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Itajub / MG
2008
Itajub / MG
2008
Agradecimentos
A Deus, que mais uma vez permaneceu ao meu lado me dando fora e sade para vencer
todos os obstculos surgidos.
Aos meus pais, Araci Augusto e Diva, pelo esforo contnuo para que eu pudesse ir busca
da realizao de um sonho.
Aos meus filhos, Victor Augusto e Arthur, demonstrando uma maturidade incomum s suas
idades.
Ao meu irmo Fbio Nogueira, exemplo de garra e sabedoria.
Ao professor Dr. lvaro Antnio Alencar de Queiroz, exemplo de competncia, amizade e
acima de tudo, paixo pela cincia.
Ao professor Dr. Demtrio Arthur Werner, por ter acreditado em mim, pela pacincia,
pelos conhecimentos transmitidos e pela co-orientao.
Ao professor Dr. cio pelo incentivo, amizade e pelos ensinamentos.
Ao professor Dr. Luiz Francisco Pontin pela amizade, pacincia, incentivo e pelas
contribuies.
profesora Dra. Ana Cludia pelas colaboraes, amizade e pelos conselhos.
professora Dra.Maria Helena e seu esposo professor Dr. Filiberto, pela amizade e
confiana.
Aos demais professores que de alguma forma contriburam para o meu desenvolvimento
cientfico.
Aos tcnicos de laboratrio Glauber e Kal, por sempre me fornecerem todas as
ferramentas necessrias para o desenvolvimento de meu trabalho e pela amizade.
Sumrio
i
SUMRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
ix
Lista de Abreviaturas
Resumo
xii
Abstract
xiv
Introduo
1.1 Introduo
12
14
15
16
18
1.5 Referncias
19
22
22
24
25
27
28
28
Sumrio
ii
29
33
36
37
2.7.1.1 Adsoro
37
37
2.7.1.3 Microencapsulamento
37
2.7.1.4 Eletropolimerizao
37
38
38
38
40
41
48
48
49
51
53
2.11 Referncias
54
58
58
61
64
66
67
i
i
i
i
Sumrio
iii
70
3.7 Referncias
71
73
73
74
75
4.3.1 As Polianilinas
77
80
83
4.5 Referncias
84
88
88
89
92
96
98
100
101
5.8 Referncias
102
105
106
7.1 Reagentes
106
7.2 Sntese dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID e preparo dos bioconjugados
106
109
7.4 Referncias
113
i
i
i
i
i
i
Sumrio
iv
115
115
119
121
130
138
145
8.7 Referncias
151
Captulo 9 Concluses
154
156
i
v
i
v
Lista de figuras
Lista de Figuras
Figura 1.1 - Representao de um biossensor: biocatalizador
6
8
10
11
Figura 1.7 (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b).
(B) Estrutura fsica de um MOSFET
13
14
15
16
18
26
Figura 2.2 - Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu substrato
28
29
30
Figura 2.5 - Representao esquemtica do mecanismo para a reao catalisada pelo on Metlico
31
32
Figura 2.7 - Representao de uma catlise covalente. Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His, ROH, RSH
33
Figura 2.8 - Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima
34
35
36
40
41
Lista de figuras
vi
42
43
46
47
48
49
51
52
59
60
61
62
63
Figura 3.6 Nmero de publicaes na rea de dendrimeros nos timos dez anos
64
67
67
68
69
70
73
77
78
79
81
83
90
92
93
94
95
96
97
99
Figura 7.1 Esquema das arquiteturas dendrticas; CHD, PGLD e PPID, respectivamente
107
Figura 7.2 Ilustrao do processo de imobilizao das enzimas GOx, CHD e urease nos dendrmeros
108
Lista de figuras
vii
Figura 7.3 Ilustrao do biossensor preparado neste trabalho atravs da tcnica de imobilizao
fsica dos bioconjugados nos nanotubos de polianilina
110
Figura 7.4 Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterizao do
dispositivo biossensor
Figura 7.5 Ilustrao da configurao da rede neural artificial utilizada neste trabalho
111
113
Figura 8.1 Vista lateral e frontal da configurao atmica de uma seo de um nanotubo de
carbono. A estrutura cristalina deste tubo particular denotada como (7, 7)
115
118
121
Figura 8.4 A relao entre a corrente resposta e o potencial dos biossensores PGLD (A),
CHD (B) e PPID (C) em NaPBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de Glicose: 20 mM
122
Figura 8.5 Curva de corrente-tempo para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C),
a 300 mV, pH 7,4 e 37 oC, em soluo de glicose de 20 mM
123
Figura 8.6 A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose para os biossensores
PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS e pH 7,4 a 37 oC
125
126
129
130
131
133
Figura 8.12 A relao entre corrente resposta para o PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) eletrodos enzimticos e concentrao de colesterol
de 0,1 M PBS, pH 7.02 a 37 oC e 0,8 V
134
136
Lista de figuras
viii
137
138
Figura 8.16 A relao entre corrente resposta e o potencial para os biossensores PGLD (A),
CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS, pH 7,02 e 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM
140
Figura 8.17 Dependncia do tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM
141
Figura 8.18 A relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C) e a concentrao de uria em 0,1 M PBS, pH 7,02 a 37 oC e 0,6 V
142
143
Figura 8.20 Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para uria medida para
os biossensores de uria baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B)
e PPID (C). As barras verticais representam a divergncia medida em
trs sensores diferentes. Quando no em uso, os sensores foram
armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC
145
Figura 8.21 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de glicose. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y = 1,023 (+0,014) [Glicose] - 0,335 (+0,177), R= 0,999
149
Figura 8.22 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de colesterol. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y =0,943 (+ 0,025) [Colesterol] 0,02452 (+ 0,0159), R = 0,997
150
Figura 8.23 Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA
para as concentraes de uria. Ajuste pelo mtodo dos quadrados mnimos:
Y = 0,998 (+ 0,008) [Uria] 0,500 (+ 0,0190), R = 0,999
151
Lista de tabelas
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1.1 Alguns eletrodos enzimticos utilizados em determinaes analticas
23
Tabela 2.2 Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular
25
91
91
117
Tabela 8.2 Caractersticas fsico-qumicas caractersticas do PPID, CHD e PGLD sintetizados neste trabalho
120
Tabela 8.3 Parmetros cinticos eletroqumico para a GOx imobilizada em dendrmeros bioconjugados
127
Tabela 8.4 Parmetros cinticos eletroqumico para a CHO imobilizada em dendrmeros bioconjugados
135
Tabela 8.5 Parmetros cinticos eletroqumico para a urease imobilizada em dendrmeros bioconjugados
144
Tabela 8.6 Concentraes das solues dos hemometablitos glicose, uria e colesterol
para treinamento da rede neural
147
Tabela 8.7 Erro obtido durante o teste da rede neural para os hemometablitos colesterol,
glicose e uria em ensaios in vitro
148
Lista de abreviaturas
Lista de Abreviaturas
ISFET- trasnsistores de efeito de campo on-seletivos
MOSFET- transistor de efeito de campo metal-xido semicondutor
ENFET- Enzyme-field effect transistor
G- nmero de gerao
PGLD- poliglicerol dendrtico
PPID- poli(propileno imina) dendrtico
CHD- quitosana dendrtico
Unifei- Universidade federal de Itajub
ICP- polmeros intrinsecamente condutores
PANI- polianilina
CTC- complexo de transferncia de carga
Lista de abreviaturas
xi
Resumo
xii
Resumo
Hoje em dia, os dendrmeros representam um interessante e promissor material orgnico
sendo usado em desenvolvimento de novos materiais para a indstria farmacutica, tais como
sistemas de liberao de drogas e, mais recentemente, como propriedades sensoras para protenas
e hemometablitos. As propriedades intrnsecas dos dendrmeros como a monodispersividade,
elevados grupos funcionais perifricos em macromolculas e boas propriedades biocompatveis
destas nanopartculas, tem conduzido para sua difuso e usados em uma variedade de aplicaes
na medicina e biotecnologia. Neste trabalho foram desenvolvidos biossensores de glicose,
colesterol e uria baseados em poliglicerol bioconjugado (PGLD), poli(propileno imina) (PPID) e
dendrmeros de quitosana (CHD). Os dendrmeros PGLD, PPID e CHD foram bioconjugados
com as enzimas glicose oxidase (GOx), colesterol oxidase (COx) e urease para obter dendrmeros
com propriedades sensoras de glicose, colesterol e uria. Os dendrmeros bioconjugados PGLD,
PPID e CHD foram atrados em nanotubos de polianilina (PANINTs) durante polimerizao
eletroqumica template de anilina. Os PANINTs foram usados como mediadores de eltrons,
devido sua alta habilidade para promover as reaes de transferncia de eltrons, envolvendo
catlise enzimtica. A resposta de corrente observada em enzimas transformadas na interface do
eletrodo demonstrou que nanotubos de polianilina so eficientes mediadores para desenvolver
biossensores. As respostas de corrente para as propriedades dos hemometablitos glicose,
colesterol e uria bioconjugados com PGLD, PPID e CHD, e GOx, COx e urease, ocorreram s
tenses de 400 mV, 700 mV e 600 mV, respectivamente. Foi obtido que a corrente resposta para
os bioconjugados PGLD, PPID e CHD facilmente atinge o estado de saturao. Os resultados
correspondentes corrente de saturao mais acentuada para o biossensor de PGLD do que para
os bioconjugados CHD e PPID. A constante aparente de MichaelisMenten (KappM) d indicaes
da cintica enzima-substrato para os bioconjugados PPID, CHD e PGLD e foi calculada a partir
da equao eletroqumica de LineweaverBurk. O biossensor baseado em PGLD, PPID e CHD
mostrou uma boa performance em concentraes de interesse clnico de glicose, colesterol e
uria. A afinidade enzimtica para o substrato (KappM), indica que a atividade cataltica enzimtica
decai na ordem PGLD>CHD>PPID. O resultado mostra que o PGLD aparenta ser um candidato
bastante promissor para o desenvolvimento de biossensores de alta performance, em comparao
com os dendrmeros CHD e PPID. Uma rede neural artificial, tipo Back-Propagation com trs
Resumo
xiii
camadas de neurnios, foi treinada e aplicada, predizendo a quantia dos hemometablitos glicose,
colesterol e uria atravs da resposta de corrente dos biossenssores desenvolvidos. A rede neural
desenvolvida para determinao de hemometablitos mostrou-se ser eficiente em ambas fases, de
treinamento e teste, respectivamente.
