INSTITUTO TECNLOGICO DE ACAPULCO

INGENIERA BIOQUMICA
ANLISIS INSTRUMENTAL

TRABAJO FINAL:
UNIDAD IV. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
UNIDAD V. ESPECTROCOPIA INFRAROJA
UNIDAD
VI.
ESPECTROCOPIA
MAGNTICA NUCLEAR
UNIDAD
VII.
MOLECULARES
UNIDAD VIII.
SEPARACIN

DE

ESPECTROCOPIA
MTODOS

DE

RESONANCIA
DE

AISLAMIE

MASAS
NTO

PROFESORA: MNICA ZARATE

JUAREZ

ESMERALDA FIGUEROA
MORENO

UNIDAD IV. ESPECTROCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

FUNDAMENTO.

Para que la radiacin electromagntica incidente, interaccione con la materia tiene

que tener una del mismo tamao o menor que las dimensiones del cuerpo
irradiado. Es por ello que la radiacin de la regin del ultravioleta ( 1-400 nm) nos
permite obtener informacin de las transiciones electrnicas de las molculas.

La espectroscopia UV-Vis se basa en el anlisis de la cantidad de radiacin

electromagntica (en el rango de longitudes de onda del ultravioleta y visible) que
puede absorber o transmitir una muestra en funcin de la cantidad de sustancia
presente.
Todas las tcnicas de absorcin suponen que cuando una radiacin incide sobre
una muestra se produce una absorcin parcial de esta radiacin, lo que hace que
se produzca una transicin entre los niveles energticos de la sustancia:
tomo, molcula o in, X, pasando esta al estado excitado, X*, el resto de
radiacin es transmitida. As analizando una u otra podemos relacionar la cantidad
de especie activa presente en la muestra.

La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometra ultravioleta-visible

(UV/VIS) es una espectroscopia de emisin de fotones y una espectrofotometra.
Utiliza radiacin electromagntica (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana
(UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagntico, es decir, una
longitud de onda entre 380nm y 780nm. La radiacin absorbida por las molculas
desde esta regin del espectro provoca transiciones electrnicas que pueden ser
cuantificadas.
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La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales

de molculas, y adems, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia.
Se utiliza de manera general en la determinacin cuantitativa de los componentes
de soluciones de iones de metales de transicin y compuestos orgnicos
altamente conjugados.
Se utiliza extensivamente en laboratorios de qumica y bioqumica para determinar
pequeas cantidades de cierta sustancia, como las trazas de metales en
aleaciones o la concentracin de cierto medicamento que puede llegar a ciertas
partes del cuerpo.
El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorcin de
radiacin ultravioleta visible por una molcula, causando la promocin de un
electrn de un estado basal a un estado excitado, liberndose el exceso de
energa en forma de calor. La longitud de onda (\lambda) comprende entre 190 y
800 nm.
La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, stos son
promovidos a estados excitados (de energa mayor). Al absorber radiacin
electromagntica de una frecuencia correcta, ocurre una transicin desde uno de
estos orbitales a un orbital vaco. Las diferencias entre energas varan entre los
diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan coloracin en las
molculas ya que absorben energa en el visible as como en el UV, como es el
caso del -caroteno.
Cuando un haz de radiacin UV-Vis atraviesa una disolucin conteniendo un
analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I. Esta
fraccin de radiacin que ha logrado traspasar la muestra es denominada
transmitancia (T) (T = I/Io). Por aspectos prcticos, se utilizar la absorbancia (A)
en lugar de la transmitancia (A = -logT), por estar relacionada linealmente con la
concentracin de la especie absorbente segn la Ley de Beer-Lambert:

EL ESPECTROFOTMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin

absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida
de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante. El vidrio, que parece ser
completamente transparente, absorbe longitudes de onda que pertenecen al
espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del IR. La absorcin de
las radiaciones UV, visibles e IR depende de la estructura de las molculas, y es
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caracterstica para cada sustancia qumica. El color de las sustancias se debe a

que absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y
slo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.
Esta espectrofotometra utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm,
principalmente de 200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm,
por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la regin
ultravioleta-visible del espectro. Se rige por una ley muy importante: la ecuacin de
Beer-Lambert.

CARACTERISTICAS DE LAS MUESTRAS

Las muestras en solucin se ponen en una pequea celda de S.

