Penicilina Industrial

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM
ENGENHARIA QUMICA
PURIFICAO DE PENICILINA G POR ADSORO

EM RESINAS HIDROFBICAS
ANDR NOGUEIRA CASTRO DE BARROS
SO CARLOS SP - BRASIL
AGOSTO DE 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
PURIFICAO DE PENICILINA G POR ADSORO

EM RESINAS HIDROFBICAS
ANDR NOGUEIRA CASTRO DE BARROS
Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa

de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da
Universidade Federal de So Carlos como parte
dos requisitos necessrios obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia Qumica.
SO CARLOS SP - BRASIL
AGOSTO DE 2008
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitria da UFSCar
B277pp
Barros, Andr Nogueira Castro de.

Purificao de penicilina G por adsoro em resinas
hidrofbicas / Andr Nogueira Castro de Barros. -- So
Carlos : UFSCar, 2008.
80 f.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de So
Carlos, 2008.
1. Penicilina. 2. Adsoro. 3. Resinas hidrofbicas. I.
Ttulo.
CDD: 660.28423 (20 a)
Dedico este trabalho aos meus pais, Idevar e Ceclia,

e s minhas irms, que em mais uma etapa de minha
vida
estiveram
presentes,
continuar caminhando
incentivando-me
A penicilina cura os homens, mas o vinho que

os torna felizes. (Fleming)
A felicidade no est no fim da jornada, e sim em

cada curva do caminho que percorremos para
encontr-la. (Autor Desconhecido)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeo a Deus por ter me dado a oportunidade de estar no mundo.
Aos meus pais, Idevar e Ceclia, s minhas irms, Lili e Ju e toda minha famlia,
agradeo todo o amor, carinho, compreenso e respeito.
Aos amigos da UFSCar, que me "aturaram" todos os dias, muitas das pessoas que
passaram e passam pelo que eu passei e passo: ficar longe da famlia em busca de um ideal
comum.
Meus agradecimentos especiais:
minha orientadora, professora Dra. Raquel de Lima Camargo Giordano, pela
orientao, insistncia e por ter confiado em meu trabalho;
Dasciana de Sousa Rodrigues, a Dasci, pela alegre e divertida convivncia no
laboratrio, pelas valiosas conversas e sugestes que foram essenciais para o
desenvolvimento deste trabalho;
Bruna pela amizade, companheirismo, pelas festas e momentos de descontrao
durante os 7 anos que estive presente em So Carlos. Aline, pela amizade e por todos os
momentos de apoio que juntos precisamos para a realizao desse trabalho. Carol, pelos
divertidos momentos nos corredores do DEQ e na academia. Dbora, pelos momentos
de conversa, discusses e entendimentos. Ao Edson, pelas conversas online e pela
divertida risada. Ao Adilson, pela pacincia diria na hora do almoo;
A todos os amigos de laboratrio, Wellington, Geisa, Bia, Thiago, Adriano, Danielle,
Andrea, pelos conselhos tcnicos, pelo apoio, pela amizade e pelos momentos de
descontrao que deixaram o ambiente de trabalho mais agradvel. A todos os amigos da
ps-graduao, Mnica, Ana Maria, Anny, Silvia, Luana, Ivana, Letcia e Sandra, pelo
apoio e pela amizade;
A todos os amigos de So Carlos, Karime, Carmen, Luana, Koki, Marina, Ricardo,
Luciano e Guilherme, pelo convvio, pela pacincia, pelo apoio e pela amizade;
A Ju Lessa pelas dicas experimentais, pela eterna amizade, pelos momentos de
desabafo. Ao Bruno pela disposio sempre que precisava de um amigo. Ao Wagner pelo
convvio, pelo apoio, pela compreenso e pela amizade. A Mariana, Carla e Alexandre,
pela sinceridade de uma amizade, onde vimos que a distncia no suficiente para separar
os amigos.
Tenho muito a agradecer e a muitas pessoas que me auxiliaram at onde j cheguei. A

todos que colaboraram direta ou indiretamente para a concretizao deste trabalho.
Para vocs, ofereo estas pginas...
Muito obrigado a todos!
FAPESP pela bolsa concedida.
CNPq e FINEP pelo apoio financeiro.
PRODOTTI S/A pelo apoio financeiro e incentivo pesquisa.
Fundao de Culturas Tropicais pela doao do Penicillium.
SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS
RESUMO
A separao de produto biotecnolgico uma rea de grande importncia econmica,
pois representa parcela predominante no custo do produto. Na produo industrial de
penicilina G (penG), a separao do antibitico vem sendo feita por extrao em solvente
orgnico. Contudo, a diminuio no uso desses solventes vem se tornando imperativa em
muitos processos qumicos, devido a questes ambientais, o que vem motivando a
empresa farmacutica PRODOTTI S/A, produtora de penG, a buscar rotas menos
agressivas ao ambiente. Adsoro uma das operaes de concentrao/purificao mais
utilizadas na indstria qumica e baseada na atrao exercida sobre o produto (fase
lquida) por uma fase slida. Projeto conjunto UFSCar/Prodotti/FINEP, em andamento,
visa estudar, entre outros objetivos, a viabilidade tcnica da substituio da extrao com
solvente pela adsoro de penG em resinas hidrofbicas. Sendo um cido fraco, a adsoro
de penG favorecida em baixos valores de pH. Entretanto, a penG pode se degradar
nesses valores de pH, sendo necessrio, portanto, se buscar condies adequadas de
operao.
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influncia do pH e da temperatura na
eficincia de adsoro da penG em resinas hidrofbicas, buscando condies de mxima
eficincia mas que no acarretem sua degradao. Foi necessrio inicialmente desenvolver
metodologia de anlise que permitisse quantificao de grande nmero de amostras de
penG no meio de cultivo, ou seja, na presena de outros nutrientes, bem como
discriminasse entre a forma preservada e a degradada. Foram comparados os mtodos de
CLAE, iodomtrico e bioensaio, concluindo-se que CLAE era preciso e quantificava
tambm a degradao, o que permitiu realizar estudos de estabilidade de penG a diferentes
valores de pH e temperaturas. Esse mtodo permitiu determinar o tempo mximo em que o
antibitico no degradava em cada condio, bem como o tempo de cultivo e, portanto,
que a variao nas concentraes presentes no meio no afetavam a quantificao de
penG. Contudo, CLAE um mtodo caro para estudo envolvendo grande nmero de
amostras provenientes de caldo de cultivo. Desenvolveu-se assim nova metodologia
baseada na hidrlise completa da penicilina G, catalisada por penicilina G acilase, que se
mostrou precisa, reprodutvel e foi por isso utilizada nas etapas seguintes deste trabalho.
Avaliou-se a seguir a eficincia de adsoro de pen G das resinas XAD-4, XAD-7, XAD761 e carvo ativado, verificando-se que XAD-4 era a mais eficiente, com pequena
aumento de eficincia a pH 4,0 (44%) quando comparada com pH 6,0 (36%). Para a resina
ii
selecionada, XAD-4, foi ento investigada as cinticas de adsoro e determinadas as

isotermas de equilbrio a diferentes valores de pH e temperaturas. A isoterma de Langmuir
foi a que melhor se ajustou aos dados experimentais em todas as condies, obtendo-se
mximo valor de qmax de 595,0651,54 mg penG/g resina, a pH 4 e 4 C.
Visando estudar a adsoro a valores de pH menores que 4,0 e evitar a degradao de
penG que ocorre quando presente a altas concentraes e valores de pH abaixo de 4,0,
estudaram-se duas estratgias de adsoro. Na primeira, o pH do caldo de cultivo foi
ajustado e em seguida este foi mantido em contato com o adsorvente. Na segunda
estratgia, o adsorvente foi adicionado ao caldo de cultivo a pH 7 e ao longo da adsoro
este pH foi reduzido at ser atingida completa adsoro de penG. O processo com
gradiente e adio gradativa de resina mostrou eficincia de adsoro de 0,77g penG/g
resina e produtividade de 0,31 g penG/g resina/hora, a pH 4,0, enquanto que adsoro
direta a pH 4,0 levou a 0,548g penG/g resina (0,548 g penG/g resina/hora). A estratgia
em gradiente, pois, aumenta a eficincia e diminui a produtividade do processo. Os
resultados mostraram que o ideal seria trabalhar diretamente a valores de pH ainda
menores que 4, mas concentraes elevadas de pen G levam degradao do antibitico
nessa faixa de pH.
A dessoro de penG foi estudada utilizando a tcnica de
planejamento experimental e investigou-se as variveis pH, temperatura e composio de

mistura gua/etanol. Os resultados mostraram que para se obter uma mxima dessoro, o
processo deve ser realizado a 8oC e utilizar como eluente uma mistura de 82,5 % etanol e
17,5 % gua em pH 6,2.
iii
ABSTRACT
The separation of biotechnological products is an area of great economic importance
once it represents the majority of the cost of this product. On industrial production of
penicillin G (penG), the separation of the antibiotic has been made by extraction on
organic solvent. However the decrease on the use of these solvents has become imperative
in many chemical processes, caused mainly by environmental issues, which has
motivating the pharmaceutical company PRODOTTI S/A, penG producer, on the research
of new and less environmental aggressive ways to obtain this substance. Adsorption is one
of the methods of concentration/purification most used by the chemical industry and it is
based on the attraction exercised over the product (liquid phase) by a solid phase. The
project sponsored by UFSCar/Prodotti/FINEP in progress has as one of its aims the study
of the technical availability of substitution of extraction of penG by solvents for extraction
by adsorption in hydrophobic resins. The penG, which is a weak acid, has therefore a
favorable adsorption in low pH values. Nevertheless, penG can degrade itself under such
conditions of pH, being required, in this way, adequate conditions for the operation.
Therefore, the objective of this assignment was evaluate the influence of pH and
temperature on the efficiency on adsorption of penG by hydrophobic resins, seeking
conditions for maximum efficiency that do not result in degradation. Initially, it was
necessary to develop the methodology that could allowed that analysis of a huge amount
of penG samples in culture medium, which means that the penG could be analyzed in the
presence of other nutrients and also could be distinguished between the intact and the
degradated form. Some methods such as CLAE, iodometric and bioassay were analyzed
and the conclusion was the CLAE method was necessary and also was able to quantify the
penGs degradation rate. This features allowed the studies of penGs stability when
exposed to different value pH and temperatures, the maximum half-life that it was stable
in each condition and the time of growth, which means that it was possible to determine
the time that the variation in the mediums concentration that did not affect the
quantification of penG. Nevertheless, the CLAE method is very expensive to be applied to
a large number of samples originated from culture medium. With this in mind, a new
methodology was developed based on the complete hydrolysis of penG catalyzed by the
penicillin G acilase, and this reaction proved to be precise and reproducible, reasons for
being chosen in the later steps of this study. The efficiency of adsorption of penG was
iv
evaluated in the resins XAD-4, XAD-7, XAD-761 and activated carbon, and the XAD-4
resin has shown to be the most efficient with little increment of efficiency at pH 4.0 (44%)
when compared to pH 6.0 (36%). Therefore, the XAD-4 resin was studied for parameters
such as adsorption kinetics and the isotherms of adsorption were determined in different
value of pH and temperatures. The Langmuirs isotherm had the best fit into the data
collected in all the conditions, with maximum value of qmax = 595.0651.54 mg penG/g
resin, at pH 4 and 4C.
In order to analyze the adsorptions in value of pH lower than 4.0 without the
occurrence of penGs degradation that usually occurs at high concentrations of this
molecule and at value of pH lower than 4.0, two strategies referring to the adsorption
conditions were studied. For the first one, the fermentative broths pH is adjusted and right
after this same broth is maintained in contact with the adsorbent. For the second method,
the adsorbent was add to the fermentative broth at a pH of 7.0 and with the adsorption
process the pH was reduced until reach the complete adsorption of the penG. The last
process showed a better efficiency of adsorption of 0.77g penG/g resin and productivity of
0.31 g penG/g resin/hour at pH 4.0, meanwhile the direct adsorption at pH 4.0 had an
efficiency of 0.548g penG/g resin (0.548 g penG/g resin/hour). The second strategy with
the gradient is better since it increases the efficiency and decreases the productivity of the
process. The results showed that the ideal situation would be to work with pH values even
lower than 4, but elevated concentrations of penG will lead to the degradation of the
antibiotic in this pH range.
The desorption of penG was studied using a technique of experimental planning and
analysis such as pH, temperature and composition of mixture water/ethanol. The results
showed that to obtain a maximum desorption, the process must be effectuated at 8C and
utilizes as eluent a mixture of 82.5% ethanol and 17.5% water on a pH of 6.2.
NDICE
RESUMO...........................................................................................i
ABSTRACT....................................................................................iii
1 INTRODUO............................................................................................. 1
2 REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................... 3
2.1 ANTIBITICOS ...........................................................................................................................3
2.2 PENICILINAS ..............................................................................................................................3
2.2.1 ESTRUTURA QUMICA DAS PENICILINAS .....................................................................................3
2.2.2 PENICILINAS SEMI SINTTICAS .................................................................................................5
2.3 PENICILINA G ............................................................................................................................5
2.3.1 ESTABILIDADE.................................................................................................................................6
2.3.2 PROCESSO DE PRODUO INDUSTRIAL.......................................................................................9
2.3.3 MTODOS DE SEPARAO ...........................................................................................................10
2.3.3.1 PURIFICAO POR EXTRAO COM SOLVENTE .........................................................................10
2.3.3.2 OUTROS MTODOS DE PURIFICAO ..........................................................................................11
2.4 ADSORO ..............................................................................................................................12

2.4.1 TIPOS DE ADSORO ...................................................................................................................13
2.4.2 ADSORVENTES...............................................................................................................................14
2.4.2.1 CARVO ATIVADO .....................................................................................................................16
2.4.2.2 AMBERLITE XAD .......................................................................................................................17
2.4.2.2.1 AMBERLITE XAD-4 ..............................................................................................................18
2.4.2.2.2 AMBERLITE XAD- 7 .............................................................................................................19
2.4.2.2.3 AMBERLITE XAD- 761 .........................................................................................................20
2.4.3 EQUILBRIO DE ADSORO.........................................................................................................20
2.4.3.1 ISOTERMA LINEAR ......................................................................................................................22
2.4.3.2 ISOTERMA DE LANGMUIR ...........................................................................................................23
2.4.3.3 ISOTERMA DE FREUNDLICH ........................................................................................................24
2.4.4 SISTEMAS TPICOS DE ADSORO..............................................................................................25
2.4.5 RECUPERAO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOS POR ADSORO EM BATELADA .........26
2.5 DESSORO ............................................................................................................................28

2.6 PLANEJAMENTO ESTATSTICO DE EXPERIMENTO ...................................................................28
3 MATERIAIS E MTODOS ...................................................................... 31

3.1 MATERIAIS ..............................................................................................................................31
3.2 MTODOS ................................................................................................................................31
3.2.1 PROCESSO DE PRODUO DE PENICILINA G .............................................................................31
3.2.2 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PENG ......................................................................32
3.2.2.1
3.2.2.2
3.2.2.3
3.2.2.4
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) .........................................................32

MTODO IODOMTRICO ..............................................................................................................33
BIOENSAIO ..................................................................................................................................33
HIDRLISE ENZIMTICA DE PENG..............................................................................................34
3.2.3 DETERMINAO DA SOLUBILIDADE DE PENG EM DIFERENTES SOLUES ........................34
3.2.4 DETERMINAO DA ESTABILIDADE DE PENG FRENTE A PH E TEMPERATURA ..................35
3.2.5 ENSAIOS DE ADSORO EM BATELADA....................................................................................35
3.2.5.1 TRATAMENTO DOS ADSORVENTES .............................................................................................35
3.2.5.2 EFICINCIA DE ADSORO DE PENG: SELEO DE RESINA ........................................................35
3.2.5.3 DETERMINAO DO TEMPO DE EQUILBRIO - CINTICA DE ADSORO .....................................36
3.2.5.4 ISOTERMAS DE EQUILBRIO.........................................................................................................36
3.2.5.5 ENSAIOS DE ADSORO DE PENICILINA G..................................................................................37
vi
3.2.6 ENSAIOS DE DESSORO EM BATELADA ..................................................................................37
4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................... 38

4.1 ESTUDODAQUANTIFICAODEPENICILINAGEMMEIODECULTIVO......................................................38
4.1.1 COMPARAO ENTRE MTODOS J UTILIZADOS....................................................................38
4.1.2 DESENVOLVIMENTO DE MTODO ENZIMTICO PARA A QUANTIFICAO DE PENG ........40
4.2 INFLUNCIA DA COMPOSIO (TEMPO DE CULTIVO) DO MEIO DE CULTIVO NA ANLISE
CROMATOGRFICA DE PENICILINA G.............................................................................................41
4.3 TESTES DE ESTABILIDADE DA PENICILINA G EM MEIO AQUOSO ...........................................43
4.4 EFICINCIA DE DIFERENTES ADSORVENTES NA SEPARAO DE PENICILINA G EM
DIFERENTES VALORES DE PH .........................................................................................................46
4.5 DETERMINAO DO TEMPO DE EQUILBRIO - CINTICA DE ADSORO ................................50
4.6 ISOTERMAS DE ADSORO .....................................................................................................50
4.7 ESTRATGIAS DE ADSORO DE PENICILINA G .....................................................................55
4.7.1 DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE ADSORO DE PENICILINA G COM GRADIENTE DE PH .........55
4.8 DESSORO DE PENICILINA G ................................................................................................59