Abstract
xiv
Abstract
Today, dendrimers represent a promising and interesting organic material being used in
developing new materials for pharmaceutical industry such as drug delivery systems and more
recently, intelligent materials with sensing properties to proteins and haemometabolites. The
intrinsic properties of dendrimers like as monodispersity, highly functional groups at
macromolecule periphery and good biocompatible properties of these nanoparticles has led to
their widespread use in a variety of applications in medicine and biotechnology. In this work
glucose, cholesterol and urea biosensors based on bioconjugated polyglycerol (PGLD),
poly(propylene imine) (PPID) and chitosan dendrimers (CHD) were developed. The dendrimers
PGLD, PPID and CHD were bioconjugated with the enzymes glucose oxidase (GOx), cholesterol
oxidase (COx) and urease to obtain dendrimers with glucose, cholesterol and urea sensing
properties. The bioconjugated PGLD, PPID and CHD dendrimers were entrapped in polyaniline
nanotubes (PANINTs) during template electrochemical polymerization of aniline. PANINTs
were used as electron mediator due to their high ability to promote electron-transfer reactions
involving enzyme catalysis. The current response observed in enzymes transformations at
electrodes interfaces demonstrated that polyaniline nanotubes are an efficient mediator for
biosensors design. The response current properties to haemometabolites glucose, cholesterol and
urea of PGLD, PPID and CHD bioconjugated with GOx, COx and urease occurs at 400 mV, 700
mV and 600 mV, respectively. It was found that the response current of the PGLD, PPID and
CHD bioconjugates easily reaches to steady state. The results about the current saturation peak
for the PGLD biosensors are meaningfully higher than CHD and PPID bioconjugates. The
apparent MichaelisMenten constant (KappM), which gives an indication of the enzymesubstrate
kinetics for the PPID, CHD and PGLD bioconjugates were calculated from the electrochemical
LineweaverBurk equation. The based PGLD, PPID and CHD biosensors showed a good
performance in glucose, cholesterol and urea concentrations of clinical interest. The enzyme
affinity for the substrate (KMapp) indicate that the enzyme catalytic activity declines in the
crescent order PGLD>CHD>PPID. The results show that PGLD appears to be a very promising
candidate for development of high-performance biosensors relatively to the CHD and PPID
dendrimers. An artificial neural network Back-Propagation type with three layers of neurons was
trained, and applied, in predicting the amount of haemometabolites glucose, cholesterol and urea
Abstract
xv
in relation to the current response of developed biosensors. The neural network developed for
determining the haemometabolites was shown to be efficient in both, training phase and the test,
respectively.
Introduo
Introduo
O aumento da longevidade humana visto ao longo do ltimo sculo, fez com que um
grande nmero de indivduos viesse a atingir uma idade crtica para o desenvolvimento de
inmeras doenas. Consequentemente, como resultado da maior longevidade humana h o
aparecimento de morbidades relacionadas ao envelhecimento, como: hipercolesterolemia,
hiperglicemia e elevao nos nveis de uria no sangue.
A hipercolesterolemia um importante fator de risco cardiovascular porque o colesterol
exerce efeito pr-oxidante que leva ao aumento na produo de radicais livres, os quais tm
importante papel na gnese da aterosclerose. A hiperglicemia, caracterizada pelo excesso de
acar no sangue, uma disfuno causada pela falta de insulina, pela diminuio na produo
ou ainda pela incapacidade de exercer suas funes. J o excesso de uria no sangue, um
indicativo forte de que o indivduo possue doenas renais e hepticas.
Tendo em vista a problemtica acima mencionada, verifica-se a importncia do controle
dos nveis de glicose, colesterol e uria no fluido sanguneo, uma vez que estes esto sujeitos a
flutuaes contnuas. As consequncias do descontrole dos nveis de glicose, colesterol e uria
so diabetes melito, infarto do miocrdio, amputao de membros inferiores, hemodilise, perda
da viso dentre outras. Surge ento a necessidade de se criar um dispositivo que monitore
diariamente os nveis destes hemometablitos simultaneamente.
A aplicao ideal de um biossensor multienzimtico seria a produo de um dispositivo
implantvel para monitoramento contnuo dos metablitos. Este dispositivo estaria conectado a
um microprocessador de controle de um sistema de liberao de frmacos pela pele, que
controlaria os nveis de glicose, colesterol e uria.
A evoluo dos mecanismos utilizados na monitorao de hemometablitos, seu
funcionamento e suas aplicaes so apresentados no captulo 1. Como pode ser observado neste
captulo, os biossensores amperomtricos so ainda os mais pesquisados em funo de suas
caractersticas nicas, tais como transferncia direta de eltrons entre a enzima e a superfcie do
eletrodo trabalhando a baixos potenciais.
Uma vez que as enzimas so os biocatalizadores responsveis pela gerao do sinal no
transdutor, o captulo 2 trata da natureza qumica das enzimas, suas classificaes, grupos aos
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
Introduo
quais pertencem e aponta os mecanismos das reaes catalisadas por estes compostos, vantagens
e desvantagens. apresentando ainda neste captulo os modelos para os mecanismos de catlise
enzimtica bem como os fatores que influenciam a atividade do biocatalizador. As tcnicas de
imobilizao fsicas e qumicas das enzimas tambm so tratadas neste captulo. Um outro fator
que deve ser levado em considerao a cintica da enzima; neste intuito a equao
eletroqumica de Michaelis-Menten foi estudada e sua linearizao foi feita a partir do grfico de
Lineweaver-Burk. Para finalizar o captulo, uma abordagem do uso das enzimas glicose oxidase,
colesterol oxidase e urease estudadas nesta dissertao no emprego de biossensores e seus
mecanismos foram relatados.
As enzimas para serem imobilizadas, necessitam de um suporte ideal, com este intuito,
estruturas altamente ramificadas, com peso molecular uniforme e com elevada concentrao de
grupos funcionais em suas periferias foram estudadas no captulo 3. Macromolculas dendrticas
de poliglicerol (PGLD), quitosana (CHD) e poli(propileno imina) foram sintetizados, purificados
e caracterizados anteriormente pelo grupo de biomateriais da Unifei. O captulo 3 aborda
essencialmente algumas caractersticas destas macromolculas.
Uma das principais preocupaes na construo de biossensores amperomtricos a
velocidade de transferncia de eltrons do stio ativo da enzima para a superfcie do eletrodo o
qual transmite o sinal para o sistema que ir converter o sinal da reao biolgica em um sinal
eltrico. O captulo 4 trata dos mediadores de eltrons mais utilizados, em especial a polianilina
(PANI) que um polmero condutor. Os polmeros intrinsecamente condutores podem combinar
as propriedades mecnicas e a processabilidade dos polmeros convencionais com um
comportamento eltrico, tico e/ou mecnico semelhantes ao de metais e semicondutores
inorgnicos.
Houve a necessidade de um sistema que pudesse tratar estatisticamente os dados das
reaes das concentraes dos substratos em relao aos picos de corrente gerados pela reao
enzima/ substrato. No captulo 5, um sistema inteligente denominado Rede Neural, foi utilizado
com o intuito de distinguir os valores das concentraes dos hemometablitos: uria, colesterol e
glicose. tratado neste captulo as aplicaes das redes neurais, seus mecanismos de
funcionamento e sua evoluo no decorrer do tempo. Um paralelo entre a rede neural utilizada e a
rede neural natural (do crebro humano), foi traado; afinal a rede neural foi projetada a partir do
Introduo
que h pacientes que necessitam de monitoramento dirio dos nveis desses hemometablitos,
como por exemplo, os pacientes diabticos.
(b)
(c)
(d)
Figura 1.2 Eletrodo de oxignio de Clark. A) Eletrodo de trabalho Pt, B) eletrodo de referncia
Ag/AgCl, C) eletrlito semi-saturado de KCl, D) membrana de Teflon, E) anel de borracha para
fixao, F) fonte de tenso para polarizao e G) instrumento para medio da corrente de sada.9
Enzima
Espcie monitorada
Glicose
Glicose oxidase
Pt(H2O2)/O2
Uria
Urease
NH3/NH4
cido rico
Uricase
O2
lcool
lcool oxidase
O2
L-tirosina
Tirosina descarboxilase
CO2
Oxalato
Oxalato oxidase
O2
Salicilato
Salicilato hidroxilase
O2
Creatinina
Creatininase
NH3
Ascorbato
Ascorbato oxidase
O2
L-lisina
lisina descarboxilase
CO2
Accar
Pt(H2O2)/O2
Lactato
Lactato dehidrogenase
O2
Penicilina
Penicilinase
Ph
450
400
350
Biossensor
amperomtrico
Biosensor ptico
300
250
Biosensor
calorimtrico
Biosensor
potenciomtrico
200
150
100
50
0
08
20
06
20
04
20
02
20
00
20
98
19
Anos
Figura 1.3 Grfico comparativo para os tipos de biossensores mais estudados. Fonte: Scielo.
I = 4 FAD
p
d
(1.1)
10
11
12
pois a relao entre a quantidade de substrato e o sinal gerado varia linearmente de acordo com a
equao 1.2.19
I = nFAva
(1.2)
E = E0 +
RT
ln([i])
zF
(1.3)
13
corrente entre a fonte e o dreno do ISFET. A Figura 1.4 ilustra a estrutura de um ISFET em
comparao a um MOSFET.
(A)
(B)
Figura 1.7- (A) Estrutura de um MOSFET (a) em comparao com um ISFET (b). (B) Estrutura
fsica de um MOSFET.9-23
14
Campo Enzimticos), ilustrado na Figura 1.5. Neste caso a reao catalizada pela enzima que
altera o potencial do meio, sendo esta alterao proporcional concentrao do analito.24
A vantagem desses dispositivos a possibilidade do uso da microeletrnica na sua
produo, possibilitando a confeco em larga escala. Em contra partida, a principal desvantagem
a dificuldade de isolamento do FET do meio reacional, o que pode influenciar o desempenho do
biossensor.22
Figura 1.8- Montagem de um ENFET. (A) Substrato de Silcio, (B) Dopagem e formao de
xido, (C) Deposio da membrana on-seletiva e (D) imobilizao da enzima e
membrana protetora.9
1.3.3- Biossensores pticos
Biossensores pticos baseiam-se na determinao das mudanas de absoro entre os
reagentes e produtos da reao, ou na medida da sada de luz por um processo luminescente.25 A
forma mais comum envolve o uso de tiras colorimtricas, as quais, contm enzimas oxi-redutoras
e um cromgeno. O produto gerado na reao entre a enzima e o analito (na maioria das vezes
H2O2), oxida o cromognio. A absorvncia do composto formado proporcional concentrao
do analito a ser determinada.