Se utilizan dos lmparas: una de H o deuterio para la regin UV, y una de W
/ halgeno para la regin visible
Se utiliza tambin una celda de referencia que contiene slo solvente.
La luz pasa simultneamente por la celda de muestra y la celda de
referencia.
El espectrmetro compara la luz que pasa por la muestra con la que pasa
por la celda de referencia.
La radiacin transmitida es detectada y el espectrmetro obtiene el
espectro de absorcin al barrer la longitud de onda de la luz.

TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS

Espectrofotmetro de doble haz: es aquel que cuenta con dos compartimientos

para celdas de muestra que le permite medir simultneamente la cantidad de
energa radiante absorbida por una matriz (blanco) y la energa absorbida por la
muestra compuesta por la matriz y la especie de inters.
Espectrofotmetro de haz simple: cuenta con un nico compartimiento de celda
con lo cual se debe realizar la medida de absorcin del blanco para poder
registrar un cero (o referencia) y luego medir la absorcin de la muestra.

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APLICACIONES

Las reas de aplicacin van desde la caracterizacin superficial de slidos hasta el

anlisis fotomtrico de muestras turbias, coloidales, transparentes y traslcidas.
Los usos tpicos abarcan desde pruebas de aseguramiento dela calidad hasta
mediciones de desarrollo de producto de textiles, colorantes, papel y vidrio.

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UNIDAD V. ESPECTROCOPIA INFRARROJA.

FUNDAMENTO.

La espectrometra de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometra

de absorcin que utiliza la regin infrarroja del espectro electromagntico. Como
las dems tcnicas espectroscpicas, puede ser utilizada para identificar un
compuesto o investigar la composicin de una muestra.
La espectrometra infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces qumicos de
las sustancias tienen frecuencias de vibracin especficas, que corresponden a los
niveles de energa de la molcula. Estas frecuencias dependen de la forma de la
superficie de energa potencial de la molcula, la geometra molecular, las masas
atmicas y, posiblemente, el acoplamiento vibracional
Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de
luz infrarroja a travs de la muestra, y se registra la cantidad de energa absorbida.
Repitiendo esta operacin en un rango de longitudes de onda de inters (por lo
general, 4000-400 cm-1) se puede construir un grfico. Al examinar el grfico de
una sustancia, un usuario experimentado puede obtener informacin sobre la
misma.

Esta tcnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho

en qumica, en especial en qumica orgnica. Se pueden generar grficos bien
resueltos con muestras de una sola sustancia de gran pureza. Sin embargo, la
tcnica se utiliza habitualmente para la identificacin de mezclas complejas (1).
La espectroscopa infrarroja tiene casi 125 aos de existencia. El primer espectro
de vibraciones moleculares fue observado en 1881 por Abney y Festing, quienes
prepararon emulsiones fotogrficas sensibles al infrarrojo cercano y fotografiaron
el espectro de absorcin de 48 lquidos orgnicos. Encontraron bandas
caractersticas en estos espectros, las cuales asociaron con la presencia de
hidrgeno en las molculas estudiadas. En 1892, Julius [3.1] obtuvo el espectro
infrarrojo de 20 compuestos orgnicos, encontrando que todos los compuestos
que contienen metilo (CH3) exhiben una banda de absorcin de 3.45 m y lleg a
la conclusin de que la absorcin de ondas calorficas se debe a movimientos
intramoleculares; en otras palabras, la estructura interna de la molcula determina
el tipo de absorcin. Tambin encontr que el efecto no es aditivo; es decir, que
no se puede predecir el espectro de absorcin de un compuesto a partir del
conocimiento de los espectros de los tomos constituyentes (2).
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Los espectrmetros infrarrojos son una de las herramientas ms importantes para

observar espectros vibracionales. Las caractersticas ms relevantes de esta
espectroscopia son las siguientes:
1. Si dos molculas estn constituidas por tomos distintos, o tienen distinta
distribucin isotpica, o configuracin, o se encuentran en ambientes distintos, los
espectros infrarrojos sern distintos.
2. Una sustancia definida puede identificarse por su espectro infrarrojo. Estos
espectros pueden ser considerados como las huellas digitales de dicha sustancia.
3. Los espectros muestran bandas que son tpicas de grupos funcionales
particulares y que tienen localizaciones e intensidades especficas dentro de los
espectros infrarrojos
4. A partir de los espectros se pueden inferir las estructuras moleculares. Para ello
se requiere un modelo en el cual basar los clculos.
5. Las intensidades en las bandas del espectro de una mezcla, son generalmente
proporcionales a las concentraciones de las componentes individuales. Por lo
tanto, es posible determinar la concentracin de una sustancia y realizar anlisis
de muestras con varias componentes.
6. Es posible, mediante el uso de dispositivos experimentales adecuados, obtener
espectros infrarrojos sin alteracin de la muestra, lo que constituye a esta
espectroscopia como una herramienta de anlisis no destructiva.
7. El tiempo necesario para obtener y almacenar un espectro infrarrojo es del
orden de minutos.