4.9 PUREZA DA PENG AO FINAL DO PROCESSO DE PURIFICAO ................................................68
4.10 SOLUBILIDADE DE PENICILINA G EM DIFERENTES SOLVENTES .............................................70
5 CONCLUSES........................................................................................... 73
6 SUGESTES............................................................................................... 75
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................... 76
vii
NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1.: Estrutura bsica da molcula de penicilina. ...................................................... 4
Figura 2.2.: Estrutura do cido 6-amino penicilnico (6-APA) ........................................... 4
Figura 2.3.: Esquema da hidrlise de penicilina G catalisada pela enzima penicilina G
acilase ................................................................................................................ 5
Figura 2.4.: Reao do anel -lactmico (Arnott et al, 1995) .............................................. 8
Figura 2.5.: Esquema da degradao cida da penicilina. (Arnott et al, 1995)................... 8
Figura 2.6.: Esquema da produo industrial de penicilina G (Menezes,1996)................... 9
Figura 2.7.: Separao da penicilina com acetato de amila, em trs estgios e em
contracorrente (Treybal, 1980) ........................................................................ 10
Figura 2.8.: Esquema de um trocador catinico (A) e aninico (B) (Collins et al, 1995) . 15
Figura 2.9.: Estrutura qumica bsica do carvo ativado.................................................... 17
Figura 2.10.: Estrutura qumica da resina Amberlite XAD-4............................................. 19
Figura 2.11.: Estrutura qumica da resina Amberlite XAD-7............................................. 19
Figura 2.12.: Diagrama das isotermas: (a) favorvel, (b) linear e (c) desfavorvel ........... 21
Figura 2.13.: Isotermas comuns de adsoro (Belter et al, 1988). ..................................... 22
Figura 2.14.: Etapas de transporte de massa na adsoro utilizando adsorventes porosos
(Sleijko, 1985). ................................................................................................ 25
Figura 3.1.: Curva de calibrao de penicilina G em gua utilizando o cromatgrafo
modelo CLASS - LC10 .................................................................................. 32
Figura 3.2.: Curva de calibrao de penicilina G em caldo de cultivo utilizando o
cromatgrafo modelo CLASS VP ................................................................... 33
Figura 4.1.: Curva de calibrao de penicilina G utilizando a hidrlise de penG .............. 41
Figura 4.2.:Curvas de calibrao para quantificar penG presente em caldo de cultivo
obtido com diferentes tempos. Anlise em HPLC, coluna C-18, BondPack,
3,9x 300mm e fase mvel 20% acetonitrila, 80% tampo fosfato 10mM, pH
6,5, tiossulfato de sdio 10mM em uma vazo de 1 mL.min-1....................... 42
Figura 4.3.: Grfico da estabilidade de PenG a 4oC em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b)
2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.................................................................... 44
Figura 4.4.: Grfico da estabilidade de PenG a 12oC em diferentes valores de pH (a) 2,0
(b) 2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0. ............................................................. 45
Figura 4.5.: Esquema da Adsoro em Carvo Ativado e grfico da quantidade de penG
adsorvida, em meio aquoso (a) e em caldo (b) ................................................ 47
Figura 4.6.: Grfico da adsoro de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvo ativado,
a 4C, pH 6,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pr-tratado
para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.............................. 47
Figura 4.9.: Efeito do pH sobre a eficincia de adsoro ................................................... 49
viii
Figura 4.10.: Cintica de Adsoro (a) 4oC e (b) 12oC, utilizando-se 0,1 g (em base seca)
de XAD-4 pr-tratada para 2 mL de caldo de cultivo de concentrao de penG
de 50 g.L-1 em valores de pH 4,0; 5,0 e 7,0..................................................... 50
Figura 4.11.: Isotermas de Adsoro- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de
XAD-4 pr-tratado para 2mL de caldo de cultivo. ......................................... 52
Figura 4.12.: Isotermas de Adsoro- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de
XAD-4 pr-tratado para 2mL de gua deionizada.......................................... 54
Figura 4.13.: Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,5 a 7,0 utilizando
2 g de XAD-4 adicionados gradativamente em 40mL de caldo com 50g.L-1 de
penG................................................................................................................. 56
Figura 4.14.: Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,2 a 7,0 utilizando
2 g de XAD-4 adicionado gradativamente em 40 mL de caldo com 50 g.L-1 de
penG................................................................................................................. 57
Figura 4.15.:Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,5 a 4,0 utilizando
1,5g de XAD-4 adicionado em 18mL de caldo com 50g.L-1 de penG ............ 58
Figura 4.16.:Diagrama de Pareto para o 1o delineamento .................................................. 61
Figura 4.17.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
no 1o delineamento .......................................................................................... 62
Figura 4.18.: Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a
resposta no 1o delineamento ............................................................................ 62
Figura 4.19.: Superfcies de resposta e curva de contorno para a dessoro de penG (%)
em funo da temperatura e pH (a) e (b), da temperatura e [EtOH] (c) e (d) e
do pH e [EtOH] (e) e (f) no 1o delineamento .................................................. 63
Figura 4.20.: Diagrama de Pareto para o 2o delineamento ................................................. 65
Figura 4.21.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
no 2o delineamento .......................................................................................... 66
Figura 4.22.: Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a
resposta no 2o delineamento ............................................................................ 67
Figura 4.23.: Superfcies de resposta para a dessoro de penG (%) em funo da
temperatura e [EtOH] no 2o delineamento ...................................................... 67
Figura 4.24.: Curva de contorno para a dessoro de penG (%) em funo da temperatura e
[EtOH] no 2o delineamento ............................................................................. 68
Figura 4.25.: Cromatogramas referentes ao processo de purificao de penG. Linha vede:
caldo fermentativo contendo penG 50 g.L-1 e Linha vermelha componentes do
caldo fermentativo dessorvidos com etanol 82,5%. ........................................ 69
Figura 4.26.: caldo de cultivo antes da adsoro e depois da dessoro com soluo
etanlica........................................................................................................... 70
Figura 4.27.: Solubilidade da penG em mistura de etanol-gua a pH 6,2 em diferentes
temperaturas ( 0 , 8 e 16oC) ............................................................................ 71
ix
NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1.: Base fsico-qumica para o desenvolvimento de processos de separao
(Ghosh et al, 1996)........................................................................................ 11
Tabela 2.2.:Caractersticas da adsoro fsica e da adsoro qumica ............................... 13
Tabela 2.3.:Propriedades fsicas dos adsorventes Amberlite XAD-4 e XAD-7 e XAD-761.
....................................................................................................................... 20
Tabela 4.1.: Teste comparativo entre os mtodos para quantificar penicilinaG. Amostras:
(1) soluo de penG sem a hidrlise por penicilinase , (2) soluo de penG na
mesma concentrao hidrolisada por penicilinase por 30 min e (3) soluo
de penG na mesma concentrao hidrolisada por penicilinase por 60 min.
Condies de diluio com tampo fosfato 100mM: 1:500 (bioensaio), 1:4
(iodometria) e 1:1 ( CLAE)........................................................................... 39
Tabela 4.2.: Estudo comparativo CLAE x Hidrlise enzimtica ....................................... 40
Tabela 4.3.: Dados de estabilidade de PenG frente a pH ................................................... 46
Tabela 4.4.: Resultados experimentais obtidos na determinao da isoterma de equilbrio
para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e 7 e temperatura 4oC e 12oC,
utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pr-tratado para 2mL de caldo de
cultivo............................................................................................................ 51
Tabela 4.5.: Parmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir, Freundlich e
Linear para a penG e seus coeficientes de correlao. .................................. 52
Tabela 4.6.: Porcentagem de penG na sua forma neutra e inica em diferentes valores de
pH. ................................................................................................................. 53
Tabela 4.7.: Resultados experimentais obtidos na determinao da isoterma de equilbrio
para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e temperatura 4oC, utilizando 0,1 g
(em base seca) de XAD-4 pr-tratado para 2mL de gua deionizada........... 54
Tabela 4.8.: Parmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir para a penG e seus
coeficientes de correlao. ............................................................................ 55
Tabela 4.9.: Valores utilizados do 1o DCCR para trs fatores ........................................... 60
Tabela 4.10.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 1o
delineamento ................................................................................................. 60
Tabela 4.11.: Coeficientes de regresso para a resposta no 1o delineamento..................... 61
Tabela 4.12.: ANOVA para a resposta no 1o delineamento ............................................... 62
Tabela 4.13.: Valores utilizados do 2o DCCR para dois fatores......................................... 64
Tabela 4.14.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 2o
delineamento ................................................................................................. 64
Tabela 4.15.: Coeficientes de regresso para a resposta no 2o delineamento..................... 65
Tabela 4.16.: ANOVA para a resposta no 2o delineamento ............................................... 66
Tabela 4.17.: Relao dos picos dos cromatogramas referentes ao processo de purificao
e os respectivos valores de suas reas ........................................................... 69
Tabela 4.18.: Solubilidade da penG em diferente solventes a 8oC e pH 6,2 ...................... 71
Tabela 5.1.: Resumo das condices definidas para o processo de purificao de penG por
adsoro em resina Amberlite XAD-4 em batelada...................................... 74
NOMENCLATURA
%EA
6-APA
7-ACA
a
A
ABS
AFA
AFNA
AMM
AMPI
C*
CLAE
Co
CPC
DHALO
DCCR
EMPG
EtOH
FG
HA
KF
KH
KL
L
n
OD
PDAB
penG
PGA
pI
pKa
Q
q*
qm
VL
w
Porcentagem de eficincia de adsoro

cido 6-amino penicilnico
cido 7-amino cefalospornico
rea do pico na anlise por CLAE
Forma inica
Absorbncia
cido fenil actico
cido fenoxi actico
gua de macerao de milho
Ampicilina
Concentrao de soluto em soluo no equilbrio
Cromatografia lquida de alta eficincia
Concentrao inicial de soluto
Cefalosporina C
Dimetro do halo no bioensaio
Delineamento composto central rotacional
ster metlico de fenilglicina
Etanol
D-fenilglicina
Forma neutra
Constante de equilbrio de Freundlich
Constante de equilbrio de Henry
Constante de equilbrio de Langmuir
Efeito principal linear da regresso
Indice da isoterma de Freundlich
Densidade ptica
p-dimetilaminobenzaldedo
Penicilina G
Penicilina G acilase
Ponto isoeltrico
Constante de equilbrio de ionizao
Efeito principal quadrtico da regresso
Quantidade de soluto adsorvida pela resina no equilbrio
Capacidade mxima de adsoro da resina
Volume de soluo
Massa de resina
mg/ mL
mg/mL
cm
mL/ mg resina
mL/ mg resina
mg / mL
mg/ g resina
mg / g resina
mL
mg
1 INTRODUO
O processamento final de produtos biotecnolgicos, que envolve as etapas de
separao, concentrao e purificao, usualmente responsvel por grande parte do custo
de produo desses compostos.
A enorme competio existente em nvel mundial no setor da indstria de processos
biotecnolgicos em geral, e particularmente da indstria farmacutica, vem colocando dois
tipos de desafios. O primeiro tipo anlogo quele enfrentado pela indstria qumica
convencional a partir da dcada de 70: aumentar a eficincia dos processos. O segundo
desafio diz respeito s crescentes exigncias de agncias governamentais, no sentido da
reduo de impactos ambientais. Em outras palavras, a busca por processos limpos ou
de qumica verde, ecologicamente sustentveis, uma das foras-motrizes do
desenvolvimento de novos processos bioqumicos e farmacuticos industriais.
A produo de penicilina G se constitui em um clssico processo industrial, onde o
processo de recuperao do produto por extrao com solvente orgnico j est bem
estabelecido. No Brasil, a nica empresa que ainda detm tecnologia para produo de
penG (microrganismo de alta produtividade, tecnologia, equipamentos) a Prodotti S/A.
Essa empresa, localizada na Av. Joo Dias, So Paulo-SP, nas instalaes que eram
ocupadas pela SQUIBB, est hoje rodeada pela cidade e tem por isso srios problemas
ambientais pela incompatibilidade de operao industrial numa agora regio urbana. Esses
problemas vm motivando a Prodotti a trabalhar com processos mais limpos, tais como a
sntese enzimtica de ampicilina, na qual j vem trabalhando com o grupo da UFSCar
atravs de Projeto PIPEFAPESP (proc.03/13177-4) e projeto FINEP - Ao Transversal
(Inovaes da Produo de Antibiticos -Lactmicos com Reduo de Impactos
Ambientais), ambos em andamento. O processo clssico utilizado na indstria para
produo de penicilina G utiliza a extrao com um solvente altamente hidrofbico
(acetato de amila, por exemplo) para separao do antibitico do meio de cultivo. O
escape desse solvente para o ambiente, bem como presena dele nos efluentes lquidos da
indstria, mesmo que em baixas concentraes aumenta o impacto ambiental do processo.
Por essa razo, foi proposto, tambm, como objetivo do projeto FINEP o estudo da
viabilidade tcnica da substituio do processo de extrao de penicilina G por solvente
por outro menos agressivo ao ambiente.
A utilizao de adsorventes polimricos para processos de purificao e para

recuperao de compostos a partir de solues diludas tem sido estudada com muito
interesse nos ltimos anos. As principais vantagens da utilizao destes adsorventes so
sua seletividade e facilidade de regenerao. Os adsorventes polimricos neutros mais
comuns so os constitudos por co-polmeros de estireno (ou etilvinilbenzeno) e
divinilbenzeno. Durante anos, esses adsorventes tm sido desenvolvidos para oferecer a
resistncia mecnica necessria, apresentarem grandes reas superficiais para adsoro e
possurem tamanhos de poros apropriados (Grzegorczk et al, 1996).
O desenvolvimento de um processo de separao eficiente e seletivo que utilize
adsorventes polimricos requer conhecimento da influncia das condies de operao
(pH, fora inica, temperatura, concentrao de composto na corrente de entrada) sobre o
fenmeno de adsoro (Vieira et al, 2003). Foi, assim, objetivo deste trabalho, determinar
inicialmente os limites operacionais do estudo em termos de estabilidade da penG e a
seguir se avaliar a influncia do tipo de resina, do pH e da temperatura na eficincia de
adsoro desse antibitico em resinas hidrofbicas. Para a(s) resina(s) e condies
selecionadas, foram determinadas as isotermas de adsoro e estudadas as condies de
dessoro utilizando-se gua e/ou etanol. O estudo foi realizado em gua e em caldo de
cultivo para se avaliar a influncia da presena de outros componentes na adsoro de
penG.
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 ANTIBITICOS
Os antibiticos so produtos do metabolismo secundrio de alguns microrganismos
que inibem o processo de crescimento de outros organismos. Eles formam um tipo
especial de agentes quimioterpicos pelo fato de serem produtos metablicos fortemente
ativos, mesmo em concentraes muito pequenas.
A inibio do processo de crescimento de um microrganismo por outro j era
conhecida h muito tempo. Em 1881, Tyndall verificou que meios de cultura turvos pelo
crescimento bacteriano se tornavam lmpidos quando cresciam fungos em sua superfcie.
O exemplo de maior destaque data de 1929 quando Alexander Fleming notou a inibio
do crescimento bacteriano em uma placa de Petri com gar contaminada com o fungo
Penicillium notatum. A substncia produzida pelo fungo recebeu o nome de penicilina.
(Crueger, 1984)
Durante a Segunda Guerra Mundial, a forte demanda de agentes quimioterpicos para
o tratamento de infeces causadas pelos ferimentos deu origem ao desenvolvimento de
um processo de produo para a penicilina, iniciando-se assim, a era dos antibiticos.
2.2 PENICILINAS
A descoberta da penicilina, o primeiro antibitico que encontrou uso prtico no
homem, marcou o inicio de uma era que produziu grande nmero de tais substncias. As
primeiras penicilinas, biossintticas ou naturais, ainda hoje esto em uso clinico. Outras,
semi-sintticas, com amplo espectro e melhores propriedades farmacocinticas, foram
sendo utilizadas no decorrer dos anos (Ligon, 2004)
2.2.1
ESTRUTURA QUMICA DAS PENICILINAS
As penicilinas compem uma classe teraputica de antibiticos com estruturas

relacionadas e com propriedades e atividades ligeiramente diferenciadas. A estrutura de
todas as penicilinas, mostrada na Figura 2.1, apresenta um ncleo comum, o cido 6amino penicilmico (6-APA), mostrado na Figura 2.2.
Figura 2.1.: Estrutura bsica da molcula de penicilina.
Figura 2.2.: Estrutura do cido 6-amino penicilnico (6-APA)
O anel -lactmico, presente no 6-APA, responsvel pela atividade de todas as

penicilinas. Alm desse anel, o 6-APAsua estrutura contm um anel de quatro membros
chamado -lactmico e um anel de cinco membros denominado anel tiazolidinico. A
existncia do anel -lactmico em todas as penicilinas responsvel pela designao geral
destes antibiticos de antibiticos -lactmicos.
Na ausncia de precursor (cido da cadeia lateral) o Penicillium chrysogenum produz
baixa concentrao de 6-APA, alm de misturas de penicilinas. As penicilinas naturais
com interesse industrial e econmico, atualmente, so a penicilina G (benzilpenicilina) e a
penicilina V (fenoximetilpenicilina) (Hillenga, 1995).
A obteno de uma dada penicilina est, conforme j comentado, relacionada com o
tipo de precursor utilizado. Assim, o fornecimento de sais de cido fenil actico (AFA)
leva formao exclusiva de penG, enquanto que o fornecimento de sais de cido fenoxi
actico (AFNA) leva formao exclusiva de penicilina V.
As penicilinas naturais podem ser destrudas por enzimas denominadas penicilinases.
Essas enzimas rompem o anel -lactmico do ncleo bsico da molcula, atravs da
hidrlise da ligao amida presente no anel. Por essa razo estas enzimas so tambm
denominadas -lactamases. Esse rompimento impede a penicilina de atuar no bloqueio da
formao da parede celular de bactrias, no combatendo assim a infeco. Bactrias que
produzem a enzima penicilinase so assim resistentes a antibiticos -lactmicos.
2.2.2
PENICILINAS SEMI SINTTICAS
Em 1959, o 6-APA foi descoberto e sintetizado em quantidades apreciveis, o que

serviu como ponto de partida para a sntese qumica de diversos derivados da penicilina
(Nathwani et al, 1993). O anel central, 6-APA, pode ser produzido em grande quantidade
por fungos por fermentao ou por hidrlise enzimtica de penG, como mostrado na
Figura 2.3.
Figura 2.3.: Esquema da hidrlise de penicilina G catalisada pela enzima penicilina G acilase
possvel adicionar, a esse anel central, diferentes cadeias laterais, criando novos
tipos de penicilinas que no so encontradas na natureza. Estas penicilinas so
denominadas penicilinas semi-sintticas, e algumas apresentam vantagens sobre as
penicilinas naturais. Por exemplo, a feneticiclina, umas das primeiras penicilinas semisintticas produzidas para uso clnico, mais facilmente absorvida que a penicilina V.
Alm de sua atividade intrnseca como antibitico, a penG tambm utilizada como
matria prima para a produo dos antibiticos semi-sintticos atravs da ligao de
diferentes cadeias laterais ao grupo amino do 6-APA. (Pelkzar et al, 1986)
2.3 PENICILINA G
A penG ou benzilpenicilina o derivado benzlico do 6-APA, apresentado sob a forma
de sal alcalino sdico ou potssico. Os sais alcalinos da penicilina apresentam-se como um
p cristalino, branco, inodoro, facilmente solvel em gua, muito higroscpico e instvel
em soluo aquosa devido ao seu anel lactmico. Funde-se a 215oC, com decomposio
(Menezes, 2000).
A penicilina G possui um pKa de 2,74. Sua forma neutra pouco solvel em gua.
um cido orgnico fraco. A concentrao da sua forma ionizada (polar) varia com o pH e,
conseqentemente, varia sua solubilidade em gua.
A variao da concentrao da forma inica da penG com o pH determina tambm sua
absoro pelo organismo. No estmago, onde o pH 2,0 tem-se 15,4% das molculas de
penG na forma inica e 84,60% na forma neutra. No duodeno, onde o pH 6,0 tem-se
99,95% das molculas ionizadas. Somente a forma neutra, apolar, consegue atravessar a
barreira lipdica da membrana celular. O mesmo fenmeno explica a eficincia da extrao
de pen G em solvente apolar nos baixos valores de pH utilizados na indstria e faz prever
a viabilidade de sua adsoro eficiente em resinas hidrofbicas.
2.3.1
ESTABILIDADE
Uma caracterstica importante de penicilinas para seu processamento industrial sua

estabilidade.
A integridade estrutural do anel -lactmico do cido 6-aminopenicilnico
primordial para a atividade das penicilinas e cefalosporinas, com a ruptura da ligao
amida desse anel resultando num produto biologicamente inativo. Esse anel a parte da
molcula dos antibiticos -lactmicos que se encaixa no stio ativo da enzima
responsvel pela sntese das peptoglicanas, que formam a parede celular das bactrias. A
ao antibacteriana da penicilina se deve ao fato de que sua presena impede a formao
de uma parede correta, a qual fica, portanto, facilmente sujeita a lise celular. A reao de
abertura do anel pode ser catalisada por cido, base ou pela enzima -lactamase, que
produzida por bactrias resistentes a antibiticos -lactmicos. A degradao de penG
influenciada pelo pH, grau de cristalinidade, fora inica, ons metlicos e composio do
solvente (Arnott et al, 1995).
Navarro et al, 2003, apud Strominger, 1967, relatam que a atividade biolgica dos
antibiticos -lactmicos atribuda grande reatividade do anel. Essa reatividade
devida tenso estrutural do anel -lactmico, que ocorre devido ao fato do ngulo de
ligao entre os tomos (90) ser inferior ao correspondente ngulo de sp3 hbrido
(109,47) ou sp2 (120). Dessa forma, a caracterstica de ressonncia da ligao amida,
responsvel por sua grande estabilidade, inibida, resultando na conhecida instabilidade
da estrutura do anel -lactmico.
relatado que a ruptura do anel -lactmico exotrmica, por causa da grande

