicador es el
azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6.
P R U E B A D E L C IT R A T O
E nzim a
C itra to d e s o d io ------------- > - P ro d u c to s m e ta b lic o s a lc a lin o s - T p H
A z u l d e b ro m o tim o l ------------- A z u l d e b ro m o tim o l
(V erd e)
(A zu l)
pH 6 ,9
pH 7,6

El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la frmula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico
de flauta). La frmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:
Protocolos
1397
P rotocolo 6-5
t il iz a c i n d e l c it r a t o
(cont.)
F o s fa to d e a m o n io d ih id ro g e n a d o
F o s fa to d ip o t s ic o
C itra to d e s o d io
S u lfa to d e m a g n e s io
A gar
A zu l d e b ro m o tim o l
A g u a d e s tila d a c s p
pH fin a l = 6 ,9
1g
1g
5g
2g
0 ,2 0
15
0 ,0 8
1
g
g
g
L

Cada lote nuevo de medio debe ser probado con un microorganismo de reaccin positiva y uno de reaccin negativa. Las siguientes
especies son los controles sugeridos:
A. Control positivo: Enterobacter aerogenes.
B. Control negativo: Escherichia coli.
IV. Procedimiento
1. Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estra nica en
el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 C durante 24 a 48 horas.
V. Resultados
A. Interpretacin
La prueba positiva est representada por la produccin de color azul oscuro en el trmino de 24 a 48 horas, que indica que el micro
organismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formacin de productos alcalinos (vase lmi
na en color 6-4D). La prueba tambin puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estra de
siembra. Esto es vlido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debi haber ingresado en la fase logartmica
de crecimiento, lo que slo es posible si ha asimilado carbono y nitrgeno. Una interpretacin positiva basada en la lectura del trazo
se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas ms, momento en que habitualmente se produce el color azul.
VI. Bibliografa
BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: BioQuest, 1968:115,138.
Blazevic DJ. Ederer GM. Principies o f Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:15-18.
Koser SA. Utilization of the salts o f organic acids by the colon-aerogenes groups. J Bacteriol 1923;8:493-520.
MacFaddin JE. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:59-63.
Simmons JS. A culture mdium for differentiating organisms of typhoid-colon aerogenes groups and for isolation of certain fungi. J
Infect Dis 1926;39:209-214.
P rotocolo 6-6
Prueba
d e l a u r e a s a : c o n v e n c io n a l
I. Principio
La urea es una diamida del cido carbnico con la frmula
O
II
NH2 C NH,
Todas las amidas se hidrolizan fcilmente, con liberacin de amonaco y dixido de carbono.
La ureasa es una enzima que tienen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea segn la siguiente reaccin qu
mica
NH, + 2HOH
CO, + H ,0 + 2NH3 ; = (NH4)2CO}

Ureasa
1398
Protocolos
P ro tocolo 6-6
P rueba
d e l a u r e a s a : c o n v e n c io n a l
(cont.)
El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinizacin y aumento de pH del medio.
M E C A N IS M O D E L A R E A C C I N D E LA U R E A S A
/N H 2
U re a s a
I 'lil3
nh
C.
U re a
Agua
E n z im a
A m O n ia C U
U IO X IQ O
d e c a rb o n o
F e n o lfta le n a
A m o n a c o
-------------------
F e n o lfta le n a
(In c o lo ra )
(R o s a -ro jo )
pH < 8,1
pH > 8,1

Los dos medios utilizados con mayor frecuencia en los laboratorios clnicos para la deteccin de actividad ureasa son el caldo urea de
Stuart y el agar urea de Christensen.
C ALD O UREA DE STUART
E x tra c to d e le v a d u ra
F o s fa to m o n o p o t s ic o
F o s fa to d is d ic o
U rea
R o jo fe n o l
A g u a d e s tila d a e s p
pH fin a l = 6,8
A G A R U R E A D E C H R IS T E N S E N
0,1
9,1
9,5
20
0,01
1
g
g
g
g
g
L
P e p to n a
19
G lu c o s a
1g
5g
F o s fa to m o n o p o t s ic o
2g
U rea
20 g
R o jo fe n o l
0 ,0 1 2 g
A gar
15 g
A g u a d e s tila d a esp
1 L
pH fin a l = 6,8