MUESTRAS A ANALIZAR.

Las muestras lquidas pueden ser prensadas entre dos planchas de una sal de
alta pureza (como el cloruro de sodio). Estas placas deben ser transparentes a la
luz infrarroja para no introducir ninguna lnea en el espectro de la muestra. Las
placas obviamente son solubles en agua, por lo que la muestra, los reactivos de
lavado y el medio deben ser anhidros (es decir, sin agua).
Las muestras slidas se preparan mezclando una cierta cantidad de muestra con
una sal altamente purificada (por lo general bromuro de potasio). Esta mezcla se
tritura y se prensa con el fin de formar una pastilla por la que pueda pasar la luz.
La pastilla necesita ser prensada a altas presiones para asegurar que sea
translcida, pero esto no puede lograrse sin un equipo adecuado (por ejemplo,
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una prensa hidrulica). Al igual que el cloruro de sodio, el bromuro de potasio no

absorbe la radiacin infrarroja, por lo que las nicas lneas espectrales provendrn
del analito.
ESPECTROMETRA INFRARROJA CON TRANSFORMADA DE FOURIER
(FTIR)
La espectrometra infrarroja por transformada de Fourier (FTIV) es una tcnica de
anlisis para obtener el espectro infrarrojo con mayor rapidez. En lugar de registrar
los datos variando la frecuencia de luz infrarroja monocromtica, se gua la luz IV
(con todas las longitudes de onda de pista utilizada) a travs de un interfermetro.
Despus de pasar por la muestra, la seal medida da el interferograma. La
realizacin de una transformada de Fourier de la seal produce un espectro
idntico al de la espectrometra infrarroja convencional (dispersiva).
Los espectrofotmetros FTIV son ms baratos que los convencionales, porque es
ms simple construir un interfermetro que un monocromador. Adems, la medida
de un solo espectro es mucho ms rpida en esta tcnica, debido a que la
informacin de todas las frecuencias se toman al mismo tiempo. Esto permite
hacer mltiples lecturas de una sola muestra y obtener un promedio, lo que
aumenta la sensibilidad del anlisis. Debido a sus mltiples ventajas, casi todos
los modernos espectrofotmetros de infrarrojos son FTIV .
Esta tcnica proporciona un espectro de reflexin de las bandas de los grupos
funcionales de las sustancias inorgnicas y orgnicas, por lo cual es posible
realizar una identificacin de los materiales. El equipo dotado de una sonda con
fibra ptica permite el anlisis directo de la superficie del objeto de estudio. Se
trate de un Mid-FTIR, Remspec con resolucin de 10 cm-1 en el intervalo
espectral de 900-5000 cm-1.
Recientemente se cuenta adicionalmente con un equipo Alpha de Bruker con un
mdulo de reflexin - sin fibra ptica- para el estudio de minerales y pigmentos en
el intervalo espectral de 400-4000 cm-1 .

APLICACIONES.

La espectrometra infrarroja se utiliza ampliamente tanto en la industria como en la

investigacin cientfica, porque es una tcnica rpida y fiable para medidas, control
de calidad y anlisis dinmicos. Los instrumentos actuales son pequeos y
pueden ser transportados, incluso para tomar medidas de campo. Con los
avances en tecnologa de filtrado computacional y la manipulacin de los
resultados, se pueden medir con precisin las muestras en una solucin (el agua
produce una banda larga de absorbancia en el rango de inters, lo que dara un
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espectro ilegible sin dicho tratamiento computacional). Algunas mquinas incluso

dicen automticamente qu sustancia est siendo analizada a travs de miles de
espectros de referencia almacenados en la memoria.
Haciendo medidas a una frecuencia especfica a travs del tiempo, se pueden
seguir los cambios en la naturaleza o la cantidad de un enlace en particular, lo que
es especialmente til para medir el grado de polimerizacin en la fabricacin de
polmeros. Las mquinas modernas pueden medir en el rango de inters con gran
frecuencia, como 32 veces por segundo. Esto se puede hacer mientras se toman
medidas simultneas con otras tcnicas. As las observaciones de reacciones
qumicas son procesadas con mayor rapidez, y de forma ms precisa y exacta.

