Antonio Crego

Profesor Titular
Qumica Analtica
Octubre, 2014

Universidad de Alcal
Centro de Qumica Aplicada y Biotecnologa

XIV Curso de Cromatografa de Lquidos acoplada

a la Espectrometra de Masas

Introduccin a la MS

Introduccin

Qu es la Espectrometra de Masas?
La Espectrometra de Masas (MS) da nombre a un
conjunto de tcnicas que se basan en la produccin de
iones en estado gaseoso
gaseoso, los cuales son seguidamente
separados de acuerdo a su relacin masa/carga y
finalmente detectados
detectados
a partir de tomos, molculas o fragmentos de molculas

Introduccin
Desarrollo

Fecha

Aplicaci
n

1 Descripci
n de la t
cnica

1919

Descubrimiento de los is
topos

Analizador de Doble Enfoque

1935

Resoluci
n elevadas de masas

1er Instrumento comercial

1940s

An
Anlisis cuantitativo de hidrocarburos en
la industria del petr
petrleo

Teora de la Fragmentaci
Teor
Fragmentaci
n

1950s

Identificacin y elucidaci
Identificaci
elucidacin estructural

GC - MS

1965

An
lisis de especies vol
tiles en
mezclas complejas

Nuevas fuentes de iones

de fase gaseosa

1965

Gran capacidad para la elucidacin de

estructuras

MS en t
ndem

1970

An
lisis de mezclas a alta velocidad

Nuevas fuentes de iones

de desorci
desorcin

1970s

An
Anlisis de especies no vol
voltiles
y termol
termolbiles

LC
LC--MS

1980s

An
Anlisis de mezclas complejas

Ionizaci
n con desorci
n
l
ser asistida por matriz

1987

An
lisis de biomol
culas

CE MS

1990s

An
lisis de mezclas complejas

NOBEL

Introduccin
Cualidades de la MS

Su capacidad
capacidad de identificacin

Es cualitativa y cuantitativa

Puede alcanzar una gran

femtogramos
femtogramos
ppt
ppt
sensibilidad

zeptomoles
zeptomoles

Es universal y especfica

Puede proporcionar informacin estructural

Sumistra informacin isotpica

Es una tcnica muy rpida

Introduccin
Qu es un espectrmetro de masas ?
Un instrumento analtico muy sensible que responde a las
cuestiones de qu hay? y cunto hay? para un nmero
de muestras increiblemente variado y amplio

Introduccin
reas de aplicacin
Farmacutico



Control de frmacos: confirmacin

y caracterizacin de impurezas
Desarrollo y descubrimiento de
nuevos frmacos

Agricultura


Biotecnologa


Alimentos


Identificacin y cuantificacin de
adulterantes, fragancias, aromas, sabores

Medioambiente


Identificacin y cuantificacin de trazas

de contaminates orgnicos e inorgnicos
en agua, suelo y aire

Identificacin y cuantificacin en
matrices complejas

Estudio del genoma-proteoma

humano

Cosmtica


Perfiles de formulaciones
y degradaciones

Industria Petroqumica


Identificacin y cuantificacin de
aditivos

Arqueologa
Medicina


Estudios clnicos y forenses

Geologa
Hidrologa

Conceptos bsicos
Istopos
La unidad de masa atmica (uma
uma)) es el Dalton (Da) que se define
como 1/12 de la masa del istopo neutro del carbono 126C.
Se denominan istopos a los diferentes tipos de tomos de
un mismo elemento cuyos ncleos difieren en su nmero de
neutrones,, presentando el mismo n de protones y de
neutrones
electrones.. As, todos los istopos de un mismo elemento se
electrones
encuentran en el mismo sitio de la tabla peridica pues tienen
igual nmero atmico (nmero de protones en el ncleo) pero
diferente nmero msico (suma del nmero de neutrones y el
de protones en el ncleo). La mayora de los elementos
qumicos poseen ms de un istopo. Solamente 21 elementos
(p.e.
p.e.,, berilio, sodio) poseen un solo istopo natural.