Deben probarse microorganismos de reaccin positiva y negativa con cada nuevo lote de medio. Se sugieren los siguientes microorga
nismos:
A. Control positivo: especies de Proteus.
B. Control positivo (dbil): especies de Klebsiella.
C. Control negativo: Escherichia coli.
IV. Procedimiento
El medio lquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar; la superficie inclinada del agar (pico de flau
ta) se siembra en estra con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 C durante 18 a 24 horas.
V. Resultados
A. Interpretacin
Los microorganismos que hidrolizan la urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos
activas pueden requerir 3 das o ms. Las reacciones son las siguientes:
1. Caldo de Stuart
Un color rojo en todo el medio indica alcalinizacin e hidrlisis de la urea.
2. Agar de Christensen
Degradadores rpidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio.
Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo slo en el pico de flauta, que gradualmente se
extiende a todo el tubo.
3. Ausencia de hidrlisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original (vase lmina en color 6-4E).
Protocolos
1399
P rotocolo 6-6
P r u e b a d e l a u r e a s a : c o n v e n c i o n a l ( c o n t.)
VI. Bibliografa
BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: Bio-Quest, 1968:154.
Christensen WB. Urea decomposition as a means o f differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella
and Shigella types. J Bacteriol 1946;52:461-466.
MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:298-308.
Stuart CA, Van Stratum E, Rustigian R. Further studies on urease production by Proteus and related organisms. J Bacteriol
1945:49:437-444.
P rotocolo 6-7
e sc a r b o x il a s a s
I. Principio
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas con sustrato especfico capaces de reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los
aminocidos, para formar aminas de reaccin alcalina. Esta reaccin, conocida como descarboxilacin, forma dixido de carbono como
producto secundario. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido. Los tres aminocidos que se prueban habitualmente para
la identificacin de las Enterobacteriaceae son lisina, ornitina y arginina. Los productos animados especficos son los siguientes:
Lisina
>
cadaverina
Ornitina
>
putrescina
Arginina
->
citrulina
La conversin de arginina a citrulina es una reaccin de dihidrolasa y no de descarboxilasa, en la que un grupo NH, se elimina de la
arginina como primer paso. La citrulina se convierte a continuacin a ornitina. que a su vez se descarboxila para formar putrescina.
El medio para descarboxilasas de Moeller es la base utilizada con mayor frecuencia para determinar la capacidad de descarboxila
cin de Enterobacteriaceae. El aminocido por probar se agrega a la base de descarboxilasa antes de la siembra con el microorganis
mo en estudio. Tambin debe sembrarse en paralelo un tubo control, que contiene la base sin el aminocido agregado. Ambos tubos se
incuban en condiciones anaerobias, lo que se logra cubriendo la siembra con una capa de vaselina lquida. Al principio de la incuba
cin ambos tubos viran al amarillo, debido a la fermentacin de la pequea cantidad de glucosa que contiene el medio. Si el amino
cido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio vira nuevamente a su color prpura original.
M E C A N IS M O D E LA R E A C C I N D E
NH:
L IS IN A D E S C A R B O X IL A S A
H2N - C - H
U s in a
d e s c a rb o x ila s a
COOH
E n z im a
C a d a v e rin a
L -lisin a
P rp u ra d e
b ro m o c re s o l
D i x id o
d e c a rb o n o
C a d a v e rin a
- P rp u ra d e b ro m o c re s o l
(A m a rillo )
(P rp u ra -la v a n d a )
pH < 5,2
pH > 5,2
LMINAS EN COLOR 6-1
Id e n tific a c i n p re s u n tiv a de E nterobacteriaceae

