Christian Frigerio

Optimizao e influncia na bioactividade do processo de secagem por radiao

infravermelha de amostras de plen apcola

Dissertao de Mestrado

MCQ Mestrado em Controlo da Qualidade

gua e alimentos

Trabalho realizado sob a orientao da Professora Maria da Graa Ribeiro Campos

Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira

Setembro 2009

 autorizada a reproduo integral desta Dissertao/Tese apenas para efeitos de

investigao mediante declarao escrita do interessado, que a tal se compromete;

Christian Frigerio

Resumo
O plen apcola definido na legislao como um alimento, e o resultado da
aglutinao de polenes de origem floral, feita pelas abelhas, com nctar (e/ou mel) e
saliva, que colectado a entrada da colmeia.
No presente trabalho uma nova tcnica pela determinao da humidade do plen apcola
baseada na utilizao de radiaes infravermelhas foi desenvolvida.
O mesmo instrumento foi usado como modelo para estudar os efeitos da secagem no
infravermelho no perfil fenlico e na actividade anti-radicalar de plen apcola. A anlise
da humidade pelo mtodo do IV mostrou uma boa reprodutibilidade e foi validada. A
actividade anti-radicalar, avaliada pelo mtodo do 2,2 difenil-2-picrilidrazil (DPPH), e o
perfil fenlico no foram afectados pelo processo de secagem com IV, o que permite
diminuir o tempo dedicado e o custo desta operao crtica.
Palavras-chave; Plen apicola; infravermelho, anti-radicalar; 2,2-difenil-2-picrilidrazil;
compostos fenlicos; flavonides; produtos naturais
Abstract
Bee-pollen is defined in the legislation as food and is the result of the agglutination of
flower pollens, made by the worker bees, with nectar (and/or honey) and salivary
substances, which is collected in the entrance of the hive. In this work a new moisture
analysis technique based on the use of infrared radiation was developed for commercial
bee pollen. The same instrument was also used to study the effects of the IR drying on
the bee pollen radical scavenge activity and phenolic/flavonoidic profile. The moisture
analysis by IR method shows a good reproducibility and was validated face of a official
method. The radical scavenge activity, assayed by 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
method, and the phenolic/flavonoidic profile werent affected by the IR drying process, that
therefore permit decreasing the time and the cost of this critical operation.
Keywords; Bee Pollen; infrared; Radical Scavenging; 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl;
Phenolic Compounds; Flavonoids; Natural Products

ii

ndice das figuras

Figura 1.1______________________________________________________________1
Figura 1.2______________________________________________________________2
Figura 2.2.1____________________________________________________________17
Figura 2.5.1____________________________________________________________20
Figura 2.5.2____________________________________________________________20
Figura 2.6.1____________________________________________________________22
Figura 2.6.2____________________________________________________________22
Figura 2.6.3____________________________________________________________23
Figura 2.6.4____________________________________________________________23
Figura 2.6.5____________________________________________________________24
Figura 3.1.1____________________________________________________________26
Figura 3.1.2____________________________________________________________26
Figura 3.1.3____________________________________________________________27
Figura 3.3.1____________________________________________________________29
Figura 3.3.2____________________________________________________________30
Figura 3.3.3____________________________________________________________31
Figura 3.3.4____________________________________________________________31
Figura 3.3.5____________________________________________________________32
Figura 3.3.6____________________________________________________________33
Figura 3.4.1____________________________________________________________34
Figura 3.4.2____________________________________________________________34
Figura 3.4.3____________________________________________________________35
Figura 3.4.4____________________________________________________________36
Figura 4.1_____________________________________________________________38
Figura 4.2_____________________________________________________________39

iii

ndice das tabelas

Tabela 2.5.1___________________________________________________________21
Tabela 3.2.1___________________________________________________________28
Tabela 3.2.2___________________________________________________________28
Tabela 3.2.3___________________________________________________________29
Tabela 3.3.1___________________________________________________________30
Tabela 3.3.2___________________________________________________________32
Tabela 4.1_____________________________________________________________37
Lista abreviaturas e smbolos
ABS; absorvncia
C; graus Clsius
CE50; concentrao eficaz a 50%
DPPH; 2,2 difenil-2-picrilidrazil ou 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl
eq.; equivalentes
FP VIII; Farmacopeia Portuguesa VIII
HPLC/DAD; cromatografia de alta prestao com detector de fotodiodos
IR; infrared
IV; infravermelho
M; molar
ml; mililitro
nm; nanometro
RH%; humidade relativa
RSD%;
SD; desvio padro
sol; soluo
UV; ultra violeta
l; microlitro
g; micrograma
; cerca de
; comprimento de onda
max; comprimento de onda mximo
; variao

iv

SUMRIO
1. Introduo___________________________________________________________1
1.1 Bioactividade teraputica _______________________________________5
1.1.1 Actividade antioxidante __________________________________5
1.1.2 Actividade Antiaterosclertica ____________________________7
1.1.3 Actividade Anti-inflamatria______________________________8
1.1.4 Actividade nas alteraes patolgicas da prstata___________9
1.1.5 Actividade na osteoporose ______________________________11
1.1.6 Anemia e o sistema hemapoitico________________________12
1.1.7 Actividade antimicrobiana_______________________________14
1.1.8 Actividade antidiarreica_________________________________14
1.1.9 Reaces alrgicas e toxicidade__________________________15
2. Materiais e mtodos__________________________________________________17
2.1 Material vegetal_______________________________________________17
2.2 Secagem_____________________________________________________17
2.3 Determinao da humidade relativa______________________________18
2.4 Preparao dos extractos_______________________________________19
2.5 Anlise cromatogrfica_________________________________________19
2.6 Determinao da actividade anti-radicalar_________________________21
2.7 Anlise estatstica_____________________________________________25
3. Resultados e discusso_______________________________________________26
3.1 Determinao da origem floral___________________________________26
3.2 Determinao da humidade relativa______________________________27
3.3 Efeitos da secagem no perfil fenlico_____________________________29
3.4 Efeitos da secagem na actividade anti-radicalar____________________33
4. Concluses_________________________________________________________37
5. Bibliografia_________________________________________________________41

1. Introduo

O gro de plen o micrsporo das Espermatfitas, e formado nos sacos polnicos das
anteras. O transporte do plen nas Gimnosprmicas de tipo anemfilo (atravs do
vento) e nas Angiosprmicas pode ser tanto anemfilo quanto zooidfilo (atravs de
animais) ou, mais raramente, hidrofilio (gua). O transporte do plen pelas abelhas
(melitofilia) , portanto, um caso particular da zooidofilia (Paiva e Figueredo, 1987).
O plen, em conjunto com o nctar, o alimento principal das abelhas, que, por este
motivo, possuem rgos de recolha especializados para cada um destes substratos. A
armadura bucal est adaptada suco de nctar e as patas para a recolha de plen,
que compactado em gros, chamados cargas polnicas. Esta compactao possvel
com o auxlio do nctar. Com o primeiro par de patas a abelha limpa o plen de toda a
parte anterior do corpo e junta-o no aafate das patas traseiras. O plen assim
agrupado sobre uma escova que se encontra na primeira articulao do tarso das patas
posteriores (Figura 1.1). Com o segundo par de patas recolhe o que se encontra no trax
e na regio ventral. Cada recolha incide quase sempre sobre um nico taxon, e
raramente misturam diferentes plens na mesma carga, geralmente numa proporo
inferior a 1%. Por esta razo podemos considerar estas cargas como puras (Campos,
1997).

Figura 1.1 Abelha a colher plen e com a carga polnica direita em destaque (neste caso
de colorao laranja) (www.apiarioanhembi.com.br)
Para alm disso, sabido que as abelhas s visitam uma pequena parte da flora e no
necessariamente em funo da produo de plen, mas pelas caractersticas dos
constituintes.
As razes pelas quais as abelhas se orientam para as colheitas ainda no esto bem
definidas, embora, Lindsted (1971) tenha demonstrado que, como existem compostos

que as atraem e orientam, ou at as viciam, impedindo-as de procurar outro tipo de

alimento, elas se fidelizam na colheita.
Dillon e Louveaux (1987) mostraram que os estmulos que intervm para a recolha do
gro de plen esto hierarquizados: o estado pulverulento da substncia o estmulo de
base; em seguida, intervm os estmulos olfactivos complexos. O plen praticamente a
nica fonte de protenas para as abelhas (Penfold e Willis, 1961).
As abelhas no consomem o plen directamente no local da colheita, mas transportamno e armazenam-no na colmeia. Mesmo por causa deste comportamento possvel
recolher o plen atravs de um dispositivo chamado caa-plen (Figura 1.2).

Figura 1.2 Caa Poln (www.prometal.cl)

As abelhas so foradas a entrar para a colmeia, passando por uma rede de orifcios de
tamanho igual ao do seu corpo, o que provoca a queda das cargas polnicas que
transportam nas corbcolas das patas traseiras numa gaveta colocada debaixo da
entrada da colmeia.
Sendo que o plen a principal fonte de alimentos para as abelhas e para as larvas, uma
dada percentagem dos orifcios do caa-plen permite a entrada de uma parte da colheita.
A partir do plen armazenado as abelhas produzem a Geleia Real para alimentar as
larvas e a rainha.
O plen mais vulgarmente comercializado o que se retira entrada da colmeia, sem
que tenha sofrido nenhuma alterao qumica.
Os produtos da colmeia, incluindo o plen apcola, so usados, enquanto alimento divino,
desde h muitos sculos, criando uma ligao entre a dieta, a medicina e a terapia.
Aproximadamente em 487-380 a.C., Herodicos de Selymbrie, mestre de ginstica,
inaugurou o seu mtodo da dieta, Grand Arte e no mesmo perodo Hippocrate de Cos
(a.C. 460-377) estabeleceu as regras no seu Tratado da Dieta The Food and the Man
Nature (Debry, 1991). Desde ento, empiricamente ou no, reconheceu-se que uma

dieta correcta poderia ter um efeito profilctico e evitar o aparecimento de algumas