quantidade de energia liberada na fisso da ligao carbono-nitrognio. (Michinik, 2004,
apud Pikal et al, 1978)
Navarro et al (2003) acompanharam a metanlise de quatro antibiticos -lactmicos
(PenG, Penicilina V, Ampicilina e Amoxicilina) em reao catalisada por Zn2+, para
estudarem a estabilidade dessas molculas. Verificaram que a reao de degradao ocorre
atravs da formao de dois complexos metlicos com a penicilina intacta, que se
decompem a diferentes velocidades para gerarem produtos idnticos. Compararam os
resultados entre si e entre os obtidos na presena de Cd2+ (Navarro et al, 1999) e
verificaram que a velocidade de degradao de penicilinas em metanol catalisada por on
cdmio muito maior que a catalisada por on zinco.
A absoro de penicilina, que requer a sua passagem pela barreira lipdica da
membrana celular, um fenmeno semelhante ao da sua extrao e da sua adsoro em
um meio hidrofbico. Quanto menor o pH, mais molculas de penG estaro na forma
eletricamente neutra e, portanto, tero mais facilidade em se transferir para o meio
hidrofbico (lipdeos da membrana ou solvente orgnico ou resina hidrofbica). Contudo,
a molcula instvel a pH cido. O pH timo de adsoro/extrao dever ser assim uma
soluo de compromisso entre coeficiente de partio e estabilidade da molcula no tempo
necessrio de contacto.
A temperatura de operao outra varivel importante. A adsoro exotrmica e o
equilbrio assim dever ser favorecido a baixas temperaturas. A menor temperatura dever
tambm favorecer a estabilidade da molcula no baixo pH, uma vez que diminui a
velocidade da reao de abertura do anel -lactmico catalisada pelos ons H+. Contudo,
na menor temperatura, o tempo necessrio para ocorrer a adsoro ir aumentar, havendo,
pois uma soluo de compromisso entre quantidade adsorvida e tempo necessrio para que
ocorra essa adsoro.
Estudos foram realizados para minimizar perdas por degradao. Arnott et al (1995)
estudaram o efeito do campo eltrico de alta voltagem na degradao de penG. Segundo
Arnott et al (1995), a aplicao do campo eltrico durante a extrao por solvente oferece
significativas vantagens sobre outras tcnicas de intensificao.
Benedict et al (1945) estudando a estabilidade de penG a diferentes valores de pH,
identificaram a estabilidade tima desta a pH 6,0, com meia vida de 396h em 24C, que foi
reduzida rapidamente para a ordem de minutos , quando se testou o pH 2,0. A Figura 2.4
mostra a reao do anel -lactmico e a Figura 2.5 mostra um esquema da degradao
cida da penicilina.
Figura 2.4.: Reao do anel -lactmico (Arnott et al, 1995)
Kheirolomoom et al (1999) estudaram a estabilidade da penG em funo da

temperatura e pH. A anlise da estabilidade mostrou que penG mais estvel no intervalo
de pH de 5,0 a 8,0. A estabilidade mxima da penG em torno do pH 6,0 e sua
instabilidade muito mais elevada em valores de pH cidos do que valores de pH bsicos.
A estabilidade da penG diminui com o aumento na temperatura para todos os valores de
pH.
Figura 2.5.: Esquema da degradao cida da penicilina. (Arnott et al, 1995)
2.3.2
PROCESSO DE PRODUO INDUSTRIAL
A penicilina produzida industrialmente pelo cultivo aerbico do fungo Penicillium

chrysogenum ou outro, em reatores agitados, com aerao, operados de forma semidescontnua (isto , alimentao contnua de vrias substncias em um cultivo
descontnuo) (Menezes, 1996).
A Figura 2.6 mostra um esquema da produo industrial de penG.
Figura 2.6.: Esquema da produo industrial de penicilina G (Menezes,1996).
O tanque de cultivo carregado com um substrato, que pode ser composto de acar
(exemplos: glicose ou sacarose), gua de macerao de milho (AMM) e outras substncias
(exemplo: sais), que so fonte de carboidratos, nitrognio e nutrientes (Menezes, 1996).
Um exemplo de produo industrial de penG se inicia com a preparao do inculo
para a fermentao, com a inoculao de bales de 500 mL, contendo 100 mL de meio de
cultura, com esporos de Penicillium chrysogenum. Os bales so em seguida colocados
num agitador orbital, numa cmara a 25C e aps 4 dias o caldo de cultura resultante
utilizado para inocular bales contendo 2 L de meio. O caldo dessa segunda etapa em
bales utilizado como inculo para nova propagao, com a durao de apenas 2 dias,
num tanque de 100 L com agitao, aerao, arrefecimento e controle de pH e
temperatura. Por fim, num tanque com 500 L de meio, produz-se, aps 3 dias, um volume
de cultura suficiente para inocular at 120 m3 de meio em tanques com 200 m3 de
capacidade (Menezes, 1996).
10
Aps a inoculao do meio segue-se uma fase breve de operao descontnua (cerca de
12 h). A partir da se iniciam adies controladas de acar e outras substncias (cido
fenilactico, sais, leos vegetais, gorduras animais, amnia e cido para correo do pH)
em quantidades suficientes para manter constante o teor de biomassa na fase de produo
da penicilina. A regulao das adies estabelecida empiricamente para cada estirpe de
fungo (Menezes, 1996).
A conduo desse processo quase exclusivamente manual, sendo apenas controlados
automaticamente a concentrao de O2 dissolvido, o pH e a temperatura. O pH e a
temperatura so mantidos constantes (6,5 e 25-27C) e a velocidade de aerao est
geralmente entre 0,5 e 1,0 m3 de ar/m3 de meio/min (Menezes, 1996).
A purificao da penicilina, aps a fase de fermentao, feita atravs de vrias etapas
rpidas de extrao lquido-lquido do caldo fermentado, ora com um solvente orgnico
(por exemplo, acetato de amila ou butila, ou metil isobutil cetona), ora com uma soluo
aquosa, sob baixa temperatura (de 0 a 3C) e com controle rgido de pH. O resultado final
um sal de penicilina (sal de potssio, sdio ou de procana, dentre outros)
(Menezes, 1996).
2.3.3 MTODOS DE SEPARAO
2.3.3.1 PURIFICAO POR EXTRAO COM SOLVENTE
A extrao lquido-lquido por meio de solventes orgnicos o processo que vem
sendo utilizado na indstria para separao de penG do caldo de cultivo. Os principais
solventes utilizados na extrao so a acetona, o acetato de amila,o acetato de butila, o
hexano, entre outros (Treybal, 1980).
Na extrao da penicilina, utilizam-se extratores com trs estgios operando em
contracorrente, como representado na Figura 2.7.
Figura 2.7.: Separao da penicilina com acetato de amila, em trs estgios e em contracorrente
(Treybal, 1980)
11
A corrente que contm a maior concentrao de penicilina a que est saindo no

terceiro estgio, ou seja, corrente de solventes com penicilina, enquanto nos dois estgios
anteriores a corrente de solvente contm pouca penicilina.
Como penG um cido fraco, sua forma neutra extrada na fase orgnica (apolar).
Assim, o primeiro passo na extrao ajustar o pH da fase aquosa entre 2 - 2,5 e

extrair a penicilina para a fase orgnica (solvente). O extrato ento tratado com uma
soluo de pH aproximadamente 6,0 para obter uma soluo aquosa rica em penicilina.
Para o prximo passo, o pH novamente ajustado com cido para um valor baixo e a
penicilina novamente extrada pelo solvente obtendo uma soluo concentrada pura.
A operao de extrao realizada com dificuldade, pois a penicilina degrada
rapidamente com a reduo do pH. Assim para a extrao em temperatura ambiente,
necessrio realizar a transferncia da penicilina em pH baixo de maneira rpida.
2.3.3.2 OUTROS MTODOS DE PURIFICAO
O desenvolvimento de novos e eficientes mtodos de separao se baseia na
explorao de caractersticas fsico-qumicas do produto, tais como: carga superficial,
hidrofobicidade, peso molecular e bioespecificidade frente a ligantes (ons metlicos),
ponto isoeltrico (pI) e estabilidade (Ghosh et al, 1996). A Tabela 2.1 mostra alguns
processos de separao.
Tabela 2.1.: Base fsico-qumica para o desenvolvimento de processos de separao (Ghosh et al, 1996).
Base Fsico-Qumica
Processo de separao
Cromatografia de troca inica
Eletrodilise
Carga
Partio em sistema aquoso bifsico
Extrao por micela reversa
Cromatografia por interao hidrofbica
Cromatografia de fase reversa
Hidrofobicidade
Precipitao
Partio em sistema aquoso bifsico
Cromatografia de afinidade
Ligao especfica
Filtrao em gel
Ultrafiltrao
Tamanho
Dilise
Eletroforese
Mobilidade eltrica
Cromatografia
Ponto isoeltrico
Cristalizao seletiva
Centrifugao
Velocidade de sedimentao
Adsoro
Atividade da superfcie
Fracionamento
Extrao slido-lquido
Solubilidade
Extrao supercrtica
12
A cristalizao vem sendo muito utilizada na indstria qumica como uma maneira de
isolar e purificar produtos. Alm disso, tambm uma ferramenta que permite controlar a
forma fsica de materiais slidos. A extrao lquido-lquido vem sendo utilizada h
dcadas na indstria de antibiticos (recuperao de penicilina G e penicilina V), sendo
que essa tcnica pode ser operada continuamente.
2.4 ADSORO
Nas ltimas dcadas, com o avano das pesquisas, bem como com o acentuado
desenvolvimento registrado na petroqumica, a adsoro passou a ser utilizada como uma
operao unitria importante dentro da Engenharia Qumica. Atualmente, a adsoro
aplicada em processos de purificao e separao, apresentando-se como uma alternativa
importante e economicamente vivel em muitos casos.
Segundo Belter (1988), as duas operaes unitrias mais comumente usadas para isolar
(concentrar) produtos de solues diludas so adsoro e extrao. A adsoro tende a ter
uma menor capacidade, mas uma maior seletividade que a extrao.
O processo de adsoro envolve a separao de uma substncia de uma fase
acompanhada por seu acmulo ou concentrao na superfcie de outra. A fase que est
adsorvendo o adsorvente, e o material concentrado ou adsorvido na superfcie desta fase
o adsorbato. A adsoro , ento, diferente de absoro, processo no qual o material
transferido de uma fase para outra interpenetra a segunda fase para formar uma soluo
(Sleijko, 1985).
Usualmente o adsorvente composto de micropartculas que so empacotadas em um
leito fixo por onde passa a fase fluida continuamente at que no haja mais transferncia
de massa. Uma vez que o adsorbato concentra-se na superfcie do adsorvente, quanto
maior for esta superfcie, maior ser a eficincia da adsoro. Por isso, geralmente os
adsorventes so slidos com partculas porosas. (Borba, 2006)
Vrios mecanismos podem estar envolvidos na adsoro. Na adsoro fsica, foras
fracas tais como foras de Van der Waals so dominantes; j na adsoro por troca-inica,
ligaes inicas fortes so utilizadas (Shulen et al, 1992).
As discusses apresentadas para os processos de adsoro normalmente se referem a
adsoro de gases em superfcie de slidos. Contudo, essas interpretaes podem ser
aplicadas analogamente para compostos dissolvidos em lquidos, o que nos ajuda a
visualizar que tipo de fenmeno de adsoro pode ocorrer num determinando processo de
adsoro utilizado em separao de produtos biotecnolgicos (Barboza, 1998).
13
Biomolculas
adsorvem
seletivamente
em
uma
variedade
de
fases
e,
conseqentemente, tcnicas de adsoro vm se tornando bastantes comuns nas separaes

de bioprodutos, principalmente por apresentarem tima resoluo (Kennedy et al, 1995).
2.4.1
TIPOS DE ADSORO
O processo de adsoro pode ser subdividido em quatro tipos: adsoro qumica ou

quimissoro, adsoro fsica ou fisissoro, adsoro de troca inica e adsoro
especfica que pode ser por bioafinidade ou por excluso de tamanho.
A adsoro fsica no especfica e s vezes similar aos processos de condensao.
As foras de atrao das molculas do fluido no slido so relativamente fracas e o
processo de adsoro ocorre exotermicamente onde o calor envolvido tem a mesma ordem
de magnitude do calor de condensao, 0,5 a 5 kcal/gmol. O equilbrio geralmente
rpido e facilmente reversvel, uma vez que a energia requerida dessoro pequena. A
energia de ativao para adsoro fsica normalmente no maior que 1 kcal/gmol, j que
as foras envolvidas neste tipo de adsoro so fracas (Smith, 1985).
Uma caracterstica importante da adsoro qumica que sua magnitude no excede a
camada monomolecular. Esta limitao deve-se ao fato de que as foras de valncia que
ligam as molculas na superfcie diminuem rapidamente com a distncia (Smith, 1985).
Drouguett (1983) comenta que a adsoro fsica por no ser ativada muito rpida,
instantnea, enquanto que a qumica por ser ativada pode demorar dias ou semanas para
atingir o equilbrio.
A adsoro pode ser resultante da ligao qumica entre o slido adsorvente e o
adsorbato presente na fase fluida. Essa ligao ocorre pela troca ou compartilhamento de
eltrons com elementos qumicos como complexos ou ons metlicos, ligados superfcie
do material slido. Este processo denominado quimissoro exotrmico, ocorre somente
como uma monocamada e irreversvel.
As principais diferenas entrem a adsoro fsica e qumica so mostradas na Tabela
2.2.
Tabela 2.2.:Caractersticas da adsoro fsica e da adsoro qumica
Adsoro Fsica
Adsoro Qumica
Baixo calor de adsoro (< 2 ou 3 vezes que o Alto calor de adsoro (> 2 ou 3 vezes que o
calor latente de vaporizao).
calor latente de vaporizao).
Formao de monocamada ou multicamadas. Somente formao de monocamada. Pode
No h dissociao das espcies adsorvidas.
envolver dissociao das espcies adsorvidas.
Somente significante a baixas temperaturas.
Possvel em uma larga escala de temperatura.
Rpida, no ativada, reversvel. No h Ativada, pode ser lenta e irreversvel. Ocorre
transferncia de eltron embora, possa haver
a transferncia de eltrons, formando uma
polarizao do adsorbato.
ligao entre o adsorbato e o adsorvente.
Fonte: Ruthven, 1984
14
O termo adsoro se relaciona com processos nos quais molculas se acumulam na

camada interfacial e dessoro denota o processo contrrio. Quando o processo de
dessoro de uma ou vrias espcies inicas acompanhado por simultnea dessoro de
uma quantidade equivalente de espcies inicas, este processo considerado como uma
troca inica (Zambon, 2003).
Na adsoro de troca inica, a fase estacionria altamente carregada, sendo que
solutos com cargas de sinais contrrios a esta so seletivamente adsorvidos da fase mvel.
Os solutos adsorvidos podem ser subseqentemente eludos, por deslocamentos por outros
ons, com o mesmo tipo de carga, porm com maior fora de interao com a fase
estacionria (Collins et al, 1995).
A adsoro especfica pode ser por bioafinidade ou por excluso. A adsoro por
bioafinidade baseia-se principalmente nas propriedades biolgicas ou funcionais das
espcies que interagem: a substncia a ser separada e o adsorvente. O princpio deste
processo o isolamento seletivo de macromolculas biolgicas, atravs das propriedades
dessas
substncias
de
se
unirem
reversivelmente
ligantes
especficos
(Collins et al, 1995).

A separao por adsoro baseada em trs distintos mecanismos: mecanismo
estrico, de equilbrio e cintico. No mecanismo de separao estrico, o slido poroso
tem poros com dimenses que permitem a entrada de pequenas molculas enquanto
excluem molculas grandes. O mecanismo de equilbrio baseado nas diferentes
capacidades do slido de acomodar diferentes espcies, isto , espcies mais fortemente
adsorvidas so preferencialmente removidas pelo slido. O mecanismo cintico baseado
nas diferentes taxas de difuso de diferentes espcies dentro do poro, ento, pelo controle
do tempo de exposio, a espcie que difunde mais rapidamente preferencialmente
removida pelo slido (Do, 1998).
2.4.2
ADSORVENTES
Geralmente, o primeiro passo para o desenvolvimento de um processo de adsoro a

procura de um adsorvente adequado separao desejada, o que inclui estudos de
capacidade de adsoro, seletividade, reutilizao e estabilidade qumica e mecnica do
material que se pretende utilizar. As matrizes polimricas mais usadas no processamento
de antibiticos so compostas de poliestireno e divinilbenzeno (Belter,1985). A seleo de
um adsorvente inclui tambm consideraes da rea superficial bem como o tipo de soluto
15
e solvente envolvido no processo de adsoro, desde relatos dos tipos de ligaes que so
formados entre o slido e o fluido (Hines et al, 1985).
Os carves usados so produtos comerciais e no so manufaturados especificamente
para biosseparaes. Resinas de troca inica so baseadas em polmeros sintticos. Os
polmeros normalmente usados contm cargas fixas como SO3-, -COO- ou NR3-, porm
eles podem adsorver efetivamente solutos inicos e no inico (Figura 2.8). Resinas feitas
de estireno e divinilbenzeno muitas vezes adsorvem solutos no polares mais fortemente;
resinas baseadas em ster acrlico tendem a ser mais efetiva para solutos hidroflicos.
Adsorventes baseados em hidrogis so muitas vezes feitos de poliacrilamida, os
conhecidos suportes dos gis de eletroforese (Belter et al, 1988).
Figura 2.8.: Esquema de um trocador catinico (A) e aninico (B) (Collins et al, 1995)
Os adsorventes sintticos so materiais esfricos com alta rea superficial e uma

superfcie hidrofbica, o que permite a adsoro de compostos orgnicos hidrofbicos
sobre sua superfcie. Por esta funo seletiva, eles podem ser usados para extrao de
compostos orgnicos de solues aquosas tais como caldos de cultivo. Considerando a
transferncia de massa dos compostos desejados, a funo dos adsorventes sintticos
similar quela da extrao com solventes. Porm, o uso dos adsorventes sintticos tem
muitas vantagens sobre os processos convencionais de extrao com solventes
(Verral, 1996).
Uma diferena que os processos adsorventes requerem uma quantidade muito menor
de solventes orgnicos. Estes so freqentemente txicos e inflamveis logo sua
eliminao pode ter vantagens prticas. Outra diferena que os adsorventes tm uma
funo de peneira molecular baseada na sua estrutura porosa de tal forma que o
fracionamento pelo tamanho molecular pode ocorrer durante o processo. Alm disso, os
adsorventes podem ser usados retidos dentro de coluna ou num modo em batelada (em
suspenso). Quando uma grande quantidade de soluo tem de ser tratada e a concentrao
16
do composto desejado muito baixa, o processo em coluna, com adsorvente empacotado,

pode ser muito eficaz (Verral, 1996).
2.4.2.1 CARVO ATIVADO
O carvo ativado o carbono amorfo, que no tem forma determinada nem regular,
que foi tratado com vapor dgua e calor at adquirir grande afinidade para adsorver
diversas substncias. So caracterizados por ter uma grande rea superficial coberta com
uma combinao de oxignio e hidrognio. Essa superfcie provavelmente consiste de
grupos polares reativos. Em 1959, sugeriu-se que a superfcie destes carves teria grupos
carbonil, hidroxil, carboxil e lactona. O carvo ativado tem um grande volume de poros
pequenos, o que gera uma grande rea superficial. Valores tpicos de rea superficial para
estes adsorventes esto entre 600 a 1200 m2/g, sendo que possvel encontrar relatos
como 3000 m2/g. Esses poros internos so classificados com base no tamanho dos
microporos (10 a 1000) ou macroporos (acima de 1000 ). A adsoro ocorre
primeiramente nos microporos com os macroporos atuando como canais condutores
(ORNELAS, 2003).
A matria prima escolhida para a preparao do carvo ativado tem um efeito
determinante nas suas propriedades de adsoro. Madeira, cco, lignina, carvo
betuminoso, petrleo e lodo de carvo ativado tm sido utilizados como matrias primas.
No existe um tipo de carvo ativado que seja eficiente para todos os fins. Como
descorante, o carvo ativado, com rea superficial muito grande e elevado volume de
poros, mais eficiente que o carvo vegetal e o carvo animal (ORNELAS, 2003).
O principal uso do carvo ativado na purificao de solues, como nas solues
aucaradas de xarope de cana, de acar de beterraba ou de milho e na remoo de gostos
e cheiros da gua para abastecimento pblico, de gorduras e de leos vegetais e animais,
de bebidas alcolicas, de substncias qumicas e de produtos farmacuticos. A recuperao
da estreptomicina (antibitico produzido por fermentao) constitui uma aplicao tpica
no tratamento contnuo de efluentes lquidos (ORNELAS, 2003).
O carvo ativado capaz de adsorver praticamente qualquer solvente orgnico acerca
de 40C e dessorv-lo quando aquecido a 121,1C, ou mais para certos compostos. O
carvo ativado pode ser obtido, na atualidade, em forma extrudada (ORNELAS, 2003).
Molculas de alta massa molecular adsorvem preferencialmente em carvo ativado,
quando comparadas a molculas de baixa massa molecular. A adsoro favorecida para
molculas no polares. Ressalta-se tambm que o pH da gua e a solubilidade do soluto no
17
solvente so importantes na sua adsoro pelo carvo ativado, devido ao carter

hidrofbico do carvo. A presena de solutos adicionais afetar as caractersticas de
adsoro para a remoo de um contaminante especfico. Em geral, no entanto, a alta
massa molecular do soluto o principal fator que controla a possibilidade de sua adsoro.
Molculas com trs ou mais tomos de carbono usualmente so removidas por adsoro
em carvo ativado. Na purificao de produtos biotecnolgicos, carvo ativado utilizado
quase que exclusivamente em meio lquido (ORNELAS, 2003). A Figura 2.9 mostra a
estrutura qumica do carvo ativado.
Figura 2.9.: Estrutura qumica bsica do carvo ativado
2.4.2.2 AMBERLITE XAD