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UNIDAD VI. ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA

MAGNTICA NUCLEAR.

FUNDAMENTO.

La espectroscopia de resonancia magntica nuclear (RMN) es una tcnica

empleada principalmente en la elucidacin de estructuras moleculares, aunque
tambin se puede emplear con fines cuantitativos y en estudios cinticos y
termodinmicos.
Algunos ncleos atmicos sometidos a un campo magntico externo absorben
radiacin electromagntica en la regin de las frecuencias de radio o
radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta de esta absorcin depende del
entorno de estos ncleos, se puede emplear para determinar la estructura de la
molcula en donde se encuentran stos.
Se prefieren los ncleos de nmero cuntico de espn nuclear igual a 1/2, ya que
carecen de un momento cuadrupolar elctrico que produce un ensanchamiento de
las seales de RMN. Tambin es mejor que el istopo sea abundante en la
naturaleza, ya que la intensidad de la seal depender de la concentracin de
esos ncleos activos. Por eso, uno de los ms tiles en la elucidacin de
estructuras es el 1H, dando lugar a la espectroscopia de resonancia magntica
nuclear de protn. Tambin es importante en qumica orgnica el 13C, aunque se
trata de un ncleo poco abundante y poco sensible.
La tcnica se ha empleado en qumica orgnica, qumica inorgnica y bioqumica.
La misma tecnologa tambin ha terminado por extenderse a otros campos, por
ejemplo en medicina, en donde se obtienen imgenes por resonancia magntica.

La primera deteccin de Resonancia Magntica Nuclear debida a la formacin de

una diferencia en las energas de ciertos ncleos en presencia de un campo
magntico fue reportada por Bloch (para el agua lquida) y Purcell (para la cera de
parafina) en 1946. La aplicacin qumica de la RMN fue descubierta a principios
de los cincuenta, al observarse que la frecuencia de resonancia de un ncleo
dependa fuertemente de su entorno qumico (chemical shift). A partir de los aos
setenta, el desarrollo de nuevas tcnicas y mayores campos magnticos (que
incrementan tanto la sensibilidad como la resolucin de las seales) permitieron
estudiar molculas cada vez ms grandes. El advenimiento de la RMN
multidimensional y el uso del marcaje 13C y 15N marcaron el inicio de la RMN
biolgica.
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INSTRUMENTACIN
ESPECTRMETRO.

EN

RESONANCIA

MAGNTICA

NUCLEAR:

EL

Un espectrmetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales:

Un imn que genere un campo magntico estable, el cual puede ser de una
intensidad variable, definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo.
Generalmente se identifica cada espectrmetro por la frecuencia de resonancia
del protn, as en un imn de 7.046 Tesla, los ncleos de 1H resuenan a 300 MHz,
y por tanto sera un espectrmetro de 300 MHz. Por el momento el imn de mayor
campo magntico del mundo lo ha instalado Bruker en la Universidad de ciencia y
tecnologa Rey Abdullah en Arabia Saudita, de 950 MHz (22.3 Tesla).1
Una sonda, que se sita dentro del imn, en la que se introduce la muestra y que
consta de las bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El
nmero de bobinas y su disposicin determinan el tipo y las aplicaciones de cada
sonda.
Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la
parte electrnica del espectrmetro
Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza
toda la informacin obtenida.

PRINCIPIOS DE LA TCNICA

La espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) estudia el

comportamiento de ciertos ncleos atmicos (aquellos que poseen spin nuclear
distinto de cero) en presencia de un campo magntico externo. El campo
magntico aplicado produce un desdoblamiento de los niveles degenerados de
energa del spin nuclear, de modo que pueden inducirse transiciones entre ellos
como consecuencia de la absorcin de una radiacin electromagntica adecuada.
La disposicin de los niveles de energa es una propiedad tanto de los ncleos de
una molcula como de su entorno electrnico y de las interacciones entre ambos.
As, la intensidad, forma y posicin de las seales en el espectro de un ncleo
determinado estn intimamente relacionadas con su estructura molecular, por lo
que un anlisis detallado del espectro proporciona valiosa informacin acerca de
la estructura del compuesto que lo origina. Por ello, esta tcnica resulta ser de las
mas eficientes y tiles para el estudio de la estructura y dinmica de molculas en
disolucin.
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APLICACIONES

Estudio de la estructura y dinmica de compuestos orgnicos, organometlicos y

biomolculas en disolucin y en estado slido.