doenas.
No que diz respeito aos produtos da colmeia foram publicados muitos artigos,
principalmente sobre o mel. No entanto, sobre o Plen Apcola e a Geleia Real muito
trabalho ainda est por fazer.
Um problema da maioria dos artigos publicados, relacionado com os nutrientes presentes
no Plen Apcola, a falta da identificao da espcie floral das amostras utilizadas no
estudo. reconhecido que isso tem influncia no tipo e na quantidade dos constituintes
investigados. Existem j vrios estudos que suportam a ideia de que o teor em
macronutrientes do Plen Apcola faz deste produto um bom suplemento alimentar,
principalmente devido s propores bem equilibradas de protenas, de lpidos e de
hidratos de carbono. Tambm o valor calrico do Plen Apcola foi avaliado por alguns
autores em 381,70 + 14,69 kCal (1595,51kJ) por 100g (Orzaez-Villanueva et al., 2002).
De acordo com Peris (1984), uma dose diria de 15g de Plen Apcola fornece a
quantidade mnima de aminocidos necessrios ao corpo humano. Cerca de 40% do seu
contedo constitudo por vrios tipos de acares. Este valor pode variar em funo
dos compostos que os autores incluem nesta classe. Por exemplo, Huidobro (1987)
obteve valores de 61%, mas considerando como parte desta fraco acares redutores
(frutose, glicose), maltose, sacarose e polissacridos. Nesse mesmo trabalho foram
includos, num grupo especial, o amido e outros polissacridos que no so absorvidos
como, por exemplo, celulose, hemicelulose, lenhina, esporopolenina, etc. Esta separao
efectivamente importante, pois foi verificado que aproximadamente 50% do peso do
Plen Apcola corresponde a material insolvel, tanto em solventes orgnicos como em
solventes aquosos, onde provavelmente se podero incluir as fibras (Campos, 1997). Os
lpidos e os minerais (clcio, fsforo, magnsio, ferro, cobre, mangansio, etc.)
representam 5 e 3% respectivamente. A maior parte (60%) dos cidos gordos encontramse na forma livre. Os cidos gordos ligados, so caracterizados por um elevado teor de
cido -linolnico (70%) seguido por pequenas quantidades de cido linoleico e oleico. O
cido palmtico o cido gordo saturado mais abundante (Seppnen et al., 1989). No
Plen Apcola encontram-se ainda diversas vitaminas como as do complexo B, o cido
ascrbico e tambm as vitaminas A, D e E. A variao das concentraes destes
compostos nas diversas espcies de plen pode ser explicada com os resultados mdios
das anlises apresentadas em bibliografia (Herbert et al., 1987; Hagedorn e Burguer,
1967).
Face a estas consideraes evidente a necessidade de mais investigao para chegar
padronizao deste produto, que dever ser sujeito a um rigoroso controlo de qualidade,
quer seja uma aplicao diettica, quer uma matria-prima bioactiva para possveis

aplicaes teraputicas (Campos, 1997), nomeadamente a incluir em Medicamentos

Base de Plantas.
A partir deste pressuposto fcil entender a utilidade do trabalho desenvolvido, onde
tentamos desenvolver e validar uma tcnica til pelo controlo da qualidade do plen
apcola.
Como se ver nos prximos captulos, esto descritas determinadas actividades s para
determinados taxa, pois em funo deste muda o perfil dos constituintes presentes.
Muitos trabalhos da literatura cientfica falham neste ponto, o que torna os resultados
dificilmente reprodutveis, no sendo a matria-prima padronizada. Da a necessidade de
utilizar um mtodo sistemtico para caracterizar o Plen Apcola em relao aos seus
polns constitutivos.
A composio floral do plen afectada por diferenas na rea de colheita e, na mesma
rea, pela estao (Szczesna et al., 2002).
Campos et al., (1996, 1997) realizaram vrios estudos que envolveram amostras de
Plen Apcola colhido em zonas e anos diferentes e que nos ajudam na identificao das
fontes

florais.

mtodo

utilizado,

que

envolveu

anlise

dos

perfis

flavonidicos/fenlicos das amostras, por cromatografia lquida de alta presso com

detector de fotodiodos (HPLC/DAD), demonstrou ser mais sensvel e preciso do que a
anlise microscpica. Para alm disso, o perfil das espcies independente de factores
geogrficos ou climticos, o que torna este mtodo universal.
Este mesmo mtodo foi utilizado em estudos taxonmicos mais avanados por AlmarazAbarca et al., (2008), onde se concluiu, por exemplo, que o perfil flavonidico/fenlico
representa um importante marcador taxonmico nas Cactaceae.
Do ponto de vista da actividade teraputica de fundamental importncia, para alm da
identificao da espcie floral, a determinao digamos quantitativa da bioactividade.
No caso da actividade antioxidante, pode ser avaliada atravs de ensaios simples como o
do DPPH (Leja et al., 2007, Silva et al., 2006). Campos et al. (2003), estabeleceram que
a actividade anti-radicalar especfica da espcie, independente da zona e da estao
de colheita, e que tende a diminuir com o envelhecimento.
Sendo esta actividade possivelmente ligada a outras, como por exemplo a actividade
anti-inflamatria, antiaterosclertica ou anti-cancergena, a sua avaliao pode ser
utilizada como marcador da bioactividade de Plen Apcola.
Aqui insere-se a segunda parte do trabalho, ou seja a tentativa de aplicar o mesmo
principio sobre que se baseia a determinao por infravermelhos da humidade na
secagem do plen apcola, e ver se esta tcnica altera a actividade anti-radicalar.

2. Bioactividade teraputica
1.1 Actividade antioxidante
Entre as diferentes teorias sobre o impacto dos radicais na sade a radical theory of
aging a que ganhou mais adeptos aps a descoberta do envolvimento dos radicais
livres em quase todos os processos de degradao celular, como doenas
cardiovasculares, artrite, cancro, diabetes, etc., e podem igualmente ser os responsveis
pela doena de Parkinson e de Alzheimer (Fher et al., 1986).
Existem tambm dados contrastantes com respeito aos efeitos anti-envelhecimento dos
antioxidantes, e muito pouco dito sobre a eficcia e a biodisponibilidade dos
antioxidantes exgenos em comparao com os nveis normais de antioxidantes
prprios do organismo, quando este se encontra num estado saudvel normal (Le Bourg,
2001).
Tambm o Plen Apcola foi usado durante sculos para proteger o organismo das
doenas e, especialmente, para reduzir o processo de envelhecimento. Seguindo esta
teoria Dudov e Starodub (1994), alimentaram ratos com Plen Apcola durante um ms e
estudaram o estado do sistema redox dos eritrcitos. Estabeleceram que o teor de
glutationa, os grupos -SH totais, assim como, a actividade da glutationa peroxidase e da
glutationa reductase aumentaram em comparao com o grupo de controlo.
Simultaneamente houve uma diminuio do malonodialdedo e de conjugados dinicos
nos eritrcitos. A actividade da superxido catalase e da superxido dismutase aumentou,
mas no de forma significativa. Os autores concluram, portanto, que nos eritrcitos dos
ratos alimentados com Plen Apcola os processos oxidativos foram bloqueados.
A resposta imunitria humoral primria e secundria (o nvel de IgM e IgG especficas),
assim como a intensidade da hipersensibilidade tardia aos eritrcitos de ovelha, foram
investigadas em coelhos alimentados com Plen Apcola durante um ms. Os resultados
mostraram que o Plen Apcola possui actividade imunomoduladora, enquanto estimulou
a resposta imune humoral e alterou a reaco da hipersensibilidade tardia (Dudov et al.,
1994).
Talvez isto tudo possa ser explicado atravs da teoria antioxidante. O exerccio fsico
aerbio impe ao organismo um consumo suplementar de oxignio, que nos seres
humanos pode chegar a ser dez vezes o consumo bsico. O conceito de esforo
oxidativo supe, antes de tudo, a rotura do equilbrio precrio existente entre a produo
e a inactivao dos radicais livres do oxignio. Portanto, com o exerccio fsico o stress
provocado por um excesso da produo de radicais. Todavia, parece paradoxal que
uma pessoa que pratica desporto com regularidade viva numa situao de esforo

oxidativo permanente, pagando as consequncias que isso implica. Hoje em dia

reconhecido pelos cientistas que o treinar a resistncia, sendo este um mecanismo
adaptvel, aumenta as defesas antioxidantes, evitando ento que o maior consumo de
oxignio provoque consequncias negativas.
Liu e Li em 1990 observaram o efeito morfolgico do Plen Apcola na lipofuscina
intercelular de ratos NIH. Os resultados demonstraram uma reduo da concentrao de
lipofuscina no msculo cardaco, no fgado, no crebro e nas glndulas supra-renais aps
administrao do Plen Apcola.
Um grande nmero de artigos foi publicado na tentativa de encontrar uma relao entre a
actividade antioxidante e os componentes do Plen.
De facto, no foi possvel estabelecer uma relao/ligao absoluta entre eles mas
verificou-se que a papel principal poderia ser atribudo aos compostos fenlicos (Campos
et al., 2003; Campos et al., 2000; Campos et al.,1994; Leja et al., 2007; Ohta et al., 2007).
Foi tambm descoberto que a actividade antioxidante do Plen Apcola especfica da
espcie e independente da sua origem geogrfica (Campos, 1997; Almaraz-Abarca et al.,
2004) e que diminui com o envelhecimento do Plen, principalmente se as condies de
armazenamento no so as ideais (Campos et al., 2003).
O Plen Apcola mostrou bons resultados tambm num estudo que visava avaliar a sua
actividade na peroxidao do cido linoleico e na captao do radical hidroxilo (Liu e Li,
1990).
Bevzo e Grygor'eva (1997) provaram que pequenas doses de raios-X activavam a
peroxidao lipdica e as enzimas antioxidantes no fgado de ratos. A introduo de
extracto de Plen Apcola na dieta dos animais normalizou a actividade de algumas
enzimas do sistema da glutationa.
A exposio crnica combinada a radiaes ionizantes (dose de 0,25 GY), e cloretos de
cdmio ou atrazina, na gua em concentraes 5 vezes superiores Limited Permissible
Concentration (LPC), levou a um incremento no nvel intercelular de K+, reduzido no
crebro do rato. No caso das radiaes isto causado por alteraes no transporte activo
dos ies, e por alteraes na permeabilidade da membrana no caso dos xenobiticos.
Administrando leo com -caroteno e Plen Apcola os efeitos da radiao foram
eliminados, mas os dos xenobiticos no. Os autores teorizaram que a aco selectiva
dos frmacos est ligada sua actividade antioxidante (Anan'eva e Dvoretskii, 1999).
Uzbekova et al., (2003) avaliaram os efeitos da administrao de Plen Apcola nas
funes hepticas de ratos idosos. Aps um ms observaram uma diminuio dos nveis
do malonodialdedo e uma normalizao no nvel dos grupos tilicos (SH-G). Tambm o
teor de ureia srica e protenas melhorou significativamente.

