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Asesor:
Coasesores:
Universidad de Antioquia
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Química
Medellín, Ant.
2009
1
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 5
1. MARCO CONCEPTUAL……………………………………………………….. 6
1.2.1 Alcaloides……………………………………………………………………… 13
1.2.2 Fenilpropanoides………………………………………………………………. 14
1.2.3 Terpenoides……………………………………………………………………. 15
2. OBJETIVOS…………………………………………………………………….. 28
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA…………………………………………...29
2ii
Página
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS……………………………………………………38
3
iii
Página
5. CONCLUSIONES………………………………………………………………... 52
REFERENCIAS
ANEXOS
iv
4
INTRODUCCIÓN
Las fitoalexinas son metabolitos secundarios sintetizados de novo, los cuales cuentan
con actividad antibiótica y se acumulan en plantas bajo la influencia de un estrés, ya sea
por microorganismos o factores del ambiente. Su expresión puede generarse mediante
dos tipos de elicitores: bióticos y abióticos. La elicitación biótica consiste en generar
esta respuesta mediante la acción de microorganismos como hongos o bacterias,
mientras que la abiótica implica el uso de agentes químicos (metales pesados) y físicos
(luz UV).
Aun cuando la hipótesis de las fitoalexinas se encuentra en su séptima década, mucha
de la información al respecto es desconocida o debatible, lo que ha generado nuevas
alternativas en la forma de estudiar el fenómeno y ha reenfocado la atención en la
explotación potencial de los mecanismos de resistencia endógena para la protección de
un cultivo. El objetivo biotecnológico se centra en el uso de extractos elicitados, los
cuales poseen una carga considerable de metabolitos con actividad antibiótica, en el
control biológico de un cultivo. Otra de las alternativas consiste en diseñar una
resistencia multimecanística contra plagas, lo que implica el uso de herramientas
interdisciplinarias con las que se posibiliten aplicaciones de alto impacto. Sin embargo,
este objetivo solo puede lograrse a través de un entendimiento completo de la respuesta
fitoalexina.
Es posible facilitar la correlación de la actividad con la biosíntesis de metabolitos que
cumplen con las características necesarias para ser llamados fitoalexinas, a través de
fraccionamientos bioguiados y el diseño de herramientas como la bioautografía en la
cual se observa, directamente, cuáles compuestos están implicados en la actividad
biocida hacia microorganismos fitopatógenos.
5
1. MARCO CONCEPTUAL.
6
particulares, pero el resultado obtenido generalmente difiere de una especie a otra. Es
así como precursores químicos comunes pueden producir resultados diferentes [2].
La definición estricta para los metabolitos secundarios es que éstos no forman parte de
la estructura molecular básica de la célula, se encuentran presentes sólo en órganos o
tejidos particulares, o en etapas definidas del desarrollo. La definición más moderna
que puede encontrarse es en la que se los considera como compuestos orgánicos que no
tienen ningún rol en la asimilación o en el crecimiento y desarrollo del organismo. Sin
embargo, aunque en la mayoría de los casos los metabolitos secundarios no parecen ser
necesarios para la supervivencia de la planta, pueden conferirle una ventaja
competitiva. A pesar de no ser bien conocido el rol biológico que juega determinado
compuesto, en muchos casos consigue convertirse en un tesoro químico. Es decir,
adquiere un interés particular o es de beneficio para el hombre [2].
Como se mencionó con anterioridad, los niveles de los metabolitos secundarios están
estrechamente relacionados con el estado nutricional y de desarrollo del organismo.
Más crítico aún es el hecho de que su producción o biosíntesis se vea fuertemente
afectada por varios tipos de estrés que se encuentran presentes en el ambiente en el cual
se desarrolla el organismo [2].
A través de los años se han considerado varias hipótesis para la existencia de los
metabolitos secundarios. Una de ellas los considera como productos de exceso en el
metabolismo, como respuesta a niveles de sustrato superiores a los requeridos para el
7
metabolismo primario, o como resultado a una limitación en la cantidad de nutrientes
que pueden ser absorbidos. Otra de las hipótesis afirma que son productos de
desviación de rutas menores, que involucran, en un primer paso, la formación de una
enzima de bifurcación, la cual dirige una cierta cantidad del sustrato destinado al
metabolismo primario, hacia el secundario [3]. También podrían representar productos
de secreción o detoxificación [2,4].
8
Cabe agregar que, curiosamente, muchos metabolitos secundarios parecen ser dañinos
para la planta que los produce [4], es por ello que a menudo los terpenos, por ejemplo,
deben ser almacenados en glándulas o en compartimentos celulares especializados para
evitar que la misma planta sufra los efectos citotóxicos del compuesto [5].
Cuando en una planta se produce un estrés, ya sea por una interacción con agentes
bióticos (microorganismos), agentes abióticos (como luz UV) o daños mecánicos
(heridas de insecto), todas estas condiciones se traducen en una respuesta de defensa de
la planta la cual involucra la activación transcripcional de diversos genes de proteínas
necesarias para la cicatrización de la herida y/o la prevención de la invasión de
microorganismos patógenos. Estos genes codifican para proteínas involucradas en: a)
fortificación de la pared celular como son la formación de calosa, lignina y proteínas
ricas en hidroxiprolina. b) la producción de inhibidores de proteasa y de enzimas líticas
tales como las quitinasas y glucanasas, y c) la síntesis de metabolitos secundarios con
actividad antimicrobiana y antioxidante [6].
9
hipersensible caracterizada por una muerte rápida de las primeras células infectadas y la
restricción de la expansión del patógeno, aislándolo del resto de la planta [7].
En general, la expresión de los genes de defensa se regula por moléculas tales como el
ácido salicílico, etileno, ácido jasmónico y las ERO. En particular, el ácido jasmónico
modula la síntesis de las proteínas de la pared celular, como son las proteínas ricas en
prolina, y activa la expresión de los genes de las enzimas involucradas en la síntesis de
metabolitos secundarios tales como la acetil-CoA carboxilasa, la chalcona sintasa, la
fenilalanina amonio liasa, la hidroximetil-glutaril-CoA reductasa, y las polifenol
oxidasas, entre otras [8].
Por su parte, las ERO pueden tener dos funciones. En la primera, pueden aumentar el
daño producido por el estrés debido a su toxicidad, mientras que en la segunda, pueden
actuar como una señal para la activación de las respuestas de defensa. En la respuesta
hipersensible, las ERO pueden limitar la expansión del microorganismo patógeno
causando la muerte de la célula vegetal huésped y/o actuando directamente sobre el
microorganismo [9].
10
De igual manera, los metabolitos secundarios están involucrados en la respuesta de
defensa de las plantas mediante la restricción de la invasión y/o matando directamente
al microorganismo patógeno, o bien, por su capacidad antioxidante, contribuyen al
mantenimiento del estado de oxido-reducción de la célula vegetal [10].
Figura 1. Representación esquemática de las respuestas de defensa, tanto locales como sistémicas, desde
el inicio de la invasión de un microorganismo patógeno.
Se había mencionado con anterioridad que las rutas para la modificación y síntesis de
carbohidratos, proteínas, grasas y ácidos nucléicos son iguales en todos los organismos
vivos, excepto por algunas variaciones menores. Del mismo modo, la biosíntesis de la
mayoría de los metabolitos secundarios se da a partir de un grupo de precursores
relativamente pequeño, los cuales se han modificado para formar un incontable número
de compuestos a través de varias rutas sintéticas. Las rutas de mayor importancia son:
la acetil coenzima A (acetil-CoA), ácido shikímico y ácido mevalónico; más conocidas
como la ruta del acetato, shikimato y mevalonato respectivamente. Estos intermediarios
se forman como subproductos de rutas como la glicólisis e intermediarios de la misma
11
(figura 2.) [11]. Por otra parte, una amplia variedad de antibióticos, péptidos, proteínas y
alcaloides son modificaciones de aminoácidos derivados de la acetil-CoA vía ciclo de
Krebs [12] o por medio de la ruta del shikimato.