O uso mais comum de biossensores pticos o controle do diabetes pela determinao do
nvel de glicose no sangue usando-se as enzimas glicose oxidase (GOx) e peroxidase (POx),
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
15
juntamente com o composto que no obsorve luz na regio visvel. O perxido de hidrognio
(H2O2) resultante da oxidao da glicose pela GOx, na presena da POx, oxida o composto sem
absorvncia no visvel em um composto colorido. A avaliao das tiras tingidas feita pelo uso
de medidores portteis de reflectncia ou pela comparao com uma cartilha colorida
previamente elaborada.
A Figura 1.5 ilustra um biossensor ptico comercial de ltima gerao. O paciente pode
acompanhar a concentrao dos hemometablitos de interesse analisando a cor da lente e
comparando esta resposta com uma tabela de cores do estojo, para verificar a qualquer hora do
dia a concentrao dos hemometablitos.
f =
k p f 2 m
A
16
(1.4)
17
(enzima) imobilizado temperatura constante. Tal medida efetuada atravs de termistores, que
so semicondutores sensveis temperatura.33
Os termistores, usados para detectar a mudana de temperatura funcionam variando sua
resistncia eltrica com a temperatura, obedecendo relao:
B
R1
= e T T
R2
1
(1.5)
18
19
1.8- Referncias
[1] BURTIS, C. A.; ASHWOOD, E. R. Tietz: Fundamentos de Qumica Clnica. 4 ed. Rio de
Janeiro: Guanabara, 1998, 836 p.
[2] THVENOT, D.R.; TOTH, K.; DURST, R.A.; WILSON. G.S. Electrochemical Biosensors:
Recommended Definitions and Classification. Disponvel em <www.iupac.org/reports/1999/
7112thevenot/> Acessado em 05 jan. 2008.
[3] KARUBE, I.; OMURA, Y. Enzyme sensors for environmental analysis. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic, n. 10, p. 177-181, 2000.
[4] WILSON, G.S.; GIFFORD, R. Biosensor for real-time in vivo measurements. Biosensors
and Bioeletronics, n. 20, p. 2388-2403, 2005.
[5] PALMER, E. Sensing things to come. Disponvel em <http://www.chemsoc.org/chembytes/
ezine/1998/palmer.htm> Acessado em 21 mar. 2008.
[6] CLARK, L.C.Jr.; LION, C. Annals of the New York Academy of Sciences, n. 29, p. 102-123,
1968.
[7] RICHARDSON, N.J.; GARDNER, S.; RAWSON, D.M. A chemically mediated
amperometric biosensor of monitoring eubacterial respiration. Journal of applied bacteriology,
n. 70, p. 422-426, 1991.
[8] RAHMAN, M.A; PARK, D.S; CHANG, S.C; MCNEIL, C.J; SHIM, Y.B. The biosensor
based on the pyruvate oxidase modified conducting polymer for phosphate ions determinations.
Biosensors and Bioeletronics, n. 21, p.1116-1124, 2006.
20
21
Calorimetric
Biosensors.
Disponvel
em
<http://www.Isbu.ac.uk/biology/enztech/
22
23
Enzima (E)
Produto (P)
24
stio ativo ficam em regies distantes, na seqncia primria, mas prximos no stio ativo, pelo
enovelamento de cadeia polipeptdica (estrutura terciria).
Algumas enzimas tm outra regio na molcula, o stio alostrico, afastada do stio ativo.
No stio alostrico molculas pequenas especficas se ligam e causam alteraes na conformao
protica que afetam o stio ativo, aumentando ou reduzindo a atividade enzimtica.
A maioria das enzimas necessita de molculas orgnicas ou inorgnicas pequenas,
essenciais sua atividade e denominadas coenzimas e co-fatores.
25
Tabela 2.2- Classificao das enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia
Molecular (IUBMB).4
1.
2.
Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e
Transaminases)
2.1 grupo com um carbono
2.2 grupos aldedo ou acetona
2.3 grupos acil
2.4 grupos glicosil
2.5 grupos fosfatos
2.6 grupos contendo enxofre
3.
4.
5.
6.
Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas prexistentes, sempre s custas de energia Sintetases)
6.1 C-O
6.2 C-S
6.3 C-N
6.4 C-C
26
27
28
Figura 2.2 - Modelo chave-fechadura. A interao entre a enzima (com estrutura rgida) e seu
substrato.7
2.4.2- Modelo do encaixe induzido
Em 1958, Daniel Koshland sugeriu uma modificao ao modelo de chave-fechadura: uma
vez que as enzimas exibem estruturas flexveis, os stios ativos alteram a sua forma de maneira
continuada atravs de interaes com o substrato, enquanto esse mesmo substrato vai interagindo
com a enzima.8 Como resultado, o substrato no se liga simplesmente a um stio ativo que
rgido. As cadeias laterais dos aminocidos que formam os stios ativos sofrem uma reorientao
de maneira a que as suas posies potenciem a ao cataltica da enzima. Em alguns casos, como
nas glicosidases, a molcula de substrato tambm sofre alteraes de conformao medida que
vai se aproximando do stio ativo.9 O stio ativo continua a sofrer modificaes at que o
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
29
substrato esteja completamente ligado e neste momento em que a conformao final e a carga
so determinadas.10 A Figura 2.3 ilustra o modelo encaixe-induzido descrito por Daniel
Koshland.
Figura 2.3- Modelo do encaixe induzido. A ligao do substrato enzima induz uma mudana
conformacional na enzima produzindo um melhor encaixe.8
2.5- Mecanismos catalticos 11
As reaes qumicas envolvidas na transformao dos substratos variam com os
mecanismos de ao das enzimas. Os principais tipos de mecanismos catalticos que as enzimas
utilizam so: (i) efeitos de proximidade e orientao, (ii) catlise eletrosttica, (iii) catlise cidobsica e (iv) catlise covalente.
(i) Efeitos de proximidade e orientao
Os substratos se aproximam dos grupos funcionais catalticos da enzima em uma
orientao espacial apropriada para que a reao possa ocorrer. Aps o correto posicionamento
do substrato, uma modificao na conformao da enzima resulta em um complexo enzimasubstrato orientado. Essa orientao leva o complexo enzima-substrato ao estado de transio,
como pode ser visto na Figura 2.4.
30
31
32
SEM CATALISADOR
COM CATALISADOR
33
Figura 2.7- Representao de uma catlise covalente. Onde X = RCOO-, RNH2, ArOH, His,
ROH, RSH.13
34
Figura 2.8- Efeito da temperatura sobre a velocidade de uma reao catalisada por enzima.15
35
anlises
clnicas
as
condies
ideais
para
anlise
so
similares
36
37
2.7.1.3 Microencapsulamento
Nesta tcnica, as enzimas esto envolvidas por membranas semipermeveis que permitem
a passagem de molculas de substrato e produto, mas no da enzima; so de forma esfrica com
tamanhos entre 1 a 100 micrometros de dimetro.21 A enzima e um monmero hidroflico so
misturados em soluo aquosa e adicionados em solvente orgnico insolvel em gua. Com a
adio de monmero hidrofbico, se inicia a reao de polimerizao, levando formao de
microesferas.24 Com este mtodo pode-se encapsular simultaneamente uma grande variedade de
enzimas, o que faz com que reaes que se sucedem em mltiplas etapas possam ser levadas a
cabo. Os principais tipos de membranas utilizadas so: Teflon, Nafion, colgeno acetato de
celulose e policarbonato.
2.7.1.4 Eletropolimerizao
No mtodo da imobilizao enzimtica por eletropolimerizao, um monmero em
soluo contendo a enzima, ao se polimerizar pela ao de um potencial eltrico, sofre deposio
na superfcie do eletrodo aprisionando simultaneamente a enzima. O monmero eletricamente
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
38
26
27
(a
enzima pode ser misturada a uma pasta consistindo de p de grafite e um leo e a pasta pode ser
misturada a diferentes componentes) e em polmeros (a enzima pode ser adicionada a um
monmero, em soluo aquosa, e este ser quimicamente polimerizado junto com a enzima). A
enzima tambm pode ser imobilizada dentro de matrizes slidas porosas.28
39
silanizao (Pt, vidro, quartzo), reao com carboimidas (amidas, nylon, grafite) e glutaraldedo
(aminas).29-30
Para tal mtodo, faz-se necessrio conhecer a densidade de grupos funcionais por unidade
de superfcie, j que este condiciona o nmero de unies enzima-substrato bem como prev a
posio da enzima na superfcie do eletrodo. O processo de imobilizao pode alterar a estrutura
do centro ativo inativando total ou parcialmente a enzima.
Geralmente os suportes polimricos insolveis para o acoplamento qumico de enzimas
contm grupos funcionais que aps ativao podem imobilizar o composto bioativo via um grupo
funcional especfico. Os principais grupos funcionais de suportes polimricos insolveis
utilizados no processo de imobilizao enzimtica so: hidroxilas (-OH), carbonilas (C=O),
carboxilas (CO(OH)) e aminas primrias (NH2).
Os grupos funcionais podem ser ativados quimicamente para imobilizao da enzima via
seu grupo NH2 funcional, mantendo a atividade enzimtica em nveis adequados para o
desenvolvimento de biossensores.
Cada suporte contendo um grupo funcional requer uma ativao especfica como pode ser
verificado na Figura 2.11.
(i) Hidroxilas
Suportes contendo hidroxilas podem ser ativados pela reao com cloreto cianrico e este se ligar
enzima por meio da reao entre o seu grupo funcional hidroxila e o grupo funcional amina da
enzima.