Na medicina tradicional chinesa uma mistura de Plen Apcola, de Radix Polygoni

multiflore, semen ziziphi spinosae, radix salviae multiorhizae, fructus schisandrae e
fructus ligustris lucidae, conhecido como NAO Li SU, usado como remdio para a
diminuio da memria. Iversen et al., (1997) avaliaram o efeito da preparao num
estudo duplamente cego com placebo, em 100 voluntrios idosos afectados por
problemas de deteriorao da memria. Os efeitos foram avaliados aps um perodo de 3
meses de tratamento, por um conjunto de testes psicolgicos e bioqumicos. Nenhum
efeito desejado foi observado, mas houve aumento do nmero de eritrcitos e dos nveis
de creatinina srica aps tratamento. No subgrupo que inicialmente mostrou um nmero
de eritrcitos abaixo da mdia, foi encontrada uma correlao positiva significativa entre o
aumento deste parmetro e alteraes na pontuao da Wechsler Memory Scale.
A actividade antioxidante marcada, em particular como radical scavenger, do Plen
Apcola permite-nos pensar que pode ser um factor relevante em algumas das
bioactividades aqui apresentadas.
1.2 Actividade Antiaterosclertica
A aterosclerose um problema de sade de grande importncia hoje em dia. o termo
utilizado para descrever a infiltrao de moncitos, acumulao de substncias gordas,
colesterol, resduos do metabolismo celular, clcio e fibrina, acumulando-se no
revestimento interno de uma artria. A acumulao resultante chamada placa.
Arteriosclerose um termo geral usado para definir o espessamento e o endurecimento
das artrias que pode ocorrer normalmente com a idade. A placa pode ento obstruir
parcial ou totalmente a corrente sangunea.
Alguns grupos de investigao demonstraram que o extracto de Plen tem propriedades
benficas, baixando os nveis plasmticos de lpidos (Samochowiec e Wjcicki, 1981;
Wjcicki e Samochowiec, 1984), reduzindo o tamanho da placa arteriosclertica (Wjcicki
et al., 1986) e diminuindo a agregao das plaquetas in vitro (Kosmider et al., 1983) e in
vivo (Wjcicki e Samochowiec, 1984). Os resultados destes ensaios foram confirmados
nos seres humanos (Wjcicki et al., 1983) e sugerem que a adio de cidos
polinsaturados dieta diminui a viscosidade do sangue e reduz os nveis de triglicridos e
colesterol nos pacientes com doena cardiovascular.
Seppnen et al. (1989) analisaram em cromatografia gasosa a composio dos cidos
gordos presentes no extracto lipossolvel de Plen (Cernitin GBX), que tem actividade
antiaterosclertica comprovada. As anlises revelaram que a maior parte (mais de 60%)
dos cidos gordos encontrava-se na forma livre, em particular (cerca de 70%) cido
linolnico (18:3n-3, -ALA).

O cido -linolnico um cido gordo essencial, ou seja, essencial para a sade

humana mas no sintetizado pelo organismo. Por este motivo, o ALA deve ser obtido
atravs da alimentao. O ALA, assim como o cido eicosapentaenico (EPA) e o cido
docosahexaenico (DHA), pertencem ao grupo dos cidos gordos omega-3 (-3).
Uma vez ingerido, o ALA convertido em EPA e DHA, que so mais prontamente usados
pelo organismo. O EPA tem actividade anti-coagulante, enquanto reduz a agregao
plaquetria. incorporado in vivo nos fosfolpidos das plaquetas, onde substitui, em certa
medida, o cido araquidnico e compete com este para a ciclo-oxigenase e a
lipoxigenase, exercendo assim um efeito anti-trombtico. Tambm pode ser convertido
em prostaglandina H3 e a tromboxano A3, compostos que promovem de forma menor a
agregao plaquetria (Moncada e Vane, 1984).
1.3 Actividade Anti-inflamatria
A inflamao uma resposta fisiolgica ao dano, fsico ou biolgico, dos tecidos ou das
clulas, que envolve um conjunto de reaces destinadas a remover a causa e a reparar
o dano.
Podemos distinguir dois tipos de inflamao:
- Inflamao aguda, de curta durao, caracterizada por edema e o movimento das
clulas do sistema imune, desde o sistema vascular para os tecidos extra-vasculares,
com o objectivo de eliminar a causa do dano e reparar os tecidos.
- Inflamao crnica, processo de longa durao, onde a inflamao, a destruio dos
tecidos e a recuperao ocorrem ao mesmo tempo.
Para o tratamento da inflamao so actualmente usados frmacos anti-inflamatrios
no-esterides e frmacos anti-inflamatrios esterides, que nem sempre tm grande
sucesso na cura destes sintomas. Por essa razo h necessidade de investigar uma
nova e segura classe de frmacos anti-inflamatrios.
Choi (2007) avaliou a actividade antinociceptiva e anti-inflamatria de extractos de Plen
de pinheiro (Pinus densiflora) em ratos. Os resultados sugeriram que o efeito analgsico
possa estar relacionado com as suas propriedades anti-inflamatrias, neurognicas e
narcticas, e que o extracto actua na cicloxigenase e na lipoxigenase. O autor especulou
que os compostos responsveis pelas actividades possam fazer parte da fraco
flavonidica do extracto, de acordo com a extensa bibliografia que existe sobre a
actividade anti-inflamatria destas molculas (Kim et al., 2004).

1.4 Actividade nas alteraes patolgicas da prstata

Uma das actividades teraputicas mais conhecidas do plen a actividade profilctica e
curativa nas desordens da prstata.
Os trs problemas mais comuns que podem afectar este rgo so: inflamao
(prostatite), inchao da prstata (hiperplasia prosttica benigna/BPH), e cancro. Nem a
prostatite nem o inchao da prstata so reconhecidos como causas directas do
desenvolvimento do cancro. No entretanto, possvel que os homens que tm uma ou
ambas dessas patologias venham a desenvolver tambm cancro da prstata.
Por volta dos 60 anos, mais de metade dos homens americanos tm sinais microscpicos
de BPH, e pelos 70 anos mais de 40% tero hiperplasia detectvel por exame fsico. Aos
50 anos, um tero tem sinais microscpicos do cancro de prstata, e chegando aos 75
anos, metade a trs quartos tero cancro. A maioria destas neoplasias permanecem
latentes, no proporcionam nenhum sinal ou sintoma ou tm um crescimento lento, pelo
que nunca se transformam numa ameaa grave sade (http://www.cancer.gov).
A prostatite crnica uma condio muito comum e mal compreendida com impacto
significativo na qualidade de vida dos homens. Devido falta de eficcia das terapias
convencionais, no surpreendente que os pacientes se tenham orientado com
frequncia crescente para a fitoterapia e outros tratamentos complementares.
Embora algumas destas terapias possam ser abundantemente usadas, somente poucas
foram sujeitas a estudos cientficos minuciosos e testadas em ensaios clnicos
controlados.
Nestes tratamentos esto includos o Zinco, Cernitin Pollen Extract (Becker e Ebeling,
1988; Buck et al., 1990; Macdonald et al., 1999; Wilt et al., 2000; Thompson, 2001),
Quercetina, Saw Palmetto (Serenoa repens) e acupunctura. As terapias complementares
podem certamente ter muito para oferecer aos pacientes, em particular para aqueles com
condies crnicas e degenerativas, em que as terapias convencionais no deram bons
resultados. No entanto, estas terapias necessitam de ser validadas segundo os mesmos
critrios cientficos usados para terapias mdicas convencionais (Shokes, 2002).
Lin et al. (1990) estudaram as alteraes morfolgicas da hiperplasia prosttica canina
tratada com Plen Apcola. Doses de 5-10 g/kg de amostra foram administradas por via
oral ao longo de 2 meses a ces idosos com hiperplasia prosttica. O tamanho da
prstata reduziu igualmente aps 1 ou 2 meses. O exame microscpico mostrou uma
marcada diminuio no dimetro da glndula, na altura do tecido epitelial e uma menor
introverso/invaginao pipilar do epitelium em comparao ao controlo. Nenhum efeito
foi observado nos nveis plasmticos de estradiol ou de testosterona, assim como,
nenhuma toxicidade aparente.

Bruneton (1999) relatou no Compendium of Pharmacognosy que um extracto de plen

de flora seleccionada foi comercializado como tratamento para a prostatite. O extracto
inclui duas fraces bioactivas. Uma hidrossolvel e a outra, rica em esteris, solvel
em acetona. A fraco hidrossolvel de AB Cernelle, Vegeholm, Sweden, foi estudada
por Zhang et al., (1995) e inibiu, in vitro, o crescimento de clulas tumorais e no
tumorais da prstata. A bioactividade descrita foi atribuda ao 2,4 dihydroxy-2H-1,4benzoxazin-3(4H)-one (DIBOA), um cido hidroxmico cclico. Este um composto activo
presente no extracto de plen, que pode ser o responsvel pela diminuio dos sintomas
nos pacientes com hiperplasia benigna. Num ensaio com 79 pacientes entre os 62 e 89
anos, afectados por esta doena, o extracto de plen mostrou um moderado efeito
benfico na reduo do volume da prstata e no estmulo a urinar (Yasumoto et al., 1995).
O extracto total diminuiu a hipertrofia da prstata em ratos, mas nos seres humanos no
foi verificada nenhuma alterao nos nveis de sangue da hormona luteinizante (LH), da
hormona folculo-estimulante (FSH), da testosterona ou da dihidro-testosterona. Nos
pacientes com adenoma prosttico, os maiores benefcios foram a diminuio da noctria,
diminuies importantes do resduo ps urinar e, no tratamento a longo prazo, diminuio
do dimetro antero-posterior da prstata. O dbito urinrio no sofreu nenhuma alterao.
Os efeitos nos outros sintomas usuais da hipertrofia benigna da prstata no foram
significativos (Bruneton, 1999).
A actividade do DIBOA, e de outros anlogos estruturais, foi igualmente estudada por
Roberts et al., (2000). O DIBOA mostrou capacidade de inibir as clulas do cancro da
prstata que so hormona independentes. Em contraste com os resultados de outros
estudos, foi evidenciada uma inibio no somente das clulas DU-145, mas tambm
uma actividade ainda maior nas clulas MCF-7 (linha de clulas do cancro da mama
humanas derivada de um paciente com carcinoma mamrio metasttico) e nas clulas
COS-7.
O extracto de plen Prostat/Poltit (produzido por Allergon), num estudo duplamente cego
com placebo, mostrou-se capaz de melhorar os sintomas em homens com sndrome
crnica da dor plvica e com prostatite no bacteriana crnica (CPPS/CNBP) (Elist, 2005).
Num ensaio clnico controlado realizado por Dutkiewicz (1996), 89 pacientes com
hiperplasia prosttica benigna (BPH) foram tratados com Cernilton durante 4 meses: 51
receberam Cernilton e 38 Tadenan (controlo). Foram descritas melhorias significativas
em 78% dos pacientes do grupo tratado com Cernilton, contra 55% dos pacientes
tratados com Tadenan. Os sintomas obstrutivos e a irritao responderam melhor
terapia. Nos pacientes tratados com Cernilton houve uma melhoria significativa no fluxo
urinrio, diminuio da urina residual e do tamanho da prstata. Este estudo mostra que
o Cernilton eficaz para pacientes com BPH.