A partir de estas rutas se derivan varios grupos de metabolitos secundarios de los cuales
tres son los más importantes y extensamente estudiados: los terpenoides, los alcaloides,
y fenilpropanoides, todos ellos implicados, mediante infinidad de mecanismos, en la
respuesta de defensa de los organismos que las producen.
12
1.2.1 Los alcaloides
Por su similitud química a moléculas que participan en la transmisión de las señales del
sistema nervioso, el efecto toxico de los alcaloides radica en su capacidad de bloquear
neurorreceptores intermediarios de la transducción de la señal neuronal y canales
iónicos de vertebrados e insectos. Por otra parte, sus efectos inhibitorios del
crecimiento de microorganismos patógenos están dados por su capacidad de
intercalarse con el DNA, de detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e
inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos [14].
13
alcaloides de la planta en la síntesis de sus ferohormonas o de compuestos que tienen
actividad contra sus propios depredadores [16].
Estos compuestos se caracterizan por tener en su estructura un anillo aromático con uno
o más grupos hidroxilo y se sintetiza a partir de un precursor común, el ácido cinámico,
derivado de la fenilalanina por la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa.
Debido a su fitotoxicidad, por lo común son almacenados en su forma glicosilada en las
vacuolas o bien pueden conjugarse con otros componentes de la pared celular [17].
Otro aspecto de relevancia en los flavonoides es que pueden limitar la invasión del
microorganismo en respuesta a la infección. Estos pueden acumularse en forma de
inclusiones en las primeras células epidérmicas que fueron atacadas por el patógeno. En
el momento en que se penetra el tejido micelar, estas inclusiones viajan hasta el lugar
liberando su contenido y matando, tanto al patógeno, como a las células infectadas que
sintetizaron estos flavonoides para finalmente detener la infección [20].
Por otra parte, los fenilpropanoides simples y los flavonoides tienen una actividad
amplia dependiendo del sustituyente del hidroxilo de su anillo fenólico. Estos
compuestos pueden actuar como agentes quelantes de los iones hierro y cobre, como
14
cosechadores de radicales, como es el radical hidroxilo, o reaccionar con moléculas
como el ácido hipocloroso o nitroso y producir compuestos con una menor capacidad
oxidativa. Algunos fenilpropanoides simples son poderosos antioxidantes capaces de
consumir el H2O2 y contribuir con el ajuste del estado de oxido-reducción celular
desencadenado durante el estrés [21].
Los terpenos se clasifican por el número de unidades isopreno (figura 5), además existen
dos posibles rutas para su biosíntesis. Una de ellas es la ruta del ácido mevalónico
donde tres moléculas de acetil-CoA se unen para formar ácido mevalónico [23] la cual
es llevada a cabo en el citosol. El intermediario de seis carbonos allí producido es
fosforilado con 2 grupos fosfato (pirofosfato) para luego sufrir una descarboxilación y
posterior deshidratación generándose el isopentenil pirofosfato (isopentenil difosfato –
IPP), al cual se le denomina “building block”. La otra ruta, independiente del
mevalonato, utiliza intermediarios de la glicólisis para sintetizar IPP (figura 4) [31] y se
da en los plastidios (figura 3) [24].
Entre los terpenos pueden encontrase gran cantidad de compuestos con actividad
biológica potencial que intervienen en la respuesta de defensa de las plantas que los
producen. Algunos de ellos poseen actividad bactericida, otros son repelentes de
insectos. Sesquiterpenos tales como la rishitina y lubimina de la papa son compuestos
con actividad antimicrobiana [39].
15
Metabolismo Primario Metabolismo Secundario
OPP
Triterpenos Sesquiterpenos
C30 C15
FDP
2X
OPP
Citoplasma
OPP
IPP DMAPP
Plastidios
OPP OPP
IPP DMAPP
OPP
1X
Monoterpenos
3X
C10
GDP
OPP
Tetraterpenos Diterpenos
C40 C20
GGDP
CH3 CH3
Isomerización
H2C OPP H3C OPP
Isopentenil PP Dimetilalil PP
(IPP) (DMAPP)
16
CAROTENOIDES
DITERPENOS
OAc O OH
O Ph O
β - caroteno
Ph NH O MONOTERPENOS
CH3 O
H
Taxol OH
OBz AcO - Pineno
SESQUITERPENOS
ESTEROIDES
Isopreno Humuleno
Colesterol POLIMEROS
HO
H
OH
n
O
MeO POLIPROPENOIDES Caucho
MeO
O
Ubiquinona Coenzima Q
Por su parte, los terpenos en combinación con otros compuestos como las oxilipinas y
los indoles, forman mezclas volátiles que funcionan como señales químicas para atraer
a los enemigos naturales de insectos herbívoros. Estudios sobre la respuesta de la planta
a esta interacción, demostraron que hay inductores (elicitores) en la saliva de los
insectos herbívoros, que estimulan la síntesis de tales terpenos volátiles [25]. De otro
lado, por su capacidad antioxidante, los terpenoides son de vital importancia para las
plantas [26]. Los carotenoides no solo son componentes estructurales esenciales de los
sistemas fotosintéticos, sino que también son protectores del daño causado por la foto-
oxidación [27].
17
distintas aplicaciones específicas. Con el avance de las ciencias involucradas se han ido
perfeccionando las técnicas de estudio lográndose, no sólo mejorar la utilización de los
productos nativos obtenidos de los recursos naturales, sino también utilizarlos como
puntos de partida para la síntesis de nuevas sustancias con mejores propiedades que las
que les dieron origen. Hasta el presente, los principales agentes farmacéuticos han sido
descubiertos a través del “screening” de productos naturales obtenidos a partir de
material vegetal, organismos marinos, animales y microorganismos. Un ejemplo
concreto lo constituye el hecho de que más del 50 % de todos los principios activos
utilizados y con eficacia comprobada clínicamente en el tratamiento de distintos tipos
de cáncer son productos naturales o sus derivados.
A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados
por la humanidad debido a sus importantes aplicaciones como productos medicinales,
colorantes, esencias, alimentos, materia prima para la industria, etc. A partir de este
hecho se creó la necesidad de aislar aquellos compuestos de interés, con el fin de
estudiar su estructura y actividad. Sin embargo, una de las complicaciones más grandes
que acarrea consigo el estudio y aislamiento de los productos naturales es que, a
diferencia de las macromoléculas que prevalecen a través de los seres vivos, los
primeros son mucho más pequeños y químicamente más diversos que las
macromoléculas como proteínas, ácidos nucléicos y polisacáridos; las cuales son
relativamente más homogéneas. Por tanto estos procesos no están ajustados a un
manual práctico en el cual se encuentra detalladamente la receta o el protocolo, son
simplemente el resultado de un uso adecuado del criterio químico y las herramientas
con las que se cuenta [1].
18
La cromatografía es probablemente la técnica más poderosa y versátil para la
separación de una mezcla en sus componentes individuales. Aunque en la actualidad es
empleada en su mayoría como una herramienta de análisis químico, esta resulta útil en
la separación de cantidades relativamente pequeñas de materiales que poseen un valor
intrínseco apreciable [28].
El método fue desarrollado por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906. Tswett llevó a
cabo la extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de
petróleo, un solvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al
hacer pasar el extracto a través de un sistema que consistía un tubo de vidrio relleno
con carbonato de calcio (tiza). Debido a que los compuestos que separó tenían color,
Tswett observó bandas o zonas de composición distintas en la columna, demostrando
que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos presentes en las plantas.
19
capa delgada (TLC) y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase
preparativa.
Sin embargo, dado el caso en el que todas estas armas constitutivas no sean suficientes
para detener la germinación de la espora del hongo y la posterior penetración de la hifa
en la epidermis, la planta usualmente responde bloqueando o retardando el avance del
invasor. Para esto se generan señales de alerta que se traducen en varios tipos de
reacciones como: refuerzos estructurales de las paredes celulares, respuestas
hipersensibles (muerte celular programada), desarrollo de resistencia sistemática
adquirida y la acumulación de sustancias químicas producidas de novo las cuales
cuentan con actividad biocida llamadas fitoalexinas [31, 32, 33, 34, 35, 36].