(ii) Carbonilas
Suportes ricos em grupos funcionais carbonlicos podem sofrer um processo de silanizao para
posterior complexao com glutaraldedo possibilitando, assim, reaes com as aminas
enzimticas.
(iii) Carboxilas
Suportes contendo carboxilas podem ser ativados com carbodiiminas e estas servirem de
complexo de ligao s enzimas.
(iv) Aminas primrias
Os suportes que contm grupos funcionais amina podem ser ativados pelo glutaraldedo que se
liga s enzimas pela reao entre os grupos funcionais aminas primrias e carbonilas.
40
Figura 2.11- Ligao covalente da enzima (com agrupamento amina) na superfcie do eletrodo.
(A) Complexao com cloreto cianrico, (B) ligao covalente por silanizao,
(C) complexao com carbodiimina e (D) glutaraldedo.22
41
42
43
at alcanar um valor de [S] em que no existe variao significativa no valor de V0. Este valor
de V0 muito prximo da velocidade mxima, Vmx.
E + S ES
k 1
(2.1)
ES E + P
k 2
(2.2)
44
A velocidade da reao enzimtica limitada pela segunda reao, uma vez que esta
ocorre mais lentamente. Sendo assim, a velocidade da reao deve ser proporcional a [ES]. A
relao entre [S] e V0 possui a mesma forma geral para todas as enzimas.
Segundo Michaelis e Menten a forma matemtica desta relao, foi descrita considerando
a hiptese bsica de que, no estado estacionrio, a velocidade da reao limitada pela quebra do
complexo ES. Esta relao, denominada equao de Michaelis-Menten, a equao da
velocidade de uma reao enzimtica com um nico substrato, e dada pela relao a seguir:
V0 =
Vmx [ S ]
km + [S ]
(2.3)
km =
(k1 + k2 )
k1
(2.4)
V0 =
Vmx
2
(2.5)
(2.6)
45
(2.7)
Deste modo, Km pode ser definido como sendo a concentrao de substrato quando V0
equivale a 1/2 Vmx. Logo, a equao de Michaelis-Menten pode ser linearizada
matematicamente, de modo a permitir a determinao experimental de km e Vmx atravs de
mtodos grficos. Uma simples transformao a inverso da equao, da seguinte forma:
1 K m + [S ]
=
V0 Vmx [ S ]
(2.8)
(2.9)
A equao de Lineweaver-Burk obtida atravs da linearizao da equao de MichaelisMenten que permite obter experimentalmente os valores de km e Vmx, atravs de uma curva 1/V0
versus 1/[S], como ilustrado na Figura 2.15.
46
47
48
Figura 2.17- Ilustrao da estrutura da enzima glicose oxidase, na forma de fitas. O FAD est
representado pela regio vermelha.38
Em virtude da sua elevada especificidade, a glicose oxidase, utilizada como elemento
biocataltico para se medir os nveis de acar no sangue, seja atravs de testes colorimtricos ou
sensoriais.25-39
49
50
A colesterol oxidase (COx) pode ser sintetizada atravs de uma grande variedade de
microorganismos,
em
ambientes
completamente
distintos.
Algumas
linhagens
de
51
52
53
54
2.11- Referncias
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55
56
57
58
59
60
monodispersas, com elevado peso molecular, elevada rea superficial e tamanho nanomrico, ao
contrrio dos polmeros lineares. Este tipo de molcula possui superfcies e interfaces altamente
controladas e apresenta cavidades internas, o que permite, por exemplo, o encapsulamento de
molculas hospedeiras bioativas.4-5
(A)
61
(B)
62
No entanto, esta sntese encontrou problemas na reduo dos grupos nitrilos. Assim o
processo s podia ser repetido duas vezes, por isso s dava aminas disubstitudas, e o rendimento
era muito baixo.
Tomalia sintetizou pela primeira vez dendrmeros
14
63
iniciador, e que se juntava a uma segunda molcula linear, produzindo assim os ramos do
dendrmero.15
Esta bsica aproximao teve resultado na criao de uma nova classe de arquitetura
polimrica, os monmeros. Estes, por sua vez, esto ligados entre eles e os ramos ligados
concentricamente a uma simples molcula (ncleo iniciador), criando assim, uma estrutura em
trs dimenses, que em geraes muito altas, devido s interaes entre os ramos, podem ser
esfricas.
A partir desta primeira sntese acidental, Tomalia ajustou as propriedades de sntese,
usando duas operaes repetidamente, utilizando como ncleo iniciador uma molcula de
amnia. A esta molcula de amnia foi adicionado metanol suficiente para facilitar a substituio
dos hidrognios da amnia pelo acrilato de metila, e assim criar um dendrmero de gerao zero.
Em seguida adicionou-se o segundo monmero, que respectivamente etileno diamina, que ataca
livremente as trs molculas do monmero adicionado anteriormente, obtendo-se assim o
dendrmero de 1 gerao. Depois os dois hidrognios do azoto do etileno diamina so
substitudos novamente pelo acrilato de metila, obtendo-se um dendrmero de 2 gerao. E assim
sucessivamente at se obter o dendrmero pretendido, ou de gerao pretendida, como mostra a
Figura 3.5.
64
1200
Nmero de publicaes
1000
800
Nmero de
publicaes
600
400
200
0
1998
2000
2002 2004
Ano
2006
2008
Figura 3.6- Nmero de publicaes na rea de dendrimeros nos timos dez anos. Fonte: Scielo.
65
gerao (em geral, a partir da gerao 4), a viscosidade volta a diminuir, de tal forma que os
dendrmeros de gerao mais alta apresentam mais grupos terminais, porm menor viscosidade
que os dendrmeros de gerao mais baixa. Este comportamento diferente dos polmeros
lineares. Afinal, para polmeros clssicos a viscosidade intrnseca aumenta continuamente com a
massa molecular.
(iii) O nmero de grupos funcionais na superfcie da macromolcula determina a gerao
do dendrmero.
(iv) A presena de muitas cadeias terminais responsvel por uma alta solubilidade,
micibilidade e reatividade dos dendrmeros. A sua solubilidade fortemente influenciada pela
natureza dos grupos da superfcie. Os dendrmeros terminais em grupos hidroflicos so solveis
em solventes polares enquanto os dendrmeros terminais com grupos hidrofbicos so solveis
em solventes apolares.
(v) A massa molar, M, dos dendrmeros pode ser descrita pela seguinte relao
matemtica:
nG 1
+ M t nmG
M = M C + nC M m m
nm 1
(3.1)
(3.2)
66
de peso molecular muito elevado so pouco solveis e, por isso, geralmente no possvel
utiliz-los no revestimento de superfcies sintticas.
(viii) A capacidade de encapsulamento de molculas na macromolcula interior uma das
propriedades nicas que os dendrmeros apresentam devido a sua forma globular e a presena de
cavidades internas.
67
grupo reativo a sntese pode ser continuada por reao com uma segunda unidade de repetio. A
repetio do ciclo de reao leva construo de grandes dendrons. A reao dos dendrons
desprotegidos com grupos reativos de um ncleo terminal constitui o dendrmero final.19-24
Embora a formao de defeitos no dendrmero seja minimizada na rota sinttica
convergente e a purificao do produto final seja mais fcil relativamente rota sinttica
divergente, o impedimento estrico, causado pelos grupos volumosos na periferia do dendrmero,
impede a obteno de sistemas de elevadas geraes.24
68
69
70
71
3.7- Referncias
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M.L.C.;
MONTANARI,
C.A.;
PIL-VELOSO,
D.
Sistemas
73
enzimas oxidorredutases
como as desidrogenases
e as oxidases
so
biocatalizadores que catalisam reaes de transferncia de eltrons, ou seja, reaes de oxireduo tal como ilustrado na Figura 4.1.
74
75
eletrocataliticamente oxidadas em eletrodos de grafite modificados com tetraciano-pquinodimetanotetrahidro-fulvaleno e 1,1-dimetilferroceno16. Derivados de rutnio (III)17-18
tambm foram empregados em algumas determinaes voltamtricas como mediadores de
eltrons na deteco de tiis incluindo a glutationa. Outros sistemas mediadores de eltrons
frequentemente utilizados so o ferricianeto de potssio e ferricianeto de sdio.
76
77
Figura 4.2- Estudo comparativo entre os valores de condutividade eltrica, (S/ cm), de
materiais polimricos dopados com os de materiais convencionais.33
O poliacetileno ainda constitui o polmero que tem alcanado os mais elevados valores
de condutividade, igualando-se aos do cobre (105 S/cm). No entanto, pela instabilidade
trmica e ambiental, alm da m processabilidade do mesmo, decorrente da sua insolubilidade
e infusibilidade, outros polmeros condutores tm sido extensivamente investigados com o
objetivo de superar tais dificuldades.34 Por este motivo, a polianilina e polmeros derivados da
anilina tm recebido grande ateno nos ltimos anos pela sua estabilidade qumica
condies ambientais, fcil obteno e baixo custo de produo.32 Alm disso, a polianilina
atingiu recentemente condutividade da ordem de 104 S/cm para um polmero de alta massa
molar orientado uniaxialmente.
4.3.1- As Polianilinas
As polianilinas representam uma classe de polmeros, cuja composio qumica na
forma de base (no dopada) dada por uma frmula geral como segue na Figura 4.3.
78
79
80
heterojunes
so
particularmente
interessantes
para
projeto
de
de biossensores
81
82
Aps o contato, o diagrama de bandas passa ser ilustrado pela Figura 4.5 (b),
considerando-se que, no equilbrio, os nveis de Fermi de ambos os materiais devem se
alinhar, promovendo um encurvamento no diagrama de banda de conduo prximo
interface, enquanto que, distante da juno, as propriedades de cada um dos materiais so
mantidas. O diagrama de banda do metal se mantm inalterado, tanto na interface como
distante da juno. A fim de alinhar os nveis de Fermi, do metal e do semicondutor, eltrons
devem ser transferidos do semicondutor para o metal, deixando doadores ionizados no
semicondutor.