Conceptos bsicos
Istopos

Conceptos bsicos
La masa atmica de un elemento es la media ponderada de las masas de
sus istopos, siendo las masas que aparecen en la tabla peridica
peridica..
Bromo:
50,69% de

79Br

de 78,91834 Da y 49,31% de

81Br

de 80,91629 Da

(0,5069 x 78,91834) + (0,4931 x 80,91629) = 79,90353 Da

La masa molecular de una molcula o ion es la suma de las masas atmicas

de cada uno de sus elementos constituyentes.
C2H5Br:
(2 x 12,0107) + (5 x 1,00794) + (1 x 79,90353) = 108,9646 Da

Estas masas NO se miden en MS

Conceptos bsicos
La masa que se mide en MS es la masa monoisotpica
La masa monoisotpica de una especie es la masa calculada a partir de un
solo istopo de los posibles de cada elemento que forman la especie, en
concreto, del istopo ms abundante de cada elemento

La masa nominal de una especie es su masa entera utilizando para la suma

los istopos ms abundantes de cada uno de sus elementos constituyentes.
C2H5Br:

12C, 1H

79Br

(2 x 12) + (5 x 1) + (1 x 79) = 108 Da

La masa exacta de una especie es la masa de la especie expresada con

todas sus cifras significativas utilizando para la suma los istopos ms
abundantes de cada uno de sus elementos constituyentes.
C2H5Br:
Br:

12C, 1H

79Br

(2 x 12) + (5 x 1,007825) + (1 x 78,91834) = 107,95746 Da

Espectro de Masas
El espectro de masas es un grfico que representa la
abundancia relativa de los iones producidos en funcin de su
relacin masa/carga
Pico base
100

Perfil
Isotpico

0
60

80

100

120

140

160

m/z

180

200

220

240

260

280

300

Espectro de Masas
El pico base se refiere a la seal ms intensa del espectro de masas y se
le asigna una abundancia relativa del 100%.

El in molecular (M.+ o M+) es el in que tiene una masa que corresponde

a la suma de las masas de los istopos ms abundantes en la naturaleza.
Est seal nos permitir calcular la masa monoisotpica de la especie
(masa nominal o exacta, en funcin de la resolucin del equipo).
El in pseudomolecular o cuasimolecular (MH+ o MH-) es el in
originado a partir de la protonacin o deprotonacin de una molcula.
Esta seal nos permite calcular la masa monoisotpica teniendo en
cuenta que le corresponde una masa igual a la de la molcula 1.
Un aducto es un in formado a travs de la interaccin de M con un in.
Las seales correspondientes a estos iones nos permiten deducir la masa
monoisotpica.

Espectro de Masas
 Perfil Isotpico
Conjunto de iones Isotpicos que normalmente aparecen a masas mayores y que
presentan menores abundancias que el ion molecular, cuasimolecular,
cuasimolecular, iones
aductos o iones fragmentos.

100

674.72
674.72

100

zoom ...

675.72

676.72
462.8

677.72

685.7
600.4 666.1 693.6

0
300

400

500

600

700

800

m/z

673

675

677

679

m/z

Espectro de Masas
 Perfil Isotpico
Perfil isotpico
Abundancia relativa depende de:


Los elementos de la molcula, junto con la

abundancia de sus istopos.
El n de cada uno de los elementos.

100
80
60
40
20
0

1296.65
1297.64

1298.64

1296

1298

m/z

Intensidad de M+1 MH+1 relativa al Ion molecular CnHm :

(n x 1,08 %)
Contribucin 13C
El carbono tiene un 98,93% de
tomos 12C y 1,07% de 13C

(m x 0,012 %)
Contribucin 2H
El hidrgeno tiene un 99,988% de tomos
1H y 0,012% de 2H

Las abundancias relativas de los picos isotpicos deben ser

coherentes con la composicin elemental propuesta dentro de 10%

Espectro de Masas
 Perfil Isotpico
 Pico (M+1) o MH+1 isotpico: 13C (1.08%)
[ 29Si,
Si, 5.08%; 33S, 0.80%;15N, 0.37% ]
 Pico (M+2) o MH+2 isotpico: 37Cl (32%) o 81Br (97.3%)
[ 34S (4.52%); 30Si (3.35%); 18O (0.20% )]
 Picos (M+4)+, (M+6)+, etc., de iones isotpicos mltiples: 37Cl o 81Br

Espectro de Masas
 Determinar la carga del Ion
La determinacin del n de cargas de un in nos permite obtener
informacin importante a cerca de la masa de este.

Cmo se determina la carga y la masa de una molcula?