20
ataque de un hongo. Bernard encontró que los tubérculos de dos especies de orquídeas
se volvían resistentes a ataques posteriores de un hongo luego de haber sido infectados
con Rhizoctonia repens. Mediante el cultivo de tejidos de tubérculo infectados y la
introducción del hongo en el medio (agar), él demostró que este tejido producía un
inhibidor del crecimiento del hongo. No obstante, los compuestos involucrados fueron
identificados décadas después [36].
21
pueden provenir de diferentes fuentes y entre ellos se encuentran los elicitores abióticos
como son algunos iones metálicos, radiación U.V., y elicitores bióticos como hongos,
bacterias, virus y herbívoros, etc. Se sabe que el tratamiento de plantas con elicitores, o
el ataque de patógenos incompatibles, desencadena una serie de reacciones de defensa,
incluyendo la acumulación de metabolitos secundarios de defensa como son las
fitoalexinas, tanto en plantas intactas como en cultivos celulares [35, 39]. Muchos
elicitores como la quitina, xiloglucanos, quitosan, h-glucanos y oligogalacturónidos
exhiben actividad elicitora entre las diferentes especies de plantas e inducen la
producción de fitoalexinas, sugiriendo que diferentes plantas poseen algunos receptores
comunes para ese tipo de señales [40].
22
De las muchas defensas potenciales en las plantas que se activan después de la
infección (postinfeccionales), ninguna otra ha sido estudiada tan a fondo y generado
tanta controversia a través de los años como la elicitación y la acumulación de
fitoalexinas [41]. Esto se debe a que el mecanismo que emplean las fitoalexinas para
detener el desarrollo del patógeno en el tejido hospedero, se encuentra aún muy
nublado para muchas de las interacciones planta-patógeno conocidas. Se ha obtenido
resultados importantes en sistemas donde ha sido posible cuantificar la fitoalexina en el
sitio de la infección, sin embargo existen pocos trabajos al respecto [41].
Otra de las aproximaciones que pueden resultar útiles para evaluar el rol de las
fitoalexinas, consiste en buscar variaciones naturales en la habilidad de una planta para
producir fitoalexinas y luego determinar si esta capacidad está relacionada a la
producción de fitoalexinas. En el sorgo, la resistencia a Colletotrichum sublineolum no
solo está relacionada a la producción de altas concentraciones de fitoalexinas en
interacciones no compatibles, sino también a la acumulación compuestos más tóxicos
por parte de genotipos específicos [43]. Es decir, esta variabilidad genotípica puede
proveer una herramienta para estudiar el rol de las fitoalexinas si se comparan las
diferencias en la resistencia y se correlacionan con la producción de fitoalexinas [44].
23
producidos luego de la infección, únicamente a partir de constituyentes preexistentes”.
De esta manera se quiso reemplazar e incluir todo tipo de metabolitos biocidas de bajo
peso molecular, además de las fitoalexinas, a los cuales no es posible correlacionárseles
como parte de un mecanismo de defensa o que, en efecto, aparentan jugar un rol en la
resistencia de las plantas [45].
Distinguir los antibióticos de las plantas con base a cómo son producidos puede parecer
un poco arbitrario. No obstante, esta distinción se basa en diferencias fundamentales en
las respuestas de las plantas en la interacción planta patógeno [45]. Es decir, para que
una fitoalexina funcione como base del mecanismo de resistencia a una enfermedad,
debe ser una respuesta activa en un tejido determinado de la planta, en el cual la
interacción de la planta con el microorganismo, genere un cambio en la actividad
metabólica de la planta. Mientras que, en el caso de una fitoanticipina, para que estos
funcionen como base del mecanismo de resistencia, la planta debe “confiar” en estos
compuestos preformados los cuales pueden jugar un papel pasivo en su interacción con
24
patógenos potenciales [45]. Es importante agregar que, en la mayoría de los casos, no es
posible conocer si el compuesto producido de novo es sintetizado únicamente en el sitio
de infección, si se acumula en todo el tejido de la planta o en un tejido en particular, e
incluso se desconoce si su producción está íntimamente relacionada a un fenómeno
específico que ocurre en una etapa particular de la enfermedad [48].
Como se mencionó con anterioridad, las fitoalexinas han sido consideradas como parte
de los mecanismos con los que las plantas responden al ataque de parásitos. Sin
embargo, algunos patógenos poseen una tolerancia, que puede ser moderada o alta, a
estos compuestos tóxicos (fitoalexinas), mientras otros son sensibles a ellos. Ha sido
posible demostrar, en unas pocas enfermedades, que los microorganismos que resultan
ser patógenos para la planta, logran metabolizar estos compuestos tóxicos mediante
mecanismos propios de detoxificación [34]. El estudio de tales mecanismos resulta ser
de gran interés debido a que: 1.) la patogenicidad de un organismo puede depender de
su habilidad para detoxificar los compuestos producidos por el hospedero y 2.) el
control de los mecanismos de detoxificación puede ayudar a mejorar la resistencia a la
enfermedad [37].
25
el aumento de la concentración de levaduras. No obstante es posible detectar trazas de
rishitina en cultivos no elicitados [39].
HO CHO
HO
CH3
HO
CH3 CH2 CH3
CH2
(2)
(1) H3C
O CH3 H3C
O CH3
OH
CH3 (5)
HO
CH3
CH3 CH2
Figura 6. Algunas fitoalexinas sesquiterpenoides de la papa. Rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3),
fituberina (4) y capsidiol (5).
De esta forma, es posible demostrar la relación quimiotaxonómica que existe entre estas
especies pertenecientes a la familia de las Solanáceas (papa (Solanum tuberosum),
tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Lycopersicon esculentum), ya que los reportes de
fitoalexinas producidas convergen a compuestos sesquiterpenoides en su mayoría.
La papa tiene un especial interés en la historia ya que, como se mencionó
anteriormente, a partir de esta se iniciaron los experimentos que dieron las bases de la
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hipótesis de las fitoalexinas [32]. Para esta se reportan metabolitos de estrés como la
rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3), fituberina (4), capsidiol (5) (figura 6) y otras 15
estructuras más [49].
Se puede encontrar una excepción en el tomate debido a que entre sus fitoalexinas se
detecta un compuesto acetilénico (cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol (figura 7)), sin
embargo éste no afecta la uniformidad de la respuesta fitoalexina en esta familia, ya que
el compuesto se produce en menor cuantía con relación a los demás.
OH
H C C C CH CH CH2 CH2OH
Figura 7. Cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol.
27
2. OBJETIVOS
Realizar una evaluación preliminar del perfil fitoquímico de los extractos elicitados
y no elicitados, con respecto a su actividad contra microorganismos fitopatógenos.
28
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA.
3.1.1 Materiales
3.1.2 Metodología.
A una cantidad aproximada de 0.5 kg del material seco y molido se le agregó un litro
de metanol y se dejó en agitación con shaker por 24 horas, al cabo de las cuales se
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filtró en algodón. El filtrado se recogió y el residuo se sometió nuevamente al mismo
proceso por dos ocasiones más. La solución metanólica obtenida se filtró nuevamente
con papel de filtro y se sometió a evaporación con vacío hasta eliminar por completo
el solvente. A la suspensión acuosa resultante se le realizó una partición líquido-
líquido con tres porciones de 30 mL de diclorometano por cada 100 mL de la misma.
Se recogió la fase orgánica y se sometió a evaporación hasta sequedad.
3.2.1 Materiales.
Los ensayos de actividad fungicida in vitro se llevaron a cabo con una cepa de
Fusarium oxysporum proporcionada por la línea de microbiología del laboratorio
GIEM. Los cultivos se realizaron en cajas de Petri de 5.3 cm de diámetro, se usó agar
malta marca OXOID®, aceite de Neem proporcionado por Biotropical, Tween 20 y un
saca bocados. La emulsificación se realizó con la ayuda de un sistema de dos jeringas
conectadas una llave de triple paso y la homogeneización se realizó con vortex. Se usó
autoclave para la esterilización de los instrumentos y los volúmenes fueron medidos
con pipetas volumétricas y micropipetas. Todos los procedimientos se llevaron a cabo
en una cámara de flujo laminar vertical Engelab. Para las cromatografías se utilizó
sílica gel 60 Merck® (0.063-0.200 mm), Sephadex® G-10 medium, sílica H 60F marca
Merck® y sílica fase reversa C-18. El acetato de etilo y el hexano marca Merck® grado
análisis, metanol destilado y una solución reveladora de vainillina marca Sigma®. Se
empleó una columna de 5.5 cm de diámetro por 70.0 cm de largo, rotavapor Büchi,
liofilizador, cromatofolios AL TLC de sílica gel 60 F254 Merck®, lámpara UV 254/366
y pistola de calentamiento.