Para uma melhor compreenso da Figura 4.5 (b), pode-se observar que a funo
trabalho do metal maior do que a funo trabalho do semicondutor, e o nvel de Fermi do
semicondutor, antes do contato, so mais alto do que o do metal. A diferena de potencial
Vbi = ( m s )
denominada potencial de contato e corresponde diferena entre a funo trabalho do metal
e do semicondutor, representando o valor do encurvamento
total da banda de conduo no equilbrio. A altura da barreira de potencial
q B = q( m )
entre o metal e o semicondutor, comumente chamada de barreira Schottky, apresentada no
caso ideal, pela diferena entre a funo trabalho do metal e a afinidade eletrnica q do
semicondutor.
O espaamento entre os estados energticos criados pela proximidade dos tomos no
slido depende do nmero de estados presentes; quanto maior o nmero de estados, mais
prximo esto os nveis eletrnicos permitidos. Portanto, no caso dos slidos, os nveis
energticos esto to prximos que mais conveniente ignorar a existncia de nveis discretos
e pensar em termos de uma banda contnua dos nveis de energias permitidos.
Este trabalho utilizou nanotubos de polianilina PANI que ao passar por um processo
de dopagem apresentam caractersticas de um semicondutor, obedecendo ao comportamento
ilustrado pela Figura 4.5. Os nanotubos de PANI foram utilizados no processo de mediao de
eltrons na interface dendrmero bioconjugado/eletrodo. Estes nanotubos foram sintetizados
pelo grupo de biomateriais da Unifei e utilizados em dispositivos biossensores. Os resultados
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
83
84
85
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ferrocene
86
[25] POPE, M.; SWENBERG, C. E. Electronic process in organic crystals and polymers.
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[26] AKCELRUD, L. Prog. Pol. Sci. p.875, 2003.
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Metals, v. 126, p. 151-158, 2002.
87
88
89
deciso fornece alertas e lembretes aos clnicos, interpretao de dados e diagnstico de doenas,
sugesto de manejo de pacientes e protocolos clnicos. A ativao do apoio deciso feita a
partir de cada aplicativo, mas tambm pode ser disparada automaticamente medida que um
conjunto de dados clnicos est sendo digitado no registro computadorizado do paciente.2
A partir da dcada de 90 consolidam-se as redes neurais como parte integrante do estudo
da Inteligncia Artificial propriamente dita. Reconhece-se, tambm, que os paradigmas biolgico
e psicolgico so complementares e necessrios para sistemas mais evoludos. Desta forma,
comeam nesta dcada a serem construdos os chamados Sistemas Hbridos. Estes sistemas
permitem a construo de grandes sistemas que abrangem uma forma mais completa de
representao do comportamento humano atravs da prpria Inteligncia Artificial.2
As redes neurais artificiais tm suas razes nas reas da neurocincia, matemtica,
estatstica, fsica, cincia da computao e engenharia. Suas aplicaes podem ser encontradas
em campos to diversos quanto modelagem, anlise de sries temporais, reconhecimento de
padres, processamento de sinais e controle;4 alm disso, tem sido recentemente introduzida no
campo da cincia dos materiais.5-6 As redes neurais, em geral, so modelos estatsticos flexveis
utilizados para a resoluo de problemas no-lineares de alta complexidade.7
5.2 Paralelo entre Redes Neurais Artificiais e Redes Neurais Naturais 4
Ao longo do processo evolucionrio, o homem desenvolveu seu crebro, sua inteligncia,
sua capacidade de raciocnio, a linguagem e outras habilidades bem mais poderosas e complexas
do que qualquer outra espcie. Isso quer dizer que o homem atingiu certo nvel de conhecimento
o que fundamental para a sua sobrevivncia, assim como para qualquer animal.
O crebro humano considerado o mais admirvel processador baseado em carbono
existente, sendo composto por aproximadamente 10 bilhes de neurnios. Todas as funes e
movimentos do organismo esto relacionados ao funcionamento destas pequenas clulas. Os
neurnios esto conectados uns aos outros atravs de sinapses, e juntos formam uma grande rede,
chamada Rede Neural. As sinapses transmitem estmulos atravs de diferentes concentraes de
sdio (Na+) e potssio (K+), e o resultado disto pode se alargar por todo o corpo humano. Esta
grande rede proporciona uma fabulosa capacidade de processamento e armazenamento de
informao.8-9
90
91
Crebro
Computador
Material
Orgnico
Metal e plstico
Velocidade
Milisegundos
Nanosegundos
Tipo de Processamento
Paralelo
Sequencial
Controle de Processos
Distribudo
Centralizado
11
14
10 a 10
10.000
105 a 106
<10
O mesmo paralelo pode ser traado comparando o computador com as redes neurais (ver
Tabela 5.2). Para tanto, a comparao no se dar com um computador especfico encontrado no
mercado, mas sim com o paradigma predominante nos computadores atuais.
92
Neurocomputadores
Executa programas
Aprende
Depende do modelo ou do
programador
Testa uma hiptese por vez
Muitos outros artigos e livros surgiram desde ento, porm, por um longo perodo de
tempo, pouco resultado foi obtido. At que em 1949, Donald Hebb escreveu um livro entitulado
"The Organization of Behavior" (A Organizao do Comportamento) que perseguia a idia de
que o condicionamento psicolgico clssico est presente em qualquer parte dos animais pelo
93
fato de que esta uma propriedade de neurnios individuais. Suas idias no eram
completamente novas, mas Hebb foi o primeiro a propor uma lei de aprendizagem especifica para
as sinpses dos neurnios. Este primeiro e corajoso passo serviu de inspirao para que muitos
outros pesquisadores perseguissem a mesma idia. E embora muito tenha sido estudado e
publicado nos anos que seguiram (1940-1950), estes serviram mais como base para
desenvolvimento posterior que para o prprio desenvolvimento.
Tambm proveniente deste perodo de tempo foi a construo do primeiro neuro
computador, denominado Snark, por Mavin Minsky, em 1951. O Snark operava com sucesso a
partir de um ponto de partida tcnico, ajustando seus pesos automaticamente, entretanto, ele
nunca executou qualquer funo de processamento de informao interessante, mas serviu de
inspirao para as idias de estruturas que o sucederam.
Em 1956 no "Darthmouth College" nasceram os dois paradigmas da Inteligncia
Artificial, a simblica e o conexionista. A Inteligncia Artificial Simblica tenta simular o
comportamento inteligente humano desconsiderando os mecanismos responsveis por tal. J a
Inteligncia Artificial Conexionista acredita que construindo um sistema que simule a estrutura
do crebro, este sistema apresentar inteligncia, ou seja, ser capaz de aprender, assimilar, errar
e aprender com seus erros.
O primeiro neuro computador a obter sucesso (Mark I Perceptron) surgiu em 1957 e 1958,
criado por Frank Rosenblatt, Charles Wightman e outros. Devido profundidade de seus estudos,
suas contribuies tcnicas e de sua maneira moderna de pensar, muitos o vem como o fundador
da neuro computao na forma em que a temos hoje. Seu interesse inicial para a criao do
Perceptron era o reconhecimento de padres. A Figura 5.3 ilustra a rede de perceptrons proposta
por Rosemblatt.
94
95
96
Figura 5.5- Estrutura do mtodo Backpropagation; (a) camada de sada; (b) camada escondida;
(c) camada de entrada.8
O algoritmo de retropropagao do erro (error backpropagation ou simplesmente
backpropagation) um algoritmo utilizado em perceptrons de mltiplas camadas e utiliza funes
de transferncia diferenciveis e no-lineares em um treinamento supervisionado. A
aprendizagem por backpropagation consiste, basicamente, em dois passos: um passo para frente,
que a propagao, e um passo para trs, a retropropagao. No passo para frente, um vetor
apresentado aos ns de entrada da rede e seu efeito se propaga atravs desta, da esquerda para a
direita e de camada em camada. Um conjunto de sadas produzido como resposta da rede.
Durante este processo, os pesos sinpticos da rede so todos fixos. A resposta da rede
subtrada da resposta desejada e, ento, determina-se o sinal de erro. Este sinal de erro
propagado para trs atravs da rede, contra a direo das conexes sinpticas. Os pesos so ento
ajustados de modo a se minimizar o sinal de erro. Na figura 5.6 tem-se a representao dos sinais
de entrada, tambm conhecidos como sinais funcionais e de erro em um perceptron de mltiplas
camadas.
97
98
A Figura 5.6 mostra uma rede neural de trs camadas, onde: X =vetor de dados de
entrada; Wi(m) a matriz de valores de peso associados a cada entrada i e a cada camada m; Fi(m)
a funo de transferncia sigmoidal de cada unidade, associada camada m.
F (h b) =
1
h b ) / 2
(
1+ e
(5.1)
sendo: bi(m) = unidades bias; d = sada desejada da rede para cada entrada; y = sada fornecida
pela rede neural para cada entrada.
A entrada para um dado neurnio i, com seus pesos correspondentes de uma certa camada
m, definida como:
m
m
m
m
m
hi( ) = wi( ) x( ) = kM=1 wik( ) .x( )
(5.2)
(5.3)
sendo y(m) = X(m+1) ou seja, a entrada da prxima camada a sada da camada anterior. Existe um
vetor de sadas y para cada vetor de entradas X. Os pesos w e bias b so atualizados para cada
clula, at obter-se o critrio de parada do treinamento (erro aceitvel alcanado). A RNA
99
empregada utilizou o mtodo de treinamento Backpropagation que realiza a busca por um erro
aceitvel.
Este erro dado por:
Ep
2
d y)
(
=
(5.4)
100
deste neurnio. Em seguida, essa mesma etapa se realiza com os demais neurnios da rede. Isso
quer dizer que os neurnios vo enfrentar algum tipo de ativao, dependendo das entradas e dos
pesos sinpticos (ver Figura 5.7).
101
(ii) No-supervisionado; neste tipo, a rede neural trabalha os dados de forma a determinar
algumas propriedades do conjunto de dados. A partir destas propriedades que o aprendizado
constitudo;
(iii) Hbrido; neste tipo ocorre uma juno dos tipos supervisionado e no-supervisionado. Assim,
uma camada pode trabalhar com um tipo enquanto outra camada trabalha com o outro tipo.
O algoritmo utilizado neste trabalho como j mencionado, foi o Backpropagation, sendo o
aprendizado supervisionado, ou seja, a entrada e sada desejadas para a rede so fornecidas por
um supervisor externo. O objetivo , atravs de um mecanismo de correo de erros, ajustar os
parmetros (pesos) da rede, de forma a encontrar uma ligao entre os pares de entrada e sada
fornecidos. O treinamento ocorre em duas fases, onde cada fase percorre a rede em um sentido.