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UNIDAD VII. ESPECTROSCOPIA DE MASAS

MOLECULARES.

FUNDAMENTO.

Hoy en da, esta tcnica contina teniendo los mismos fundamentos que en su
origen, aunque el espectrmetro de hoy en da poco tenga que ver con su
predecesor.
La espectrometra de masas se fundamenta en la separacin de partculas
moleculares o atmicas por su diferente masa.
El proceso de la espectrometra de masas comprende bsicamente cuatro etapas:
Ionizacin de la muestra.
Aceleracin de los iones por un campo elctrico.
Dispersin de los iones segn su masa/carga.
Deteccin de los iones y produccin de la correspondiente seal elctrica.

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IONIZACIN DE LA MUESTRA
La ionizacin de la muestra se consigue por bombardeo mediante electrones (e-)
segn el proceso: M + e- M+ + 2eB.
Aceleracin de los iones por un campo elctrico
Convertimos una fraccin significativa de los tomos formados en la etapa 1 en un
flujo de iones, generalmente positivos y de carga nica.
La velocidad que adquieren viene regida por la frmula: v = [2eV/m]
Donde V es el potencial aplicado, e la carga del electrn y m la masa.
Cuando las partculas aceleradas se someten a la accin de un campo magntico
(H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo,
desarrollando una fuerza centrfuga mv2/r, la cual es igual a la fuerza de atraccin
del campo Hev. De esto deducimos que el radio es igual a:
r = (2Vm/H2e)
Dispersin de los iones segn su relacin masa/carga
Basndonos en la ecuacin anterior podemos calcular la relacin m/e que es:
m/e = H2.r2/2V
Dado que la mayora de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola
carga y que el resto de parmetros se mantienen constantes, la relacin m/e suele
ser la masa del in.
La utilidad analtica de un espectrmetro de masas depende de la resolucin del
instrumento, o capacidad del mismo para separar dos partculas de diferente
masa.
Deteccin de los iones y produccin de la correspondiente seal elctrica
El ordenador al que est conectado el aparato recoge las distintas seales y las
reproduce en forma de espectrograma, formato de fcil interpretacin.

INSTRUMENTACIN

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Bsicamente un espectrmetro de masas costa esencialmente de las siguientes

partes:
*Sistema de entrada de muestras.
*Cmara de ionizacin.
*Acelerador. *Analizadores.
*Detector.

Sistema de entrada de muestras.

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se
convierten al estado gaseoso por calentamiento a unos 400C y se introduce
lentamente en la cmara de ionizacin.
La finalidad del sistema de entrada es permitir la introduccin de una muestra
representativa en la fuente de iones con la mnima perdida de vaco. En los
espectrmetros de masas ms modernos encontramos diferentes tipos de
sistemas de entrada:

Sistemas indirectos de entrada: es el sistema ms clsico y el ms simple, en el

cual la muestra se volatiliza externamente y se introduce en la regin de ionizacin
que est a baja presin. El sistema de entrada es normalmente de vidrio para
evitar posibles prdidas por adsorcin.
Entrada por sonda indirecta: los lquidos y los slidos no voltiles se pueden
introducir en la regin de ionizacin mediante un soporte para muestra o sonda, el
cual se inserta a travs de un cierre de vaco. El sistema de cierre se utiliza para
controlar la cantidad de aire que entra despus de la insercin de la sonda en la
regin de ionizacin. Las sondas tambin se usan cuando la cantidad de muestra
es limitada ya que se pierde mucha menos cantidad.
Sistemas de entrada cromatrogrficos y de electroforesis capilar. Es un tipo de
sistema de entrada especial, est indicado su uso cuando al espectrmetro de
masa va acoplado un sistema de cromatografa de gases o de lquidos de alta
eficacia o a columnas de electroforesis capilar que permiten la separacin y
determinacin de los componentes de mezclas complejas (Mtodos, 2006)
Cmara de ionizacin
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Las fuentes de iones de los espectrmetros de masas, tienen todas unas