3.2.2 Metodología.
30
3.2.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los
extractos.
El agar fue preparado según las especificaciones del fabricante agregando 50 g de agar
malta en un litro de agua destilada y calentando luego hasta su completa disolución.
Posteriormente se sometió a esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC.
Se prepararon emulsiones de los extractos crudos, tanto elicitado como no elicitado,
mezclando 720 mg de extracto, 2 mL de aceite de Neem, 0.2 mL (4 gotas) de Tween
20. La mezcla se llevó a un volumen total de 10,0 mL y se emulsificó haciendo pasar la
mezcla entre dos jeringas conectadas por una llave de tres pasos, para finalmente
obtener una emulsión madre con una concentración de extracto de 72000 ppm. Todos
los procedimientos se llevaron a cabo al interior de una cámara de flujo laminar y todos
los materiales usados fueron esterilizados en autoclave o bajo radiación UV.
Para cada emulsión se realizaron diluciones a 9000, 6000 y 3000 ppm, tomando 1000,
666 y 333 µL, respectivamente, de las emulsiones madre, 7.0 mL de agar malta y se
completó cada una de ellas, a un volumen total de 8,0 mL con agua estéril.
Posteriormente la mezcla se homogenizó con vortex, para luego ser vertida en una caja
de Petri estéril de 5.3 cm de diámetro.
Con la ayuda de un saca bocados se cortó un trozo de agar de una cepa de Fusarium
oxysporum, el cual se ubicó en el centro de la caja una vez solidificado el medio de
cultivo. Las cajas se sellaron con vinilpel y se incubaron a temperatura ambiente. Se
realizaron tres repeticiones de cada una de las concentraciones y se midió el radio del
halo de crecimiento del hongo cada 24 horas.
La emulsión empleada en el control se preparó como se describió anteriormente, esta
vez sin agregar extracto alguno. Para el control de la emulsión se tomó 1000 µL de esta
emulsión, se mezcló con 7,0 mL de agar malta y se homogenizó en vortex. Para el
control absoluto, a 7,0 mL de agar se le agregó 1000 µL de agua estéril para completar
el mismo volumen total. Ambos controles se realizaron por triplicado y de igual manera
se midió el radio del halo de crecimiento cada 24 horas.
Inicialmente se evaluó únicamente la actividad de los extractos crudos Elicitado y No
elicitado.
31
3.2.2.2 Fraccionamiento del extracto crudo elicitado.
Se llevó a cabo una cromatografía de columna con sílica gel usando un gradiente de
4:1, 3:1, 2:1 y 1:1 del sistema hexano:acetato de etilo. Se recogieron 83 fracciones de 2
mL aproximadamente. Luego de observar su perfil por TLC se reunieron 8 fracciones
totales, las cuales se denominaron como A, B, C hasta H, respectivamente.
Con base a los reportes de la literatura se seleccionó la fracción B y se le realizó una
cromatografía de columna usando sílica fase reversa con soporte C-18 como material
de empaque y un gradiente de isopropanol:agua como fase móvil, el cual se varió desde
una proporción 20:80 hasta 70:30, agregando 10 mL de fase móvil cada vez que se
cambiaba de una proporción de solventes a otra. Se recogieron 20 fracciones de las
cuales se tomaron las número 16 y 17, debido a que se observó como una sola banda en
32
la placa cromatográfica cuando se corrían por TLC. Se eliminó el solvente orgánico
mediante evaporación con vacío, el agua restante mediante liofilización y se corrió el
respectivo espectro 1HRMN.
Se unieron las fracciones F y G, y se les aplicó una cromatografía en fase reversa
siguiendo un procedimiento similar al descrito recientemente. En este caso la
composición de la fase móvil se varió desde una proporción inicial 10:90
isopropanol:agua, hasta 60:40. De igual manera se colectaron 20 fracciones,
escogiéndose la 12 y 13 debido que se observaron como una sola banda que mostró
fluorescencia al irradiarse con luz UV de onda larga. Esta muestra fue secada mediante
evaporación con vacío y liofilización, y enviada para la toma de su respectivo espectro
1
HRMN.
3.2.2.5 Fraccionamiento del extracto Fr3.
Se le realizó una cromatografía de exclusión por tamaño al extracto Fr3 usando una
fase estacionaria de Sephadex® y un sistema triple de solventes compuesto por
hexano:acetato de etilo:metanol como eluente, en proporciones 3:2:1. Se recogieron 16
fracciones de 5 mL cada una y a partir de monitoreo por TLC se determinó reunir las
fracciones 1-5. Posteriormente se realizó una cromatografía de columna con sílica H,
cuyas dimensiones fueron de 2 cm de diámetro por 11cm de largo, en un sistema de
hexano:acetato de etilo (2:1). De las 15 fracciones obtenidas se decidió unir las número
10 y 11. Posteriormente, el solvente fue evaporado y la muestra fue dispuesta para la
toma del espectro 1HRMN.
3.3.1 Materiales.
Todos los reactivos y materiales empleados para la marcha fitoquímica provinieron del
laboratorio de fitoquímica de la Universidad de Antioquia.
3.3.2 Metodología.
33
La metodología seguida en la marcha fitoquímica fue tomada del manual de laboratorio
de fitoquímica de la Universidad de Antioquia. El esquema general se muestra en la
figura 1 del anexo No1. Las pruebas para los diferentes grupos de metabolitos se
realizaron como sigue:
En un tubo de ensayo que contiene un mililitro de extracto se agrega una gota de FeCl 3
al 1% y se agita suavemente. La prueba se considera positiva con la aparición de
coloraciones violeta, verde, azul y negro.
34
3.3.2.5 Prueba de Cardiotónicos.
35
3.4.1 Materiales.
3.4.2 Metodología
Se preparó medio para levaduras usando una fuente de carbono (azúcar comercial) a
una concentración de 100 g/L, KH2PO4 2.0 g/L, (NH4)2SO4 3.0 g/L, MgSO4.7H2O 1.0
g/L, extracto de levadura 4.0 g/L, peptona 3.6 g/L y agua destilada. Luego se sometió a
esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC. El revelador se preparó mezclando
36
una solución de 0.8 g/L de MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) y
tritón X-100 al 0.1% en agua.
Se tomaron 20,0 mL de medio para levaduras y se le agregaron 5,0 mL de suspensión
de levaduras a una concentración de 6.4x107células/mL. La mezcla se homogeneizó en
vortex y se vertió en una caja de Petri estéril. Luego se tomó la placa desarrollada por
TLC y se sumergió en el medio inoculado por 20 segundos. Seguidamente se dispuso
en una caja de Petri de 9.1 cm de diámetro, se selló con vinilpel y se incubó a 37ºC por
4 horas. Transcurrido este tiempo, se sumergieron las placas en el revelador MTT por
10 segundos para nuevamente ser introducidas en la caja de Petri e incubarse a las
mismas condiciones iniciales por 12 horas más. Se realizaron controles de solvente y
absoluto. En el primero se realizó el corrido de las placas de TLC a las mismas
condiciones pero sin sembrar extracto alguno, mientras que en el control absoluto el
único proceso previo realizado a la placa fue la activación a 105ºC. Cada
procedimiento se llevó a cabo por triplicado.
37
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS.
Con el fin de mantener las condiciones lo más homogéneas posible entre el material
Elicitado y No elicitado, se optó por asperjar cada 24 horas por 48 horas antes de
someter el material a secado en estufa. De esta manera se pudo evitar la podredumbre
del material por acción bacteriana, que pudiera afectar la eficiencia de la extracción
mediante la degradación de los metabolitos de estrés usando mecanismos de
detoxificación. La porción No elicitada no corría el riesgo de sufrir podredumbre, ya
que en este caso, luego de ser rebanado el material se sometía a secado de forma
inmediata.