Estas duas fases so chamadas de forward e backward. A fase forward utilizada para definir a
sada da rede para um dado padro de entrada. A fase backward utiliza a sada desejada e a sada
fornecida pela rede para atualizar os pesos de suas conexes a cada iterao.
5.6- Dificuldades encontradas
A modelagem de uma rede neural depende da anlise consistente de um sistema muitas
vezes complexo, implicando em dificuldades para definir qual arquitetura melhor responde s
necessidades do problema proposto e na escolha de quais dados so verdadeiramente relevantes
para o processamento. Alm da entrada, tambm devemos definir de forma ideal os parmetros
de aprendizagem, os pesos sinpticos e os nveis de bias, os quais so de severa importncia para
o processo de aprendizado.
Outra dificuldade encontrada seria a extrao de regras justificativas da deciso tomada
pela rede, as quais representariam o conhecimento adquirido durante o treinamento.
Contudo, pesquisadores vm tentando minimizar as dificuldades da implementao das
redes neurais atravs de algoritmos extratores de regras e o uso de sistemas hbridos,
combinando, por exemplo, uma rede neural com algoritmos genticos, para que se possa otimizar
a definio das taxas de aprendizado, pesos sinpticos e nveis de bias, ou ento utilizando
algoritmos que faam extrao de regras lgicas.
102
103
desejada. A maioria dos mtodos de aprendizado para RNAs do tipo Perceptron de mltiplas
camadas utilizam variaes deste algortmo.19-20-21
O algoritmo Backpropagation supervisionado, ou seja, a entrada e sada desejadas para a
rede so fornecidas por um supervisor externo. O objetivo , atravs de um mecanismo de
correo de erros, ajustar os parmetros (pesos) da rede, de forma a encontrar uma ligao entre
os pares de entrada e sada fornecidos. O treinamento ocorre em duas fases, onde cada fase
percorre a rede em um sentido. Estas duas fases so chamadas de forward e backward. A fase
forward utilizada para definir a sada da rede para um dado padro de entrada. A fase backward
utiliza a sada desejada e a sada fornecida pela rede para atualizar os pesos de suas conexes a
cada iterao.19-20-21
5.8 Referncias
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/renato/papers/checkup-18.htm> Acessado em 24 mar.2008.
[2] COIERA, E.W. Inteligncia Artificial na Medicina Disponvel em <http://dfm.ffclrp.
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[3] GONGORA, A.D. O Que Inteligncia Artificial. Disponvel em <http://www.pr.
gov.br/batebyte/edicoes/ 2002/bb119/estagiario.htm> Acessado em 24 mar.2008.
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[5] ZHANG, Z., FRIEDRICH, K., Artificial Neural Networks Applied to Polymer Composites:
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[7] BAHR, H.B., HORROCKS, D.H., Dynamic Weight Estimation Using an Artificial Neural
Network, Artificial Intelligence in Engineering, v. 12, p. 135-9, 1998.
[8] Uma introduo s Redes Neurais. Disponvel em <http://www.din.uem.br /ia/neurais/>
Acessado em 24 mar.2008.
[9] Neural Networks. Disponvel em < http://www.zsolutions.com/Neural.htm> Acessado em 24
mar.2008.
[10]
HERNANDEZ,
E.D.M.
104
Redes
Neurais.
Disponvel
em
< http://www.lps.usp.
105
106
106
107
108
por 2 horas a 4 oC. Em seguida os dendrmeros foram ativados pela adio de 0,5 mL de
tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP, Sigma-Aldrich) e 0,5 mL de trietil
amina (TEA, Sigma Aldrich). O sistema foi mantido sob agitao constante por 2 minutos e em
seguida dialisado empregando membrana de celofane por trs dias contra soluo aquosa de NaCl
0,2 mol/L e dois dias contra gua destilada e desionizada. Aps a dilise, a amostra do
bioconjugado foi liofilizada, e em seguida, a leitura do sobrenadante em epectrofotmetro
UV/VIS (Varian, Cary 50) a 280 nm permitiu o clculo da quantidade de enzima imobilizada nos
respectivos dendrmeros. A Figura 7.2 ilustra o processo de imobilizao das protenas GOx,
COx e urease nos dendrmeros PGLD, CHD e PPID.
A eficincia de imobilizao das enzimas nos dendrmeros foi expressa em termos de
ndice de imobilizao (IM) definido por:
PT PTs
IM = o
PTo
x100
Figura 7.2- Ilustrao do processo de imobilizao das enzimas GOx, CHD e urease nos
dendrmeros.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
109
110
Figura 7.3- Ilustrao do biossensor preparado neste trabalho atravs da tcnica de imobilizao
111
Figura 7.4 Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterizao do
dispositivo biossensor.
As curvas das correntes em funo da tenso (curva I x V) foram obtidas atravs de uma
fonte tenso/corrente Keitlhey, modelo 237 (K237). O Keitlhey K237 uma unidade fontemedidora de alta preciso, fundamental realizao de medidas de tenso de 10V a 1100 V, e
medidas de corrente de 10 fA a 100 mA, escalas estas fundamentais s medidas de baixos sinais e
quaisquer outras que exijam preciso. Para o controle automatizado de aquisio de dados, este
instrumento possui interface IEEE-488 padro, o que permite a programao via computador.
Quando programado como fonte de tenso, o ampermetro conecta-se em srie com a
fonte de tenso e a sada. Quando programado como fonte de corrente, o voltmetro conecta-se
em paralelo entre fonte de corrente e sada.
Como proteo ao circuito externo, o modelo K237 possui um limite de concordncia
programvel, o qual nunca excedida pela unidade fonte-medidora. Ajustando-se uma corrente
de concordncia apropriada pode-se prevenir dissipao excessiva de energia do dispositivo.
Ajustando-se uma tenso de concordncia apropriada pode-se proteger o dispositivo de uma
sobretenso.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
112
113
Figura 7.5- Ilustrao da configurao da rede neural artificial utilizada neste trabalho.
7.4- Referncias
[4] DE QUEIROZ A.A.A.; ABRAHAM, G.A.; CAMILO, M. A. P.; HIGA, O.Z.; SILVA, G.S. ;
FERNNDEZ, M.D.M.; ROMAN, J. S. Physicochemical and antimicrobial properties of boroncomplexed polyglycerol-chitosan dendrimers. Journal of Biomaterials Science. Polymer
Edition, Netherlands, v. 17, n. 6, p. 689-707, 2006.
[5] VIEIRA, N.C.S. Biossensores de glicose nanoestruturados baseados em dendrmeros
PAMAM e filmes finos de In2O3:Sn. Dissertao de Mestrado. Universidade Federal de Itajub
(UNIFEI), 2006. Orientador: Prof. Dr. lvaro A. A. de Queiroz.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
114
115
Figura 8.1 Vista lateral e frontal da configurao atmica de uma seo de um nanotubo de
carbono. A estrutura cristalina deste tubo particular denotada como (7, 7).5
Os NTCs possuem propriedades especiais devido sua dimensionalidade, estrutura e
topologia. A constituio bsica do retculo do nanotubo as ligaes covalentes C-C, como nas
camadas do grafite. Portanto, nos nanotubos o carbono tambm se encontraria com uma
hibridizao de orbitais atmicas do tipo sp2. 6
O desenvolvimento de biossensores e dispositivos similares baseados em nanotubos de
carbono ainda encontra-se em sua fase inicial a nvel tecnolgico em vrios pases. De fato, ainda
no existe uma tcnica reprodutiva que garanta a produo de nanotubos de carter
exclusivamente metlico ou semicondutor. Ao mesmo tempo a dopagem de nanotubos ainda est
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
116
longe de ser entendida, sendo que somente recentemente, aps mais de uma dcada aps a
primeira observao experimental dos nanotubos, comeam a aparecer estudos de dopagem de
nanotubos de parede simples (SWNT) de forma a conferir as propriedades eltricas de interesse
para utilizao destes nanomateriais em diversos setores de interesse da indstria eletro-eletrnica
e biomdica. Entretanto, o processo de dopagem ainda est longe de estar dominado. A primeira
etapa de um processo de desenvolvimento de dispositivos base de nanotubos passa
obrigatoriamente pelo domnio das tcnicas de crescimento.
Uma classe de nanotubos, que vem despertando um significativo interesse da comunidade
cientfica a de nanotubos de polmeros condutores. Neste trabalho, nanotubos de PANI foram
utilizados como mediadores de eltrons no processo de obteno de biossensores de glicose,
colesterol e uria.
Os nanotubos de polianilina e seus derivados formam uma classe de polmeros condutores
em relao ao processo de dopagem. Este material pode ser dopado por protonao, isto , sem
que ocorra alterao do nmero de eltrons (oxidao/reduo) associados cadeia polimrica. A
polianilina pode ocorrer em diferentes estados de oxidao, dos quais a forma esmeraldina, 50%
oxidada, a mais estvel.7
O produto da oxidao da anilina foi primeiramente preparado em 1862, porm suas
propriedades foram reconhecidas somente cerca de 100 anos depois (dcada de 80 do sculo 20),
despertando um interesse particular devido ao baixo custo de produo, facilidade de sntese e
alto rendimento. As snteses da polianilina e do polipirrol podem ser realizadas de maneiras
semelhantes sob a ao de um agente oxidante. No caso da polianilina, essencial manter um
meio com pH 1,0.
A forma base esmeraldina (isolante) do polmero pode reagir com solues de cidos
(HCl) resultando na forma sal esmeraldina (condutora). A reao de protonao ocorre
principalmente nos nitrognios imnicos da polianilina (-N=). Esse estado contm duas unidades
repetitivas, a amina-fenileno e a imina-quinona. Alm da elevada condutividade eltrica, que
chega ordem de 102 Scm-1, outra propriedade interessante da polianilina exibir diferentes
coloraes quando se variam as condies de pH ou o potencial eltrico (ver Tabela 8.1).
117
118
(A)
(B)
Figura 8.2- Micrografia MEV de PANINTs contendo os dendrmeros bioconjugados
119
(8.1)
120
log[]sMs = log[]uMu
(8.2)
log M u =
k 1 + vs
1
.log s +
log M s
1 + Vu
ku 1 + vu
(8.3)
13
neste trabalho.