caractersticas comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas
transforman los componentes de una muestra en iones.
En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones estn combinados en
un nico componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o
negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior
del analizador de masas o sistema separador a travs del acelerador. (Skoog,
Hiller, Hieman, 2000, 212).
La formacin de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un
anlisis por espectrometra de masas. El aspecto de los espectros de masas para
distintas especies moleculares, depende en gran medida del mtodo utilizado para
la formacin de los iones. Estos mtodos los podemos dividir endos categoras:
Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se
ioniza.
Estn generalmente restringidas a compuestos trmicamente estables que tengan
puntos de ebullicin menores de unos 500C. En la mayora de los casos, estos
requerimientos limitan la utilizacin de las fuentes de fase gaseosa a compuestos
con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons.
Son aplicables a muestras no voltiles y trmicamente inestables (Harvey, 2002,
486) Normalmente los espectrmetros de masas estn equipados con accesorios
que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos
que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons.
Fuentes de desorcin. En estas la muestra en estado slido o lquido, se
transforma directamente en iones gaseosos.
Son aplicables a muestras no voltiles y trmicamente inestables (Harvey, 2002,
486) Normalmente los espectrmetros de masas estn equipados con accesorios
que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes.
Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000
Daltons. Las fuentes de iones se pueden clasificar tambin en fuentes duras y
fuentes blandas.
Fuentes duras: comunican suficiente energa a las molculas para que estn en
un estado de energa altamente excitado. La relajacin posterior, implica la rotura
de las uniones produciendo iones fragmentados. Su espectro da lugar a muchos
picos y nos da informacin acerca de la naturaleza de los grupos funcionales e
informacin estructural de los analitos.
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 Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentacin y el resultado es un espectro

con muy pocos picos dndonos informacin til ya que nos permite la
determinacin exacta del peso molecular de la molcula o molculas

APLICACIONES
Las aplicaciones son muchas y abarcan tantos campos que resulta complicado
citarlas todas, a continuacin veremos las ms caractersticas:
Elucidacin de la estructura de molculas orgnicas y biolgicas.
Determinacin del peso molecular de pptidos, protenas y
oligonucleicos.
Identificacin de los compuestos de cromatogramas en capa fina y
papel.
Determinacin de secuencias de aminocidos en muestras de
polipptidos y protenas.
Deteccin e identificacin de especies separadas por cromatrografa
y electroforesis capilar.
Identificacin de drogas de abuso y sus metabolitos en sangre, orina
y saliva.
Control de gases en enfermos respiratorios durante los procesos
quirrgicos.
Pruebas para confirmar la presencia de drogas en sangre de
caballos de carreras y en atletas olmpicos.
Datacin de ejemplares en arqueologa.
Anlisis de partculas en aerosoles.
Determinacin de residuos de pesticidas en alimentos.
Control de compuestos orgnicos voltiles en el agua de suministro

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VIII. MTODOS DE AISLAMIENTO Y SEPARACIN

Los mtodos cromatogrficos
La cromatografa lquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:
C. de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad
C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin
C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular
C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica
Cromatografa de reparto
La cromatografa de reparto est formada por la cromatografa Lquido-Lquido y la
cromatografa unida qumicamente. Estas tcnicas se diferencian en la forma en
que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En el
segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une
qumicamente a la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada
debido a que la cromatografa lquido-lquido necesita de un recubrimiento
peridico de las partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria
por disolucin en la fase mvil.
En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas qumicamente
se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es el elemento
bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes,
porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la cromatografa de fase unida qumicamente se
clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carcter
no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales
polares.
Esta tcnica puede utilizarse en la separacin de mezclas edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.
Cromatografa De Adsorcin
La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la
cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han
convertido en un mtodo importante de la HPLC.

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Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la
almina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares
inferiores a 5 000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y reparto tienden
a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
En general la cromatografa Lquido-Slido es ms adecuada para muestras que
son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en
disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en
fase inversa. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar
compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de
este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.
Cromatografa De Exclusin
La cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel o
cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de
las molculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separacin
obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de elucin es proporcional
al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos
de alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems
tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre
el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida.
La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una
red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo
tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en
primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el
volmen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el
volmen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes.
Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente. En resumen los
factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el
tamao de la partcula y el flujo de elucin.
Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y
qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y
tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex),
derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas
de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor
resolucin y menor gasto en la columna.