La identificacin presuntiva de Enterobacteriaceae se basa en el aspecto de las colonias que crecen en los
m edios de aislamiento primario y en una evaluacin de ciertas reacciones bioqum icas. Por definicin, para
que un m icroorganism o sea clasificado como Enterobacteriaceae debe ferm entar la glucosa, produciendo
cido o cido y gas; reducir nitratos a nitritos y no m ostrar ninguna actividad de citocrom o oxidasa.
A. Tincin de Gram de un frotis de esputo que muestra los bacilos gramnegativos pletricos y cortos caracte
rsticos de los miem bros de Enterobacteriaceae. Tambin se m uestran dos leucocitos polimorfonucleares, lo
que sugiere un proceso infeccioso continuo en este paciente. En este caso el cultivo confirm que el m icro
organism o era K. pneumoniae.
B.
Cultivo m ixto que m uestra el crecim iento a las 24 horas en agar sangre de dos m orfotipos de bacilos gram
negativos grandes y un tercer m orfotipo de un m icroorganism o ms pequeo del que se puede sospechar que
es una especie grampositiva. Un m orfotipo se puede observar como colonias blancas, grandes y brillantes,
mientras que el otro aparece com o grandes colonias grises con bordes irregulares. Se puede sospechar que
ambos tipos de colonias contienen bacilos gramnegativos tpicos de los m iem bros de Enterobacteriaceae.
Tambin se presentan muchas colonias completas, blancas y pequeas, tpicas de uno de los cocos grampositivos.
C . Colonias rosadas, grandes, mucoides y brillantes en agar de MacConkey tpicas de muchas especies de
Klebsiella y Enterobacter. Slo sobre la base de su apariencia, se puede sospechar que estas colonias cons
tituyen una especie de Enterobacteriaceae.
D. Patrn en form a de enjam bre de una cepa mvil de especie de Proteus en una placa de agar chocolate.
E.
Serie de tubos con agar hierro de Kigler (KIA) en pico de flauta (agar inclinado) que m uestra varios patro
nes de reaccin. El tubo del extremo izquierdo ilustra una porcin inclinada cida (amarilla) y un extremo
cido (am arillo), lo que indica tanto ferm entacin de glucosa com o de lactosa. Tambin obsrvese el espa
cio en la parte inferior del tubo y la divisin en el agar en el medio del tubo que indica la produccin de gas
( C 0 2) por parte del microorganismo. Las cantidades abundantes de C 0 2, com o se observan aqu, suelen ser
producidas slo por m icroorganismos pertenecientes a la tribu V ( Klebsielleae ). El segundo tubo desde la
izquierda ilustra una reaccin acida/cida pero sin presencia de gas, tpica del tipo de reaccin que se ve con
E. coli. El tercer tubo de la izquierda m uestra un agar inclinado alcalino (rojo)/profundidad cida caracte
rsticos de un no ferm entador de lactosa. El cuarto tubo ilustra un agar inclinado rojo/profundidad negra, que
indica la produccin de sulfuro de hidrgeno (H,S). Cuando se observa este tipo de reaccin con un m icro
organismo oxidasa negativo, se presum e que la porcin profunda del tubo es cida (amarillo), lo que indica
ferm entacin de glucosa aun cuando el color am arillo est enm ascarado debido a la produccin de H,S. La
reaccin en el quinto tubo (extremo derecho) rojo/rojo es tpica de los bacilos gramnegativos no fermentadores que no ferm entan lactosa ni glucosa.
F.
Tres tubos de m edios de cultivo violeta que contienen tubos de Durham para dem ostrar la form acin de gas.
Los dos tubos de la derecha m uestran cido a partir de glucosa (color amarillo), com parados con el control
negativo de la izquierda. El tubo del extremo derecho muestra la coleccin de gas dentro del tubo de
Durham, caracterstica de un m icroorganismo que produce tanto cido com o gas a partir de glucosa.
G. Prueba de citocrom o oxidasa que muestra una reaccin color violeta positiva ( izquierda) com parada con una