10

A fraco hidrossolvel de outro extracto de plen de flora seleccionada, Secale cereale,

(Cernitin T60) foi experimentada em ratos implantados com carcinoma de Lewis
(Furusawa et al., 1995). Esta mostrou ser um potente imunoestimulante dos macrfagos
sem citotoxicidade in vitro. A actividade desta fraco foi explicada por Jaton et al., (1997),
que identificaram uma srie de glicsidos, em particular os Secalsidos A e B,
responsveis pela aco antitumoral in vivo. No foi detectada toxicidade in vitro em
vrias linhas celulares (L120 leucemia, S180 sarcoma, clulas KB). Foi tambm
demonstrado que, em presena da inibio da proliferao celular com Ciclofosfamida,
inibio

da

activao

dos

macrfagos

com

2-cloroadenosina

ou

em

ratos

imunodeficientes, os efeitos eram abolidos. Face a estes resultados, foi colocada a

hiptese de os mecanismos de aco envolverem, possivelmente, a activao do sistema
imunitrio.
Outro polissacrido (LBPP) foi isolado do plen de Brassica napus L., e testada a sua
actividade antitumoral em ratos com Sarcoma 180 e melanoma B16 (Yang et al., 2007).
Houve uma diminuio no crescimento dos tumores, um aumento da resposta imune e
uma diminuio da anormalidade do sangue perifrico (actividade antianmica). Portanto,
concluiu-se,

como

nos

estudos precedentes,

que a

actividade antitumoral

provavelmente devida a uma aco immunomoduladora e antianmica.

O Plen Apcola de Brassica campestris tambm foi objecto de estudo. A fraco
esteride do seu extracto clorofrmico revelou-se capaz de aumentar a actividade da 3caspase, com consequente apoptose das clulas PC-3 do cancro da prstata,
provavelmente via inibio da expresso da protena Bcl-2 (Wu e Lou, 2007).
1.5 Actividade na osteoporose
Define-se osteoporose a perda da massa e da arquitectura ssea, que tm como
consequncia a reduo da resistncia e o aumento do risco de fracturas. As fracturas,
por fragilidade, so caractersticas da osteoporose e so, particularmente comuns, na
coluna, no quadril e no antebrao. Verifica-se um aumento relativo idade e tm um
grande impacto na sade da populao idosa no mundo ocidental, causando morbilidade
e mortalidade significativas e custos econmicos enormes para os servios sanitrios de
toda a Unio Europeia. As mudanas demogrficas e o crescimento da esperana de
vida conduziro a um aumento acentuado no nmero de indivduos que iro sofrer destes
episdios nas prximas dcadas.
O osso constitudo por uma matriz extracelular de colagnio, principalmente colagnio
de tipo I, onde o mineral sseo depositado sob a forma de sais do clcio.

11

O esqueleto contm 99% do clcio total do organismo e a homeostase est intimamente

ligada com o metabolismo sseo. A concentrao srica do clcio regulada
principalmente pela hormona paratiroideia e pelo calcitriol, o metabolito biologicamente
activo da vitamina D, sintetizado no rim a partir do precursor calcidiol. A hormona
paratiroideia afecta a homeostase do clcio atravs dos efeitos no osso, no rim e no
metabolismo da vitamina D.
Durante a infncia e a adolescncia a massa do osso continua a aumentar, at um pico
mximo na terceira dcada de vida. Depois do pico mximo ter sido alcanado, h um
perodo de consolidao do osso, em que a integridade do esqueleto mantida pelo
processo de remodelao ssea. Neste perodo o tecido sseo mais antigo removido
pelos osteoclastos e substitudo por um novo tecido formado pelos osteoblastos.
A idade em que a perda de massa ssea comea no est bem definida, mas parece
ocorrer por volta dos 40 anos, tanto nos homens como nas mulheres. Nos homens, a
perda calcula-se, em mdia, entre 0,5 e 1% por ano. Nas mulheres h uma acelerao,
at aproximadamente 2% por ano, aps a menopausa (com variao entre 1% e 6%).
Depois da menopausa h um aumento do turnover sseo e uma diminuio na formao
do osso, que conduzem perda rpida da massa ssea (Compston, 1994). estimado
que nas mulheres aproximadamente 35% e 50% do osso cortical e esponjoso (trabecular)
so perdidos no curso da vida (Mazess, 1982; Riggs et al., 1981).
A osteoporose primria tradicionalmente classificada em: tipo I, ou osteoporose postmenopausa, e tipo II, ou osteoporose senil (Riggs e Melton, 1983). A deficincia de
estrognios indicada como o principal factor patogentico responsvel para a
osteoporose tipo I, caracterizada, prevalentemente, pela perda do osso esponjoso. A
osteoporose de tipo II, que ocorre em homens e mulheres idosos, resulta da perda de
osso cortical e esponjoso. Postula-se que a deficincia da vitamina D e o
hiperparatiroidismo secundrio so os maiores responsveis pela perda da massa ssea.
Foram identificados vrios factores de risco para esta patologia:

Factores endgenos, como o sexo feminino, a idade, a estrutura fsica magra, a

raa Asitica ou Caucasiana

Factores exgenos, como menopausa prematura, hipogonadismo primrio ou o

secundrio no homem, amenorreia primria ou secundria, alimentao deficiente
em clcio, deficincia das vitaminas D, terapia com glucocorticides.

As intervenes farmacolgicas actuais, para a preveno das fracturas nos pacientes

com osteoporose, apostam principalmente na reduo do turnover e da reabsoro dos
ossos. O tratamento da doena feito com estrognios, bifosfonatos, clcio, calcitonina,
metabolitos da vitamina D e fluoreto. O clcio e a vitamina D so usados, igualmente, na
preveno primria e secundria.

12

Recentemente o grupo de investigao do Laboratory of Endocrinology and Molecular

Metabolism da Universtity of Shizuoka, conduziu um extenso trabalho sobre os efeitos do
extracto de Plen Apcola de Cistus ladaniferus. Num primeiro estudo, de Yamaguchi et
al., (2006) o extracto hidrossolvel aumentou significativamente a actividade da fosfatase
alcalina, enzima que participa na mineralizao ssea (Majeska e Wuthier, 1975), e o teor
de ADN em tecido diafiseal e metafiseal do fmur de rato cultivados in vitro. Estes efeitos
foram confirmados in vivo, tendo sido tambm observado um aumento da concentrao
de clcio nos dois tecidos. As actividades in vitro foram completamente inibidas na
presena de cicloheximida, um inibidor da sntese proteica, o que pode indicar que a
actividade mediada pela sntese de alguma protena.
No estudo sucessivo, Hamamoto et al., (2006a) observaram que o extracto de Plen
Apcola de Cistus ladaniferus inibiu, in vitro, a reabsoro ssea em tecidos femurais de
ratos e tambm inibiu a formao de clulas osteoclsticas em culturas de clulas da
medula.
Sempre Hamamoto et al., (2006b) aperceberam-se que a fraco mais activa do extracto
era a que tinha massa molecular (MW) inferior a 1000. Esta mostrou aumentar
significativamente, in vitro, o teor de clcio nos tecidos diafiseal e metafiseal do fmur de
rato e prevenir a formao de clulas osteoclsticas em culturas de clulas da medula na
presena da hormona paratiroideia. Os efeitos foram inibidos aps tratamento da fraco
a 80C durante 20 ou 60 minutos.
Outros dois modelos da osteoporose, in vivo, foram utilizados por Yamaguchi et al.,
(2007a,b) para avaliar os efeitos do extracto de Plen Apcola de Cistus ladaniferus. Um
dos modelos assenta no facto que a diabetes conhecida como causa da perda de
massa ssea e hipercalcmia por perda de clcio do osso. Neste primeiro estudo, os
autores usaram

ratos

em

que

induziram

diabetes

com

administrao

de

estreptozotocina (STZ). A administrao do extracto inibiu a perda de peso provocada

pela STZ, preveniu parcialmente o aumento dos nveis plasmticos da glucose, dos
triglicridos e do clcio, e inibiu a diminuio do fsforo inorgnico plasmtico. A nvel dos
tecidos metafiseal e diafiseal do fmur houve preveno da diminuio da fosfatase
alcalina, da concentrao do ADN e da concentrao do clcio (esta pode ser a razo da
diminuio dos valores plasmticos).
No segundo estudo foram utilizados ratos ovariectomizados. O tratamento com extracto
de plen no preveniu o aumento de peso observado no controlo, mas levou a uma
restaurao das alteraes morfolgicas do tecido metafiseal, preveno da sua
desmineralizao e da perda de densidade mineral. Houve tambm um aumento da
polar-strengh diafiseal e metafiseal, assim como, a preveno da perda de clcio em
ambos os tecidos.