Las masas de papa usadas en cada porción a ser extraída, tanto de la parte Elicitada
como la No elicitada, y la respectiva masa del material seco y molido se muestran en la
tabla 1 del anexo No1.
Luego de realizárseles la partición líquido-líquido con diclorometano a los extractos, y
someterlos de nuevo a evaporación con vació, se obtuvieron 18.215 g y 18.850 g de
extracto crudo Elicitado y No elicitado, respectivamente, para un rendimiento del
0.71% en el Elicitado y 0.62% en el No elicitado, ambos con base a la masa del
material seco.
38
Figura 8. Ensayo de actividad fungicida para el extracto No elicitado a las 120 horas, donde se muestran los controles absoluto y de
emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
Se realizó una prueba ANOVA para comparar las medias del halo de crecimiento de los
controles mediante el paquete estadístico STAT GRAPHICS, encontrándose que no hay
diferencias significativas en la rata de crecimiento del hongo (P = 0.373901). Esto
sugiere que el aceite, el cuya concentración final máxima en el medio es de 2.5%, no
tiene ningún efecto en el desarrollo normal del hongo. Sin embargo, a pesar de este
hecho, y de contar con emulsiones estables en el tiempo, se siguió evaluando el control
de la emulsión en los experimentos subsiguientes para controlar cualquier posible
variable.
Para el extracto No elicitado, aunque visualmente hay diferencias sutiles en la
pigmentación del micelio, con respecto a el control, estas solo se observan en la
concentración más alta de extracto. De la misma manera que en los controles, por
medio de la prueba ANOVA no se encontraron diferencias significativas con respecto
al control para ninguna de las concentraciones (P > 0.05) (ver figura 8). En todos los
casos se observó una rata de crecimiento similar entre si y una coloración violácea con
apariencia algodonosa en el halo del hongo.
Por otro lado, el extracto Elicitado sí presentó diferencias apreciables con respecto a los
controles, mostrando además efectos sobre el hongo que se incrementaban a medida
que se aumentaba la concentración del mismo. El efecto del extracto Elicitado en el
desarrollo del hongo se manifestó en un decoloramiento del micelio y una disminución,
39
aunque sutil, en la rata de crecimiento. Estos datos se encuentran consignados en la
tabla 3 del anexo No 1. Los datos del radio de crecimiento a las diferentes
concentraciones de extracto Elicitado fueron sometidos a una prueba ANOVA
mostrando diferencias significativas con respecto al control para todas las
concentraciones (P=0.00067 entre Elicitado C1 y el control). Los datos adquiridos a
partir de los controles se encuentran consignados en las tablas 4 y 5 del anexo No1.
A partir de estos ensayos pudo demostrarse que hubo un efecto evidente del extracto
Elicitado en el hongo, lo cual puede atribuirse a la presencia de metabolitos con
actividad que estaban ausentes en el extracto No elicitado, indicando que, en efecto,
hubo una elicitación en el tejido del tubérculo causada por el cloruro de cobre (ver figura
9).
Figura 9. Ensayo de actividad fungicida para el extracto Elicitado a las 144 horas, donde se muestran los controles absoluto y
de emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
Otro hecho importante es que, bajo las mismas condiciones de extracción, se obtuvo un
rendimiento ligeramente mayor para el extracto Elicitado, lo cual puede indicar que el
estrés generado en el tejido aumentó la producción del metabolismo secundario. Sin
embargo, aun no puede atribuirse este aumento de metabolitos a la síntesis de
compuestos activos por parte de las células de papa. Para ello es necesario un soporte
estadístico en el cual se comparen las medias de varias extracciones a materiales
40
Elicitados y No elicitados para demostrar que, en efecto, la elicitación induce una
mayor producción de metabolitos en el material.
La evidencia de metabolitos con actividad presentes en el extracto Elicitado y ausentes,
o presentes en muy baja concentración, en el extracto No elicitado, generó la necesidad
de realizar un fraccionamiento del extracto Elicitado para evaluar la actividad de
fracciones obtenidas y, de igual manera, observar el carácter de polaridad de los
metabolitos más activos en una partición donde se obtuviesen tres fracciones, una de
baja polaridad, otra de polaridad intermedia y otra de mayor polaridad. La masa de las 3
fracciones obtenidas y sus respectivos rendimientos se encuentran consignados en la
tabla 6 del anexo No1. Los criterios para conformar estas fracciones fueron los
resultados arrojados por TLC, al igual que la obtención de una cantidad suficiente del
extracto para la realización de los respectivos ensayos de actividad fungicida y los
subsecuentes particionamientos.
Se realizaron los ensayos de actividad de los extractos Fr1, Fr2 y Fr3 obtenidos en el
fraccionamiento del Elicitado. En la evaluación de la fracción Fr1 la apariencia del
micelio del hongo, al igual que el radio del halo de crecimiento, fue similar a la del
control, sugiriendo que no hubo ningún efecto de este extracto en el desarrollo normal
del hongo. Este hecho se demostró posteriormente comparando, mediante un análisis
ANOVA, la rata de crecimiento radial del hongo en el control y en el extracto Fr1 (ver
anexo No1, tabla 7) concluyéndose que no hubo diferencias significativas entre ellos (P =
0.4918). De igual manera se realizó la comparación del extracto Fr1 con el No elicitado
obteniéndose en el mismo resultado. Esta se convierte en una evidencia de que el
extracto No elicitado está compuesto, en su gran mayoría, de metabolitos poco polares
los cuales no presentan efectos notorios sobre el hongo a las, relativamente, altas
concentraciones evaluadas. Se confirma además el resultado obtenido en el ensayo
comparativo de actividad entre el extracto Elicitado y No elicitado, en el cual puede
concluirse que, efectivamente, hubo elicitación.
Por otra parte, para los extractos Fr2 y Fr3 se observó un efecto inhibitorio del
crecimiento del hongo, además de cambios evidentes en la apariencia del micelio (ver
figura 10). Estos cambios en la apariencia se manifestaron como un decoloramiento del
41
micelio, el cual era más pronunciado para el Fr2 que para el Fr3. Esto demuestra que,
en su mayoría, los metabolitos implicados en la actividad se concentraron en las
fracciones Fr2 y Fr3, lo cual da indicios de un carácter polar importante en estos
compuestos, debido a que los sistemas de solventes usados para su elusión (Fr2 y Fr3)
son de carácter polar.
Figura 10. Ensayo de actividad fungicida para los extractos Fr2 y Fr3 a las 144 horas, donde se muestran las diferentes
concentraciones evaluadas para ambos extractos C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
Aunque la inhibición fue mucho más marcada para la Fr2 que para la Fr3, el hecho más
importante se observó para la concentración de 9000 ppm de la primera (Fr2), en la
cual se inhibe por completo el crecimiento del hongo. Es decir, a diferencia del extracto
Fr3 y las demás concentraciones evaluadas del Fr2 donde el efecto es fungistático, para
la concentración más alta del Fr2 se observa un efecto fungicida.
Teniendo en cuenta este hecho, se plantea la posibilidad de desarrollar una formulación
de un agente fungicida preparado a partir de este extracto, ya que los agentes fungicidas
comerciales son preparados en concentraciones entre el 1-2%. Para el caso del extracto
Fr2 se tiene una inhibición total con una concentración cercana al 1%, sin embargo,
sería necesario analizar factores como la estabilidad, biodegradabilidad, fitotoxicidad y
costos, entre otros, para evaluar la viabilidad del proceso.
42
Los datos del halo de crecimiento del hongo con respecto al tiempo para los extractos
Fr2 y Fr3 se encuentran en las tablas 8 y 9 del anexo No1. Los datos de los controles
para este experimento se encuentran en las tablas 10 y 11 de esta misma sección.