reaccin negativa (derecha: no se observ ningn color azul dentro de los 10 segundos; vase protocolo 1-5).
Cualquier m icroorganismo que da una reaccin positiva puede ser excluido de la familia Enterobacteriaceae.
H.
M edios de prueba de nitrato que contienen tubos de Durham para dem ostrar la formacin de gas nitrgeno.
E l tubo de la izquierda m uestra una reaccin positiva (roja) despus del agregado de a-naftilam ina y cido
sulfnico. El m icroorganism o de prueba ha reducido los nitratos en el medio a nitritos, los cuales reaccio
naron con los reactivos para form ar el pigm ento rojo p-sulfobenceno-azo-a-naftilam ina (vase protocolo
6-2). El tubo del medio tam bin m uestra una reaccin de nitrato positiva, pero en este caso todo el nitrato
fue reducido prim ero a nitrito y luego reducido a su vez a gas nitrgeno, indicado por la coleccin de gas
dentro del tubo de Durham. Como no hay nitrito en el tubo, no hay color rojo cuando se agregan reactivos.
El tubo del extremo derecho no muestra ningn color rojo ni gas y muestra una prueba negativa para la
reduccin de nitrato.
LMINAS EN COLOR 6-2
A s p e c t o d e l a s c o l o n i a s d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e e n a g a r e s d e M a c C o n k e y y E M B
El agar de MacConkey y el agar eosina azul de metileno (EMB) son dos medios de aislamiento primario de
uso frecuente para la diferenciacin presuntiva de los miembros de Enterobacteriaceae fermentadores y no
fermentadores de lactosa. En agar de MacConkey, las colonias que fermentan la lactosa aparecen rojas debi
do a la conversin cida del indicador, el rojo neutro. En agar EMB, los fermentadores vidos de lactosa
producen un brillo metlico verde cuando la produccin del cido es suficiente como para reducir el pH
hasta aproximadamente 4,5 o menos.
A. Superficie de agar de MacConkey con crecimiento de 24 horas de colonias rojas, fermentadoras de lactosa.
El color rojo difuso en el agar que rodea las colonias es causado por microorganismos que fermentan con
avidez la lactosa, con produccin de grandes cantidades de cidos mixtos y precipitacin de las sales bilia
res en el medio (p. ej., Escherichia coli).
B. Superficie de agar de MacConkey que muestra tanto colonias rojas, fermentadoras de lactosa, como colo
nias claras ms pequeas, que no fermentan la lactosa.
C y D. Superficie de placas de agar EMB que muestran el brillo verde producido por los miembros de
Enterobacteriaceae vidos fermentadores de lactosa (o sacarosa). La mayora de las cepas de E. coli pro
ducen colonias con este aspecto de agar EMB y, como E. coli se encuentra entre las cepas ms frecuentes
de muestras clnicas, el aspecto de estas colonias puede servir a menudo para su identificacin presuntiva.
Sin embargo, se deben evaluar las caractersticas distintas de la produccin de un brillo verde en EMB antes
de poder identificar en forma definida a un microorganismo como E. coli, ya que otras enterobacterias que
fermentan la lactosa pueden tener un aspecto similar.
E y F. Superficie de placas de agar EMB que muestran un cultivo mixto de E. coli (colonias brillantes verdes) y
especies de Shigella. La mayora de las especies de Shigella no fermentan lactosa y, por lo tanto, producen
colonias semitranslcidas y no pigmentadas en agar EMB. Otras especies incapaces de fermentar lactosa
producen colonias de aspecto similar a las ilustradas en estas fotografas.
LMINAS EN COLOR 6-4
C a r a c t e r s t i c a s d i f e r e n c i a l e s d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e
A. Prueba de ono-nitrofenil-(3-D-galactopiransido (ONPG) que muestra una reaccin positiva (amarilla)