Em 1965, Rohm & Haas comercializaram o primeiro adsorvente orgnico sinttico
macroporoso, tambm chamado de resina Amberlite XAD. Esses adsorventes foram
descritos como prolas rgidas insolveis. Possuem alta variedade de rea superficial,
porosidade e distribuio de tamanho de poros. Devido a estas diferenas nas propriedades
de superfcie, os adsorventes Amberlite XAD exibem uma ampla faixa de espectros de
polaridade de superfcie que vai de um extremo no polar at o outro altamente polar. A
quantidade relativamente grande de dados de adsoro disponveis tem demonstrado que
os adsorventes Amberlite XAD so altamente versteis e efetivos como meios de adsoro
(Voser, 1982).
Segundo Voser (1982) no possvel predizer exatamente quais materiais sero
adsorvidos por um dado adsorvente; porm, sob um ponto de vista prtico, o conceito
geral de que molculas hidrofbicas ou no polares ou pores de molculas so atradas
por superfcies hidrofbicas e hidroflicas ou materiais polares a superfcies polares ou
hidroflicas um conceito proveitoso. Se cada molcula pensada como tendo ambos os
terminais hidrofbico e hidroflico, ento o terminal hidrofbico ser atrado pelo
adsorvente hidrofbico como Amberlite XAD-4. Isto particularmente verdade quando a
adsoro ocorre a partir de solues aquosas. Adsorventes de polaridade intermediria ou
18
hidroflica como Amberlite XAD-7 tero uma atrao por ambos os terminais da
molcula, o hidrofbico e o hidroflico.
Adsoro sobre resinas polimricas um mtodo usado para a remoo de compostos
qumicos e farmacuticos a partir de solues diludas. O uso destes adsorventes para
separao de aminocidos, a partir de solues aquosas diludas, est comeando a ser
estudada como tcnica promissora na separao destes compostos (Doulia et al, 2001;
Grzegorczyk et al, 1996).
Vieira et al (2003), estudaram a adsoro em resinas hidrofbicas de ampicilina
(AMPI), D-fenilglicina (FG), ster metlico de fenilglicina (EMPG) e 6-APA, sendo os
dois primeiros produtos e os dois ltimos reagentes na sntese de ampicilina, catalisada por
penG acilase (PGA). A influncia do pH, nas eficincias de adsoro desses compostos,
nas resinas XAD-4, XAD-7 e XAD-761, foi avaliada na faixa de pH entre 4,5-8,5. Os
valores obtidos a 4C foram pouco superiores aos obtidos a 25C. A eficincia de
adsoro de AMPI e 6-APA diminuram com o aumento do pH, para as trs resinas.
Comportamento oposto foi observado para EMPG, e o pH no afetou a eficincia de
adsoro de FG. Os resultados obtidos atravs de ensaios em batelada mostraram que a
resina XAD-4 apresentou os melhores valores de seletividade e capacidade de adsoro.
Essa resina atingiu uma razo de ampi/FG= 7,0, ou seja, a resina adsorve 7 vezes mais
ampicilina do que fenilglicina a pH 8,5 e apresentou capacidade de adsoro mxima de,
aproximadamente, 455 mg de ampicilina/ g de resina, a pH 6,5. Diferentes modelos de
equilbrio de adsoro foram ajustados aos dados experimentais: os modelos Linear e de
Langmuir representaram a adsoro de FG e ampicilina sobre a resina XAD-4 a pH 6,5,
respectivamente.
2.4.2.2.1
AMBERLITE XAD-4
Amberlite XAD-4 um adsorvente polimrico (copolmero de estireno-divinilbenzeno)

na forma de grnulos brancos. um polmero no inico, cujas propriedades de adsoro
derivam da sua estrutura devido natureza aromtica na sua superfcie e apresenta elevada
rea superficial. A estrutura permite excelente estabilidade fsica, qumica e trmica
(Rohm & Haas- XAD-4, 2003).
A Figura 2.10 mostra a estrutura qumica, e a Tabela 2.3 apresenta algumas
propriedades fsicas da resina Amberlite XAD-4.
19
Figura 2.10.: Estrutura qumica da resina Amberlite XAD-4
2.4.2.2.2
AMBERLITE XAD- 7
A resina Amberlite XAD-7 um polmero de acrlico e divinilbenzeno, no inico,

aliftico e com ligaes cruzadas, do qual deriva suas propriedades adsortivas. Possui
estrutura macroreticular e apresenta-se na forma de esferas brancas insolveis. Apresenta
elevada rea superficial e excelente estabilidade fsica e trmica. Devido sua natureza
aliftica, o adsorvente polimrico, Amberlite XAD-7, pode adsorver compostos no
polares de sistemas aquosos e compostos polares de solventes no polares
(Rohm & Haas- XAD-7, 2003). A Figura 2.11 mostra a estrutura qumica da resina
Amberlite XAD-7.
Figura 2.11.: Estrutura qumica da resina Amberlite XAD-7
20
2.4.2.2.3
AMBERLITE XAD- 761
A resina Amberlite XAD-761 um adsorvente fenlico altamente poroso e granular,

apresenta-se na forma de esferas de colorao ocre. A presena dos grupos hidroxila
fenlico e alcolico contribui para suas propriedades hidroflicas (Rohm & Haas- XAD761, 2004).
A Tabela 2.3 apresenta as propriedades fsicas dos adsorventes: Amberlite XAD-4,
XAD-7 e XAD-761.
Tabela 2.3.:Propriedades fsicas dos adsorventes Amberlite XAD-4 e XAD-7 e XAD-761.
Propriedade
Polaridade
Funcionalidade
Amberlite XAD-4#
Hidrofbica
Aromtica
Grnulos brancos
Forma Fsica
2
Resinas
Amberlite XAD-7##
Intermediria
Acrlica
Esferas brancas
insolveis
> 380
9
> 0,50
0,0 14,0
150
> 750
rea superficial (m /g)
5
Dimetro mdio do poro (nm)
> 0,50
Porosidade (mL/mL)
0,0 14,0
Faixa de pH de Trabalho
150
Temperatura mxima(C)
Porosidade*** = medida por porosmetro de mercrio
Fontes: ***Bautista et al, 1999
# Rohm & Haas Co- XAD4, 2003
### Rohm & Haas Co XAD-761,2004
2.4.3
Amberlite XAD-761###
Hidroflica
Fenlica
Grnulos de colorao
ocre
150-250
0,6-0,8
0,95-1,18
0,0 -8,0
40
## Rohm & Haas Co XAD-7,2003
EQUILBRIO DE ADSORO
Adsoro de uma substncia de uma fase para a superfcie de outra em um sistema

especfico leva a uma distribuio termodinamicamente definida daquela substncia entre
as fases quando o sistema alcana o equilbrio. A maneira comum de representar esta
distribuio expressar a quantidade de substncia adsorvida por unidade de massa de
adsorvente, q*, como funo da concentrao residual de equilbrio, C*, da substncia
remanescente na fase soluo (Slejko, 1985).
Independente do modelo matemtico proposto, uma condio necessria, mas no
suficiente, para a descrio adequada da dinmica de adsoro em colunas de leito fixo
que a relao matemtica utilizada (isotermas de adsoro, isotermas de troca inica, lei de
ao das massas) represente apropriadamente os dados de equilbrio entre as fases na
coluna (Ernest et al, 1997; Silva et al, 2002). Alm disso, a primeira etapa num projeto de
sistemas consiste na seleo do material adsorvente, cuja avaliao realizada por meio
dos dados experimentais ou relaes de equilbrio.
O estudo do equilbrio de adsoro, que no corresponde transferncia de massa entre
as fases, usado para determinar a distribuio do adsorbato entre o seio da fase fluida e
21
da fase adsorvida na superfcie do slido adsorvente. A distribuio de equilbrio

geralmente medida temperatura constante, e referida como isoterma de equilbrio
(Hines et al, 1985). O estudo do equilbrio de adsoro d informao sobre a capacidade
do adsorvente ou a quantidade requerida para remover uma unidade de massa do adsorbato
sob as condies do sistema (Aksu et al, 2003).
A natureza geral da inclinao ou da zona de transferncia de massa da curva de
ruptura (perfil de concentrao do efluente de uma coluna) influenciada pela isoterma de
equilbrio, embora a forma do perfil de concentrao possa ser significativamente
modificada por efeitos cinticos (Ruthven, 1984).
Para um propsito de avaliar a dinmica de adsoro, as isotermas so classificadas em
(a) favorveis, (b) linear e (c) desfavorvel. A Figura 2.12 mostra estes trs tipos de
isotermas.
Figura 2.12.: Diagrama das isotermas: (a) favorvel, (b) linear e (c) desfavorvel
Na maioria dos processos de adsoro, as isotermas so favorveis e, portanto, a

dessoro desfavorvel. Na dessoro, a zona de transferncia de massa dispersiva,
conduzindo a uma propagao contnua do perfil de concentrao, enquanto que na
adsoro, a zona de transferncia de massa compressiva, conduzindo a um
comportamento padro (Ruthven, 1984).
Como na extrao, a anlise da adsoro est baseada no equilbrio e nos balanos de
massa. A diferena bsica que o equilbrio no apresentado como coeficiente de
partio, mas sim como uma isoterma de adsoro. Isotermas tpicas de adsoro so
mostradas na Figura 2.13. Para cada isoterma, a abscissa corresponde concentrao de
soluto em soluo, geralmente expressa em massa de soluto por volume de soluo. A
ordenada corresponde concentrao de soluto sobre a superfcie adsorvente,
22
freqentemente expressa em massa de soluto por massa de adsorvente. As trs isotermas

mostradas na Figura 2.13 ocorrem em biosseparaes (Belter et al, 1988).
As isotermas podem ser determinadas no equilbrio, sendo utilizadas para a seleo de
um adsorvente baseado na sua capacidade, ou alternativamente, elas podem ser
determinadas como funo do tempo, sendo utilizadas para selecionar um adsorvente com
base na sua taxa de adsoro (Sleijko, 1985).
Figura 2.13.: Isotermas comuns de adsoro (Belter et al, 1988).
A informao do equilbrio de adsoro uma parte muito importante no

entendimento do processo de adsoro. No importa quantos componentes esto presentes
no sistema, o equilbrio de adsoro dos componentes puros ingrediente essencial para o
entendimento de como estes componentes podem ser acomodados pelo slido adsorvente
(Do, 1998).
2.4.3.1 ISOTERMA LINEAR
Em uma adsoro sobre superfcie uniforme, onde as concentraes so
suficientemente baixas, tal que uma molcula est isolada da molcula vizinha, a relao
de equilbrio entre as concentraes da fase fluida e da fase adsorvida ser linear
(Ruthven, 1984). Obtm-se assim o modelo de isoterma mais simples, que o da adsoro
linear ou partio constante, que descrito por uma equao da seguinte forma:
q* = K H C *
(2.1)
onde q* a quantidade de soluto adsorvido por quantidade de adsorvente, C* a

concentrao de soluto em soluo, e KH a constante de equilbrio (Sleijko, 1985).
23
Este modelo tem a vantagem de descrever um conjunto de dados de adsoro em

termos de um nico parmetro, KH, e simplificar a modelagem dos dados, j que pode ser
resolvido implicitamente para qualquer um dos termos. Todos os demais modelos de
isotermas, como por exemplo, os modelos de Freundlich e Langmuir, podem ser reduzidos
direta ou indiretamente relao linear sob condies especiais (Sleijko, 1985).
2.4.3.2 ISOTERMA DE LANGMUIR
A isoterma de Langmuir um modelo terico, cuja expresso matemtica fundamentase nas seguintes hipteses:
I. Todos os stios do slido tm a mesma atividade para a adsoro;
II. No existe interao entre as molculas adsorvidas;
III. Toda adsoro segue o mesmo mecanismo, e cada complexo adsorvente-adsorbato
tem a mesma estrutura;
IV. A extenso da adsoro no mais que a formao de uma camada
monomolecular sobre a superfcie do adsorvente. (Borba, 2006).
A
expresso
matemtica
para
isoterma
de
Langmuir
para
um
sistema
monocomponente dada por:

q* =
qm C *
KL + C*
(2.2)
em que q* a quantidade adsorvida pela resina no equilbrio (mg/ g resina), C* a

concentrao de soluto em soluo no equilbrio (mg/ mL), qm a capacidade mxima de
adsoro da resina (mg/ g resina) e KL a constante de adsoro de Langmuir (mg/ mL).
Esta isoterma possui forte base terica e est fundamentada num postulado de reao
qumica entre o soluto e os stios vagos sobre a superfcie do adsorvente e a no existncia
de interao entre soluto-soluto, resultando num recobrimento em monocamada:
Soluto + stios vagos = stios preenchidos
(2.3)
KL , constante de adsoro de Langmuir, o inverso da constante de equilbrio, sendo

descrita por
(2.4)
alm disso, o nmero total de stios ativos deve ser fixado,
[stios totais] = [stios vagos] + [stios preenchidos]
combinando as duas ltimas equaes temos:
(2.5)
24
(2.6)
Assim, sendo o nmero de stios preenchidos proporcional a q*, a equao 2.6
equivalente a equao 2.2 (Belter et al, 1988).
As constantes da isoterma de Langmuir tm significado fsico. O parmetro KL
representa a razo entre a taxa de adsoro e dessoro. Portanto, baixos valores deste
parmetro indicam forte afinidade do on pelos stios do material. O parmetro qm
representa o nmero total de stios disponveis no material adsorvente (Borba, 2006).
Embora derivada para explicar situaes de adsoro reversveis, a equao de
Langmuir pode refletir adequadamente sistema de adsoro irreversvel e est
caracterizada pela formao de monocamada que indica a capacidade de saturao
(Ko et al, 2001).
2.4.3.3 ISOTERMA DE FREUNDLICH
Ao contrrio da forte base terica apresentada pela isoterma de Langmuir, esta
isoterma muitas vezes falha ao descrever dados experimentais adequadamente
(Sleijko, 1985). A isoterma de Freundlich no prev a saturao do adsorvente. Assim, o
modelo permite a existncia de uma cobertura superficial infinita (Reed et al, 1993).
Essa isoterma corresponde adsoro em stios no uniformes. Nesse caso o calor de
adsoro freqentemente diminui com o aumento da cobertura na superfcie. A falta de
uniformidade, todavia, pode ou existir previamente nos diferentes stios de adsoro ou ser
causada pelas foras repulsivas entre tomos ou molculas adsorvidas. Especialmente no
caso da ligao entre a superfcie e o adsorbato ser parcialmente inica, as repulses
podem se tornar grandes, diminuindo notadamente o calor de adsoro em coberturas mais
elevadas. A equao 2.7 descreve matematicamente esta isoterma:
q* = K F C *n
(2.7)
onde KF a constante de equilbrio de Freundlich (mL/ mg resina) e n um ndice

desta isoterma. O ndice 1/n indicativo da energia ou intensidade da reao (Sleijko,
1985).
As dimenses de KF dependem do valor de n, se a adsoro favorvel, ento n < 1;
se esta desfavorvel, ento n > 1 (Belter et al, 1988).
2.4.4
25
SISTEMAS TPICOS DE ADSORO
As primeiras observaes relacionadas ao processo de adsoro foram feitas no sculo