Se realizaron gráficos del radio del halo de crecimiento promedio del hongo con
respecto al tiempo y se observó que, tanto para los controles como para los extractos en
las tres concentraciones evaluadas, las curvas obtenidas se ajustaron de forma
satisfactoria a un modelo lineal (P<0.05 y R>0.92) (VER ANEXO 3) usando el paquete
estadístico STAT GRAPHICS. De esta manera se pudo probar que cada una de las
pendientes tenía una relación de proporcionalidad directa con la rata de crecimiento del
hongo en un medio determinado. Estos valores se pueden encontrar en la tabla 12 del
anexo No1.
0,018
Fracción 2
0,016
R2 = 0,3659
R2 = 0,6877
Rata de crecimiento (cm/h)
0,014
Fracción 3
0,012
R2 = 0,7295
0,01 R2 = 0,9942
No elicitada
0,008
0,006
Elicitada
0,004
0,002
R2 = 0,9208
0 Fracción 1
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Concetración (ppm)
Figura 11. Gráfico de la rata de crecimiento, representada por la pendiente, para cada uno de los
extractos a las diferentes concentraciones evaluadas.
Se quiso comparar la inhibición entre los diferentes extractos evaluados para lo cual se
graficaron los valores de las pendientes de las curvas de crecimiento con respecto a la
concentración del extracto (figura 11). En este gráfico se puede observar que luego del
fraccionamiento del extracto Elicitado la actividad de la fracción Fr2 se incrementa, ya
que presenta la menor rata de crecimiento para todas las concentraciones. Sin embargo,
un detalle importante es el incremento en la actividad de los extractos Elicitado y Fr3
43
con el aumento de la concentración. Es decir, a pesar de que el extracto Elicitado
presenta un efecto inhibitorio mayor que el Fr3 para las concentraciones de 3000 y
6000 ppm, mientras que para la concentración de 9000 ppm la tendencia se invierte,
demostrando que el incremento en la concentración para el extracto Fr3 genera un
aumento más dramático en la actividad. Suponiendo que la tendencia se conserva a
medida que se aumenta la concentración, a partir de las ecuaciones de las rectas,
mediante extrapolación, podría calcularse de forma aproximada el valor de la
concentración de estos extractos para que el efecto observado sea fungicida y no
fungistático. De esta manera se encuentra que son necesarias concentraciones de 48300
y 21100 ppm para el extracto Elicitado y el Fr3, respectivamente. No obstante, el efecto
más dramático en el aumento de la concentración lo muestra el extracto Fr2, para el
cual se observó experimentalmente que se necesitaba, como máximo, una
concentración de 9000 ppm para observar un efecto fungicida en Fusarium oxysporum.
En términos comparativos, la inhibición generada por el extracto Fr2 es un poco más
del doble que la del Fr3, y esta a su vez, es tres veces mayor que la del extracto crudo
Elicitado (ver figura 11).
Ahora, analizando los extractos No elicitado y Fr1, se observa una gran similitud en la
forma de sus curvas (figura 11) lo cual se había demostrado estadísticamente mediante el
análisis ANOVA. Sin embargo, otro hecho para resaltar es que, debido a que se
presentan pendientes positivas al aumentar la concentración de extracto, se puede
afirmar que hay un efecto benéfico en el crecimiento del hongo, expresado en un
aumento en la rata de crecimiento al incrementar la concentración de extracto. A pesar
de ello, el efecto positivo mostrado es bastante bajo debido a que, como se había
mencionado, no hay una diferencia estadísticamente significativa con respecto al
control. En la figura 12. se comparan gráficamente el efecto inhibitorio total de los
diferentes extractos evaluados, a partir de las pendientes obtenidas en el gráfico de rata
de crecimiento vs. concentración de extracto (figura 11).
44
4.2.2 Fraccionamiento del extracto Fr2.
A partir de los resultados obtenidos en los ensayos, en los que el extracto Fr2 mostró
una mayor actividad que las demás fracciones, se decidió continuar con su
fraccionamiento. Se le aplicó cromatografía de columna usando sílica H, como se
describió en la metodología, ya que se requería una mayor resolución que la
proporcionada por la sílica gel. Se obtuvieron ocho fracciones de acuerdo a los perfiles
de TLC (A, B, C hasta H respectivamente).
45
espectroscopía no estuviese reportada en la literatura como un compuesto que está de
hecho implicado en la base de la defensa de una planta, la conclusión de si es o no una
fitoalexina hubiese estado pobremente sustentada.
-2,20E-06
-1,70E-06
-1,20E-06
Pendiente
-7,00E-07
-2,00E-07
3,00E-07
lic ita do do n1
No e Elic ita Fra cc
io io n 2
n3
Fra cc Fra cc
io
Extractos evaluados
Figura 12. Gráfico de la pendiente obtenida en la figura 5 para cada uno de los extractos evaluados.
Se decidió someter esta fracción a una cromatografía de exclusión por tamaño usando
Sephadex® debido la poca resolución lograda por cromatografía en fase normal, la cual
se evidenció por TLC. Las cinco primeras fracciones eluidas se reunieron ya que
aparecían como una sola banda con un Rf de aproximadamente 0.2 en TLC. El hecho
de que eluyeran primero indicaba que se trataba de la molécula, o mezcla de moléculas,
de mayor tamaño en la mezcla. Se le realizó una purificación usando una columna de
sílica H con la cual se obtuvo un compuesto (MA) que se presumía puro gracias a su
perfil de TLC. No obstante, la información arrojada por el espectro 1HRMN no fue lo
suficientemente concluyente, hecho que se atribuye a la cantidad de muestra “pura”
46
13
obtenida (8 mg) la cual impide obtener un espectro CRMN confiable. El espectro se
encuentra adjunto en el anexo No 2, figura 2.
Se realizó una partición del extracto crudo Elicitado usando agua caliente y filtrando de
igual manera sobre papel de filtro para remover material insoluble. El filtrado acuoso
resultante mostró los siguientes resultados:
47
PRUEBA CONCENTRACIÓN COLORACIÓN
APARENTE
Terpenoides (++) Verde
Cardiotónicos (+) Magenta
Alcaloides (+++) Amarillo
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
48
a) b) c)
Figura 13. Placas de TLC para el extracto Fr2 donde a) corresponde a la placa revelada con vainillina, b) bajo luz
UV de onda corta y c) luz UV de onda larga.
49
vainillina y la revelada con luz UV de onda corta, podría atribuirse esta inhibición a una
baja concentración de compuestos en esta área de la placa.
Figura 14. Resultados de la bioautografía luego del revelado con DTT, donde se muestra la bioautografía para el extracto Fr2 y
los controles de solvente y absoluto.
50
por una serie de bandas coloreadas de tonalidades verdes a amarillas en donde podría
haber inhibición. El sustento de esta hipótesis es que, debido a la poca proliferación de
levaduras y la reactividad de los compuestos implicados, posiblemente se dio una
reacción entre el revelador (MTT) y los compuestos allí presentes, evidenciándose con
la aparición de estas bandas coloreadas que van hasta donde se alcanza el frente del
solvente.
51
5. CONCLUSIONES
52
El método bioautográfico posibilita la correlación directa de bandas de inhibición
con la actividad mostrada en las fracciones evaluadas. Además, de este modo se
facilita la separación y aislamiento de compuestos activos en el extracto, a partir del
factor de retención de las bandas de inhibición observadas en la bioautografía. Estos
compuestos pueden ser de interés para su elucidación estructural y, eventualmente,
su correlación como compuestos que cumplen las características necesarias para ser
llamados fitoalexinas.
53
ANEXO No1.
Tablas.
Tabla 1. Cantidad en masa del material Elicitado y No elicitado empleado en cada porción a ser extraída.
