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Chromatographie
chromatographie
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chromatographie
chromatographie
chromatographie
chromatographie
d'adsorption
de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
d'change d'ions (+ chromatographie ionique)
de paires d'ions
d'exclusion (sparation selon la taille)
d'affinit
adapte la sparation d'nantiomres
Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs sparer :
Adsorbants :
- Les adsorbants doivent tre insolubles dans le solvant et chimiquement inertes vis--vis du solvant et des
soluts.
- Leur granulomtrie varie entre 5 et 100 m et leur surface spcifique de 50 1000 m2 /g,
- L'activit d'un adsorbant dpend de sa nature et de sa teneur en eau.
N. B. Dans certains cas, on cherche diminuer l'activit adsorbante, et on fait au contraire une dsactivation.
-La capacit d'adsorption peut tre :
- faible (carbonate de calcium...)
- forte (silice, alumine, charbon ...)
-La polarit peut tre
- faible (charbon...)
- forte (silice SiO2, utilise sous forme hydrate : gel de silice, qui prsente des fonctions "silanol" :
Si-OH , alumine Al2O3, n H2O...)
Solvants :
On utilise gnralement des mlanges de solvants, de polarit voisine de celle des soluts sparer (ceux-ci doivent
tre solubles dans l'luant !). On classe les diffrents solvants selon leur "force luante" qui traduit leur polarit:
Srie luotrope sur alumine de quelques solvants, classs par ordre de polarit croissante :
solvant
force luante
solvant
force luante
Ether de ptrole
0,01
Actone
0,56
Hexane
0,01
Dioxane
0,56
Cyclohexane
0,04
Butanol
0,56
Ttrachlorure de carbone
0,18
Actate d'thyle
0,58
Ether isopropylique
0,28
Actonitrile
0,65
Tolune
0,29
Pyridine
0,71
Benzne
0,32
Dimthylsulfoxyde
0,75
Ether thylique
0,38
Isopropanol
0,82
Chloroforme
0,40
Ethanol
0,88
Chlorure de mthylne
0,42
Mthanol
0,95
Dichlorothane
0,49
Eau
> 0,95
Acide actique
> 0,95
Selon la nature des composs sparer, on choisit des solvants de force luante ( o ) approprie. C'est rarement un
solvant pur, mais en fait un mlange de 2 4 solvants, optimis par tests successifs vis--vis des composs tudis,
sans que cela obisse des rgles permettant de prdire les rsultats. Des abaques permettent de calculer la force
luante d'un mlange binaire :
Dans les mlanges contenant plus de deux solvants, les derniers sont prsents dans de trs faibles proportions (< 2%)
et correspondent des solvants de forte polarit (eau, acide) destins amliorer la symtrie des pics. Le choix du
solvant doit obir certaines contraintes :
- miscibilit des composantes lmentaires
- compatibilit avec le systme de dtection ("cut-off" en UV)*
* N.B. Cette contrainte n'existe pas avec la chromatographie sur couche mince, pour laquelle le choix des solvants est
donc plus tendu.
Applications :
La chromatographie d'adsorption est utilise pour sparer des molcules organiques de masse molaire 100
1000 g/mol et de polarit moyenne;
-les molcules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont lues les premires (= elles migrent au front
en CCM).
-Les molcules trop polaires risquent d'tre adsorbes de faon irrversible, et ne sont donc pas lues
(= elles resteraient sur la ligne de dpt en CCM).
Exemples :
- lipides : strols et strodes, carotnodes, phospholipides...
- pigments, mdicaments...
- oses et oligosides, acides amins et oligopeptides
L'utilisation de ce mode de chromatographie est assez large, en raison de sa facilit d'emploi et du fait que la
transposition depuis la chromatographie sur couche mince est trs aise.
ECHANGEURS D'ANIONS
FORTS
FAIBLES
Les changeurs forts sont ioniss quel que soit le pH, alors que les carboxylates ne le sont qu' pH > 3 et les amines
tertiaires ne sont protones qu' pH acide. On utilise les changeurs d'anions forts pour sparer des acides faibles (ex
acides carboxyliques) et les changeurs faibles pour sparer des acides forts (ex esters phosphate). Le mme type de
raisonnement s'applique aux changeurs de cations.
La nature de l'ion changeable est variable : par exemple une rsine cationique peut tre utilise sous forme acide
(lie H+) ou sous forme sodique (lie Na+); il faut donc conditionner la rsine sous la forme ionique adquate
avant son utilisation, et la rgnrer aprs usage.
Caractristiques :
-Porosit : le support est un polymre plus ou moins rticul ; la porosit dpend du taux de pontage : un polymre
trs rticul a des pores de petite taille et convient pour des petites molcules.
-Granulomtrie : le support est commercialis sous forme de grains de diamtre variant de 30 800 m
(chromatographie basse pression) Celui des colonnes HPLC a une granulomtrie de 5-10 m (supports totalement
poreux) ou lgrement suprieure (supports pelliculaires, en couche de 1 m sur des billes de verre). Les changes
sont d'autant plus rapides et efficaces que les grains sont petits.