XVIII, contudo recente o desenvolvimento de tecnologia para aplicao deste fenmeno
em processos industriais, como purificao e separao de produtos. O desenvolvimento
desta operao foi realizado tomando-se como base a utilizao de leitos fixos e
fluidizados, colocando-se um slido adsorvente em contato com uma alimentao fluida
(Homem, 2001).
Os processos de separao que utilizam a tcnica de adsoro podem ser operados
basicamente de duas formas: atravs de bateladas e em leito fixo.
A maneira pela qual um adsorvente entra em contato com a soluo, contendo o soluto
a ser adsorvido, particularmente importante para operaes de separao em grande
escala. As taxas de adsoro sobre os adsorventes so controladas pelos processos de
transporte do soluto at a superfcie e dentro dos adsorventes, como pode ser visto na
Figura 2.14.
Figura 2.14.: Etapas de transporte de massa na adsoro utilizando adsorventes porosos
(Sleijko, 1985).
Os ensaios em batelada so convenientes e informativos para selecionar o tipo de

adsorvente ou para otimizar certas condies. Nos experimentos em batelada, os
parmetros a serem examinados incluem a relao massa de adsorvente/volume de
soluo, pH, temperatura e tempo de contato. Se o composto de interesse tem um ou mais
grupos ionizveis, o pH pode influenciar na capacidade de adsoro do slido adsorvente.
Desta maneira, para adsoro em resinas hidrofbicas, o pH deveria ser ajustado de tal
forma que o composto de interesse no esteja ionizado. desejvel empregar resinas com
o menor dimetro possvel, operando em condies eficientes, para permitir que se alcance
altas taxas de adsoro. O termo operao eficiente importante; a escolha de um
determinado tamanho de resina impe algumas restries ao tipo de sistema de reator que
26
pode ser usado. Adsorventes de alta capacidade, por exemplo, so geralmente utilizados
em reatores em batelada ou de mistura (Sleijko, 1985).
2.4.5 RECUPERAO
BATELADA
DE
PRODUTOS BIOTECNOLGICOS
POR
ADSORO
EM
Prasad et al (1980) investigaram o desempenho de quatro trocadores inicos

semelhantes na purificao de estreptomicina atravs do estudo cintico e o
comportamento do equilbrio de adsoro. Os ensaios em batelada foram realizados com
sulfato de estreptomicina em soluo aquosa em cada adsorvente separadamente. Os
autores observaram que a capacidade de adsoro de estreptomicina nos diferentes
trocadores inicos obedece seguinte ordem: KB-2 > Indion 236 > IRC-50 > KB4-P2.
Tambm foi observado que no h influncia da temperatura no equilbrio de adsoro
dentro da faixa estudada (13 a 23C) em todos os adsorventes testados.
Boothroyd (1986) descreveu vrios mtodos de recuperao de cefalosporina C (CPC).
Dois estgios so comuns nos processos descritos, a filtrao como primeiro estgio de
separao slido-lquido, e o estgio final de purificao que envolve a concentrao da
CPC atravs da adsoro de seu ncleo carboxlico em uma resina fracamente bsica
(IRA-68) e dessoro com acetato de potssio ou acetato de sdio seguido da precipitao
da cefalosporina C como sal de potssio ou de sdio, respectivamente. As variaes do
processo ocorrem na preparao do filtrado para o estgio final. O objetivo desses estgios
intermedirios a remoo de todos os ons fortes que possam ser adsorvidos
preferencialmente cefalosporina.
Ghosh et al (1996) descreveram processos tpicos de purificao de cefalosporina C. O
primeiro processo utiliza uma combinao de tcnicas de membrana e cromatografia. As
clulas so removidas por microfiltrao e protenas e polissacardeos so removidos por
ultrafiltrao. O permeado da ultrafiltrao concentrado por osmose reversa e o
antibitico finalmente purificado por cromatografia lquida de alto desempenho,
obtendo-se uma recuperao acima de 98,5%.
Em outro mtodo, foi sugerido o uso de uma combinao de ultrafiltrao, coluna
cromatogrfica e osmose reversa. A recuperao pode ser maior que 90% atravs das
colunas cromatogrficas utilizando resina trocadora de nions de base fraca (Diaion WA30), adsorventes poli aromticos neutros (Diaion HP-20 e Amberlite XAD-2000) e
trocadora de ctions de cido forte (Diaion SK-1B), nessa seqncia. O mtodo de
purificao concludo com a secagem do produto, obtendo-se a cefalosporina na forma
27
de sal de sdio ou potssio (Ghosh et al, 1996). Mais uma vez observa-se que adsoro
sempre est presente na purificao de CPC.
Bautista et al (1999) desenvolveram um estudo sobre o equilbrio de adsoro da amilase obtida a partir da Aspergillus oryzae em duas resinas polimricas comerciais, uma
resina hidrofbica (AmberliteXAD-761) e uma resina trocadora aninica (Duolite A-568).
Os autores determinaram o efeito do pH, fora inica e temperatura na reteno do
adsorbato, estudaram a capacidade de adsoro das resinas e o equilbrio de adsoro
atravs da obteno das isotermas de adsoro em diferentes temperaturas. Foi possvel
concluir que para o sistema hidrofbico a constante de adsoro aumenta com o aumento
da fora inica enquanto que utilizando a resina trocadora de ons o efeito oposto. Isso
ocorre devido a competio entre os sais presentes na fase mvel e os grupos carregados
da -amilase pelos grupos amino da resina trocadora de ons. Em ambos os sistemas a
constante de adsoro cresce quando o pH decresce de 8,0 a 6,0. Tambm foi observado
que o equilbrio de adsoro em diferentes temperaturas mostrou um comportamento no
linear para os dois sistemas descritos pela isoterma de Langmuir.
Dutta et al (1999) estudaram a adsoro de alguns antibiticos semi-sintticos
(cefadroxil, cefalexina, 6-APA e 7-ACA) em carvo ativado e quatro tipos de resinas
polimricas. Observaram que h grande dependncia entre o pH e a quantidade adsorvida.
Segundo eles, o fenmeno de adsoro foi determinado por interaes hidrofbicas entre o
antibitico e o adsorvente. Eles concluram que o carvo ativado o melhor adsorvente
dos antibiticos estudados, porm os estudos foram realizados em meio aquoso.
Barboza et al (2000) estudaram a purificao da cefalosporina C, proveniente de caldo
de cultivo, em coluna de leito fixo utilizando a resina no inica Amberlite XAD-2. O
processo de adsoro pde ser avaliado em termos de fator de purificao e fator de
concentrao. A diminuio da temperatura de 25 para 10C a um pH de 3,6 favoreceu o
processo de adsoro. Assim nas melhores condies de operao da coluna de leito fixo,
temperatura de 10C e pH 3,6, os autores obtiveram um fator de concentrao de
cefalosporina C de 7,6 e um fator de purificao de 4,7, considerados bons fatores na
purificao de antibiticos.
Casey et al (2007) estudaram a eficcia do uso de resinas para a recuperao da
geldanamicina de caldos de fermentao. Foram avaliadas as resinas Amberlite XAD-4, 7,
16, 1180 e 1600, e Sepabeads SP-850 e Diaion HP-20. Todas as resinas avaliadas foram
28
capazes de recuperar 90% de geldanamicina em uma concentrao de 15 g.L-1, sendo

seletivas para adsoro de geldanamicina ao invs dos contaminantes.
2.5 DESSORO
Um dos mais crticos passos nos processos de purificao por adsoro est
relacionado dessoro dos compostos de interesse, com a recuperao ou no do
composto adsorvido. A dessoro normalmente acompanhada pelo uso de condies que
resultem em uma significante queda na afinidade da ligao adsorvente-adsorbato. Uma
tima condio de dessoro aquela que permite uma completa e efetiva recuperao do
adsorbato em volumes relativamente pequenos, enquanto ao mesmo tempo no
compromete a atividade qumica de ambos, adsorvente e adsorbato. A dessoro
normalmente efetuada por mudanas no pH, no potencial inico, e composio qumica do
tampo (Rehm et al, 1993).
Quando o composto alvo um neutro no ionizvel, solventes orgnicos miscveis em
gua, como os alcois menores, so usados como eluentes. Porm, um tampo aquoso ou
mistura tampo/solvente pode ser prefervel para compostos ionizveis (isto , mais
solveis em gua) (Verrall, 1996).
Todas as substncias orgnicas ou inorgnicas que mudam a polaridade do produto
adsorvido, pela formao de sais, ou que possuem uma maior afinidade pela resina so
possveis eluentes. Alguns exemplos so: cidos, bases, solues tampo, sais inorgnicos,
substncias orgnicas neutras solveis em gua (alcois), solventes orgnicos no
miscveis em gua e gua (quente, refrigerada) (Voser, 1982).
A escolha da composio do eluente e da sua concentrao determina a seletividade, o
volume de eluato e se o cido ou base adsorvido dessorvido como um sal ou cido ou
base livre. Quando se decide sobre a composio do regenerante, a solubilidade das
impurezas e sua afinidade para com a resina devem ser levadas em considerao.
Idealmente se espera alcanar 100% de regenerao com um volume mnimo de
regenerante. Elevadas temperaturas durante a regenerao podem ser vantajosas
(Voser, 1982).
2.6 PLANEJAMENTO ESTATSTICO DE EXPERIMENTO

A necessidade crescente da otimizao de processos, minimizando custos e tempo,
maximizando rendimento, produtividade, pureza e melhor qualidade de produtos levam os
29
engenheiros de processos, e particularmente os bioqumicos a buscarem tcnicas

sistemticas de planejamento de experimentos.
A utilizao de experimentos planejados estatisticamente, associada s tcnicas de
superficie de resposta, tem sido utilizada para a otimizao dos processos. O planejamento
de experimentos uma tcnica cuja aplicao em processos qumicos industriais vem
crescendo continuamente, principalmente a partir da dcada de 80 com a evoluo dos
microcomputadores e a disponibilidade de softwares estatsticos que facilitaram os
clculos e a anlise de dados.
O mais importante beneficio do planejamento estatstico de experimentos que ele
pode dar mais informaes por experimento do que ensaios no planejados, alm de
reduzir o tempo gasto e melhorar a eficincia das investigaes, particularmente quando
muitas variveis so potencialmente importantes. Um segundo beneficio um ensaio
organizado atravs da coleo e anlise de informao. Freqentemente as concluses de
um experimento planejado so evidentes, sem anlises estatsticas extensivas. Outra
vantagem a certeza de confiabilidade da informao luz de variao experimental e
analtica. Essa anlise criteriosa dos resultados, quando apresentados em um trabalho, traz
mais credibilidade s concluses do pesquisador (Staeheli, 1987).
O planejamento dos experimentos, isto , a especificao detalhada das operaes
experimentais que devem ser realizadas, depender do objetivo particular que ele queira
atingir. Cada objetivo ir requerer um planejamento diferente, para que possa ser
alcanado de forma eficaz. Um planejamento de experimentos bastante utilizado o
planejamento fatorial de dois nveis, de grande utilidade em investigaes preliminares,
quando se deseja saber se determinadas variveis tm ou no influncia sobre a resposta, e
no se est preocupado ainda com uma descrio muito rigorosa dessa influncia. So
planejamentos muito simples de executarem e podem ser ampliados para formarem um
planejamento mais sofisticado, que necessrio quando se quer conhecer melhor a relao
funcional existente entre as respostas e as variveis. Por outro lado, quando se deseja fazer
apenas uma triagem inicial das variveis, vantajoso comear pela execuo de um
planejamento fatorial incompleto, o chamado fatorial fracionrio (Box et al, 1978).
Atravs destas tcnicas sistemticas de conduo de experimentos possvel avaliar
o efeito principal de cada varivel na resposta desejada, bem como as interaes entre elas.
A partir da anlise de varincia pode-se propor um modelo probabilstico adequado que
correlacione as respostas em funo das variveis estudadas, construindo-se a superficie
de resposta para determinar as faixas timas de operao. Nem sempre o objetivo do
30
trabalho em estudo a otimizao do processo, mas sim um melhor conhecimento sobre as

respostas do sistema frente a variaes ou perturbaes que podem ocorrer dentro das
faixas de operaes estabelecidas. Assim, outra informao muito importante que pode ser
obtida atravs do planejamento fatorial a variao das variveis que apresentam
nenhuma ou pouca influncia nas respostas, fornecendo subsdios fundamentais quanto
flexibilidade e robustez do sistema e conseqentemente na definio da melhor estratgia
de controle operacional (Rodrigues et al, 1998).
Quando o nmero de variveis aumenta, crescem as chances de que uma ou mais
variveis no afetem significativamente a resposta, seja por meio de efeitos principais, seja
por meio de efeitos de interao. Ento as opes so os planejamentos fatoriais
fracionados, que so teis nas etapas prvias de desenvolvimento de processos. Assim,
este procedimento muito interessante em termos qualitativos, mas no se deve a partir de
um planejamento fracionado otimizar o processo, pois os efeitos principais esto
confundidos com interaes de 2a e 3a ordem ou superiores, conforme o tipo de resoluo
do fracional (Box et al, 1987).
A metodologia de superficie de resposta uma tcnica de otimizao baseada no
emprego de planejamentos fatoriais, introduzida na dcada de 50, e que desde ento tem
sido usada com grande sucesso na modelagem de diversos processos industriais
(Box et al, 1987).
31
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 MATERIAIS
Penicilina G potssica, fornecida pela empresa Prodotti S/A; resinas XAD-4, XAD-7 e
XAD-761, da Rohm & Haas Co; Carvo Ativado (dp < 1,19 mm), da Synth. Metanol grau
HPLC, da Tedia Brazil. Todos os outros reagentes so de grau analtico de diferentes
fornecedores.
Penicillium chrysogenum cultivado para obteno de caldo tpico foi doado pela
Fundao de Culturas Tropicais.
Escherichia coli ESS, cedida gentilmente pela pesquisadora Paloma Liras (rea de
Microbiologa, Facultad de Ciencias Biolgicas y Ambientales, Universidad de Len,
Len, Spain).
3.2 MTODOS
3.2.1
PROCESSO DE PRODUO DE PENICILINA G
O meio de manuteno para P. chrysogenum foi preparado utilizando a tcnica de tubo

inclinado e era constitudo de extrato de malte 20 g.L-1, peptona 1 g.L-1, glicose 20
g.L-1e agar 20 g.L-1. A cada cinco meses o fungo era transferido desse meio slido para
um outro tubo inclinado com um novo meio de manuteno .
O cultivo do microrganismo iniciou-se com a transferncia dos esporos contidos nos
tubos com meio de manuteno para um erlenmeyer contendo 100 mL do meio de cultivo
composto de: gua de macerao de milho 28 mL.L-1, fosfato de sdio monobsico
5,2 g.L-1, sulfato de amnio (NH4)2SO4 5,2 g.L-1, hidrxido de clcio Ca(OH)2 1,2 g.L-1,
carbonato de clcio CaCO3 0,8 g.L-1, polipropileno 2000 (antiespumante) 2,6 mL.L-1,
gua 800 mL. L-1 e sacarose 10 g.L-1.
O erlenmeyer, contendo a suspenso de esporos para germinao, foi mantido em
agitao (250 rpm), a 25C por 24 horas. Em seguida o caldo de cultivo resultante foi
distribudo em erlenmeyers contendo meio de cultivo fresco, no qual se adicionou o
precursor para a produo de penG (fenilacetato de potssio 2,56 g.L-1).
Aps 24 horas, o caldo de cultivo era filtrado vcuo com papel filtro qualitativo (de
dimetro 7,0 cm) para remoo da massa de fungos e o filtrado era armazenado a -20oC.
3.2.2
32
DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PENG
Para a determinao da concentrao de penG foi utilizada a cromatografia lquida de

alta eficincia (CLAE), o mtodo iodomtrico, o bioensaio e a hidrlise enzimtica de
penG.
3.2.2.1 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE)
A anlise de penG em meio aquoso foi realizada utilizando a tcnica CLAE,
empregando-se uma coluna C-18, BondPack, 3,9x 300mm e fase mvel 20% acetonitrila,
80% tampo fosfato 10mM, pH 6,5, tiossulfato de sdio 10mM em uma vazo de
1 mL/min, com deteco UV a 254nm usando-se o cromatgrafo da marca Shimadzu
modelo CLASS-LC10. Ao utilizar o cromatgrafo modelo CLASS-VP, alterou-se a fase
mvel para 25% metanol e 75% gua deionizada, excluindo a existncia de sal na fase
mvel.
A concentrao de penG em amostras foi calculada a partir de uma curva de calibrao
(rea pico X Concentrao penG), a qual foi preparada utilizando como solvente, gua ou
caldo de cultivo livre de penG. As curvas de calibrao e as equaes obtidas so
apresentadas nas Figuras 3.1 e 3.2.
Figura 3.1.: Curva de calibrao de penicilina G em gua utilizando o cromatgrafo modelo

CLASS - LC10
33
Figura 3.2.: Curva de calibrao de penicilina G em caldo de cultivo utilizando o cromatgrafo

modelo CLASS VP
3.2.2.2 MTODO IODOMTRICO

A determinao da concentrao de penG pelo mtodo iodomtrico foi realizada
empregando-se uma seqncia de reaes com a penG. Primeiramente, uma soluo
contendo penG (2mL) foi misturada com 2 mL de NaOH 1N por 15 minutos com a
finalidade de romper o anel -lactmico produzindo o cido penicilinico. Neutralizou-se
a soluo com 2 mL de HCl 1,2N. Adicionou-se um excesso de soluo de iodo 0,01N
(10mL). Aps 15 minutos reagindo, o iodo no consumido foi titulado com tiossulfato de
sdio 0,01N (USP 26, 2003).
3.2.2.3 BIOENSAIO
Para a realizao dos bioensaios utilizou-se a Escherichea coli ESS, bactria sensvel a
antibitico -lactmico. A bactria foi cultivada em meio agar nutriente (5 g.L-1de
peptona, 3 g.L-1 de extrato de carne, 20 g.L-1 de agar e 100mL de gua destilada, com pH
ajustado em 7,2), por 48 horas em estufa a 36- 37 C.
Para suspender os microrganismos utilizados no bioensaio, adicionaram-se 10 mL de
soluo salina (0,9% m/v) para cada tubo contendo bactrias cultivadas em 20 mL de agar
nutriente inclinado. A densidade optica (OD) da suspenso resultante foi lida a um
comprimento de onde de 600 nm, em espectrofotmetro.
34
A suspenso obtida foi misturada ao meio agar nutriente de tal forma que 1 mL da
soluo com OD600 igual a 1 fosse adicionado a 100 mL de agar. Nessa parte do
procedimento, tomou-se o cuidado de controlar a temperatura do agar de tal forma que ela
no fosse muito alta para matar o microrganismo e ao mesmo tempo no to frio para no
solidificar o agar.
Aps a mistura, alquotas de 20 mL de agar foram despejadas em placas de Petri com
150 mm de dimetro, previamente esterilizadas.
Aps solidificao do meio, perfurou-se o nmero necessrio de poos de 5 mm de
dimetro, nos quais foram adicionados 20 L das solues preparadas de amostra ou de
padro de antibitico, adequadamente diludas.
As placas foram incubadas a 36-37C por 24 horas, medindo-se, ento, os dimetros
dos halos de inibio.
3.2.2.4 HIDRLISE ENZIMTICA DE PENG
Para a hidrlise, a amostra contendo penG foi diluda em tampo fosfato 100mM
pH 9,0 em proporo 1:1. Um milmetro dessa soluo foi adicionado a um microtubo de
capacidade de 1,5 mL o qual foi mantido fechado em um banho termostatizado a 37C em
repouso. A essa mistura, adicionou-se 50 L da soluo de PGA (5U), e a reao ocorreu
durante 20 minutos formando 6-APA. Para a determinao da concentrao de 6-APA em
soluo foi usado o mtodo PDAB Balasinghan et al (1972). Assim, ao fim da hidrlise,
uma alquota de 25 L foi transferida a uma cubeta de capacidade de 4mL contendo
2,5mL de p-dimetilaminobenzaldedo (PDAB). Aps 2,5 minutos, a amostra foi analisada
em espectrofotmetro (marca PHARMACIA BIOTECH modelo Ultrospec 2000) a 415nm
e a absorbncia foi determinada.
3.2.3 DETERMINAO DA SOLUBILIDADE DE PENG EM DIFERENTES SOLUES
A solubilidade da penG em diferentes solues foi determinada seguindo o mtodo de
Gude et al,1996. Os ensaios foram realizados a temperatura constante, 8oC em fracos de
100 mL. As amostras foram preparadas gravimetricamente, ou seja, eram adicionadas
massas conhecidas de penG at a percepo de formao de precipitado. Os frascos foram
lacrados e ento eram colocados em uma mesa incubadora rotativa (shaker), sob
agitao suave (100 rpm). Todas as amostras foram agitadas por pelo menos 4 horas e em
35
seguida as suspenses foram deixadas para sedimentar. Aps a sedimentao, amostras do

sobrenadante foram retiradas por meio de uma seringa acoplada a um filtro de 0,2m,
evitando a passagem de slidos. Aps essa etapa, as amostras foram analisadas por
cromatografia de alta eficincia (CLAE).
3.2.4 DETERMINAO DA ESTABILIDADE DE PENG FRENTE A PH E TEMPERATURA
Os experimentos de determinao da estabilidade foram realizados em batelada. No
foi utilizado tampo, ou seja, os valores de pH foram ajustados apenas no inicio de cada
experimento. Ajustou-se o pH (nos valores pr-determinados) de 100 mL de gua
destilada (a 4C e 12oC) e adicionou-se 0,3g de penG obtendo-se uma soluo 3 g.L-1 e
ajustou-se novamente o pH. Essa soluo foi colocada em agitao com temperatura
controlada. Coletaram-se amostras no decorrer do tempo e essas foram diludas em tampo
fosfato 100 mM pH 7,0 (1:1) para interromper a degradao e a concentrao residual de
penG foi determinada atravs de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE).Os testes
de estabilidade foram realizados em meio aquoso e em triplicata.
3.2.5
ENSAIOS DE ADSORO EM BATELADA
3.2.5.1 TRATAMENTO DOS ADSORVENTES