(izquierda) comparada con el control negativo (derecha). Una reaccin positiva indica que el microorganis
mo es capaz de producir P-galactosidasa, enzima requerida para la degradacin inicial de lactosa, liberando
el orfo-nitrofenol de color amarillo.
B. Tubo de agar semislido SIM (sulfuro indol motilidad) (derecha) y de agar hierro de Kligler (KIA) en pico
de flauta" (izquierda), que muestra las diferencias en sensibilidad para detectar sulfuro de hidrgeno (H,S)
por los diferentes medios. El delicado ennegrecimiento difuso en el tubo SIM es producido por un micro
organismo mvil productor dbil de H,S (en este caso S. typhi). Obsrvese que el H,S producido en el tubo
KIA menos sensible aparece slo en el medio del tubo, en la interfaz del agar inclinado y la profundidad,
tpico de S. typhi en este medio.
C y D. Cuatro tubos en los que se realizaron las pruebas de indol (I), rojo de metilo (RM), Voges-Proskauer (VP)
y citrato (C). Cuando estas cuatro pruebas se realizan juntas constituyen las reacciones IMViC clsicas. La
formacin de indol a partir del triptfano est indicada por un color rojo con el agregado de reactivo de
Kovac (tubo de la extrema izquierda, panel C). El desarrollo de un color rojo en el tubo de RM seala una
cada en el pH hasta 4,4 o ms bajo, que indica fermentadores fuertes de cidos mixtos (segundo tubo desde
la izquierda, panel C). Un color rojo en el tubo VP indica la presencia de acetona (acetilmetilcarbinol) for
mada a partir del piruvato en la va metablica del butilenglicol (tercer tubo desde la izquierda, panel D).
El crecimiento en el pico de flauta del agar citrato de Simmon y la conversin del indicador de azul de bromotimol a un color azul alcalino indica que el microorganismo puede utilizar citrato de sodio como nica
fuente de carbono (tubo ms a la derecha, panel D). C muestra las reacciones para E. coli (+ + ). El panel
D muestra las reacciones para Klebsiella/Enterobacter ( + +).
E. Los dos tubos de la izquierda muestran reacciones de fenilalalina desaminasa negativa (amarillo claro) y
positiva (verde oscuro). El color verde es producido por la reaccin entre el reactivo FeCl3 y el cido fenilpirvico en el medio, resultante de la desaminacin de fenilalanina (vase protocolo 6-8). Los tres tubos de
la derecha son los picos de flauta del agar urea de Christensen. El tercero desde la derecha muestra una reac
cin positiva fuerte (color rojo en todo el medio, que indica una reaccin alcalina por la degradacin de la
urea), comparado con el control negativo de la extrema derecha (color totalmente amarillo). La reaccin en
el segundo tubo desde la derecha (color rojo slo en el agar inclinado) es producida por microorganismos
como especies de Klebsiella y algunas especies de Enterobacter que son productores dbiles de ureasa.
F.
Cuatro tubos que contienen medio de descarboxilasa de M0ller cubierto con una capa de vaselina para lograr
un medioambiente anaerobio (vase protocolo 6-7). De izquierda a derecha: tubo de control de crecimien
to desprovisto de aminocidos (el crecimiento est indicado por la conversin a un color amarillo debido a
la fermentacin de glucosa en el medio), arginina, lisina y ornitina. El indicador violeta de bromocresol es
amarillo a un pH cido y violeta a un pH alcalino. Por lo tanto, cualquier tubo que aparezca violeta indica
un pH alcalino, reaccin producida por los microorganismos que pueden descarboxilar el aminocido con
tenido en el medio. El microorganismo que se muestra aqu es arginina negativo y ornitina positivo y es la
reaccin tpica observada con E. aerogenes.
G. El agar lisina hierro (LIA) se utiliza para diferenciar los microorganismos entricos sobre la base de su capa
cidad para descarboxilar o desaminar lisina y formar H,S. Los microorganismos que descarboxilan la lisina
producen una reaccin alcalina (violeta) en el extremo del tubo (tubo intermedio). Los microorganismos que
desaminan la lisina producen un agar inclinado rojo sobre una profundidad cida (amarilla) (tubo ms a la
izquierda). Las bacterias que generan H S producen ennegrecimiento del medio principalmente en el centro
y la profundidad del tubo (tambin se observa en el tubo del extremo izquierdo). El tubo del extremo izquier
do es lisina desaminasa positivo y lisina descarboxilasa negativo. El tubo intermedio es lisina desaminasa
negativo y lisina descarboxilasa positivo. El tubo del extremo derecho es negativo tanto para lisina desami
nasa como para lisina descarboxilasa. (Profundidad rojiza pero no amarilla).
H. Tubos de medio de motilidad. Los microorganismos mviles muestran un crecimiento difuso lejos de la
lnea de inoculacin (tubo de la izquierda)', los microorganismos inmviles slo muestran crecimiento a lo
largo de la lnea de corte (tubo de la derecha). Tambin se encuentra disponible un medio de motilidad al
que se agrega cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). El crecimiento de microorganismos capaces de redu
cir el TTC aparece rojo a lo largo de la lnea de corte y en el rea a la que han migrado las clulas, lo que
facilita la diferenciacin entre bacterias mviles e inmviles (vase lmina en color 7-1E). (Fotografa cor
tesa de Health and Education Resources, Bethesda, MD).