-Capacit de rtention : c'est la quantit maximale d'ions que peut fixer l'changeur d'ions, exprime en mEq/g de
poids sec ou en mEq/ml de poids humide. Elle dpend de la densit du support en groupements fonctionnels et il faut
en tenir compte pour ne pas trop charger une colonne.
L'affinit d'un changeur pour un ion donn dpend de plusieurs facteurs:
de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :
L'affinit d'un changeur pour un ion donn dpend de plusieurs facteurs:
de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :
- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution
de la densit de charge de l'ion considr, qui dpend:
-
de
de
du
de
et
si
si
Les luants sont des solutions aqueuses qui contiennent des ions changeables avec les soluts fixs sur l'changeur :
-solutions contenant un ion de densit de charge plus leve et (ou) de concentration plus leve.
-solutions d'un pH tel qu'il modifie la charge des ions fixs et (ou) des groupements fonctionnels et provoque leur
libration dans l'luat.
On peut luer avec une solution de composition constante (conditions isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou)
de force ionique, pour dcrocher successivement les diffrents ions fixs sur l'changeur.
Applications : La chromatographie d'change d'ions est utilise pour sparer des molcules ionisables, quelle que
soit leur taille : ions minraux, acides amins, peptides, protines, nuclotides, acides nucliques, glucides ioniss et
lipides ioniss.
On appelle paire d'ions une entit forme par l'association de deux ions de charge oppose. La paire d'ions a donc
une charge nette nulle et peut dans ce cas prsenter des proprits hydrophobes qui permettent de l'analyser par
sur une colonne de chromatographie en phase inverse.
Pour arriver cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un dtergent anionique ou
cationique. Ces dtergents sont des molcules ionises qui comportent par ailleurs des chanes carbones
hydrophobes (ex ttrabutylammonium, laurylsulfonate,) et forment avec les composs sparer des paires d'ions
hydrophobes.
On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un trs grand nombre de paramtres :
-
De tels systmes s'avrent plus performants (N) que les systmes d'change d'ions et ont des capacits plus grandes (
= ils permettent d'injecter de plus grandes quantits d'chantillon sur une colonne de mme dimension).
6-2-5-La chromatographie d'exclusion
La chromatographie d'exclusion est aussi appele FILTRATION SUR GEL ou TAMISAGE MOLECULAIRE. Cette
technique est apparue en 1959 avec un produit nouveau : le Sephadex.
Le Sephadex est un gel de dextrane (polymre de glucose a-1-6 produit par Leuconostoc mesenterodes), auquel on
fait subir une rticulation. Il se prsente sous forme de billes poreuses, dont la porosit dpend du degr de
rticulation. Ces billes sont trs hydrophiles et gonflent dans l'eau. Il en existe diffrents types en fonction de la taille
des billes et de leur porosit.
Principe de la chromatographie d'exclusion :
1 : Dpt d'un mlange de deux molcules (des grosses et des petites) sur une
colonne remplie d'un gel de Sephadex.
2 : Les petites molcules peuvent pntrer dans les billes de Sephadex car leur
diamtre est infrieur celui des pores du gel. Les grosses molcules ne le
peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'o
le nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molcules ont donc un trajet plus court parcourir pour arriver en
bas de la colonne; elles sont donc lues les premires.
4 : Les petites molcules sont lues ensuite car elles ont une plus grande distance
parcourir pour arriver en bas de la colonne.
D'une faon plus gnrale :
-Les molcules de taille suprieure celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel et
ne se rpartissent que dans le volume extrieur aux billes, c'est--dire dans la phase mobile (luant). Elles sortent les
premires, un volume d'lution Vo appel volume mort de la colonne.
-Les molcules de taille infrieure celle des pores des billes de Sephadex peuvent pntrer librement dans les
billes et se rpartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide l'intrieur des billes ou phase
stationnaire + volume de liquide l'extrieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernires, un
volume d'lution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
-Les molcules de taille intermdiaire pntrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme;
elles pntrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont lues dans l'ordre des masses molaires
dcroissantes.
- isolement des ARNm polyA+ sur colonne d'oligodT- ou polyU- sepharose partir d'un extrait d'ARN total (les ARNm
reprsentent 1% du total)
- purification de rcepteurs hormonaux avec des colonnes sur lesquelles on a fix des molcules d'hormones
- un degr de spcificit trs infrieur, les colonnes sur lesquelles sont greffes des ions boronate ont une affinit
pour les diols cis et permettent de fixer entre autres les sucres.
Techniques en haute pression ( titre d'exemple) On donnera ici comme exemple le choix offert par un fabricant
(Pierce Eurochemie) :
Type de phase stationnaire
Type d'application
Immunoglobulines
Bleu Cibacron
Concanavaline A (lectine)
Glycoprotines, sucres
Ren Lafont
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