13

No ltimo trabalho de Yamaguchi et al., (2007c) foi experimentada a actividade da

fraco MW 1000 em clulas osteoblsticas MC3T3-E1, in vitro. Observaram que esta
fraco possua um efeito estimulador na proliferao destas clulas, supostamente
actuando como um factor de crescimento, aumentava a concentrao de ADN (sugerindo
uma actividade mitognica) e da fosfatase alcalina, provavelmente estimulando a
diferenciao e a mineralizao dos osteoblastos.
1.6 Anemia e sistema hematopoitico
A anemia uma doena caracterizada por um baixo nmero de glbulos vermelhos. Isto
pode ser causado por muitas razes, entre as quais a hemlise, uma dieta pobre em ferro
ou a produo de diferentes tipos de hemoglobina. Em funo da causa h diferentes
tipos de anemias como, a anemia hemoltica, a anemia ferropnica nutritiva, anemia
falciforme, entre outras.
Relativamente a esta doena, foram realizadas vrias pesquisas com Plen Apcola e
outros produtos da colmeia. Wang et al. (1993) avaliaram os efeitos de Plen Apcola oral
em murganhos e ratos com anemia hemoltica. Os resultados mostraram que o Plen
Apcola antagonizou marcadamente a inibio do sistema hemopoitico e reduziu o
nmero de glbulos brancos no sangue nestes animais.
Haro et al. (2000) realizaram um estudo similar em ratos saudveis e em ratos com
anemia ferropnica nutritiva. Estudaram o efeito da adio de Plen Apcola multiflora
numa dieta padro. O grupo alimentado com Plen Apcola mostrou um maior aumento
de peso, assim como, um aumento dos nveis de hemoglobina e uma diminuio no
nmero de plaquetas, constituindo estes valores um parmetro hemtico que reflecte o
estado do ferro no organismo. Concluiu-se que o plen apcola aumenta a utilizao
digestiva do ferro, mostrando-se til neste tipo de doenas.
O Plen Apcola pode, portanto, ter efeitos benficos no tratamento da anemia e de
doenas relacionadas com o sistema hemopoitico, mas mais estudos so necessrios
para compreender o mecanismo envolvido e sua contribuio para a actividade
teraputica.
1.7 Actividade antimicrobiana
Embora haja poucos estudos sobre a actividade antimicrobiana do Plen Apcola, os
existentes mostram que o plen possui estas propriedades contra algumas espcies
bacterianas, especialmente patognicas das plantas. Campos et al. (1998) fizeram
ensaios preliminares usando diferentes flavonides isolados a partir de extractos de

14

Plen Apcola de Eucaliptus globulus, Ranunculus sardous e Ulex europeus. Observaram

que os derivados da herbacetina encontrados no Plen de Ranunculus Sardous e Ulex
europeus tm actividade antibitica marcada contra Pseudomonas aeruginosa. O plen
de Eucaliptus globulus, rico principalmente em derivados da quercetina, no mostrou
nenhuma actividade.
Esin et al., (2006) estudaram a actividade anti-bacteriana de Plen turco em 13 espcies
bacterianas patognicas para as plantas. Os resultados mostraram que o extracto de
Plen tem um efeito inibidor contra todos os micrbios patognicos, embora com
diferenas em funo da espcie patognica em estudo. Os investigadores concluram
ento, que este extracto de Plen Apcola tem potencial para se tornar um agente
protector de sementes, porque algumas das bactrias patognicas so transmitidas
atravs deles.
1.8 Actividade antidiarreica
Outra actividade teraputica que se pode atribuir ao Plen Apcola o seu efeito
antidiarreico. H poucos trabalhos nesta direco, mas os existentes confirmam esta
actividade. Campos (1997) estudou o efeito de extractos de Plen Apcola de Eucaliptus
globulus e de Salix atrocinerea em ratos Swiss OFFI. Os resultados mostraram que
ambas as espcies tm propriedades antidiarreicas. No entanto, tm algumas diferenas;
o extracto de Plen de Eucaliptus globulus revelou-se mais eficaz em retardar a diarreia e
o de Salix atrocinerea reduziu maioritariamente a percentagem de excrementos diarreicos.
Ambas as espcies florais reduziram os excrementos diarreicos em cerca de 30%.
Este estudo concluiu que a actividade antidiarreica do Plen Apcola das espcies
testadas pode ser devida aos constituintes polifenlicos, especialmente quercetina e
seus derivados, embora outros compostos possam ter um papel nesta actividade e ser
tambm responsveis pelas diferenas nos resultados.
1.9 Reaes alrgicas e toxicidade
So parcos os estudos de efeitos secundrios e de toxicidade do Plen Apcola, que
normalmente bem tolerado, embora a presena de plenes e de substncias alergnicas
no possa ser excluda.
Num relatrio publicado por Puente et al., (1997) foi relatado um exemplo de uma mulher
espanhola de 34 anos, com um historial clnico de rino-conjuntivite sazonal e intolerncia
ao mel que desenvolveu gastroenterite eosinoflica aps ingesto de Plen Apcola.

15

Tambm Greenberger e Flais (2001) estudaram a reaco alrgica num paciente que
tinha tido uma reaco anafilctica aps a ingesto do plen apcola. O paciente teve
reaco alrgica com formao de eritema aps administrao de Plen Apcola em
concentrao de 1 mg/mL.
Uma das situaes provavelmente mais problemticas relaciona os possveis efeitos
adversos relacionados com a presena de alcalides. Boppr et al., (2008) descreveram
a presena em Plen Apcola de Echium vulgare, Echium plantagineum, Eupatorium
cannabinum, Senecio jacobaea, Senecio ovatus de alcalides pirrolizidnicos e seus
derivados, que so conhecidos por terem actividade hepatotxica, pneumotxica,
genotxica e carcinognica (Stegelmeier et al., 1999).

16

2. Materiais e mtodos
2.1 Material vegetal
O plen apcola utilizado neste estudo plen fresco destinado ao mercado. A colheita
foi realizada em Janeiro de 2009 em Lavos (Figueira da Foz, Portugal) e imediatamente
congelado e conservado a uma temperatura de -21C.
A identificao do taxon fez-se atravs da comparao dos perfis obtidos por anlise em
HPLC/DAD de cargas polinicas separadas em funo da cor e de acordo os que fazem
parte da nossa base de dados.
Tambm se procedeu confirmao destes resultados por observao ao microscpio
de suspenses das amostras separadas.
De qualquer forma, a identificao atravs da comparao dos perfis fenlicos resulta
mais fcil e menos sujeita a eventuais erros aleatrios.
2.2 Secagem
A secagem do plen apcola um processo de extrema importncia pela conservao e
portanto pela segurana deste produto que, quando colhido, tem uma humidade relativa
(RH%) entre 25-30%. Valores entre 4 e 8% so considerados adequados (Campos et al.
2008), no s para evitar o crescimento de bactrias mas tambm para manter
caractersticas organolpticas adequadas.
Os mtodos de secagem utilizados foram dois:
- Secagem por radiao infravermelha (IV)
- Secagem tradicional
Pela secagem IV utilizou-se como modelo uma balana para medio da humidade Kern
MLB 50-3 (figura 2.2.1).

Figura 2.2.1 Moisture analyser Kern MLB 50-3

17

O princpio de funcionamento deste aparelho baseia-se na medio, por diferena em

comparao com a massa inicial, da quantidade de humidade perdida aps irradiao
controlada com raios IV. Este tipo de radiao, quando absorvida, no tem energia
suficiente para promover transies electrnicas (como no caso da radiao UV), mas
esta energia devolvida ao sistema atravs de fenmenos de oscilao das ligaes
moleculares que provocam colises entre as molculas. Desta forma gera-se calor, que
favorece a evaporao da gua.
Se, como no caso, se utiliza uma radiao na regio do mdio infra-vermelho
aumentamos ainda a capacidade de secagem, enquanto o comprimento de onda da
radiao resulta bem ajustado com as bandas de absoro da gua.
Pala alm disso, sendo uma radiao tem uma capacidade de penetrao maior no
substrato, e portanto a transferncia de calor no est limitada por causa de fenmenos
de conduo, como acontece na secagem tradicional.
O mtodo desenvolvido prev a secagem de amostras de 1g de plen apcola por 10
minutos a uma temperatura de 50C.
A secagem tradicional foi realizada a uma temperatura de 40C numa estufa com
extraco de ar, pelo tempo necessrio para chegar a humidade desejada (4 horas e 45
minutos).
2.3 Determinao da humidade relativa
A avaliao do contedo de gua em qualquer produto destinado ao consumo humano
de primria importncia. Uma das principais razes que a gua disponvel no substrato
est directamente ligada possibilidade de desenvolvimento de bactrias e fungos.
Sobre esta matriz, plen apcola, j existem estudos que demonstram a contaminao
por fungos produtores de micotoxinas e ocratoxinas (Gonzalez et al., 2005), e a sua
capacidade de funcionar como substrato estimulador da produo de ocratoxina A em
Aspergillus ochraceus Wilh., constituindo portanto um grande risco para os consumidores
(Medina et al., 2004).
Para avaliar a humidade relativa de cada amostra de plen foram retiradas cinco
alquotas de 1g cada e foram secas a uma temperatura de 50C at peso constante ao
longo de trs intervalos de tempo de 45 segundos cada usando uma balana para
medio da humidade Kern MLB 50-3
Como mtodo de referncia pela validao foi utilizado um dos mtodos descritos na FP.
VIII.
Transcrevendo o Mtodo a citado no ponto 2.2.32. PERDA POR SECAGEM vem que:

18

A perda por secagem a perda de massa expressa em percentagem m/m.

Mtodo. Coloque a quantidade indicada da amostra num recipiente tarado e seco
previamente nas condies preconizadas para a substncia a ensaiar. A secagem da
substncia faz-se at massa constante ou durante o tempo indicado, segundo um dos
seguintes processos. Se a temperatura de secagem indicada por um s valor em vez
de um intervalo, a secagem efectuada temperatura prescrito 2C.
A alnea que selecionmos foi a d) uma vez que se aproxima mais do processo que os
apicultores utilizam na secagem do produto antes de ser colocado no mercado. Assim
nessa alnea vem que:
d) na estufa com indicao de um intervalo de temperatura: a secagem efectuada na
estufa no intervalo de temperatura prescrito na monografia.
Como no existe monografia para o plen apcola serviu-nos de base a temperatura de
40C uma vez que assim manteramos estveis uma percentagem elevada de
constituintes.
2.4 Preparao dos extractos
Amostras dos diferentes taxa, tanto frescos quanto secos, foram extrados com uma
soluo de Etanol/gua 1:1, nas concentraes de 20mg/mL e 10mg/mL respectivamente,
em ultra-sons por 30 minutos.
O material insolvel foi separado centrifugando a 6000 rpm por um tempo de 5 minutos e
as amostras foram imediatamente analisadas.
Escolheu-se a mistura etanol/gua 1:1 porque nos permite extrair uma maior variedade
de compostos em comparao com outros solventes e tambm por ter um baixo impacto
ambiental.
2.5 Anlise cromatogrfica
A anlise cromatografica foi realizada por cromatografia de altas prestaes (HPLC)
acoplada com um detector de fotodiodos (diode array, DAD), segundo o mtodo descrito
por Campos et al. (1997).
Este tipo de tcnica considerada, j a muitos anos, a de eleio para anlise e
identificao de flavonoides e cidos fenlicos (Markham & Bloor, 1998), que se prestam

19

facilmente deteco por absoro na regio espectral do UV/visvel porque possuem

vrios cromoforos, como se mostra a ttulo de exemplo na figura 2.5.1.