Tabla 2. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto No elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom Prom Prom
C11 C12 C13 C21 C22 C23 C31 C32 C33
(h) C1 C2 C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,6 0,60 0,4 0,4 0,3 0,37 0,3 0,2 0,2 0,23
120 1,8 1,9 1,9 1,87 1,9 1,9 1,8 1,87 1,8 1,8 1,7 1,77
144 2,3 2,3 2,2 2,27 2,2 2,2 2,2 2,20 2,2 2,2 2,2 2,20
Tabla 3. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom Prom Prom
C11 C12 C13 C21 C22 C23 C31 C32 C33
(h) C1 C2 C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,7 0,6 0,63 0,5 0,5 0,5 0,50 0,5 0,4 0,4 0,43
72 1,0 1,1 1,0 1,03 0,9 0,9 0,9 0,90 0,9 0,9 0,8 0,87
144 ------ 1,9 1,8 1,85 1,6 1,6 1,6 1,60 1,5 1,7 1,6 1,60
54
Tabla 4. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto del
primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom
CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3
(h) CtrlA
0 0,2 0,2 0,2 0,2
48 1 0,8 0,8 0,867
72 1,4 1,3 1,4 1,367
144 2,4 2,4 2,4 2,4
Tabla 5. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control de la emulsión
del primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom
CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3
(h) CtrlE
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,7 0,63
72 1,2 1,1 1,1 1,13
144 2,3 2,3 2,2 2,27
Tabla 6. Masas y rendimientos de las fracciones obtenidas del extracto Elicitado. El rendimiento se
calculó con base a la cantidad de extracto crudo Elicitado empleado (11.30 g)
Tabla 7. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr1. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom Prom Prom
C11 C12 C13 C21 C22 C23 C31 C32 C33
(h) C1 C2 C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,5 0,6 0,57 0,4 0,4 0,3 0,37 0,3 0,2 0,2 0,23
120 1,8 1,8 1,9 1,83 1,9 1,8 1,8 1,83 1,8 1,8 1,7 1,77
144 2,3 2,1 2,3 2,23 2,3 2,3 2,2 2,27 2,2 2,2 2,2 2,20
55
Tabla 8. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr2. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom Prom Prom
C11 C12 C13 C21 C22 C23 C31 C32 C33
(h) C1 C2 C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,4 0,4 0,5 0,43 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
72 0,7 0,8 0,9 0,80 0,4 0,4 0,4 0,40 0,2 0,2 0,2 0,20
96 1,2 1,0 1,2 1,13 0,8 0,8 0,8 0,80 0,2 0,2 0,2 0,20
120 1,7 1,6 1,7 1,67 1,1 1,1 1,1 1,10 0,2 0,2 0,2 0,20
144 1,8 1,8 1,9 1,83 1,4 1,5 1,5 1,47 0,2 0,2 0,2 0,20
Tabla 9. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr3. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom Prom Prom
C11 C12 C13 C21 C22 C23 C31 C32 C33
(h) C1 C2 C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,7 0,6 0,63 0,5 0,4 0,4 0,43 0,3 0,3 0,3 0,30
72 1,0 1,1 1,0 1,03 0,8 0,7 0,8 0,77 0,5 0,5 0,5 0,50
96 ------ 1,7 1,5 1,60 1,3 1,2 1,2 1,23 0,9 0,9 0,9 0,90
120 ------ 2,1 2,0 2,05 1,7 1,7 1,7 1,70 1,2 1,4 1,3 1,30
144 ------ 2,4 2,4 2,40 2,1 2,1 2,0 2,07 1,7 1,6 1,6 1,63
Tabla 10. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto en el
segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom
CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3
(h) CtrlA
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 1,2 1,2 1,0 1,13
120 2,0 2,0 2,1 2,03
144 2,3 2,2 2,4 2,30
Tabla 11. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control de la emulsión
en el segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo Prom
CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3
(h) CtrlE
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,4 0,53
120 2,0 1,9 2,0 1,97
144 2,4 2,3 2,4 2,37
56
Tabla 12. Datos de la pendiente obtenidos a partir del análisis estadístico para cada uno de los extractos a
las diferentes concentraciones evaluadas.
Concentración No
Elicitado Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3
(ppm) elicitado
3000 0,0148352 0,0138622 0,0146368 0,01234130 0,0161210
6000 0,0150336 0,0118590 0,0152625 0,00930556 0,0136905
9000 0,0150183 0,0119124 0,0150183 0 0,0105159
57
ANEXO No2
58
Figura 2. Espectro 1HRMN para la muestra MA.
59
Figura 4. Espectro 1HRMN para la muestra MC.
60
ANEXO No3.
2
Radio (cm)
1.6
Pvalor = 0.045
Prom CA_1
R = 0.947
1.2
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
CONTROL ABS.Tiempo _h_1
1.6
Radio (cm)
Prom CA_2
0.4
0
0 20 40 60 80 100 120
CONTROL ABS.Tiempo _h_2
61
Plotdel
Rata de crecimiento ofhongo
Fitted Model
para el control emulsión 1
Prom CE_1 = 0.0333333 + 0.015812*CONTROL EMUL.Tiempo _h_1
2.4
1.6
Prom CE_1
Radio (cm)
Pvalor = 0.0148
1.2
R = 0.985
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
CONTROL EMUL.Tiempo _h_1
Plotdel
Rata de crecimiento ofhongo
Fitted Model
para el control emulsión 2
Prom CE_2 = 0.0782051 + 0.0152244*CONTROL EMUL.Tiempo _h_2
2
1.6
Radio (cm)
Prom CE_2
1.2
Pvalor = 0.0159
0.8 R = 0.984
0.4
0
0 20 40 60 80 100 120
CONTROL EMUL.Tiempo _h_2
62
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto No
Plot of Fitted Model
elicitado
Ext No Elicitado.PROM C1 = 0.0761905 + 0.0148352*Ext No Elicitado.Tiempo
Ext No Elicitado.PROM C1 2.4
1.6
Radio (cm)
0.4
0
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo_h_
2
Radio (cm)
1.6
1.2
Pvalor = 0.0276
R = 0.972
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo_h_
63
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto No
Plot of Fitted Model
elicitado
Ext No Elicitado.PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*Ext No Elicitado.Tiempo
Ext No Elicitado.PROM C3 2.4
1.6
Radio (cm)
0.4
0
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo_h_
1.6
Ext Elicitado.PROM C1
Radio (cm)
1.2
Pvalor = 0.0133
R = 0.986
0.8
0.4
0
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo_h_
64
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto
Plot of Fitted Model
Elicitado
Ext Elicitado.PROM C2 = 0.0884615 + 0.011859*Ext Elicitado.Tiempo
Ext Elicitado.PROM C2 1.6
1.2
Radio (cm)
0.4
0
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo
_h_
1.2
Radio (cm)
0.4
0
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo_h_
65
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 1
Plot of Fitted Model
FRACCION 1 Prom C1 = 0.0666667 + 0.0146368*FRACCION 1 Tiempo _h_
2.4
2
FRACCION 1 Prom C1
1.6
Radio (cm)
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
2
FRACCION 1 PROM C2
1.6
Radio (cm)
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
66
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Fr 1
Plot of Fitted Model
FRACCION 1 PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*FRACCION 1 Tiempo _h_
2.4
FRACCION 1 PROM C3
2
1.6
Radio (cm)
Pvalor = 0.0413
1.2 R = 0.958
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
1.6
Radio (cm)
1.2
Pvalor = 0.0010
R = 0.974
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 2.Tiempo_h_
67
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 2
Plot of Fitted Model
FRACCION 2.PROM C2 = -0.05 + 0.00930556*FRACCION 2.Tiempo
FRACCION 2.PROM C2 1.5
1.2
Radio (cm)
0.9
Pvalor = 0.0073
R = 0.929
0.6
0.3
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 2.Tiempo_h_
2
FRACCION 3.PROM C1
Radio (cm)
1.6
Pvalor = 0.0003
1.2 R = 0.986
0.8
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo_h_
68
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 3
Plot of Fitted Model
FRACCION 3.PROM C2 = -0.0285714 + 0.0136905*FRACCION 3.Tiempo
2.4
2
FRACCION 3.PROM C2
1.6
Radio (cm)
0.4
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo_h_
1.5
FRACCION 3.PROM C3
1.2
Radio (cm)
0.3
0
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo _h_
69
REFERENCIAS
[1] Richard, J.P. Cannell. Natural products isolation. Methods in biotechnology. Humana Press (1998).
540p.
[3] Ferry N., Edwards M., Gatehouse J., Gatehouse A. MR. Plant–insect interactions: molecular
approaches to insect resistance. Current Opinion in Biotechnology. Vol 15, Issue 2, 2004, Pages 155-161.