Iones moleculares o cuasimoleculares
cuasimoleculares:




Carga simple: m/z = M/1 (M+H)/1

Doble carga: m/z = M/2 (M+2H)/2
n cargas:
m/z = M/n (M+nH)/n

Iones isotpicos
isotpicos:



Molculas
pequeas

Carga simple: m/z = 1 Da

Doble carga: m/z = 1/2 Da
n cargas:
m/z = 1/n Da

Molculas
grandes

Espectro de Masas
En el caso de molculas pequeas cargadas con un n de cargas
pequeo, el perfil isotpico nos permitir determinar la carga y a
partir de ah la masa del compuesto.
1296.65

100
80

+1

1297.64

60

648.82

100
649.32

80

40

20

60

40
1296

+2

1298.64

m/z

1298

1/2

649.81

1/2
1/2

20

650.31

0
649

432.93

100
80
60

651 m/z

650

+3

433.26

324.95

100

1/3
433.58

40

80

1/3
1/3

20

60

+4

325.17

1/4
325.42

1/4

40
433

434

m/z

1/4

20

325.68

0
325.0

325.5

326.0

m/z

Espectro de Masas
En el caso de molculas grandes cargadas con un n de cargas elevado, no ser
posible observar el perfil isotpico, pero las seales correspondientes a los
diferentes iones con distinta carga que se pueden formar a partir de la molcula
de partida nos permitir determinar la carga y masa del compuesto
Para dos picos
consecutivos

13 H

14 H
12 H

15 H

16 H

11 H
10 H

17 H

MW = 12351.3 Da

Espectro de Masas
52cargas
(M+52)/52

Albmina de Suero Bovino: 66.431,6 uma

1278.5867
1278.5867
1329.6960
1231.2576
1385.0607
+52
1187.3191
1166.5027
1445.2353
1146.4055
1477.3362
1126.9893
1510.8975
1546.0132
1108.2210
1582.8037

8.8e4
8.5e4
8.0e4
7.5e4
7.0e4
6.5e4
6.0e4
5.5e4
5.0e4

1621.3936
1661.9195
1704.4614
1749.3392
1796.5976

1090.0658

4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
2.5e4

1072.4737

65 cargas
1055.4930

(M+65)/65

+37
+36 +35

1023.0333

1.0e4

(M+35)/35

1899.1972

+38
1038.9971

2.0e4
1.5e4

35 cargas

+65

5000.0
0.0
700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

m/z

DECONVOLUCION ESPECTROS
Programas matemticos de localizacin de series de seales en un espectro
de masas que correspondan al mismo peso molecular.

Espectro de Masas
 Perfil o Patrn de Fragmentacin
Conjunto de fragmentos que aparecen en el espectro con sus
abundancias relativas.
Iones
Fragmento

Eritromicina
158.1

100

576.4

M+
734.5

%
558.4
522.4

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

577.4

735.5

(M+1)+

716.5
600

650

700

750

Los fragmentos de una ruptura ayudan a corroborar la

identificacin de la molcula,
molcula, siendo claves muy valiosas de la
estructura del compuesto analizado.

800

m/z

Parmetros Fundamentales en MS
Poder de resolucin vs Resolucin
El poder de resolucin de un espectrmetro de masas es su capacidad
para generar seales separadas entre si a partir de iones con m/z
similares y, as, obtener un espectro con una resolucin determinada

0,6 Da

Mayor Poder Resolucin

Menor ancho del pico
Mayor Resolucin entre picos contiguos
Mayor capacidad de separacin de iones
Resolver menores diferencias de masa

0,1 Da

Parmetros Fundamentales en MS
m
Poder de Resolucin =
m
Media altura FWHM

10% de valle

m = valor menor de m/z

m = diferencia de masa
entre dos picos con una
altura de valle entre
ellos del 10%
m = anchura del pico a
media altura

Parmetros Fundamentales en MS
1000

RS de 0,6 FWHM
Resolucin Unidad

RS =

1000
= 1.667
0,6

0,6 Da
1001

RS de 10% valle
1002

10%

RS =

1000
= 1.000
1

1000

Alta Resolucin
0,1 Da
1001
1002

RS de 0,1 FWHM
RS =

1000
= 10.000
0,1

Parmetros Fundamentales en MS
Efecto de la magnitud de
masa medida en el poder de
resolucin y en la resolucin
del espectro

m/z = 2.722
Rs = 13.500
m = 0.20 uma

Mayor Masa
m/z = 118
Rs = 4.700
m = 0.025 uma
Mayor Poder de Resolucin
Menor Resolucin

118

119

m/z

2722

2723

2724

m/z

Parmetros Fundamentales en MS
Exactitud de una Masa
La diferencia entre la masa medida a partir de la m/z y la masa
exacta calculada, expresada como error relativo en ppm.

intensidad

545.4200

m/z

 Masa Medida
545.3249 245.3239
545.4200
 Masa Exacta
545.3231
245.3232
545.3231
 Error Relativo
545.4200
545.4200--545.3231
545.3231
/545.3231
= 0.00017769
 Exactitud de Masa
178 ppm
3 ppm
3 ppm

Baja Resolucin

Alta Resolucin

Parmetros Fundamentales en MS
Cuando asignamos un ion molecular a un pico
del espectro habremos determinado la masa
molecular monomono-isotpica del compuesto,
posiblemente la parte ms importante de la
identificacin en MS, su frmula molecular.
molecular.