3
2
8

O 4

7
A

4
5
6

3
5

Figura 2.5.1 Cromoforos de uma flavona

Estes cromoforos, tambm chamados anis A B e C, so visveis nos espectros sob a
forma de trs diferentes bandas (figura 2.5.2). As substituies nos diferentes anis
provocam desvios hipsocrmicos ou batocrmicos, em funo do tipo de substituio.

Banda II
Banda I
IIb

IIa

Figura 2.5.2 Espectro de absoro de um flavonoide, com evidenciadas as bandas I, IIa e

IIb
Atravs da leitura desses espectros, em particular observando a posio dos diferentes
mximos de absoro e a altura relativa entre eles, podemos obter importantes
informaes sobre as estruturas em questo.
Para o plen apcola vrios trabalhos publicados utilizam esta tcnica na separao e
estudo dos perfis polinicos, (Campos 1997a, Campos 1997b, etc) e foi tambm proposta
como mtodo de referncia para identificao de espcie floral, na base do facto que o
perfil fenlico de um taxon resulta independente das condies climticas e geogrficas
(Campos 1997b, Campos et al. 2008).
Os extractos foram analisados num cromatografo Gilson 170, equipado com uma coluna
Waters Spherisorb (4,6x250mm), auto injector e um detector UV-vis diode array (DAD)
Gilson 170.

20

Os volumes de injeco foram 20L para os extractos de plen fresco e 10L para as
amostras secas, e a eluio foi realizada utilizando um fluxo de 0,8mL/min com uma
temperatura da coluna de 24C.
Os eluentes usados foram gua acidificada a pH ~ 2,3 com cido ortofosfrico (A) e
acetonitrilo (B) misturados em gradiente linear.
O gradiente utilizado foi o seguinte:
Tempo

0 min

100%

0%

0-12 min

91%

9%

12-20 min

87%

13%

20-30 min

67%

33%

30-32 min

67%

33%

32-42 min

57%

43%

42-60 min

57%

43%

Tabela 2.5.1 Gradiente utilizado na anlise em HPLC/DAD do perfil fenlico

Por cada pico cromatogrfico foi adquirido um espectro entre 220 e 400nm e os
cromatogramas foram gravados a 260 e 340nm.
A identificao das estruturas foi realizada por comparao com a base de dados e
aplicando as regras tericas apresentadas no livro de Campos & Markham (2007).
As reas de todos os picos cromatogrficos foram adquiridas a 340nm de forma a
poder calcular a concentrao dos compostos principais de cada amostra em mg
equivalentes de rutina/ mg de plen seco. Para esta quantificao construiu-se uma curva
de calibrao da rutina e por regresso linear calculou-se a equao da recta

y = 4,2159x10-9A + 0,0062 R2= 0.9996

2.6 Determinao da actividade anti-radicalar

Para determinar esta actividade utilizou-se uma tcnica j amplamente referenciada na
bibliografia, que utiliza o radical livre 2,2 difenil-picrilhidrazil (DPPH).

21

Figura 2.6.1 - Radical 2,2 difenil-picrilhidrazil

Esta tcnica in vitro um mtodo espectrofotomtrico que se baseia na diminuio da
absoro tpica das solues deste radical causada pela reduo do mesmo.
Os flavonides e os cidos fenlicos so amplamente conhecidos por serem molculas
anti-radicalares (referencias), e no caso do plen apcola so considerados os maiores,
mas no os nicos, contribuintes para esta actividade. Existem vrias teorias sobre a
forma como os flavonoides possam interagir com as espcies radicalares, mas parece
fundamental a existncia de dois ou mais grupos funcionais referidos na figura 2.6.2
OH
OH
O

HO

OH
HO

OH
OH

HO

O
OH
HO

OH
OH

HO

O
O
O

Figura 2.6.2 Grupos estruturais envolvidos na actividade anti-radicalar

O intervalo de linearidade existe por concentraes de DPPH entre 10x10-5 M e 10x10-4 M.
As solues podem ser conservadas por um mximo de 8 horas e os recipientes
utilizados para as conter no podem ser de plstico ou de materiais similares.
Acrescentando ao DPPH vrias alquotas de substncia anti-radicalar pode-se notar
como a banda com max nos 517nm diminui linearmente sem que ocorra alguma
alterao. A banda a max 320nm apresenta-se, pelo contrrio, alterada na sua forma.
A leitura da absorvncia portanto realizada a uma max de 517nm o que no
corresponde ao verdadeiro mximo (figura 2.6.3), mas sim ao mximo do pico mais
estvel ao longo do tempo.

22

Figura 2.6.3 espectro DPPH adicionado de Aliquotas de quercetina padro (in Campos,
1997)
A validao do processo feita por avaliao da capacidade anti-radicalar de um
composto de actividade conhecida, frente a uma soluo do radical de concentrao
conhecida. Neste caso o padro escolhido foi o cido ascrbico em soluo etanlica a
50%, o qual teve uma concentrao eficaz a 50% (CE50), nas condies de trabalho, de
2.41 g/ml de soluo de DPPH.

DPPH cido ascrbico

% /\ ABS

100
80
60
40

y = 20,052x + 1,6408

20

R = 0,9946

0
0

g/mL sol DPPH

Figura 2.6.4 Resultado do ensaio da actividade anti-radicalar do cido ascrbico

Esta actividade expressa-se como CE50, ou seja a concentrao da soluo em anlise
necessria para diminuir em 50% a absoro da soluo de DPPH a max 517 nm.
No mtodo utilizado no presente estudo 5,91 mg de DPPH, exactamente pesados, foram
misturados com 125 ml de etanol puro, com a ajuda de ultra-sons. Uma vez solubilizado o
radical so acrescentados mais 125 ml de gua, tendo assim um volume final de 250 ml.
absolutamente necessrio solubilizar o DPPH em etanol puro e depois acertar o
volume final com gua, isto porque a solubilidade do radical em solues aquosas
limitada.

23

Em tubos de ensaio a 2,5 ml desta soluo so adicionados pequenos volumes (1, 3, 5, 8,

10, 15, 20, 25 l) dos extractos de plen apcola anteriormente homogeneizados.
Agitam-se os tubos em vortex por alguns segundos e deixa-se reagir por 10 minutos.
A absorvncia portanto lida a max 517 nm e calcula-se a variao percentual da em
comparao com um branco, constitudo por uma soluo de DPPH sem acrscimo de
extracto algum. No Microsoft Excel por extrapolao grfica calculada a recta de
regresso entre os pontos e atravs dela calcula-se a CE50 do extracto analisado. Por
exemplo,

Dose extracto (l)

ABS

g plen

g polen/mL sol

% ABS

Branco I

0,71

25

0,124

500

200

82,50

20

0,182

400

160

74,31

15

0,26

300

120

63,30

10

0,369

200

80

47,92

0,42

160

64

40,72

0,498

100

40

29,71

0,56

60

24

20,96

0,603

20

14,89

Branco II

0,707

70,00

% /\ Abs

60,00
50,00
40,00

y = 0,4407x + 11,573

30,00

R = 0,9968

20,00
10,00
0,00
0

50

100

150

g/mL sol

CE50 = 65,63 g polen/mL sol

Figura 2.6.5 Examplo de calculo da CE50
Foram ensaiados em triplicado as amostras de plen fresco, seco pela metodologia IV e
seco pela metodologia tradicional.

24

2.7 Anlise estatstica

Todas as determinaes de humidade se realizaram em quintuplicado, os testes da
actividade anti-radicalar e as anlises em HPLC/DAD foram feitas em triplicado, e os
resultados foram sujeitos a estudo estatstico clssico.
Os resultados dos ensaios do DPPH pelas diferentes metodologias de secagem foram
comparados entre eles atravs de T-test (p0,05) e a validao do mtodo de
determinao da humidade relativa por IV foi realizada face ao mtodo de referncia
atravs de um teste Z-score.

25

3. Resultados e discusso

3.1 Determinao da origem floral

Como j foi referido anteriormente a determinao dos taxa presentes no plen utilizado
neste trabalho foi realizada por anlise em HPLC/DAD dos extractos etanlicos,
comparando sucessivamente os perfis fenlicos obtidos com os existentes na nossa base
de dados.
A separao das cargas em funo da cor levou formao de dois grupos distintos; um
primeiro com cargas de cor acastanhada e um segundo com cargas de cor laranja.