Dendrmero
DB(a)
Mnx10-3 (b)
Mwx10-3 (b)
PPID
0.95
1.805
2.831
1.56
CHD
0.89
17.752
21.679
1.22
PGLD
0.82
121
16.724
17.564
1,05
(a)
DB=Degree of branching calculado por anlise NMR. (b)Calculado por anlise GPC.
A baixa disperso no peso molecular (Mn/ Mw) observada e o baixo grau de ramificao,
caracterizam as estruturas dendrticas PPID, CHD e PGLD.
de
reconhecimento
moleculares
da
enzima
para
executar
funes
de
122
Deve ser observado que a utilizao dos bioconjugados PGLD, CHD e PPID para
construo de biossensores de glicose podem facilitar a fabricao de dispositivos em nanoescala,
promovendo a integrao de componentes biolgicos a sistemas da microeletrnica a um nvel de
biocompatibilidade aceitvel para o projeto de sistemas implantveis.22-23
A Figura 8.4 ilustra a resposta da corrente em funo do potencial aplicado para os
dispositivos biossensores de glicose baseados nos dendrmeros PPID, PGLD e CHD. Observa-se
que a resposta do biossensor aumenta com o potencial aplicado.
350
(A)
300
(B)
250
I/nA
200
(C)
150
100
50
0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
123
A relao corrente-tempo quando o potencial dos biossensores PPID, PGLD e CHD foi de
300 mV mostrada na Figura 8.5.
160
(A)
140
120
I (nA)
100
80
(B)
60
(C)
40
20
0
0
10
12
14
16
18
20
Tempo (s)
Figura 8.5- Curva de corrente-tempo para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C), a
124
comerciais. Considerando que a enzima est uniformemente distribuda nos sistemas dendrticos
estudados a saber; PGLD, CHD e PPID, a reao parece ocorrer predominantemente na
superfcie do biossensor a baixas concentraes de glicose. Entretanto, uma vez que os
fenmenos de difuso da carga eletrnica e de substrato so competitivos, o pequeno desvio
observado no tempo de saturao na corrente eletroqumica gerada na superfcie do transdutor
parece estar associada a processos de difuso ou o transporte de carga na interface
dendrmero/transdutor.
Foi visto que a corrente resposta dos eletrodos enzimticos alcana facilmente o estado de
estabilidade (saturao). Dos resultados na Figura 8.6 o pico de saturao da corrente para o
biossensor PGLD significativamente maior que para os bioconjugados PPID e CHD. O
decaimento observado na corrente resposta para o biossensor CHD e PPID pode estar relacionado
a um processo de inibio da atividade da GOx pelos grupos amina, protonados, na periferia do
CHD e PPID, respectivamente.
A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose mostrada na Figura 8.6.
Conforme pode ser observado, existe uma dependncia da corrente com a concentrao do
substrato indicando que todos os sistemas dendrticos bioconjugados parecem obedecer o modelo
proposto por Michaelis-Menten.
A constante aparente de Michaelis-Menten (KappM), que d indicao da cintica enzimasubstrato para o biossensor de glicose baseado na imobilizao da GOx nos dendrmeros PPID,
CHD e PGLD podem ser calculadas pela equao eletroqumica de Lineweaver-Burk:24
1
i SS
K app M 1
1
+
i Max [ S ] i Max
(8.1)
sendo iSS a corrente de estado-constante depois da adio do substrato, iMax a mxima corrente
medida abaixo da condio de saturao do substrato e [S] a maior concentrao de substrato.
O grfico de Lineweaver-Burk 1/iSS versus 1/[S] dos bioconjugados PGLD, PPID e CHD
imobilizados em nanofibras de PANI mostrado em Figura 8.7 a partir dos quais foi possvel
calcular os valores das correspondentes constantes cinticas, cujos valores esto mostrados na
Tabela 8.3.
125
200
(A)
160
(B)
I (nA)
120
80
(C)
40
0
0
10
20
30
40
50
Figura 8.6- A relao entre corrente resposta e concentrao de glicose para os biossensores
PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS e pH 7,4 a 37 oC.
126
0,040
0,035
(C)
0,030
-1
I (nA )
0,025
-1
0,020
(B)
0,015
(A)
0,010
0,005
0,00
0,05
0,10
0,15
-1
0,20
0,25
0,30
-1
[S] (mM )
Figura 8.7- Grfico eletroqumico de Lineweaver-Burk para os biossensores PGLD (A), CHD
(B) e PPID (C). PGLD: [I]-1= 0,02708[S]-1+0,00474 (r2= 0.999), CHD: [I]-1=
0,04351[S]-1 +0,00648 (r2=0.997) e PPID: [I]-1=0,09491[S]-1 +0,01258 (r2=0.994).
127
Tabela 8.3- Parmetros cinticos eletroqumico para a GOx imobilizada nos dendrmeros PGLD,
CHD e PPID.
Dendrmero
KMapp (mM)
iMax (nA)
KMapp / iMax
PGLD
5.71
210.97
0.027
CHD
6.71
154.32
0.043
PPID
7.54
79.49
0.095
GOx solvel
5,94 mM 25
--------
--------
A constante de Michaelis, KappM, foi maior para o bioconjugado PPID-GOx, que para o
bioconjugado CHD-GOx e PGLD-GOx. A KappM relacionada concentrao do substrato que
alcana a taxa mxima da reao enzima-catlise. Assim, o menor valor de KappM, a menor
concentrao de substrato para obter o valor mximo da reao enzima-catlise. Para o menor
valor de KappM, maior a afinidade da enzima para o substrato. Deste modo, o dendrmero PGLD
parece ser um promissor portador de GOx. O novo biossensor projetado baseado no aumento da
incorporao de GOx no dendrmero PGLD exibiu melhor desempenho analtico em relao
configuraes dos biossensores que usam os dendrmeros CHD ou PPID.
A topologia do dendrmero um importante parmetro molecular que determina suas
propriedades fsicas e suas aplicaes. Para controlar a topologia do dendrmero e arquitetura
com preciso, atualmente o tema central na cincia dos polmeros com enfoque para o preparo
de macromolculas com novas propriedades.26
A periferia da unidade dendrtica dos dendrmeros CHD e PPID preenchida com grupos
primrios amina, enquanto todos os pontos ramificados, no interior do dendrmero, so ocupados
por amina terciria. possvel que as funes amina primrias, presentes na periferia da unidade
dendrtica pode tambm participar atravs das ligaes de hidrognio com o local cataltico da
enzima, resultando em um decrscimo da bioatividade dos biossensores CHD e PPID.
O baixo desempenho dos bioconjugados PPID e CHD em relao ao PGLD pode ser
explicado em exame das estruturas qumicas do PPID e CHD. Ambos, PPID e CHD so
polmeros catinicos altamente ramificados que possuem aminas primrias, secundrias e
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
128
129
1,2
1,1
Sensibilidade normalizada
1,0
(A)
0,9
0,8
0,7
0,6
(B)
0,5
0,4
0,3
(C)
0,2
0,1
0
10
15
20
25
30
Dias
Figura 8.8- Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para glicose medida para os
biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais representam a
incerteza das medidas em trs sensores diferentes. Quando no em uso, os sensores
foram armazenados em NaPBS (0.1 M, pH 7,4) a 4 oC.
Uma diminuio constante observada para o PANINTs/CHD-GOx e PANINTs/PPIDGOx, provavelmente devido a um efeito de inibio da estrutura de CHD e PPID na atividade da
GOx. A mais baixa estabilidade dos biossensores de CHD e PPID pode ser devido a uma
distribuio menos homognea de GOx na superfcie do sensor, que tambm poderia resultar em
uma certa restrio no acesso de glicose para o stio ativo da enzima.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
130
A maioria dos biossensores de colesterol comercial possui limite de leitura de 150 a 300
mg/dL e tempo de resposta de 180 segundos. Esses biossensores so vendidos em lotes
separadamente do dispositivo eletrnico para anlise.
As molculas de colesterol podem sofrer a ao da enzima colesterol oxidase, produzindo
4-colesten-3-ona e perxido de hidrognio, como ilustrado na Figura 8.9.
O biossensor para colesterol foi analisado atravs de ensaios in vitro com solues de
colesterol com diferentes concentraes. A medida da resposta do biossensor foi feita em um
multmetro Keithley modelo K 237, lendo-se a corrente gerada pelo dispositivo. A Figura 8.10
ilustra a relao entre a corrente e o potencial aplicado.
131
350
(A)
300
250
I/A
200
(B)
150
100
(C)
50
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
132
tempo, indicando que o processo pelo qual o analito (colesterol) chega a superfcie do eletrodo
disfuncional. Este processo se deve ao gradiente de concentrao existente entre o seio da soluo
fisiolgica e a superfcie do eletrodo. A concentrao do analito na superfcie do eletrodo e no
seio da soluo a mesma, caso o sistema se encontre em passagem de corrente. No incio da
varredura catdica, ocorre a polarizao do eletrodo com o aparecimento de uma corrente de
reduo. O perxido de hidrognio formado pela oxidao enzimtica do colesterol reduzido
eletroquimicamente na superfcie do eletrodo, levando a um gradiente de concentrao e, assim,
observa-se a formao de uma corrente difusional. Consequentemente diz-se que o processo
difusional controla a chegada do analito ao eletrodo. A saturao na curva Ixt (Figura 8.11)
ocorre mais rapidamente nos biossensores de CHD e PPID significando que a difuso do analito
menor nestes dois materiais.
A Figura 8.12 mostra a dependncia da resposta do biossensor frente concentrao de
colesterol. Quando a concentrao de colesterol muito baixa, ocorre um decrscimo na
atividade da enzima, contudo se a concentrao da enzima for muito alta, pode ocorrer uma
inibio do substrato. Como pode ser observado na Figura 8.12, observa-se uma saturao nas
respostas dos biossensores de CHD e PPID a 1 mM. Neste caso associaes do colesterol via
ligaes de hidrognio com a periferia do dendrmero poderia reduzir significativamente a
difuso do analito e conseqentemente levar uma saturao mais rpida na corrente. Para o
biossensor de PGLD a saturao ocorreu somente a 60 mM, indicando que a difuso do analito
neste bioconjugado parece ser maior, relativamente aos biossensores de CHD e PPID.