[4] Howell C.R., Hanson L.E. Induction in terpenoid synthesis in cotton roots. Phytopatol. 90:248-52.
[5] Sepúlveda, G.; Porta, H. 2003. La participación de los metabolitos secundarios en la defensa de las
plantas. Revista Mexicana de fitología. Vol. 21. No. 1. 355-363 p.
[6] Peña-Cortes H., y Willtmitzer L. 1995. The role of the hormones in gene activation in response to
wounding. pp. 395-414.
[7] Hammond-Kosack, K.E., Jones, J.D. 1996. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant
cell 8: 1773-1791.
[8] García-Ponce, B., Rocha-Sosa, M. 2000. The octadecanoid pathway is required for pathogen-induced
multifunctional acetyl-CoA carboxylase accumulation in common bean (Phaseolus vulgaris). Plant
science 157:181-190.
[9] Dat, J., Vandenabeele, S. 2000. Dual action of the oxygen reactive species during plant stress
responses. Cell and molecular life sciences. 57:779-795.
[10] Grant, J.J. Loake, G.J. 2000. Role of reactive oxygen intermediate and cognate redox signaling in
desease resistence. Plant fisiology 124:21-29.
[11] Tolonen, Ari. Analysis of secondary metabolites in plant and cell culture tissue of Hypericum
perforatum L and Rhodiola rosea L. Department of Chemistry, University of Oulu, P.O.Box 3000, FIN-
90014 University of Oulu. Oulu, Finland. 2003.
[12] Dewick, Paul M. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. John Wiley & Sons, Ltd.
2002. 507 p.
[13] Facchini, PJ. 2001. Alcaloid biosynthesis in plants. Annual review of physiology and plant
molecular biology. 52:29-66.
[14] Wink, M. Schimmer, O. 1999. Modes of action of defensive secondary metabolites. pp. 17-134.
Sheffield Academic press. Sheffield, England. 304p.
[17] Edwards, R. Gatehouse, JA. 1999. Secondary metabolism. pp. 193-218. Plant biochemistry and
molecular biology. John Wiley and Sons Ltd. Maryland, USA. 384p.
70
[18] Petersen, M., Strack, D. 1999. Biosíntesis of fenilpropanoid and related compound. pp. 151-221.
Annual plant reviews. Vol 4. Sheffield Academia Press Ltd. London, UK. 374p.
[19] Padmavati, M., Sakthivel, N. 1997. Diferencial sensitivity of rice pathogens to growth inhibition by
flavonoids. Phytochemistry 46:499-502.
[20] Snyder, BA., Nicholson, RL. 1990. Synthesis of phytoalexins in sorghum as a site-specific response
to fungal ingress. Science 248:1637-1639.
[21] Rice-Evans, C., Miller , N.J. 1997. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in plant
science 4:184-190.
[23] John Buckingham. Dictionary of Natural Products. Chapman & Hall/CRC, England. CRC Press
(1997). 615 p.
[24] Eisenreich, W., Rohdich, F. 2001. Deoxyxyloluse phosphate pathway to terpenoids. Trends in plant
science 6:78-84
[25] Shen, B., Zheng, Z., Dooner, H.K. A maize sesquiterpene cyclase gene inducen by insect herbivory
and volicitin. National academy of sciences. 2000. 97: 14807-14812.
[26] Grassmann, J., Hippeli, S., Elstner, E.F. Plants defense and its benefits for animals and medicine:
role of phenolics and terpenoids in avoiding oxygen stress. Plant Physiology and biochemistry. 2002. 40:
471-478.
[27] Bartley, G.E., Scolnik, P.A. Plant carotenoids: pigments for fotoprotection, visual attraction, and
human health. Plant cell. 1995. 7:1027-38.
[28] Scott, Raymond. Principles and practice of chromatography. Chrom-Ed Book series. 2003. 100p.
[31] Paiva Nancy L. An Introduction to the biosynthesis of Chemicals Used in Plant -Microbe
Communication. J Plant Growth Regul (2000) 19:131–143.
[32] Harborne Jeffrey B. The comparative biochemistry of phytoalexin induction in plants. Biochemical
Systematics and Ecology 27 (1999) 335-367.
[33] Zhao J, Lawrence C. D, Verpoorte R, et al. Elicitor signal transduction leading to production of
plant secondary metabolites. Biotechnology Advances 23 (2005) 283–333.
[34] Andreu A., Oliva C., Distel S., Daleo G. Production of phytoalexins, glycoalkaloids and phenolics in
leaves and tubers of potato cultivars with different degrees of field resistance after infection with
Phytophthora infestans. Potato Research 44 (2001) 1 – 9.
[35] Jurgen Ebel. Phytoalexin synthesis: The biochemical analysis of the induction process. Ann. Rev.
Phytopathol. 1986. 24: 235-64.
71
[36] Rene e J. Grayer *, Tetsuo Kokubun. Plant±fungal interactions: the search for phytoalexins and
other antifungal compounds from higher plants. Phytochemistry 56 (2001) 253-263.Andreu A., Oliva C.,
Distel S., Daleo G. Production of phytoalexins, glycoalkaloids and phenolics in leaves and tubers of
potato cultivars with different degrees of field resistance after infection with Phytophthora infestans.
Potato Research 44 (2001) 1 – 9.
[37] Daniel, M. and R. P. Purkayastha. 1995. Handbook of Phytoalexin Metabolism and Action.
Dekker. New York.
[38] Müller, K.O. (1958). Studies on phytoalexins. I. The formation and the immunological significance
of phytoalexin produced by Phaseolus vulgaris in response to infections with Sclerotinia fructicola and
Phytophthora infestans. Aust. J. Biol. Sci. 11, 275-300.
[39] D'Harlingue A., Amdouh A., Malfatti P., Soulie MC., Bompeix G. Evidence for rishitin biosynthesis
in tomato cultures. Phytocheraistry (1995), Vol. 39, No. 1, pp. 69-70.
[40] Hahn, M. G., J. Cheong, R. Alba, J. Enkerli, and F. C. Oligosaccharide elicitors: Structures and
recognition. 1993 in Mechanisms of Plant Defense Responses (B. Fritig and M. Legrand, eds.). Kluwer
Academic, Dordrecht. pp. 99-116.
[41] Hammerschmidt, R. Phytoalexins: What have we learned after 60 years? Annual Review of
Phytopathology. 1999. 37:285–306.
[42] Thomma, BPHJ, Nelissen, I., Eggermont, K., Broekaert, WF. Deficiency in phytoalexin production
causes enhanced susceptibility of Arabidopsis thaliana to the fungus Alternaria brassicicola. Plant
Journal.1999.19:163–71.
[43] De Verdier, K., Nicholson, RL. Accumulation of 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins and resistance
to Colletotrichum sublineolum in sorghum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 1999. 55:263–
73.
[45] VanEtten,H.D., Mansfield, J.W., Bailey, J.A., Farmer, E.E. 1994b. Two classes of plant antibiotics:
phytoalexins versus „„phytoanticipins‟‟. The Plant Cell 6:1191–1192.
[46] Bredenberg J.B.-S., and Hietala, P.K. (1961). Confirmation of the structure of trifolirhizin. Acta
Chem. Scand.15: 936-937.
[47] Dewick, P.M. (1975). Pterocarpan biosynthesis: Chalcone and isoflavone precursors of
demethylhomopterocarpin and maackiain in 14,Trifolium prafense. Phytochemistry. 979-982.
[48] Nicholson, R., Wood, k. Phytoalexins and secondary products: where are them and how can we
measure them?. Physiological and Molecular plant pathology. 2001. 59: 63-69.
[49] Bailey, J.A., Mansfield, J.W. (Eds.) Phytoalexins. 1982. Blackie, Glasgow.
[50] Natalie Ferry, Martin G Edwards, John A Gatehouse and Angharad MR Gatehouse. Plant–insect
interactions: molecular approaches to insect resistance.
Current Opinion in Biotechnology, Volume 15, Issue 2, April 2004, Pages 155-161.
72