Inicialmente, as resinas XAD foram pr-tratadas com metanol, etanol e gua
destilada. Para cada grama de resina, foram adicionados 2 mL de metanol e a mistura foi
mantida sob agitao por 30 minutos. Em seguida, a resina foi separada por filtrao a
vcuo e o procedimento foi repetido duas vezes. A resina tratada com metanol foi lavada
com gua destilada e seca em estufa a 50C por 24 h. Em seguida, a resina passou por um
processo de hidratao utilizando etanol e gua. 100 mL de etanol foram mantidos em
contato com a resina at que no fosse observadas bolhas de ar no etanol, indicando que o
volume interno das partculas do adsorvente estava totalmente preenchido pelo solvente.
Em seguida, o etanol foi substitudo por gua destilada e a resina foi lavada
abundantemente com gua destilada em sistema de filtrao a vcuo.
3.2.5.2 EFICINCIA DE ADSORO DE PENG: SELEO DE RESINA
Para os estudos de eficincia de adsoro, utilizou-se 0,25g (em base seca) de
adsorvente pr-tratado (XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvo ativado) para 5 mL de caldo
de cultivo de concentrao de penG de 50 g.L-1, temperatura de 4oC, e pH de 6,0; 5,0 e
36
4,0. Determinou-se a concentrao de penG no sobrenadante depois de 45 minutos de

adsoro (amostrando-se com filtro de tamanho de corte de 0,45 m) sob agitao. A
eficincia de adsoro foi calculada por meio da relao percentual entre a concentrao
inicial e a final de penicilina na soluo, conforme mostrado na Equao 3.1.
% EA =
(C O C*)
100
CO
(3.1)
onde C* a quantidade de equilbrio em soluo do composto e Co a concentrao

inicial do mesmo. Assim, uma eficincia de adsoro de 50% expressa que 50% da
concentrao inicial do composto foi adsorvida pela resina.
3.2.5.3 DETERMINAO DO TEMPO DE EQUILBRIO - CINTICA DE ADSORO
Para cintica de adsoro, utilizou-se 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pr-tratada para
2mL de caldo de cultivo com 50 g.L-1 de penG, temperatura de 4 C e 12 oC, e valores de
pH de 4,0; 5,0 e 7,0. Retiraram-se amostras do sobrenadante nos tempos 0, 2, 4, 6, 10, 20,
30, 45 e 60 minutos. Quando a concentrao de penG em soluo era constante, o
equilbrio era alcanado. A concentrao de penG na amostra foi determinada por
hidrlise enzimtica.
3.2.5.4 ISOTERMAS DE EQUILBRIO
Para isoterma de adsoro, utilizou-se 0,1 g (em base seca) de adsorvente pr-tratado
para 2mL de caldo de cultivo com diferentes valores de concentrao de penG,
temperatura entre 4 e 12oC, e valores de pH entre 4,0 e 7,0. Determinou-se a concentrao
de penG no sobrenadante depois de atingido o equilbrio de adsoro. As concentraes de
equilbrio na resina, q*, foram determinadas pelo balano de massa, utilizando a Equao
3.2:
q* =
(C O C*) V L
w
(3.2)
sendo q* a concentrao adsorvida do composto no equilbrio por massa de resina, Co a

concentrao inicial, C* a concentrao em soluo do composto no equilbrio, VL o
volume de soluo e w a massa de resina utilizada.
37
Com os dados de q* e C*, possvel estabelecer qual modelo da literatura (Linear,

Langmuir e Freundlich Equaes 2.1, 2.2 e 2.7, respectivamente) representa a cintica
de adsoro na resina escolhida para extrao de penG.
3.2.5.5 ENSAIOS DE ADSORO DE PENICILINA G
Para promover uma mxima adsoro de penG, optou-se pela anlise de dois mtodos
de adsoro: o uso ou no de gradiente de pH durante o processo.
No caso da adsoro sem gradiente, o pH da soluo de penG em contato com a resina
foi vagarosamente ajustado at o valor de 4,0, a fim de evitar degradao pontual da penG.
Com o gradiente, a soluo de penG em pH 7,0 mantida em contato com a resina por 45
minutos, at atingir o equilbrio de adsoro. Em seguida o pH ajustado para 5,0,
novamente por 45 minutos. Esse procedimento foi repetido reduzindo-se o valor de pH at
completa adsoro de penG. Entretanto, para valores baixos de pH (3,0, 2,5 e 2,0), o
procedimento respeitou o tempo que o antibitico no degradava.
Esses experimentos de adsoro foram realizados a 4C com agitao mecnica
(agitador sem p) e o pH foi ajustado para os valores desejados utilizando titulador
automtico (marca METROHM modelo 718 STAT Titrino).
3.2.6 ENSAIOS DE DESSORO EM BATELADA
A resina contendo penG adsorvida foi filtrada para separao do sobrenadante e
colocada em contato com eluente a diferentes valores de pH, temperaturas e composio
de mistura gua/etanol conforme o planejamento fatorial. Amostras foram retiradas com
filtro para determinao da concentrao de penG. Esses experimentos de dessoro foram
realizados em mesa incubadora rotativa com agitao de 250 rpm.
38
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 ESTUDO DA QUANTIFICAO DE PENICILINA G EM MEIO DE CULTIVO
4.1.1
COMPARAO ENTRE MTODOS J UTILIZADOS
Vrias metodologias so conhecidas e utilizadas para a determinao de penG. Entre

elas
destacam-se:
cromatografia
lquida,
bioensaio,
titulao
iodomtrica
ou
mercuriomtrica e alguns mtodos espectrofotomtricos baseados na reao de penG com

hidroxilamina ou imidazole (Grime,1979; Zhu, 1997). Cada um destes mtodos apresenta
vantagens e desvantagens, e a aplicao desses mtodos depende fortemente do tipo de
meio que contm a molcula de interesse.
A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) uma das tcnicas mais utilizada
para determinao de penG. Apesar de apresentar vantagens como elevada
reprodutibilidade e preciso, a anlise de penG em meios complexos como o caldo de
cultivo pode gerar rpida perda de eficincia da coluna, devido ao contato de inmeras
molculas contaminantes com a fase estacionria.
Muitas vezes, a baixa sensibilidade (em 254nm) do experimento, associado ao baixo
nvel de concentrao de penG numa amostra de caldo, exige que um grande volume desta
seja injetado no sistema para atingir nveis detectveis do analito de interesse, aumentando
assim, o risco de perda de eficincia da coluna cromatogrfica devido ligaes
irreversveis que podem ocorrer entre os contaminantes e a fase estacionria.
Uma maneira de minimizar danos coluna realizar uma reao de derivatizao da
penG para aumentar a sensibilidade do mtodo e reduzir a quantidade de amostra injetada.
Entretanto, as reaes de derivatizao envolvem o uso de reagentes txicos e exigem
maior tempo de anlise.
Neste trabalho, um mtodo cromatogrfico sem derivatizao, descrito em detalhes no
item 3.2.2.1 foi utilizado como mtodo de referncia para confirmar a concentrao de
penG em algumas amostras, as quais foram anteriormente analisadas por mtodos
alternativos.
Um dos mtodos investigado e implementado, com vistas a minimizar danos ao
sistema de cromatografia foi o mtodo iodomtrico, descrito em detalhes no 3.2.2.2. Este
foi desenvolvido por Alicino, 1940, e h vrios anos utilizado para quantificar penicilina
em muitos produtos formulados, derivados e amostras de caldo de cultivo adequadamente
39
tratados (Alicino, 1961). Nesse mtodo, penG reage com iodo e o excesso deste
quantificado. Apesar de ser uma metodologia simples e de baixo custo, a anlise de penG,
com baixo grau de pureza, apresenta alguns obstculos. Por exemplo, muitos outras
substncias presentes no meio podem consumir o iodo, resultando assim na determinao
de uma concentrao aparente de penG. Alm disso, variaes na resposta podem ocorrer
em funo da temperatura, tempo, pH e concentrao de iodo (Grime, 1979).
O bioensaio, mtodo descrito em detalhes no item 3.2.2.3, um teste de determinao
da concentrao de penG ativa no meio. Neste mtodo, bactria sabidamente sensvel a
penicilina G cultivada em placa onde se perfuram poos para adio de amostras ou
solues padro de penG. O halo de inibio de crescimento proporcional
concentrao de penG, o menor halo corresponde a uma menor concentrao de penG.
Contudo, um mtodo pouco exato e o mais trabalhoso, embora seja tambm um teste que
garante no s haver penG no meio, mas tambm que ela est realmente desempenhando a
funo esperada.
Investigou-se inicialmente a eficincia do mtodo iodomtrico na quantificao de
penG em caldo de cultivo, preparando-se 50 mL de uma soluo padro de penG 50g.L-1
em tampo fosfato 100mM, pH 7,0. Alquotas dessa soluo foram analisadas pelo mtodo
cromatogrfico, iodomtrico e bioensaio.
Em seguida, 25 mL da soluo de penG 50g.L-1 foi submetida inativao a 37oC pela
adio de 25mg de penicilinase (enzima que hidrolisa o anel -lactmico). Alquotas desta
soluo foram retiradas aps 30 e 60 min de hidrlise e foram analisadas pelos trs
mtodos. As concentraes determinadas em cada mtodo so apresentadas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1.: Teste comparativo entre os mtodos para quantificar penicilinaG. Amostras: (1) soluo
de penG sem a hidrlise por penicilinase , (2) soluo de penG na mesma concentrao hidrolisada por
penicilinase por 30 min e (3) soluo de penG na mesma concentrao hidrolisada por penicilinase
por 60 min. Condies de diluio com tampo fosfato 100mM: 1:500 (bioensaio), 1:4 (iodometria) e
1:1 ( CLAE).
CLAE
M. Iodomtrico
Bioensaio
-1
-1
C (g.L )
C (g.L )
DHALO (cm)
49,14
63,08
5,50
PenG 50g/L
43,12
60,84
4,90
PenG 50g/L hidrlise-30 min
43,18
59,16
4,80
PenG 50g/L hidrlise-60 min
12,13
6,21
12,73
% Hidrolisada
Observou-se que o percentual de reduo na concentrao de penG ativa determinada

por CLAE semelhante a estimativa do percentual hidrolisada obtida no bioensaio.
Entretanto, este percentual menor quando se utiliza o mtodo iodomtrico. Estes
resultados indicam que no possvel diferenciar as formas ativas e degradadas de penG
40
pelo mtodo iodomtrico. Alm disso, o longo tempo de anlise dessa metodologia nos
incentivou a buscar novas estratgias para quantificar penG na forma intacta de maneira
simples e rpida.
4.1.2 DESENVOLVIMENTO DE MTODO ENZIMTICO PARA A QUANTIFICAO DE
PENG
A medida de atividade da enzima penicilina G acilase produzida durante o cultivo de
Bacillus megaterium, quantificando-se espectrofotometricamente o produto da hidrlise de
penicilina G catalisada pela enzima metodologia amplamente utilizada no grupo de
Engenharia de Processos Enzimticos do DEQ/UFSCar. Nesse mtodo, cido 6aminopenicilnico (6-APA) gerado na reao reage com dimetilaminobenzaldedo
(PDAB), gerando bases de Schiff coloridas. Baseando-se nessa metodologia, o mtodo
desenvolvido neste trabalho consiste na hidrlise completa da penG presente na amostra
catalisada por penicilina G acilase (PGA) livre (solvel), quantificando-se 6-APA
produzido com PDAB. Como mostrado na Figura 2.3, para cada mol de penG hidrolisada,
um mol de 6-APA liberado.
Esse mtodo foi tambm comparado com anlise CLAE. Os resultados obtidos,
mostrados na Tabela 4.2, indicam que as concentraes obtidas atravs do mtodo
enzimtico esto de acordo com os valores de concentrao obtidos para as mesmas
amostras analisadas por CLAE.
Tabela 4.2.: Estudo comparativo CLAE x Hidrlise enzimtica
CLAE
Hidrlise
Enzimtica
Conc. Terica
de penG ( g.L-1)
Conc. de penG
( g.L-1)
Conc de penG
( g.L-1)
50,00
49,65
48,85
25,00
23,56
26,11
12,50
13,21
12,27
6,25
6,21
6,34
A obteno da curva de calibrao utilizando como solvente o caldo de cultivo, o uso

de excesso de enzima no meio e sua especificidade, garantem a boa reprodutibilidade e
exatido nas medidas realizadas. Assim, a hidrlise enzimtica, associada quantificao
do 6-APA atravs de reao com PDAB (Balasinghan, 1972), foi utilizada neste trabalho
de maneira satisfatria, visto que penG em diferentes meios e em ampla faixa de
concentrao foi determinada com exatido e preciso.
41
Como pode ser observado na Figura 4.1, o ajuste linear apresenta correlao excelente,
demonstrando que a curva de calibrao pode ser aplicada dentro da faixa de concentrao
utilizada.
Figura 4.1.: Curva de calibrao de penicilina G utilizando a hidrlise de penG
4.2 INFLUNCIA DA COMPOSIO (TEMPO DE CULTIVO) DO MEIO DE

CULTIVO NA ANLISE CROMATOGRFICA DE PENICILINA G
As caractersticas do caldo de cultivo variam com o tempo de cultivo devido
liberao de vrios compostos orgnicos, os quais podem interferir na anlise da penG. A
anlise deste efeito importante para o estudo de adsoro de penG em diferentes
concentraes, visto que esta concentrao tambm est associada ao tempo de cultivo.
Assim, inicialmente, foram realizados experimentos para caracterizar caldos de
cultivos obtidos em diferentes tempos com o objetivo de monitorar o surgimento de
interferentes na anlise de penG. Esse efeito foi investigado adicionando-se quantidades
conhecidas de penG a caldos de cultivo obtidos em diferentes tempos e analisando-se por
cromatografia lquida de alta eficincia, as respostas obtidas (reas dos picos
correspondentes a concentraes conhecidas de penG) para as mesmas concentraes nos
diferentes meios de cultivos. Foram analisados caldos de cultivos obtidos em 24, 48 e 120
h (Figura 4.2). Os resultados mostram que no h variaes significativas dos coeficientes
angulares das curvas que correlacionam linearmente rea de pico em funo da
concentrao de penG, para os diferentes tempos de cultivo analisados.
42
3,0x10
2,5x10
24 h -> A= 2,18*Conc.PenG - 115851,84

48h -> A= 2,68*Conc.PenG - 275563,08
120h -> A= 2,22* Conc.PenG -212754,37
rea
2,0x10
1,5x10
1,0x10
5,0x10
0,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
-1
Conc. PenG (g.L )

Figura 4.2.:Curvas de calibrao para quantificar penG presente em caldo de cultivo obtido com
diferentes tempos. Anlise em HPLC, coluna C-18, BondPack, 3,9x 300mm e fase mvel 20%
acetonitrila, 80% tampo fosfato 10mM, pH 6,5, tiossulfato de sdio 10mM em uma vazo de
1 mL.min-1.
Os resultados apresentados na Figura 4.2 indicam que uma nica curva de calibrao
pode ser utilizada para analisar caldos de cultivos obtidos em diferentes tempos, pois os
compostos orgnicos liberados no interferem significativamente na quantificao de
penG.
O objetivo principal neste trabalho investigar a eficincia de adsoro de penG em
diferentes resinas hidrofbicas. A partir dos resultados obtidos anteriormente observa-se
que as condies de anlise j esto bem estabelecidas. Entretanto, ainda se faz necessrio
definir os intervalos de pH e temperatura em que a molcula de interesse (penG) estvel.
Em seguida, dentro deste intervalo, estabelecer qual a melhor resina, a melhor temperatura
e o melhor pH para adsoro de penG .
Portanto, a prxima etapa deste trabalho foi estudar a estabilidade de penG em
diferentes temperaturas e pH.
43
4.3 TESTES DE ESTABILIDADE DA PENICILINA G EM MEIO AQUOSO

A degradao da penG em uma soluo aquosa devido dissociao do grupo
carboxil que transforma penicilina ativa em produtos inativos, tais como o cido peniclico
(Hersbach et al, 1984).
As temperaturas tpicas usadas industrialmente na estocagem da penG, enquanto
aguarda separao do microorganismo, e na extrao com solvente esto em torno de 12oC
e 4oC, respectivamente. Assim, os ensaios de adsoro e estabilidade da penG foram
realizados nessas duas temperaturas (Kheirolomoom et al, 1999).
Quanto mais cido o pH, menos ionizada estar a penG e, portanto, maior dever ser a
sua afinidade pela resina hidrofbica, conforme observou Vieira et al (2003) para
ampicilina. por essa razo que, tambm na indstria, a extrao lquido-lquido com
solvente hidrofbico feita no valor de pH entre 2-2,5. Torna-se importante, ento,
estudar a estabilidade de penG a valores de pH cidos e assim foram realizados testes de
estabilidade a pH variando de 2,0 a 7,0.
Os grficos apresentados na Figura 4.3 mostram os resultados dos experimentos de
estabilidade de penG em diferentes valores de pH a 4oC. A linha azul indica o tempo
mximo em que no se observa perda, por degradao, da penG.
44
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
1,0
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
0,9
0,8
0,7
0,9
0,8
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10
15
20
25
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
1,0
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
35
40
45
50
55
60
65
45
50
55
60
65
45
50
55
60
65
(b)
(a)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,5
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10
15
20
Tempo (min)
25
30
35
40
Tempo (min)
(c)
(d)
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
1,0
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
30
Tempo (min)
Tempo (min)
0,9
0,8
0,7
0,9
0,8
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10
15
20
25
30
35
40
Tempo (min)
Tempo (min)
(f)
(e)
o
Figura 4.3.: Grfico da estabilidade de PenG a 4 C em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0,
(d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.
Os resultados obtidos mostram que penG no se degrada entre valores de pH de 4,0 a

7,0 durante os 60 minutos de ensaio. Para pH 2,0, observou-se rpida degradao de penG
e uma degradao mais lenta em pH 3,0. Entretanto, como economicamente mais
interessante trabalhar com temperaturas mais altas, realizou-se o estudo da estabilidade em
45
diferentes valores de pH a 12oC. Os grficos apresentados na Figura 4.4 mostram esses
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
1,0
0,9
0,9
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
resultados.
0,8
0,7
0,6
0,8
0,7
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10
15
20
25
Tempo (min)
30
35
40
45
50
55
60
65
Tempo (min)
(a)
(b)
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,4
0,3
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0,3
65
Tempo (min)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tempo (min)
(d)
(c)
1,2
1,2
1,1
1,1
1,0
0,9
Conc. Normalizada
Conc. Normalizada
1,0
0,8
0,7
0,6
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
10
Tempo (min)
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tempo (min)
(e)
(f)
o
Figura 4.4.: Grfico da estabilidade de PenG a 12 C em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0,
(d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.
Durante o isolamento da penG, 10-15% do produto so perdidos e manter a

integridade
da
molcula
importante
para
reduo
de
tais
perdas
(Kheirolomoom et al, 1999). Portanto, neste trabalho foram determinados os intervalos de

tempo em que no ocorre degradao de penG em valores de pH especficos.
46
Os tempos que a penG pode permanecer em soluo com diferentes valores de pH a

4C e 12C sem que se observe degradao, esto apresentados na Tabela 4.3.
Tabela 4.3.: Dados de estabilidade de PenG frente a pH
pH
T(C)
4
12
2,5
2 min
2 min
15 min
2 min
30 min
4 min
1h
1h
1h
1h
1h
1h
Aps estimar a estabilidade de penG em diferentes valores de pH, seguiu-se a etapa de

adsoro em diferentes resinas XAD e carvo ativado.
4.4 EFICINCIA DE DIFERENTES ADSORVENTES