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Este tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin

de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.
Cromatografa De Intercambio Inico
La cromatografa de intercambio inico est basada en la atraccin entre iones del
soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de
intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la fase
estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catinicos contienen
puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.
Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles.
Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas,
en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden
su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos de amonio
cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles
de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y
pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio inico tienen aplicacin en estudios donde intervienen
molculas pequeas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeos de la
resina. Los intercambiadores inicos de poliestireno son tan grandes que las
macromolculas muy cargadas, como las protenas, se pueden enlazar
irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio
inico de macromolculas. Los geles de intercambio inico se usan en el caso de
molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones
exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos
inorgnicos.
En resumen la gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las
diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de
una sustancia.
Todas estas tcnicas tienen en comn la existencia de una fase estacionaria a
travs de la cual fluye una fase mvil, as como la presencia de un mecanismo de
inyeccin de la muestra y un mecanismo de deteccin de los diferentes
componentes separados.
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el qumico sueco Arne
Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta
esfera.
La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico
basada en el movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un
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determinado medio (solucin tampn de electroforesis), a travs de una matriz o

soporte reticulado como resultado de la accin de un campo elctrico. El
comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad electrofortica y sta
por la carga, tamao y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacin
carga/tamao ms rpido migra un in en el seno del campo elctrico.
Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromolculas de
inters en la industria biotecnolgica y qumica. Ha sido un mtodo muy til para la
separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA y RNA)
con gran resolucin.
En un sistema electrofortico pueden originarse distintos fenmenos que afectan
la separacin de las sustancias:
Difusin
Este fenmeno es provocado por la existencia de gradientes de concentacin que
favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentaracin de cada especie.
Afecta tanto a partculas cargadas como no cargadas. Las molculas tienden a
moverse de una forma aleatoria debido a que poseen energa cintica propia. Esto
es lo que se denomina difusin. Con un aumento de la temperatura aumentar la
difusin por un incremento de la energa cintica.
Migracin
Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en
este caso, el campo elctrico y su intensidad.
Flujo trmico
Al pasar una corriente elctrica a travs de un sistema que origina una resistencia
dada, se produce calor. Por tanto el sistema electrofortico no es isotrmico. En
general la fase lquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que
origina un transporte de las partculas de inters no debido a la migracin.
Friccin
La friccin con el solvente dificultar el movimiento (es decir, al moverse los
solutos chocarn con las molculas del solvente que estn en su camino), lo que
genera una fuerza que se opone al movimiento.
La suma de todos estos factores provoca que las molculas no migren de una
manera uniforme, de modo que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar
de la solucin, los iones comenzarn a moverse formando un frente cuya anchura
aumentar con el tiempo. Para reducir esta anchura podemos reducir el
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movimiento de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a

dicho movimiento.
Esta situacin nos permite diferenciar dos mtodos electroforticos:
Electroforesis convencional
Electroforesis capilar.
Electroforesis Convencional
La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos aos para separar
especies complejas de elevado peso molecular de inters biolgico y bioqumico.
Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un
gel semislido y poroso que contiene un tampn acuoso en el interior de sus
poros. Esta ser la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de
las molculas, controlando as su migracin uniforme.
Mediante esta tcnica se pueden separar varias muestras simultneamente.
Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente
continua a travs del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se
han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se
tien para visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la deteccin, control de pureza,
caracterizacin, cuantificacin (por comparacin con controles) as como
preparacin y purificacin (por extraccin de bandas desde el gel) de molculas y
fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polmeros ramificados
que tienen los espacios entre ramificacin rellenos de lquido. Las redes de
polmeros no solo reprimen la conveccin sino que tambin actan como cribas
que pueden retardar y hasta bloquear la migracin de los analitos polimricos ms
grandes. En cambio los iones pequeos pueden moverse libremente a travs de la
estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos
mecanismos de separacin: electroforesis, que separa por la relacin
carga/tamao y tamizado, que separa mayormente por tamao. Los geles ms
comunes son agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polmero derivado de un polisacrido neutro, que gracias a su
poder de gelificacin y propiedades fsico-qumicas, lo han convertido en el
soporte ms comn para electroforesis en el rea de Biologa Molecular. La
poiliacrilamida es un polmero formado a partir de acrilamida y N,N

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metilenbisacrilamida. La concentracin de ambos reactivos define el grado de

reticulacin del gel.
Ambos geles tienen en comn que adquieren la misma forma y estn
prcticamente libres de cargas inicas. Esto es importante para evitar que la
disolucin tampn se desplace por el gel cuando se active el campo elctrico.
A continuacin se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar
esta tcnica de separacin:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnolgica,
aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados
que se encuentran en la literatura ms actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles
desnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y la electroforesis
preparativa. Estas tcnicas no son de aplicacin tan general pero no por ello dejan
de ser importantes.
Electroforesis Capilar (CE)
La electroforesis capilar es una tcnica alternativa de la electroforesis
convencional y surge debido a que la velocidad de separacin y resolucin de los
compuestos mejora a medida que aumenta el campo elctrico aplicado. Esta
afirmacin no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una
dependencia directa de ste con el campo elctrico. Esto se debe a que el
calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separacin. Para
solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar con
un dimetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta tcnica
est representada en el siguiente esquema:
El mecanismo de separacin est basado en las relaciones carga/masa de los
analitos. Su utilidad est en la separacin de protenas y pptidos entre otras
sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da
lugar a separaciones con volmenes de muestra extraordinariamente pequeos
(de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se
emplean volmenes de muestra en el orden de los L, con una elevada resolucin
y rapidez. Ofrece adems mayor facilidad y velocidad que la cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC).
Esta tcnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los
mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayora con muy
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baja concentracin inica, incorpora los principios de la automatizacin a travs de