 Si masa encontrada es 203.0 

23 frmulas moleculares diferentes
pueden tener esa masa.
 Si masa encontrada es 203.03 
4 frmulas moleculares diferentes
pueden tener esa masa.
 Si masa encontrada es 203.034 
SLO una formula molecular tiene
esa masa.

LC acoplada a MS
La MS puede identificar casi de modo inequvoco cualquier
sustancia pura,
pura, pero normalmente no es capaz de identificar los
componentes individuales de una mezcla de compuestos debido a la
extrema complejidad del espectro obtenido por superposicin de
los espectros particulares de cada compuesto.

Por qu acoplar MS a una tcnica de separacin?

1.

Cuando trabajamos con compuestos parecidos

parecidos..

2. Cuando la matriz de la muestra interfiere.

3. Cuando un compuesto se encuentra en una proporcin mucho ms
elevada que otros.
otros.

LC acoplada a MS
A
B
C
D

MS

Identificar especies moleculares o atmicas

Es posible Identificar A?

LC acoplada a MS
LC
Fase mvil

Mezcla
A+B+C+D

Desecho

Columna Separadora

Detector

Seal

Registro

Tiempo

LC acoplada a MS
El Tcnica de Separacin separa los
componentes de la mezcla para que
lleguen al detector a distinto tiempo

LC

MS

El MS ionizar los compuestos separados y

determinar su relacin m/z,
identificndolos en base a su espectro de
masas y cuantificndolos en base al rea de
los picos del cromatograma

LC acoplada a MS
Registro MS: monitorizacin de la corriente inica total (SCAN)

Cromatograma de Iones Totales (TIC)

Representa en funcin del tiempo la
intensidad de todos los iones detectados
dentro del intervalo de masas seleccionado
(espectro)

Intensidad
de corriente

Cromatograma
de Iones Extrados (EIC)

Tiempo
ESPECTROS DE MASAS

Intensidad
de corriente

Cromatograma
del Pico Base (BPC)

m/z

m/z

m/z

LC acoplada a MS
BPC

representa en funcin del tiempo la intensidad del ion del pico base
correspondiente al espectro obtenido en cada momento

EIC

representa en funcin del tiempo la intensidad de un determinado ion

elegido entre todos los iones del espectro obtenido en cada momento

Intens.

Oxatetraciclina

TIC

x10 6
2.0 (200-500 m/z)

1.0
x10 5
1.5

Mayor sensibilidad
en la deteccin

BPC

0.5
x10 5
0.75

EIC
(461 m/z)

0.25
0.00
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5 Time [min]

LC acoplada a MS
Registro MS: monitorizacin de la corriente inica de un ion (SIM)

Cromatograma del SIM

Representa en funcin del tiempo la intensidad de un determinado ion
Intens.

Oxatetraciclina

TIC

x10 6
2.0 (200-500 m/z)

Mayor sensibilidad
en la deteccin

1.0
x10 5
0.75

SIM
(461 m/z)

0.25
0.00
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5 Time [min]

LC acoplada a MS

UV 220 nm

2,809

800
0,301

Imazalil?

7,128

mUA

7,411

Cromatogramas de un extracto de piel de naranja extrada con metanol para la

deteccin de un fungicida

4,323

4,106

3,805

2,373

1,571

1,209

200

0,390
0,534
0,650

400

3,057
3,196

2,645
2,747

600

0
1

min

API-ES, Pos, Scan, Frag: 30, "ES pos 30fr 20%"

3.912

MSD1 TIC, MS File (C:\HPCHEM\PES1COPY\0511B027.D)

8000000

TIC
(Scan: 150-400 m/z)

4.254

7000000

6000000

Imazalil?
3.656

4.879

2000000

3.185

2.800

3000000

2.974

0.386

4000000

4.574

0.611

5000000

1000000

0
1

min

LC acoplada a MS
Cromatogramas de un extracto de piel de naranja extrada con metanol para la
deteccin de un fungicida
API-ES, Pos, SIM, Frag: 30 (TT), "ES pos SIM 80%"

3.184

MSD2 TIC, MS File (C:\HPCHEM\PES1COPY\0511B027.D)

300000

EIC
IC
(m/z 297)

Mejor sensibilidad
Mejor
selectividad
250000
Imazalil

200000

(296 Da)
m/z

150000

SIM
(m/z 297)

100000

NO HAY
ESPECTRO

6.481

5.263

2.704

1.108

0.541

50000

0
2

10

min