PENICILINA G EM DIFERENTES VALORES DE PH
NA
SEPARAO
DE
Dutta et al (1999) estudaram a adsoro de antibiticos -lactmicos em carvo

ativado e resinas polimricas. Observaram que h grande dependncia entre o pH e a
quantidade adsorvida. Segundo eles, o fenmeno de adsoro foi determinado por
interaes hidrofbicas entre o antibitico e o adsorvente. No entanto, esses estudos foram
realizados em meio aquoso.
Atualmente, na indstria, o processo de purificao de penG pode envolver uma etapa
utilizando carvo ativado para a remoo de impurezas presentes no caldo de cultivo.
Uma vez que essa etapa realizada na indstria acreditava-se que ela no deveria implicar
grandes perdas de penG. Foram realizados experimentos preparando-se solues 50 g.L-1
de penG utilizando como solvente gua ou caldo de cultivo para avaliar o efeito das
impurezas na eficincia de adsoro de penG em carvo ativado.
As condies utilizadas neste experimento foram pH 6,0, temperatura de 4C,
concentrao de penG de 50 g.L-1, 1 hora de adsoro e 0,1g do carvo ativado
(previamente tratado) em 5 mL de caldo de cultivo. Em pH 6,0 penG est praticamente
toda ionizada (99,9%) e no dever ter grande afinidade pelo carvo ativado.
A Figura 4.5 apresenta os resultados de adsoro em carvo ativado.
(a)
47
(b)
Figura 4.5.: Esquema da Adsoro em Carvo Ativado e grfico da quantidade de penG adsorvida,
em meio aquoso (a) e em caldo (b)
Observou-se que, para uma mesma massa de penG adicionada gua ou caldo de
cultivo, uma quantidade bem maior de penG dissolvida em gua (aproximadamente 62%)
adsorvida em carvo ativado, enquanto somente 14 % de penG presente em caldo de
cultivo adsorvida. Assim, mesmo com a competio dos demais componentes do caldo
de cultivo pelo adsorvente e a presena de um grupo cido ionizado na penG, ainda se
observa uma razovel adsoro do antibitico. Considerando-se esses resultados, decidiuse no incluir a adsoro em carvo ativado para a retirada de impurezas do caldo, mas, o
carvo ativado ser utilizado como um adsorvente na continuidade do estudo.
Passou-se a seguir a testes de adsoro em diferentes resinas XAD e carvo ativado,
visando selecionar qual tinha maior eficincia de adsoro de penG. A Figura 4.6 mostra
os resultados obtidos no teste de adsoro de penG em diferentes adsorventes em pH 6,0 e
temperatura de 4C.
Figura 4.6.: Grfico da adsoro de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvo ativado, a 4C,
pH 6,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pr-tratado para 5 mL de caldo de cultivo
-1
contendo 50 g.L de penG.
48
Esse teste mostrou que a maior eficincia de adsoro, aproximadamente 36% de

penG presente no caldo, foi obtida com XAD-4.
Visando confirmar os resultados iniciais, que apontam XAD-4 como melhor resina,
foram determinadas as eficincias de adsoro de penG a pH 4,0 e 5,0, utilizando as
mesmas condies do experimento anterior. As Figuras 4.7 e 4.8 mostram os resultados
obtidos no teste de adsoro de penG em diferentes adsorventes, temperatura de 4C, pH
4,0 e pH 5,0 , respectivamente.
-1
-1
49
Conforme pode ser observado na Figura 4.9, no houve alterao significativa na

eficincia de adsoro em qualquer resina utilizada com o pH. Essa alterao foi em torno
de 8% ao longo da faixa de pH estudada utilizando a resina XAD-4, enquanto que a
alterao foi em torno de 7%, 6% e 6% utilizando XAD-7, XAD-761 e carvo ativado,
respectivamente.
Figura 4.9.: Efeito do pH sobre a eficincia de adsoro
Ainda, penG no mostrou alterao no padro de adsoro para as diferentes resinas

nos trs valores de pH testados. Observou-se que nos trs valores de pH estudados, a
porcentagem de penG adsorvida maior na XAD-4 seguida da XAD-7, carvo ativado e
XAD-761. Esses resultados indicam, pois Amberlite XAD-4 como melhor adsorvente, a
qual foi, portanto selecionada para uso em todo restante do trabalho.
Dutta et al (1999) afirmam que o carvo ativado o melhor adsorvente de alguns
antibiticos lactmicos (como cefalexina, cefadroxil e 6-APA). No entanto, os estudos
foram realizados em meio aquoso. Como mostrado anteriormente, penG altamente
adsorvida em carvo ativado quando em meio aquoso, como mostrado na Figura 4.5.
Entretanto, isso no foi observado na adsoro de penG em caldo de cultivo, devido
competio entre impurezas e penG.
Aps estimar o melhor adsorvente a ser utilizado no trabalho, procurou-se estudar a
cintica de adsoro, visando tambm estabelecer o tempo de contato necessrio para
garantir que o equilbrio fosse alcanado.
50
4.5 DETERMINAO
ADSORO
TEMPO
DO
DE
EQUILBRIO - CINTICA
DE
O tempo necessrio para se atingir o equilbrio depende da velocidade de adsoro,

portanto da afinidade entre a matriz e a penG, e da temperatura de adsoro. O fenmeno
est ilustrado na Figuras 4.10 (a) e (b), que apresentam os resultados a 4oC e 12oC,
respectivamente.
(a)
(b)
o
Figura 4.10.: Cintica de Adsoro (a) 4 C e (b) 12 C, utilizando-se 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pr-1
tratada para 2 mL de caldo de cultivo de concentrao de penG de 50 g.L em valores de pH 4,0; 5,0
e 7,0.
O pH e temperatura so variveis importantes no estudo de adsoro. Sabe-se que em

valores de pH mais cidos, a penG encontra-se mais em sua forma neutra e assim facilita
sua adsoro na resina. Isso pode ser comprovado nos ensaios de cintica, que mostrou
uma menor concentrao de penG em pH 4,0 quando atingido o equilbrio.
Sabe-se que a adsoro exotrmica e o equilbrio assim dever ser favorecido a
baixas temperaturas. Como se pode observar nos grficos da Figura 4.10, nas duas
temperaturas estudadas no observou diferenas no tempo de equilbrio. Em 4oC, a
adsoro foi levemente mais lenta ao comparada os resultados em 12oC.
A comparao entre os tempos de contato obtidos em ambas as temperaturas mostra
que o estado de equilbrio foi atingido com 45 minutos. Optou-se assim pela continuidade
do estudo com tempo de contato de 45 minutos.
4.6 ISOTERMAS DE ADSORO

A determinao da isoterma de equilbrio importante para se determinar a
capacidade mxima de adsoro da resina, bem como o valor da sua afinidade. A faixa de
51
concentrao no estudo em questo foi estabelecida considerando-se dados de produo

industrial, que relatam se atingir valores de at 50 g.L-1 de penG no caldo de cultivo.
Usou-se assim a faixa entre 5 e 50 g.L-1. Como o perfil cintico dos ensaios para a
determinao do modelo cintico foram semelhantes nos diferentes valores de pH, optouse por determinar as isotermas de adsoro nas duas temperaturas (4 e 12oC) em apenas
dois valores de pH (4,0 e 7,0).
Os resultados experimentais utilizados na determinao da isoterma de equilbrio para
a penG utilizando resina XAD-4 so apresentados na Tabela 4.4.
Tabela 4.4.: Resultados experimentais obtidos na determinao da isoterma de equilbrio para penG
utilizando XAD-4, em pH 4 e 7 e temperatura 4oC e 12oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4
pr-tratado para 2mL de caldo de cultivo.
4 oC
pH 7,0
pH 4,0
q* (mg
q* (mg
Co
C*
C*
penG/ g
penG/ g
(mg/mL) (mg/mL)
(mg/mL)
resina)
resina)
50
33,03
339,40
32,73
345,48
40
24,97
300,60
23,82
323,56
30
16,89
262,20
16,48
270,43
25
14,48
210,43
14,24
215,21
20
9,82
203,60
10,67
186,54
15
8,48
130,43
8,42
131,64
10
4,77
104,60
4,77
104,68
5
2,82
43,56
2,41
51,86
0
0,00
0,00
0,00
0,00
12oC
pH 7,0
pH 4,0
q* (mg
q* (mg
C*
C*
penG/ g
penG/ g
(mg/mL)
(mg/mL)
resina)
resina)
33,27
334,52
32,18
356,44
24,23
315,34
22,32
353,70
16,01
279,73
14,10
318,08
13,28
234,38
12,39
252,19
10,47
190,55
8,01
239,86
6,43
171,37
6,23
175,48
3,83
123,42
2,87
142,60
1,50
70,00
1,36
72,74
0,00
0,00
0,00
0,00
A Figura 4.11 apresenta os resultados obtidos da isoterma de adsoro de penG em

XAD-4 atravs da tcnica descrita anteriormente.
52
400
350
q* ( mg PG / g XAD-4)
300
o
250
T=12 C e pH 4,0
200
T=4 C e pH 4,0
T=12 C e pH 7,0
150
T= 4 C e pH 7,0
100
50
0
0
10
15
20
25
30
35
40
C* ( mg / mL )
Figura 4.11.: Isotermas de Adsoro- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 prtratado para 2mL de caldo de cultivo.
Analisando-se os coeficientes aparentes de correlao apresentados na Tabela 4.5,

pode-se observar que o modelo de Langmuir apresenta um ajuste significativamente
melhor aos pontos experimentais. Assim, pode-se determinar a mxima capacidade e a
constante de adsoro de penG em XAD-4 nas diferentes combinaes de valores de pH e
temperatura.
Tabela 4.5.: Parmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir, Freundlich e Linear para a
penG e seus coeficientes de correlao.
Langmuir
pH T(oC)
qm
(mg/g)
KL
(mg / mL)
Freundlich
R2
KF
(mL/ mg resina)
Linear
R2
KP
(mg / mL)
R2
595,0651,54 21,673,64 0,9942 0,6150,075
43,4210,15
0,968 10,811,41 0,960
534,6856,36 18,554,06 0,9885 0,5930,089
44,7912,42
0,950 10,141,51 0,940
12
439,8414,82
6,170,66
0,9958 0,4010,067
97,3919,29
0,935 10,482,45 0,886
12
431,7211,34
9,190,67
0,9981 0,4580,046
71,4110,13
0,980
9,451,65
0,930
Os resultados apresentados nas Tabelas 4.4 e 4.5 indicam que a adsoro mais
eficiente quando realizada a pH 4,0 e 4oC. Era esperado que a pH 4,0, a eficincia de
adsoro apresentasse resultados significativamente melhores que a pH 7,0, visto que
53
medida que diminui o pH aumenta a concentrao da forma neutra , que dever ter maior
afinidade pela resina. Entretanto, observa-se que a diferena entre os valores de
concentraes de penG na forma neutra (valores calculados na Tabela 4.6) a pH 4,0 e pH
7,0, muito baixa, o que explica a pouca variao observada na eficincia de adsoro.
Um efeito significativo do pH na adsoro de penG em resina hidrofbica s seria
observado para valores de pH em torno de 2,74. Alm disso, a adsoro de penG contida
em uma matriz complexa (caldo de cultivo) deve considerar o efeito do pH no somente
sobre a penG, mas tambm sobre todas as molculas existentes neste meio, as quais
tambm competiro pelos stios de adsoro.
Por outro lado, acredita-se que a forma ionizada da penG pode interagir com XAD-4
atravs de sua cadeia lateral hidrofbica, ao contrrio do que se observa na extrao
utilizando solvente hidrofbico, onde somente a forma neutra extrada.
Tabela 4.6.: Porcentagem de penG na sua forma neutra e inica em diferentes valores de pH.
pH
Forma Neutra
(HA)
Forma Inica
(A-)
pH
Forma Neutra
(HA)
Forma
Inica (A-)
1
2
2,74
3
3,2
3,5
4
5
98,21%
84,60%
50,00%
35,46%
25,75%
14,81%
5,21%
0,55%
1,79%
15,40%
50,00%
64,54%
74,25%
85,19%
94,79%
99,45%
6
7
8
9
10
11
12
13
0,05%
0,01%
~0,0%
~0,0%
~0,0%
~0,0%
~0,0%
~0,0%
99,95%
99,99%
~100,00%
~100,00%
~100,00%
~100,00%
~100,00%
~100,00%
Analisando os valores da capacidade mxima na mesma temperatura, os resultados

apresentados nas Tabelas 4.4 e 4.5 indicam que a adsoro mais eficiente quando
realizada a temperaturas menores.
Alm da complexidade do meio, tambm devem ser considerados os erros associados
ao ajuste do modelo de Langmuir, devido principalmente, correlao dos parmetros
dificultar a percepo do efeito do pH e da temperatura na adsoro de penG, j que os
valores de KL e qmax podem variar de uma forma que se compensem. Foi possvel,
entretanto, determinar as condies experimentais mais adequadas adsoro, dando
suporte s etapas seguintes deste estudo.
Para efeito comparativo, foi importante estudar a isoterma de equilbrio de penG em
gua deionizada para se determinar a real capacidade mxima de adsoro de penG pela
resina, sem a competio com as impurezas do caldo. A faixa de concentrao no estudo
54
em questo foi igual ao do estudo com caldo de cultivo. Por apresentar melhores
condies de adsoro, optou-se por determinar a isoterma de adsoro em 4oC e pH 4,0.
Os resultados experimentais utilizados na determinao da isoterma de equilbrio para
a penG utilizando resina XAD-4 so apresentados na Tabela 4.7.
Tabela 4.7.: Resultados experimentais obtidos na determinao da isoterma de equilbrio para penG
utilizando XAD-4, em pH 4 e temperatura 4oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pr-tratado
para 2mL de gua deionizada.
Co (mg/mL)
50
40
30
20
10
0
4 oC
pH 4,0
q* (mg penG/
C* (mg/mL)
g resina)
27,81
472,40
19,23
469,48
10,04
378,50
6,66
295,80
2,99
136,00
0,00
0,00
A Figura 4.12 apresenta os resultados obtidos da isoterma de adsoro de penG em

XAD-4 atravs da tcnica descrita anteriormente.
500
q* ( mg PG / g XAD-4)
400
300
200
100
0
0
10
15
20
25
30
C* ( mg / mL )
Figura 4.12.: Isotermas de Adsoro- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 prtratado para 2mL de gua deionizada.
A Tabela 4.8 apresenta a mxima capacidade e a constante de adsoro de penG em

XAD-4 em 4oC e pH 4,0 utilizando gua deionizada.
55
Tabela 4.8.: Parmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir para a penG e seus
coeficientes de correlao.
Langmuir
qm
(mg/g)
KL
(mg / mL)
R2
644,2156,58
8,201,91
0,9841
pH T(oC)
4
Os resultados apresentados nas Tabelas 4.5 e 4.8 indicam que XAD-4, a 4C e pH4,
tem capacidade de adsoro de penG dissolvida em gua similar apresentada quando
penG estava dissolvida no meio de cultivo, o que indica que a resina tem alta seletividade
por penG.
Conhecendo a estabilidade da penG em diferentes valores de pH e temperatura, as
propriedades fsico-qumica da resina escolhida e a interao entre penG e resina pode-se
iniciar o estudo de adsoro da penG em Amberlite XAD-4.
4.7 ESTRATGIAS DE ADSORO DE PENICILINA G

4.7.1 DESENVOLVIMENTO
GRADIENTE DE PH
DO
PROCESSO
DE
ADSORO
DE PENICILINA
COM
Em valores de pH mais cidos, penG pouco solvel e apresenta baixa estabilidade.

Entretanto, essa condio importante para promover melhor adsoro desse antibitico
em resinas hidrofbicas. Foi impossvel se determinar isotermas de adsoro a valores de
pH menores que 4, pois para valores altos de concentrao, em pH menor que 4,0, o
antibitico tem forte tendncia a formar polmeros. Visando estudar a adsoro em valores
de pH baixos, minimizando perdas de penG por degradao, optou-se pelo uso de
gradiente de pH durante a adsoro.
O processo iniciou-se em pH 7,0 e conservou-se nesse pH durante 45 minutos. A
seguir, o pH foi ajustado para 5,0, no qual permaneceu por mais 45 minutos, depois para
4,0, mantido por mais 45 minutos. Em seguida, o pH foi ajustado para 3,0 e permaneceu
por 30 minutos, quando foi novamente ajustado para pH 2,5 por 15 minutos. Retiraram-se
amostras ao final de cada tempo, antes da mudana de pH. Com essa estratgia, ao se
diminuir o pH, a concentrao de penG no meio j estaria menor, pois parte dela j estaria
adsorvida, o que possibilitaria a adsoro em pH mais cido.
A adsoro em sistema de gradiente de pH foi realizada mantendo uma soluo sob
agitao mecnica em banho a uma temperatura de 4oC.
Para aumentar a eficincia na adsoro, optou-se em aumentar a quantidade de resina
durante o gradiente de adsoro, simulando uma operao em coluna com ajuste de pH
56
entre estgios. Nesse teste, a adsoro iniciou-se com 0,5 g de XAD-4 e a cada mudana
de pH adicionou-se mais 0,5 g, totalizando 2 g de resina em 40 mL de uma soluo
50 g.L-1. Alquotas do sobrenadante foram retiradas e a concentrao de penG foi
monitorada ao longo do tempo em todos os valores de pH. Os resultados obtidos nesse
ensaio esto apresentados na Figura 4.13.
50
16,23%
45
-1
Concentrao ( g.L )
40
35
38,87%
30
25
20
69,43%
15
pH 7,0
pH 5,0
pH 4,0
pH 3,5
10
5
85,28%
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Tempo (min)
Figura 4.13.: Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,5 a 7,0 utilizando 2 g de
XAD-4 adicionados gradativamente em 40mL de caldo com 50g.L-1 de penG
Considerando que em processo de separao de penG por extrao com solvente,

ocorrem perdas entre 10 15% (Kheirolomoom et al, 1999), podemos considerar o
processo de adsoro adequado para a recuperao de penG. Contudo, devido s perdas
que podem ocorrer durante a dessoro, decidiu-se fazer um novo experimento usando
uma reduo ainda maior do pH, visando atingir adsoro mxima.
Para aumentar a recuperao de penG a partir do caldo de cultivo, o mesmo processo
anterior foi realizado seguido da diminuio do pH de 3,5 para 3,2 sem adio de nova
quantidade de resina. Os resultados obtidos esto apresentados na Figura 4.14.
57
50
25,16%
30,32%
-1
Concentrao ( g.L )
40
30
57,74%
20
pH 7,0
pH 5,0
pH 4,0
pH 3,5
pH 3,2
10
66,45%
99,03%
0
50
100
150
200
Tempo (min)
Figura 4.14.: Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,2 a 7,0 utilizando 2 g de
XAD-4 adicionado gradativamente em 40 mL de caldo com 50 g.L-1 de penG
Analisando-se os resultados obtidos no segundo experimento de adsoro com

gradiente, quando se reduziu o pH de 7,0 para 4,0, conseguiu-se adsorver
0,77g penG/g resina, ou seja, um valor maior que capacidade mxima de adsoro da
resina XAD-4 (q*= 0,59g penG/ g resina, a pH 4,0 e 4oC). Considerando-se ainda o tempo
de adsoro, nesse mesmo intervalo de pH, tem-se uma produtividade de
0,31g penG/g resina/hora.
Reduzindo-se o pH para 3,5 a capacidade de adsoro da resina e a produtividade
tambm se reduziram para 0,66 g penG/g resina e 0,22 g penG/g resina/hora. A reduo do
pH para 3,2, levou a um aumento da capacidade total de adsoro para
0,99 g penG/g resina e da produtividade para 0,28 g penG/ g resina/hora.
A diminuio da capacidade total e produtividade que se observou quando se reduziu
o pH de 4,0 para 3,5 pode ser explicada pela menor concentrao de penG na soluo no
incio de cada etapa. Contudo, o grande aumento na eficincia de adsoro que se
observou quando se reduziu o pH de 3,5 para 3,2 pode ser explicado pela maior
quantidade da forma neutra nessa faixa de operao e tambm pela degradao de 25% de
penG nas condies do ensaio (concentrao de penG no final da etapa de pH 3,5 a pH 3,2
durante 30 minutos).
58
Em novo experimento, 18 mL de uma soluo 50 g.L-1 de penG inicialmente em pH