un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado, aunque
la reproducibilidad en el anlisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se
pueden utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como
resultado se obtiene un electroferograma con picos caractersticos de cada
compuesto separado. En realidad ambas tcnicas son complementarias al
basarse en mecanismos de separacin diferentes.
Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la tcnica de electroforesis con la
cromatografa de reparto. Permite la separacin en funcin de la migracin
electrofortica y tambin en funcin del peso molecular de las muestras. Se lleva a
cabo en una matriz polimrica con estructura de gel poroso, cuyos poros
contienen una mezcla tampn donde ocurre la separacin. Estos geles estn
contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son tambin de agarosa y
poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las tcnicas ms importantes y ms
utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separacin.
Est basada en la separacin de los analitos segn la relacin carga/tamao.
En esta tcnica la composicin del tampn es constante en toda la zona de
separacin. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes inicos de
la mezcla migren cada uno segn su propia movilidad y se separen en zonas que
puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas
completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampn. Su principal
inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros.
Enfoque isoelctrico: la diferencia de los puntos isoelctricos de las protenas se
aprovecha para separarlas por el mtodo de isoelectroenfoque. Este mtodo se
basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolucin o gel. Este
gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos
que migran por s mismos hasta que alcanzan sus puntos isoelctricos. Cuando al
gradiente de pH se le introduce una protena, cada zona intercambia protones con
la muestra proteica, generando una separacin isoelctrica conocida como
electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el
tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforticas es
independiente de la velocidad. Es una tcnica de separacin por desplazamiento.
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Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito lder o gua
en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los
componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito
terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los
componentes de la muestra. La seleccin de los electrolitos guas y terminales
depende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos
los componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre estn en contacto con la zona adyacente.
Esta caracterstica es necesaria para mantener la continuidad elctrica a lo largo
del sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta tcnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere
usualmente corridas separadas para determinar cada forma inica.
La electrocromatografa capilar es un hbrido entre la HPLC y la CE donde se
renen algunas de las mejores caractersticas de cada tcnica por separado, por
lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografa capilar
puede usarse para la separacin de especies no cargadas. Proporciona una
elevada eficacia en las separaciones de microvolmenes de disolucin de
muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presin.
En la electrocromatografa capilar la fase mvil se transporta a travs de la fase
estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmtico y no por un
bombeo mecnico, lo que simplifica significativamente el equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografa capilar:
Electrocromatografa rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo
electroosmtico a travs de un capilar que contiene un relleno tpico de HPLC en
fase inversa. Las separaciones dependen de la distribucin de los analitos entre la
fase mvil y la fase estacionaria lquida retenida por el relleno.
Cromatografa capilar electrocintica micelar. Esta tcnica requiere la utilizacin de
un tensoactivo en un nivel de concentracin en el cual se formen micelas. Estas
micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interaccin
de las micelas y los solutos es la que produce la separacin.
En resumen la cromatografa y la electroforesis son en la actualidad tcnicas
ampliamente utilizadas en la resolucin de macromolculas de inters en la
industria biotecnolgica, biolgica y bioqumica. Muestra de ello es el numeroso
grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada.

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Se destaca en las ltimas dcadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta

versin instrumental de la electroforesis convencional resulta ms ventajosa
debido a los pequesimos volmenes que se necesitan para el estudio en
cuestin y los resultados se obtienen en un tiempo mnimo. Estos aspectos la
hacen preferida entre las tcnicas de separacin.

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BIBLIOGRAFA

1. http://www.espectrometria.com/espectrometra_ultravioleta-visible
2. http://ocw.uc3m.es/ingenieria-quimica/quimica-ii/practicas-1/PR-FAnexos.pdf
3. http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml#ixzz3uL4SmFDX
4.

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