Figura 3.1.1 Aspecto das cargas polinicas de Eucaliptus globulus

A anlise dos extractos realizados a partir destas amostras mostrou perfis completamente
distintos, que pertencem as espcies Eucaliptus globulus (figura 3.1.2) e Salix atrocinerea
(figura 3.1.3). Os resultados foram confirmados por observao ao microscpio Figura
3.1.1.
2

340nm, 0.01 sensitivity

260nm, 0.01 sensitivity
Pump 1
Pump 2

50

AU

% Mobile Phase

100

0
0

20

40

60

Minutes

Figura 3.1.2 Perfil de Eucaliptus globulus

26

100

340nm, 0.01 sensitivity

260nm, 0.01 sensitivity
Pump 1
Pump 2

50

AU

% Mobile Phase

0
0

20

40

60

Minutes

Figura 3.1.3 Perfil de Salix atrocinerea

3.2 Determinao da humidade relativa
A avaliao da humidade relativa realizou-se com o Moisture Analyzer Kern MLB 50-3.
Os resultados obtidos no concordam com os da bibliografia, enquanto as amostras
mesmo pertencendo a espcies diferentes mostraram os mesmos valores de humidade
relativa, 24,73 0,21% para o plen de Eucaliptus globulus e 24,77 0,35% para o poln
de Salix atrocinerea.
Este facto pode ser devido a uma errada manipulao pelo apicultor ou no momento da
colheita ou na conservao do produto, que provocou uma distribuio uniforme do
contedo de gua. Provavelmente os resultados existentes na bibliografia referem-se a
plenes colhidos e conservados separadamente, evitando assim a difuso da humidade
at ao equilbrio, o que no normalmente feito no caso do plen comercial,
Sendo o mtodo muito rpido ( 15 minutos) e potencialmente menos caro que o mtodo
oficial sentimos a necessidade de o avaliar em termos de reprodutibilidade e preciso,
validando-o em comparao com um dos mtodos da Farmacopeia Portuguesa VIII.
A avaliao da reprodutibilidade foi realizada quantificando a humidade relativa de 5
diferentes amostras de plen disponveis no nosso laboratorio em quintuplicado, em dias
diferentes e por operadores diferentes. Os resultados mostrados na tabela 3.2.1 mostram
a reprodutibilidade do mtodo, tendo valores de RDS% absolutamente aceitveis vista a
heterogeneidade da matria-prima.

27

Amosta 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

11,79

27,82

26,1

2,26

22,34

11,48

27,79

26,1

1,3

23,94

11,08

27,88

25,88

2,19

22,05

11,49

27,48

25,09

2,48

22,69

11,61

27,86

25,86

2,08

22,79

SD

0,26

0,16

0,42

0,17

0,34

Media

11,49

27,77

25,81

2,25

22,47

RDS%

2,27

0,59

1,61

7,49

1,51

Tabela 3.2.1 Avaliao da reprodutibilidade. Dados expressos como RH%

tambm importante notar uma tendncia do RSD% a diminuir com valores de
humidade relativa cada vez mais baixos, o que indica uma progressiva perda de
reprodutibilidade.
Procedeu-se ento a validao do Mtodo de IV face ao mtodo oficial.
Escolheu-se uma das amostras (amostra 5) e repetiu-se a secagem, mas desta vez
seguindo as indicaes da Farmacopeia.
Determinao IV

Determinao FU VIII

22,34

22,2

23,94

22,14

22,05

22,2

22,69

22,15

22,79

21,89

Media

22,762

22,116

SD

0,721

0,129

Tabela 3.2.2 Resultados da determinao da RH% na amostra 5 segundo os dois

mtodos
Foi ento utilizado o Test Z-score, assumindo o valor obtido atravs da secagem segundo
o mtodo da Farmacopeia como verdadeiro. Na realizao do teste admitimos um erro de
0,2%, que representa a incerteza da medida indicada nas caractersticas do Kern MLB
50-3.

28

Secagem IR
Mean
Known Variance

22,762

22,116

0,51967

0,01673

Observations
Hypothesized Mean Difference
z

Secagem FU VIII

0,2
1,361681309

P(Z<=z) one-tail

0,0866493

z Critical one-tail

1,644853476

P(Z<=z) two-tail

0,1732986

z Critical two-tail

1,959962787

Tabela 3.2.3 Resultados do test Z-score

Sendo que o z calculado inferior ao z tabelado podemos afirmar que o mtodo de
determinao da humidade por IV realizado nas condies descritas previamente
equivalente ao mtodo da Farmacopeia escolhido.
Em concluso o mtodo desenvolvido mostrou-se reprodutvel e preciso em comparao
com a metodologia oficial escolhida, para alm de ser notavelmente mais rpido e
portanto menos dispendioso do ponto de vista energtico.
3.3 Efeitos da secagem no perfil fenlico
Plen apcola uma matriz particularmente rica em compostos fenlicos, os quais so
considerados os maiores responsveis das vrias actividades biolgicas atribudas a este
produto, sobretudo pela actividade anti-radicalar (Leja et al., 2007; Campos et al., 1994,
Campos et al., 2003; Mrghita et al., 2009; Silva et al., 2006).
Na figura 3.3.1 podemos ver o perfil completo de uma amostra de Eucaliptus globulus
fresco e na tabela 3.3.1 especificados os compostos maioritrios com os respectivos
espectros e estruturas.
2

340nm, 0.01 sensitivity

260nm, 0.01 sensitivity

AU

2
4
0

20

40

60

Minutes

Figura 3.3.1 Perfil de HPLC/DAD dos compostos fenlicos e polifenlicos do plen

apcola de Eucaliptus globulus fresco

29

Tempo de reteno
(minutos)
35,98

Composto

Estrutura

Quercetina 3-O-soforsido

44,61

Miricetina

45,71

Tricetina

51,21

Luteolina

57,11

Derivado do acido cafeco

57,76

Derivado do acido cafeco

Tabela 3.3.1 Resumo dos principais compostos encontrados em plen de Eucaliptus

globulus com relativos tempos de reteno e estruturas
Comparando agora os cromatogramas obtidos a partir dos extractos de poln de
Eucaliptus fresco, seco por IV e seco pelo mtodo tradicional podemos verificar que no
qualquer alterao no perfil cromatogrfico (figura 3.3.2).

Polen fresco

Secagem IV

Secagem tradicional
0

20

40

60

Minutes

Figura 3.3.2 Comparao dos cromatogramas de plen apcola de Eucaliptus globulus

fresco, seco por IV e pelo mtodo tradicional
Verificou-se tambm que os espectros UV correspondentes aos constituintes no
sofreram qualquer tipo de alterao (dados no apresentados).

30

Passamos ento a verificar se houve alguma alterao do ponto de vista quantitativo.

g rutina eq/mg poln

Para este objectivo escolhemos quantificar a quercetina 3-O-soforsido como marcador.

Figura 3.3.3 Resultados da quantificao de quercetina 3-O-soforsido

Observando o grfico claro como nem a secagem IV nem a tradicional provocaram
variao alguma no contedo do composto quantificado, como de resto se esperava dada
a perfeita sobreponibilidade dos cromatogramas.
Passando agora ao plen de Salix atrocinerea na figura 3.3.4 podemos ver o perfil
completo de uma amostra plen fresco e na tabela 3.3.2 especificados os compostos
maioritrios com os relativos espectros e estruturas, quando conhecidas.

2
340nm, 0.01

sensitivity

260nm, 0.01

sensitivity

AU

4
3

20

40

60

Minutes

Figura 3.3.4 - Perfil HPLC/DAD dos compostos fenlicos e polifenlicos do plen apcola
de Salix atrocinerea fresco

31

Tempo de reteno
(minutos)
37,04

Composto

Estrutura

38,62

Caempferol-3-Oneohesperidsido )

39,26

Caempferol-3-O -derivado

45,31

Derivado do acido cafeco

46,52

Derivado do acido cafeco

Quercitina 3-O- derivado

Tabela 3.3.2 Resumo dos principais compostos encontrados em plen de Salix

atrocinerea com relativos tempos de reteno e estruturas
Sobrepondo os cromatogramas obtidos a partir dos extractos de poln de Salix
atrocinerea fresco, seco por IV e seco pelo mtodo tradicional podemos verificar que,
como no caso precedente, so perfeitamente reprodutveis (figura 3.3.5).

Poln fresco

Secagem IV

Secagem tradicional
0

20

40

60

Minutes

Figura 3.3.5 Comparao dos cromatogramas de plen de Salix atrocinerea fresco, seco
por IV e pelo mtodo tradicional
Os espectros UV dos diferentes constituintes mantiveram-se inalterados (dados no
mostrados).
A verificao de eventuais alteraes quantitativas devidas aos processos de secagem,
realizou-se quantificando o Caempferol-3-O-neohesperidsido, que o composto
maioritrio no extracto etanlico de plen de Salix atrocinerea.

32

Figura 3.3.6 Resultados da quantificao de Caempferol-3-O-neohesperidsido

Analisando os resultados verifica-se alguma diferena na concentrao deste composto,
mas que no significativa do ponto de vista quantificativo (0,1g/mg de poln). Para
alm disso a diferena maior existe entre o plen fresco e o seco tradicionalmente, mas a
mdia deste ltimo falseada por um valor aberrante.
Concluindo podemos afirmar que a secagem com IV no provocou alteraes no perfil
fenlico dos taxa estudados, o que tambm se observa na secagem tradicional.
Contudo o mtodo por IV destaca-se pela rapidez com que conduzida a secagem, que
se pode traduzir num menor consumo de recursos energticos e numa melhor
rentabilizao do tempo, com um consequente aumento da produtividade quer analtica
quer comercial.
3.4 Efeitos da secagem na actividade anti-radicalar
As evidncias cientficas acerca da actividade anti-radicalar do plen apcola so vrias,
e na bibliografia est amplamente descrita para um grande nmero de espcies florais
(Silva et al., 2006; Leja et al., 2007; LeBlanc et al., 2009; aric et al., 2009; Mrghita et
al., 2009), pois espcie-especifica, independente da origem geogrfica e das condies
climticas, e diminui ao aumentar o tempo de conservao (Campos et al., 2003, Campos,
1997a).

33

Mesmo que os compostos fenlicos, dos quais este produto rico, sejam considerados
como os principais contribuintes provvel que existam outros compostos que participam
para a actividade anti-radicalar (Campos et al., 2000).
Sendo o teste do DPPH um mtodo simples, rpido e extensamente referenciado na
bibliografia, foi escolhido para a avaliao desta actividade.
Inicialmente tentamos utilizar amostras constitudas por uma nica carga polnica
(10mg), de forma a diminuir ao mximo o consumo de matria-prima e de solventes,
mas os resultados no foram reprodutveis (Figura 3.4.1).

80
70

80
70
60
50

y = 0,4032x + 6,1329
R2 = 0,9852

60
50
40
30
20
10
0

40
30
20
10
0

EC50 = 79,07g/ml sol

CE
0

50

100

y = 0,3524x + 4,7814
R2 = 0,9901

150

200

EC50 = 93,26g/ml sol

CE
0

50

100

150

200

250

Figura 3.4.1 Resultado do teste do DPPH em duas amostras constitudas por uma nica
carga polinica de Eucaliptus globulus
Mesmo ao aumentar os tamanhos das amostras (mantendo a concentrao invariada),
para evitar pequenas contaminaes devidas desagregao de parte das cargas
polnicas provocada pelo manuseamento, os resultados no se mostraram melhores
(figura 3.4.2).