133
350
(A)
300
250
I/A
200
150
(B)
100
(C)
50
0
0
20
40
60
80
Tempo (s)
Figura 8.11- Dependncia de tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD
(B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de colesterol: 1 mM.
134
300
(A)
250
I/A
200
(B)
150
100
(C)
50
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
[Cho]/mM
Figura 8.12- A relao entre corrente resposta para o PGLD (A), CHD (B) e PPID (C) eletrodos
135
bioconjugados.
Dendrmero
KMapp (mM)
iMax (nA)
KMapp / iMax
PGLD
0,84
87,56
0,0096
CHD
0,92
58,46
0,0171
PPID
6,25
0,34
18,621
COx Livre
1,3215 27
------
-----
136
1,2
(C)
1,0
0,6
-1
I /A
-1
0,8
0,4
(B)
0,2
(A)
0,0
0
6
-1
10
-1
[Cho] /mM
PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A): [I]-1 =0.0096 [S]-1 0.01142
(r2=0.941), CHD (B): [I] -1 = 0,0159 [S]-1-0,0171 (r2=0.950) e PPID: [I]-1=18,621
[S]-1 + 2,977 (r2=0.854).
A Figura 8.14 ilustra a sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para a
medida de colesterol para os biossensores de PGLD(A), CHD (B) e PPID (C). Observa-se na
Figura 8.14 uma queda acentuada na resposta do biossensor com o tempo de armazenamento para
os bioconjugados CHD e PPID relativamente ao bioconjugado PGLD. O fato de a resposta decair
mais acentuadamente para os bioconjugados amnicos seria justificado como sendo devido
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
137
1,1
1,0
Sensibilidade normalizada
0,9
0,8
0,7
(A)
0,6
0,5
0,4
(B)
0,3
0,2
(C)
0,1
0,0
0
10
15
20
25
30
Dias
para os biossensores de PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As barras verticais
representam a incerteza das medidas em trs sensores diferentes. Quando no em
uso, os sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC.
138
fato conhecido da literatura de que existe atualmente um grande interesse voltado para a
incorporao de materiais nanoestruturados na construo de biossensores para que a transduo
do sinal qumico resultante da reao enzimtica seja mais eficiente, seja pela contribuio da
grande rea superficial desses materiais ou pela facilidade do analito se difundir atravs da
nanoestruturas.
A metodologia de nanoestruturao do biossensor de uria adotado neste trabalho
analogamente aos outros biossensores se baseou na formao de um depsito dos dendrmeros
bioconjugados dispersos regularmente nos interstcios dos nanotubos de polianilina, obtidos pela
tcnica de matriz digitalizada por eletropolimerizao, conforme discutido anteriormente.
A dosagem da uria no sangue empregada principalmente para avaliar doenas renais e
hepticas. Neste trabalho estudou-se a deteco eletroqumica da amnia pelos bioconjugados
dendrticos PGLD, CHD e PPID. A enzima imobilizada nas superfcies dendrticas foi a urease.
Uma vez que esta enzima capaz de catalisar a decomposio da uria em amnia, os
dispositivos desenvolvidos neste trabalho podem ser denominados de biossensores de uria,
conforme exemplificado na Figura 8.15.
A Figura 8.16 ilustra a relao entre a corrente amperomtrica e o potencial aplicado para
a deteco de amnia para os biossensores PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). Como pode ser
observado, a resposta do biossensor aumenta com o potencial aplicado saturando em cerca de 600
mV para os sistemas estudados. Observa-se que a sensibilidade de deteco do filme de PGLD
significativamente maior para o dendrmero de PGLD indicando que esta nanoestrutura parece
ser mais apropriada para a imobilizao da enzima relativamente aos dendrmeros amnicos.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
139
140
600
(A)
500
I/nA
400
300
200
(B)
100
(C)
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
CHD (B) e PPID (C) em 0,1 M NaPBS, pH 7,02 e 37 oC. Concentrao de uria:
10 mM.
141
500
(A)
400
I/nA
300
200
(B)
100
(C)
0
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (s)
Figura 8.17- Dependncia do tempo da corrente resposta para os biossensores PGLD (A), CHD
(B) e PPID (C) a 0.8 V em PBS pH 7,4 a 37 oC. Concentrao de uria: 10 mM.
142
(A)
400
I/nA
300
(B)
200
100
(C)
0
0
20
40
60
80
100
Concentrao de uria(mM)
Figura 8.18- A relao da corrente resposta dos eletrodos enzimticos PGLD (A), CHD (B) e
143
0,05
(C)
0,04
(B)
-1
I /nA
-1
0,03
0,02
(A)
0,01
0,00
0,00
0,05
0,10
nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). PGLD (A): [I]-1 =0.168[S]-1
9.86.10-4 (r2=0.990), CHD (B): [I]=0,321[S]-1-0,0011 (r2=0.994) e PPID: [I]1
144
Tabela 8.5- Parmetros cinticos eletroqumicos para a enzima urase imobilizada nos
KMapp (mM)
iMax (nA)
KMapp / iMax
PGLD
170,39
1,04.103
0,168
CHD
291,81
909,09
0,321
PPID
19,06
62,5
0,305
Urease Solvel
4,0 mM 28
-----------
------------
145
1,2
Sensibilidade normalizada
1,0
0,8
(A)
0,6
(B)
0,4
0,2
(C)
0,0
0
10
15
20
25
30
Dias
Figura 8.20- Sensibilidade em funo do tempo de armazenamento para uria medida para os
biossensores de uria baseados nos sistemas PGLD (A), CHD (B) e PPID (C). As
barras verticais representam a incerteza das medidas em trs sensores diferentes.
Quando no em uso, os sensores foram armazenados em 0,1 M PBS, pH 7,4 a 4 oC.
8.6- Determinao dos hemometablitos glicose, colesterol e uria simultaneamente
utilizando uma RNA
146
147
Tabela 8.6- Concentraes das solues dos hemometablitos glicose, uria e colesterol para
[Colesterol]
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1,0
1,2
[Uria]
0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
28,0
32,0
36,0
40,0
Foram obtidas 11 curvas IxV sendo cada intensidade da curva tomada como entrada na
RNA. Pesos apropriados foram aplicados para treinamento do algoritmo at que os resultados
esperados fossem atingidos dentro do erro estabelecido.
As Figuras 8.21 a 8.23 ilustram os resultados obtidos na determinao simultnea dos
hemometablitos glicose, colesterol e uria utilizando a RNA tipo backpropagation. O erro
quadrtico mdio para os conjuntos de treinamento foi aproximadamente de 1,5%, portanto a
rede consegue reproduzir bem o teor de hemometablitos das amostras utilizadas na sua
construo.
A Tabela 8.7 mostra os resultados obtidos pela aplicao da RNA treinada a um conjunto
teste. A RNA treinada parece ser adequada para a determinao dos hemometablitos glicose,
uria e colesterol uma vez que os erros absolutos foram baixos.
148
Tabela 8.7- Erro obtido durante o teste da rede neural para os hemometablitos colesterol,
Valor esperado
Valor obtido
(mM)
(mM)
Glicose
0,000
0,003
-0,3
Glicose
3,890a
3,873
1,7
Glicose
6,132b
6,095
3,7
Uria
0,000
0,009
-0,9
Uria
1,340c
1,309
3,1
Uria
3,351d
3,312
3,9
Colesterol
0,000
-0,001
0,1
Colesterol
1,200
1,185
1,5
Colesterole
1,200
1,185
1,5
a,b
c,d
149
25
Valores Obtidos
[Glicose] (mM)
20
15
10
0
0
10
15
20
25
V a lo re s E sp e ra d o s
[G lico se ] (m M )
Figura 8.21- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as
150
1,4
1,2
Valores Obtidos
[Colesterol] (mM)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0 ,2
0 ,4
0,6
0 ,8
1,0
1 ,2
V a lo re s E s p e ra d o s
[C o le s te ro l] (m M )
Figura 8.22- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as
151
50
40
Valores Obtidos
[Uria] (mM)
30
20
10
0
0
10
20
30
40
V a lo re s E s p e ra d o s
[U r ia ] (m M )
Figura 8.23- Resultados esperados versus resultados obtidos para o treinamento da RNA para as
[1] IIJIMA, S.; Helical microtubules of graphitic carbon. Nature, v.354, p.56, 1991.
[2] HUGHES, T. V.; Chambers, C. R.; U.S. pat.v. 405,p.480, 1889.
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[4] DAY, L.; MAU, A. W. H. Adv. Mater. v.13, p.899, 2001.
Aspectos Bioeletroqumicos de Dendrmeros como Nanoplataformas para Aplicaes Clnicas
152
153
[18] SILVA, A R.P. Estudo das propriedades bioqumicas de sistemas arborescentes PGLDAAS para o tratamento do cncer. 2008, Dissertao (Mestrado em Engenharia de Materiais).
LASKIN,
A.
I.
Enzymes
and
immobilized
cells
in
biotechnology.
EUA,
Captulo 9- Concluses
154
Captulo 9- Concluses
O estudo das propriedades cinticas dos dendrmeros PGLD, CHD e PPID
bioconjugados com as enzimas GOx, COx e urease foi realizado atravs de ensaios
eletroqumicos para anlise da resposta do biossensor ao seu respectivo substrato. Cada ensaio
foi essencial tanto para a caracterizao dos dendrmeros quanto sua utilizao como
nanoplataforma para imobilizao do biocatalizador quanto sua performance na anlise
clnica dos hemometablitos glicose, colesterol e uria.
Em linhas gerais, concluiu-se deste trabalho que os dendrmeros PGLD, CHD e PPID
bioconjugados com as enzimas GOx, COx e urease apresentam respostas eletroqumicas
diferenciadas em presena dos substratos glicose, colesterol e uria, respectivamente. Dentre
os bioconjugados, mereceu destaque o bioconjugado baseado no dendrmero PGLD que
apresentou alta estabilidade operacional e de armazenamento. No caso particular dos
dendrmeros CHD e PPID, concluiu-se serem necessrios estudos mais aprofundados do
trinmio densidade de cargas/difuso do substrato/topologia. Finalmente, os resultados
obtidos neste trabalho permitem as seguintes concluses:
Captulo 9- Concluses
155
156