Pruebas Bioquimicas Enterobacterias

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ENTEROBACTERIACEAE

4-2), lo cual indica que el microorganismo es capaz de

La identificacin definitiva de ls miembros de Enterobacteriaceae puede requerir una batera de pruebas

Citocromo oxidasa negativa (vase lmina color 4-1 G).

tos de carbono que resulten en productos finales cidos.

Fructosa 1,6 difosfato

cido frmico - - - - Acetil -CoA

cido succnico - - Acetaldehdo

Acetil-meti lcarb inol

holes, y slo se produce una pequea cantidad de cido;

(6) cido pirvico

Fermentacin cido mixta

(2) cido lctico

Acetil metil carbinol

Diacetilo KOH + aire

pH < 4,4 convierte al

Fig. 4-2. Vas cido mixta y butilengliclica de fermentaci11 de la glucosa.

Fig. 4-3. Fermentacin bacteriana de la lactosa: la lactosa,

Pared celu lar

manipulacin bastante ingeniosa de una molcula forma

ACTIVIDAD CITOCROMO OXIDASA

Una variedad de diferentes medios lquidos o con agar

, sacarosa a glucosa es de 10: 1 en el medio TSI). Esta re- iY/ .;)

Los principios bioqumicos en los que se basan' las

Superficie inclinada alcalina / profundidad alcalina

Superficie incli nada

Superficie inclinada cida /

AGAR HIERRO DE KLIGLER

Sulfato ferroso, 0,2 g

la superficie inclinada; y entre las 18 y las 24 horas, la

que Yersinia enterocolitica.fermenta la sacarosa, pero no

QUMICOS Y COMPUESTOS USADOS

En 1905, MacConkeyl 94 describi por primera vez un

4-1. MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES PARA LA RECUPERACIN

El agar MacConkey es un medio

Los fermentadores fuertes de la

El agar EMB es un medio de plaqueo diferencial que puede ser

Las colonias de los fermentadores de la,ctosa fuertes tpicos,

Agar eosina azul de metileno (EMB)

Frmula de Holt-Harris Teague modificada. Agar EMB Levine no contiene sacarosa.

Agar Hektoen entrico

El agar SS es un medio altamente Cualquier colonia fermentadora de

12 g El agar HE es una formulacin re- Los fermentadores rpidos de lacPeptona

Agar xilosa li sina

3,5 g El agar XLD es menos inhibidor

mentadoras de lactosa. Se incluy sacarosa en el medio

MEDIOS DE AISLAMIENTO ALTAMENTE SELECTIVOS

Los medios se hacen altamente selectivos mediante el

RECUADRO 4-4. SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO

l. Inocular la muestra directamente en placas de agar

MacConkey o EMB para aislamiento primario de todas

Para muestras distintas de heces o hi sopados rectales,

El indo] es uno de los productos de degradacin del

En la figura 4-2 se ilustra un esquema simplificado que

RECUADRO 4-5. PRUEBAS USADAS PARA MEDIR LAS

Utilizacin de hidratos de carbono

Agar sulfuro-indol-movil idad

Agar movilidad-indol-orn itina

mosfrico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo

final de la prueba de Ko'Ser era la presencia o Ja ausencia

saber que en un tiempo las ms important~ s decisiones

Muchas especies de bacterias poseen enzimas que

MEDIO PARA LA DETECCIN DE SULFURO DE HIDRGENO