80

y = 0,4119x + 5,7683
R2 = 0,9887

70
60
50
40
30
20

EC50 = 81,34g/ml sol

CE

10
0
0

50

100

150

200

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

60

y = 0,4518x + 7,6051
R2 = 0,9737

y = 0,6342x + 4,6944
R2 = 0,9982

50
40
30
20

EC50 = 71,08g/ml sol

CE

EC50 = 54,11g/ml sol

CE

10
0

50

100

150

200

20

40

60

80

100

Figura 3.4.2 Resultado do teste do DPPH em trs amostras preparadas com 0,5g de
plen apcola de Eucaliptus globulus
Evidenciou-se, ento, que a centrifugao das amostras utilizadas nos ensaios provocava
grandes alteraes nos resultados o que conduziu a um novo passo na metodologia e

34

que consistiu em suspender as amostras de plen apcola antes de coloc-las a reagir

com o radical DPPH.
Numa primeira anlise dos resultados obtidos com o plen apcola de Eucaliptus globulus
(figura 3.4.3) nota-se que a CE50 do plen fresco muito superior ao referido na
bibliografia: 64,471,29 g/ml contra 40 0,3 g/ml (Campos et al., 2003). Este fenmeno
pode ser devido ao mau estado de conservao ou a algum erro na fase da
colheita/produo. Daqui a utilidade de avaliar a actividade anti-radicalar de amostras
comerciais (Campos et al., 2008).

Figura 3.4.3 Resultados do ensaio da actividade anti-radicalar para o plen apcola fresco,
seco pelo mtodo IV e seco pelo mtodo tradicional de Eucaliptus globulus expressos em
CE50SD. a, b grupos diferentes.
As amostras secas pelas duas metodologias proporcionaram resultados muito
semelhantes aos do plen apcola fresco. Contudo, aps termos aplicado o teste T
podemos ver como na realidade o plen seco por IV perdeu actividade, mesmo sendo a
diferena mnima, em comparao ao plen fresco. Tambm a sua capacidade de captar
o radical DPPH resulta inferior ao mtodo de secagem tradicional, que comparvel com
o fresco.
Analisando agora os resultados proporcionados pelo plen de Salix atrocinerea (figura
3.4.4), notamos em primeiro lugar que a actividade anti-radicalar resulta notavelmente
superior aos referidos em bibliografia: 102,333,96 g/ml contra 150 4,7 g/ml (Campos
et al., 2003).
Se juntamos este resultados com a presena de uma proporo relativa entre o composto
maioritrio e os derivados do cido cafeico no prpria da variedade de Salix atrocinerea

35

descrita na nossa base de dados, e tambm no devida a contaminao por plen de

Eucaliptus globulus, podemos postular que podemos ter em estudo uma nova variedade
de Salix atrocinerea ainda no descrita (Gomes et al., 2009).

Figura 3.4.4 Resultados do ensaio da actividade anti-radicalar para o plen apcola fresco,
seco pelo mtodo IV e seco pelo mtodo tradicional de Salix atrocinerea expressos em
CE50SD. a grupo.
As amostras secas tiveram uma maior actividade anti-radicalar em comparao ao plen
fresco, mas esta diferena no resulta estatisticamente significativa. De facto, pelo teste
T todas as amostras so iguais e portanto a secagem tanto por IV quanto a tradicional
no provocou alterao da actividade do plen apcola de Salix atrocinerea.
Em concluso podemos dizer que, para os dois taxa em estudo, a secagem tradicional
no se mostrou prejudicial do ponto de vista da bioactividade como estvamos a espera.
A secagem com IV levou a uma perda muito limitada da actividade no plen de
Eucaliptus globulus, fenmeno que no se repetiu no de Salix atrocinerea.
Contudo continua a haver uma vantagem do ponto de vista da velocidade de exsicao e
da conteno dos custos desta operao, sem perda da actividade anti-radicalar.

36

4. Concluses
Como j discutido na introduo o plen apcola um produto de particular interesse do
ponto de vista alimentar, isto pelo seu contedo bem equilibrado de macronutrientes
(Orzaez-Villanueva et al., 2002; Peris, 1984), quais aucares, lipidos e protenas, e
tambm de micronutrientes, como por exemplo vitaminas e minerais (Herbert et al., 1987;
Hagedorn e Hamburguer, 1967).
A este produto da colmeia so tambm atribudas varias actividades biolgicas, entre as
muitas actividade anti-radicalar, nas alteraes patolgicas da prostata e na osteoporose
(Campos et al., 2003; Silva et al., 2006; Leja et al., 2007; LeBlanc et al., 2009; aric et al.,
2009; Mrghita et al., 2009; Zhang et al., 1995; Elist, 2005; Yamaguchi et al., 2006;
Face a estas consideraes evidente que haja a necessidade de ulteriores pesquisas
para chegar padronizao deste produto, que dever ser sujeito a um rigoroso controlo
de qualidade, que seja visando uma aplicao diettica quer seja destinada como
matria-prima bioactiva para possveis aplicaes teraputicas (Campos, 1997)
nomeadamente a incluir em Medicamentos Base de Plantas.
Neste sentido enquadra-se a necessidade de desenvolver uma mais rpida metodologia
de determinao da humidade, tanto para controlar este importante parmetro tanto para
poder padronizar a matria-prima em futuros estudos de bioactividade.
A luz das performances obtidas pelo analisador de humidade Kern MLB 50-3 em termos
de reprodutibilidade e de preciso podemos concluir que o objectivo foi alcanado. Este,
nas condies descritas e para o material utilizado, mostrou-se equivalente ao mtodo
descrito na alinha d) do ponto 2.2.32. PERDA POR SECAGEM da FP VIII (Teste Zscore), e restituiu valores de RDS% absolutamente aceitveis quando testado com
amostras com diferente humidade relativa.
Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

Desvio padro

0,26

0,16

0,42

0,17

0,34

Media

11,49

27,77

25,81

2,25

22,47

RDS%

2,27

0,59

1,61

7,49

1,51

Tabela 4.1 Resumo da avaliao da reprodutibilidade da determinao da humidade

relativa por IV. Dados expressos como RH%
Para alm de ser equivalente o mtodo mostra-se enormemente mais rpido, e portanto
menos dispendioso do ponto de vista energtico.

37

Com base do princpio do funcionamento deste analisador de humidade decidimos

tambm optimizar uma tcnica de secagem com radiao IV pelo plen apcola, e avaliala face a uma simulao do mtodo tradicional que consta de uma secagem por
conveco.
A tcnica foi optimizada ao longo do tempo, at chegar as condies utilizadas no estudo
onde se mostrou basicamente equivalente a tcnica tradicional.
Este resultado no foi exactamente o esperado; isto no pelo resultado da secagem IV,
mas porque ao contrrio do esperado a secagem tradicional no proporcionou alteraes
nos parmetros estudados.
A secagem por IV no produziu nenhuma alterao no perfil fenlico dos dois taxon em
estudo e na actividade anti-radicalar de Salix atrocinerea. No entanto relevou-se uma
diminuio, mesmo que muito pequena, da actividade do plen de Eucaliptus globulus. O
facto de esta variao ser to limitada e no ser acompanhada por nenhuma alterao do
perfil fenlico, deixa-nos muitas dvidas sobre o seu valor. Contudo mais so necessrios
para eliminar esta incerteza.

Eucaliptus globulus

Polen fresco

Secagem IV

Secagem tradicional
0

20

40

60

g rutina eq/mg poln

Minutes

Figura 4.1 Resumo efeitos da secagem no perfil fenlico e na actividade anti-radicalar de

Eucaliptus globulus

38

Salix atrocinerea

Poln fresco

Secagem IV

Secagem tradicional
0

20

40

60

Minutes

Figura 4.2 Resumo efeitos da secagem no perfil fenlico e na actividade anti-radicalar de

Salix atrocinerea
Em concluso podemos dizer que a secagem por IV no produz relevantes alteraes
na actividade anti-radicalar nas condies utilizadas no estudo, e portanto pode ser
aplicada no tratamento desta matria prima em substituio do mtodo tradicional, muito
mais demorado e caro.
Outro facto importante surgiu com este estudo.
Mais uma vez foi estabelecido que no s os compostos fenlicos concorrem pela
actividade anti-radicalar. Isto demonstrado pelas incidncia nos resultados dos testes
do DPPH da centrifugao, o que nos sugere que haja algum composto insolvel no
nosso solvente a concorrer pela actividade. Contudo analisando os resultados de
Campos (1997), onde foram avaliadas todas as fraces obtidas a partir da extraco do
plen, no conseguimos justificar esta actividade. Podemos ento s postular que haja
algum composto que esteja ligado a superfcie das estruturas celulares do plen que
participe na actividade.
Concluindo mais estudos so precisos para determinar a real aplicabilidade na industria
desta tcnica de secagem com radiao IV avaliando possveis alteraes de outros
compostos existentes no plen apcola, em particular os de interesse alimentar.

39

Tambm novos estudos devero ser feito de forma a identificar e isolar os compostos que
apresentam actividade anti-radicalar, para alm dos j conhecidos, porque esta
actividade est na base de outras como actividade anti-inflamatoria, anti-aterosclerotica e
antitumoral.

40

5. Referncias
Almaraz-Abarca N, Campos MG, vila-Reyes JA, Naranjo-Jimnez N, Herrera-Corral J,
Gonzales-Valdez LS Variability of antioxidant activity among Honeybee-collected Polle of
different botanical origin. Interciencia 2004 29: 574-578
Almaraz-Abarca N, Campos M.G, Delgado-Alvarado E.A, vila-Reyes J.A, Herrera-Corral
J, Gonzlez-Valdez G.S, Naranjo-Jimnez N, Frigerio C, Tomatas A.F, Almeida A.J,
Vieira A, Uribe-Soto J.N Pollen Flavonoid/Phenolic Acid Composition of Four Species of
Cactaceae and its Taxonomic Significance. Am J of AgricBiol Scien 2008 3 (3): 534-543
Anan'eva TV, Dvoretskii AI Effect of beta-carotene oil and bee pollen on ion transport in
rat brain slices following radiation-chemical exposure. Radiats Biol Radioecol 1999 39 (23): 341-4
Becker H and Ebeling L Conservative treatment of benign prostatic hyperplasia (BPH)
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