7,0, teve seu pH vagarosamente ajustado at o valor de 4,0. Atingido pH 4,0, adicionou-se
1,5 g de XAD-4. Iniciou-se, ento, a adsoro e o monitoramento da concentrao de
penG at que atingisse o equilbrio de adsoro. Aps 60 minutos, ajustou-se o pH para
3,5 permanecendo por mais 30 minutos. Os resultados obtidos nesse ensaio esto
apresentados na Figura 4.15.
pH 4,0
50
pH 3,5
-1
Conc. PenG (g.L )
40
30
20
10
91,34%
94,64%
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tempo ( min )
Figura 4.15.:Resultados da adsoro de penG a 4C na faixa de pH de 3,5 a 4,0 utilizando 1,5g de

XAD-4 adicionado em 18mL de caldo com 50g.L-1 de penG
Como se pode observar no grfico de Figura 4.15, aps 1h de experimento a pH 4,0,

aproximadamente 91% da penG presente havia sido adsorvida na resina XAD-4, ou seja,
0,55g penG/g resina (0,55g penG/g resina/hora). Entretanto, 0,77g penG/g resina foi
adsorvida usando-se gradiente, com produtividade de 0,31 g penG/g resina/hora. Houve,
assim, aumento da eficincia de adsoro, mas diminuio da produtividade. Nova
tentativa de reduo do pH para 3,5 elevou a capacidade de adsoro para 0,58g penG/g
resina, com reduo da produtividade para 0,38 g penG/g resina/hora. O uso de gradiente
parece realmente melhorar o desempenho da adsoro, alm de proteger a penG da
degradao qumica. Contudo, trabalhando-se com alta concentrao de penG, em baixo
59
valor de pH (sem gradiente), a velocidade de adsoro muito maior, sendo o ideal

trabalhar diretamente com baixo pH.
A tentativa de adsoro com o pH ajustado diretamente para 3,5 resultou em
degradao visvel a olho nu da penG, confirmando a ocorrncia de polimerizao e
degradao do antibitico em valores de pH inferiores a 4,0, quando concentraes mais
elevadas da forma neutra esto presentes.
O estudo efetuado mostrou que se for aumentada a quantidade de resina, pode-se
atingir altas eficincias a pH 4,0 em 45 minutos ou a pH mais baixos em menores tempos.
A pH 4,0, o antibitico permanece estvel mesmo a altas concentraes. Essa operao
mais simples, pois requer apenas uma etapa de reduo do pH do caldo de cultivo antes do
contato com a resina. Se a adsoro na indstria for realizada em batelada, conforme
estudado aqui, recomenda-se, pois, operao a pH 4,0. Passamos assim, a seguir, para a
prxima etapa prevista: estudo da dessoro de penG.
4.8 DESSORO DE PENICILINA G

Experimentos preliminares mostraram que o contato com fase aquosa a pH 7,0 no era
suficiente para dessorver penG, sendo necessrio assim uso de co-solvente para aumentar
a hidrofobicidade da fase eluente. Optou-se por usar etanol como co-solvente, devido ser
um composto biocompatvel, alm da sua grande aceitao do ponto de vista ambiental e
ampla disponibilidade no Brasil. Na etapa de dessoro, foi elaborado um procedimento
experimental levando em considerao todas as variveis independentes que poderiam
influenciar no processo, como: temperatura do eluente, valores de pH do eluente e
composio da mistura gua/etanol.
Esse procedimento experimental foi realizado em duas etapas: um delineamento
composto central rotacional (DCCR) para a anlise dos efeitos principais das variveis
sobre as respostas e seqencialmente, outro planejamento fatorial completo reduzindo o
nmero de variveis e alterando as faixas de estudo em funo do impacto que elas
tiveram sobre as respostas.
Nos ensaios de dessoro, misturou-se 0,1g de XAD-4, contendo penG adsorvida com
2 mL de mistura gua/etanol durante 1 hora. A porcentagem de penG dessorvida no
eluente era medida utilizando-se hidrlise enzimtica com PGA e quantificando-se o
6-APA liberado pela reao com PDAB. A base de Schiff formada era quantificada
espectofotometricamente, conforme descrito em Material e Mtodos.
60
Assim, foi realizado um planejamento fatorial completo 23, incluindo os seis pontos
axiais e quatro repeties no ponto central, totalizando 18 ensaios. A Tabela 4.9 apresenta
os valores utilizados no planejamento e a Tabela 4.10, apresenta a porcentagem de penG
dessorvida em cada ensaio.
Tabela 4.9.: Valores utilizados do 1o DCCR para trs fatores
Variveis
T (oC)
pH
[EtOH]%
-1,68
4,0
4,0
0,0
-1
5,6
4,6
20,0
0
8,0
5,5
50,0
1
10,4
6,4
80,0
1,68
12,0
7,0
100,0
Tabela 4.10.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 1o delineamento
Ensaios T (oC)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
pH
-1
-1
+1
-1
-1
+1
+1
+1
-1
-1
+1
-1
-1
+1
+1
+1
-1,68
0
+1,68
0
0
-1,68
0
+1,68
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
[EtOH]
-1
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
0
0
0
0
-1,68
+1,68
0
0
0
0
%
Dessorvida
29,62
34,02
32,90
31,09
64,09
62,85
74,39
75,34
66,07
68,97
65,60
63,47
31,45
79,58
70,36
73,15
70,53
72,36
Conforme as condies utilizadas, a porcentagem de penG dessorvida variou de 29,62

a 79,58%. Os pontos centrais apresentam uma pequena variao, indicando uma boa
reprodutibilidade do processo.
Atravs dos resultados obtidos foi possvel determinar os coeficientes de regresso que
esto apresentados na Tabela 4.11.
61
Tabela 4.11.: Coeficientes de regresso para a resposta no 1o delineamento

Coeficientes
Erro
de Regresso Padro
72,15
0,53
-3,92
1,43
-4,97
16,84
-8,16
-0,50
-0,36
2,81
Mdia
T(L)
T(Q)
pH(L)
pH(Q)
[EtOH] (L)
[EtOH] (Q)
T x pH
T x [EtOH]
pH x [EtOH]
4,09
2,21
2,30
2,21
2,30
2,21
2,30
2,89
2,89
2,89
t(8)
p-valor
17,66
0,24
-1,70
0,65
-2,16
7,60
-3,55
-0,17
-0,12
0,97
<0,0001
0,8184
0,1270
0,5360
0,0626
0,0001
0,0075
0,8664
0,9041
0,3607
Lim. Conf. - Lim. Conf.

95%
+95%
62,73
-4,58
-9,22
-3,67
-10,28
11,73
-13,47
-7,18
-7,03
-3,87
7,604086
(3)[EtOH](L)
-3,5473
[EtOH](Q)
-2,16145
pH(Q)
-1,70282
T(Q)
2Lby3L
(2)pH(L)
(1)T(L)
81,58
5,63
1,39
6,54
0,33
21,95
-2,86
6,17
6,31
9,48
,9693961
,6466482
,2373028
1Lby2L
-,173662
1Lby3L
-,124414
p=,1
Efeitos Estimados (valores absolutos)
Figura 4.16.:Diagrama de Pareto para o 1o delineamento
Como pode ser observado na Tabela 4.11, somente os parmetros, linear e quadrtico,
da varivel concentrao de etanol e o parmetro quadrtico da varivel pH do modelo
foram significativos (p-valor < 0,1), como confirmado pelo Diagrama de Pareto
(Figura 4.16).
Pode-se, ento, elaborar um modelo com as variveis codificadas:
%DESSORVIDA = 72,15 - 4,97 pH2 + 16,84 [EtOH] - 8,16 [EtOH]2
Analisando-se a Tabela 4.12, verificamos que o F calculado foi significativo
(p-valor < 0,01) e a porcentagem de variao explicada, de 90,31%.
62
Tabela 4.12.: ANOVA para a resposta no 1o delineamento

Soma de
Grau de Quadrado
F
Quadrados Liberdade
Mdio
calculado
4991,44
535,85
5527,29
REGRESSO
RESDUOS
TOTAL
% variao explicada (R) =
9
8
17
554,60
66,98
90,31
p-valor
8,28
0,0037
3,39
(tabelado)
F 9;8;0,05 =
Esses resultados indicam uma relativa concordncia entre os valores experimentais e

previstos pelo modelo, expressos na Figura 4.17. Pela Figura 4.18 podemos observar que
os erros de ajustamento esto independentes e normalmente distribudos em torno da reta.
90
80
Valores Previstos
70
60
50
40
30
20
10
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
Valores Experimentais
Figura 4.17.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta no 1o
delineamento
3,0
2,5
,99
2,0
,95
Valores Normais Esperados
1,5
1,0
,75
0,5
,55
0,0
,35
-0,5
-1,0
,15
-1,5
,05
-2,0
,01
-2,5
-3,0
-12
-10
-8
-6
-4
-2
10
12
14
Resduos
Figura 4.18.: Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a resposta no 1o
delineamento
63
O delineamento composto central rotacional (DCCR) utilizado neste processo foi

muito interessante para avaliar os fatores que afetam a dessoro da penG. Os modelos
foram significativos, sendo possvel construir as superfcies de resposta (Figura 4.19) e
definir as regies de interesse.
6,8
6,4
pH
5,9
5,5
5,1
4,6
4,0
4,0
5,6
6,8
8,0
9,2
10,4
11,6
T ( C)
(a)
60
50
(b)
94,6
[EtOH] (%)
79,8
64,9
50,0
35,1
20,2
0
4,0
5,6
6,8
8,0
9,2
10,4
11,6
T (oC)
(c)
70
60
50
40
30
20
10
(d)
94,6
[EtOH] (%)
79,8
64,9
50,0
35,1
20,2
0
4,0
4,6
5,1
5,5
5,9
6,4
6,8
pH
(e)
(f)
Figura 4.19.: Superfcies de resposta e curva de contorno para a dessoro de penG (%) em funo da
temperatura e pH (a) e (b), da temperatura e [EtOH] (c) e (d) e do pH e [EtOH] (e) e (f) no 1o
delineamento
70
60
50
40
30
20
10
64
Observando-se as superfcies de resposta, para maximizar a dessoro da penG os

ensaios devem ser realizados entre valores de pH 5,2 a 6,8 em uma concentrao de etanol
entre 65% e 100%. Como observado na Figura 4.19 (c) e (d), a temperatura de dessoro
no significativa, assim fixou-se 8oC (valor no ponto central) como a temperatura de
estudo.
Definidas as faixas mais adequadas para maximizar a dessoro da penG, foi realizado
outro planejamento fatorial completo 22, incluindo os quatro pontos pseudo-axiais e trs
repeties no ponto central, totalizando 11 ensaios. Cada ensaio foi realizado em
duplicata. A Tabela 4.13 apresenta os valores utilizados no planejamento e a Tabela 4.14,
apresenta a porcentagem de penG dessorvida em cada ensaio.
Tabela 4.13.: Valores utilizados do 2o DCCR para dois fatores
Variveis
pH
[EtOH]
-1
5,2
65,0
0
6,0
82,5
1
6,8
100,0
Tabela 4.14.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 2o delineamento
Ensaios
pH
[EtOH]
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
1.11
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
-1
+1
-1
+1
0
0
0
0
0
-1
+1
-1
+1
-1
+1
0
0
0
0
0
-1
+1
-1
-1
+1
+1
0
0
0
-1
+1
0
0
-1
-1
+1
+1
0
0
0
-1
+1
0
0
%
Dessorvida
76,64
80,21
79,29
80,19
94,93
97,74
96,25
74,06
66,38
65,70
70,15
77,05
78,33
82,52
77,01
94,48
91,93
94,56
57,53
79,34
74,28
80,33
65
Conforme as condies utilizadas, a porcentagem de penG dessorvida variou de 57,53

a 97,74%. Os pontos centrais apresentam uma pequena variao, indicando uma boa
repetibilidade do processo.
Atravs dos resultados obtidos foi possvel determinar os coeficientes de regresso que
esto apresentados na Tabela 4.15.
Tabela 4.15.: Coeficientes de regresso para a resposta no 2o delineamento
Mdia
pH(L)
pH(Q)
[EtOH] (L)
[EtOH] (Q)
pH x [EtOH]
Coeficientes
de
Regresso
92,68
0,32
-0,70
0,23
-14,81
-1,18
Erro
Padro
t(13)
p-valor
0,57
0,45
0,70
0,45
0,70
0,55
162,97
0,71
-1,00
0,51
-21,26
-2,13
<0,0001
0,4904
0,3363
0,6165
<0,0001
0,0525
Lim.
Conf. 95%
91,46
-0,66
-2,20
-0,75
-16,31
-2,38
pH(Q)
(1)pH(L)
(2)[EtOH](L)
93,91
1,30
0,81
1,21
-13,30
0,01
-9,57996
[EtOH](Q)
1Lby2L
Lim. Conf.
+95%
-,961471
-,449961
,319877
,2312109
p=,05
Estimativa do Efeito ( Valores Absolutos )
Figura 4.20.: Diagrama de Pareto para o 2o delineamento
Neste caso, a dessoro mostrou-se altamente influenciada pela concentrao de etanol

(Figura 4.20). O parmetro quadrtico da varivel concentrao de etanol do modelo
sobressaiu diante das outras variveis podendo-se elaborar um modelo com a varivel
codificada:
66
%DESSORVIDA = 92,68 14,81 [EtOH]2

Analisando-se a Tabela 4.16, verificamos que o F calculado foi significativo
(p-valor <0,01) e a porcentagem de variao explicada, de 86,51%.
Tabela 4.16.: ANOVA para a resposta no 2o delineamento
REGRESSO
RESDUOS
TOTAL
Soma de
Quadrados
Grau de
Liberdade
Quadrado
Mdio
1241,67
193,68
1435,35
5
16
21
248,33
12,10
% variao
explicada (R) =
F 5;16;0,05 =
86,51
F calc
p-valor
20,51
< 0,0001
2,85
(tabelado)
Esses resultados indicam uma relativa concordncia entre os valores experimentais e

previstos pelo modelo, expressos na Figura 4.21. Pela Figura 4.22 podemos observar que
os erros de ajustamento esto independentes e normalmente distribudos em torno da reta.
96
94
92
90
Valores Previstos
88
86
84
82
80
78
76
74
72
70
75
80
85
90
95
100
105
Valores Experimentais
Figura 4.21.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta no 2o
delineamento
67
3,0
2,5
,99
2,0
,95
Valores Normais Esperados
1,5
1,0
,75
0,5
,55
0,0
,35
-0,5
-1,0
,15
-1,5
,05
-2,0
,01
-2,5
-3,0
-8
-6
-4
-2
Resduos
Figura 4.22.: Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a resposta no 2o
delineamento
Os modelos foram significativos, sendo possvel construir a superfcie de resposta

(Figura 4.23), a curva de contorno (Figura 4.24) e definir as regies de interesse.
92
90
88
86
84
82
80
78
76
Figura 4.23.: Superfcies de resposta para a dessoro de penG (%) em funo da temperatura e
[EtOH] no 2o delineamento
68
100,0
96,5
93,0
[EtOH]
89,5
86,0
82,5
79,0
75,5
72,0
68,5
65,0
5,20
5,52
5,36
5,84
5,68
6,16
6,00
6,48
6,32
pH
6,80
6,64
7,12
6,96
92
90
88
86
84
82
80
78
76
Figura 4.24.: Curva de contorno para a dessoro de penG (%) em funo da temperatura e [EtOH]
no 2o delineamento
Observando-se curva de contorno, para maximizar a dessoro da penG, em torno de

92%, os ensaios devem ser realizados entre valores de pH 5,4 a 7,0 em uma concentrao
de etanol entre 80% e 86%. Para uma melhor dessoro, optou-se por utilizar valores de
pH e de etanol que, entre essas faixas, so mais centrais.
Assim, a dessoro ser conduzida a 8oC em pH 6,2, utilizando-se como eluente uma
mistura com 82,5% de etanol e 17,5% de gua.
4.9 PUREZA DA PENG AO FINAL DO PROCESSO DE PURIFICAO

A Figura 4.25 mostra os cromatogramas obtidos do caldo de cultivo contendo penG e
da soluo eluda da resina XAD-4, onde podem ser vistos os vrios picos correspondentes
aos vrios componentes presentes. Os picos 1, 2 e 3 so referentes a impurezas e o pico 4
referente a penG. A linha verde mostra os picos antes da adsoro e a linha vermelha
apresenta todos os picos referentes aos componentes dessorvidos da resina em soluo
etanlica.
69
(C)
Figura 4.25.: Cromatogramas referentes ao processo de purificao de penG. Linha vede: caldo
fermentativo contendo penG 50 g.L-1 e Linha vermelha componentes do caldo fermentativo
dessorvidos com etanol 82,5%.
Observa-se que h uma reduo significativa na intensidade dos picos referentes a

impurezas do caldo de cultivo. A Tabela 4.17 apresenta os valores da rea de cada pico.
Tabela 4.17.: Relao dos picos dos cromatogramas referentes ao processo de purificao e os
respectivos valores de suas reas
Pico
1
2
3
4
Composto
Impureza 1
Impureza 2
Impureza 3
Penicilina
rea Inicial
10664218
47176290
9441466
8762369
rea Final
2728350
22694758
4810532
A Figura 4.26 mostra uma foto do caldo de cultivo antes da adsoro e depois da
dessoro com soluo etanlica.
70
Figura 4.26.: caldo de cultivo antes da adsoro e depois da dessoro com soluo etanlica.
Observa-se que ocorre uma significante clarificao do caldo de cultivo, indicando

que vrios componentes do caldo foram separados da penicilina. Esses componentes no
so detectados nas condies de anlise do CLAE.
Analisando os cromatogramas, os valores da rea e a foto comparativa, pode-se
observar que a resina Amberlite XAD-4 seletiva na adsoro e dessoro da penG. Uma
grande quantidade de impurezas presentes inicialmente no caldo de cultivo no estavam
presentes ao final do processo na soluo de etanol/gua. Apesar de alguns contaminantes
competirem com a penG pelos stios ativos da resina, a adsoro de penG maior do que a
adsoro dos contaminantes, o que j havia sido indicado pela comparao entre as
isotermas obtidas para adsoro de penG quando esta estava dissolvida em gua ou no
meio de cultivo. CASEY et al. (2007), que estudaram a eficcia de XAD-4 para
recuperao de geldanamicina de caldos de fermentao, tambm concluiu que a resina era
seletiva para esse antibitico.
Assim, a penG apresenta-se em uma forma bem mais pura ao final do processo de
purificao. A resina apresenta assim no s alta capacidade de adsoro de pen G, mas
tambm boa seletividade para o antibitico.
4.10 SOLUBILIDADE DE PENICILINA G EM DIFERENTES SOLVENTES

Aps o processo de dessoro, havia uma soluo de penG em 82,5% de etanol e
17,5% de gua. Para a utilizao da penG, havia a necessidade dela ser retirada da soluo
e cristalizada. Ento, houve a necessidade de estudar a solubilidade da penG em gua,
etanol, mistura 82,5% etanol/gua e acetato de isobutila.
Os ensaios foram realizados a temperatura constante, 8oC. Em frascos com 100mL de
cada solvente em pH 6,2, adicionou-se penG at o ponto em que havia a presena de penG
precipitada, indicando saturao da soluo. Os frascos foram lacrados e colocados sob
71
agitao suave por quatro horas. Em seguida, os frascos permaneceram em repouso para as
suspenses sedimentarem. Aps a sedimentao, amostras do sobrenadante foram
retiradas por meio de uma seringa acoplada a um filtro de 0,2m, evitando a passagem de
slidos. Aps essa etapa, as amostras foram analisadas por cromatografia de alta eficincia
(CLAE) e os resultados esto apresentados na Tabela 4.18.
Tabela 4.18.: Solubilidade da penG em diferente solventes a 8oC e pH 6,2
Solvente
H2O
82,5% EtOH-H2O
EtOH
Acetato de isobutila
Solubilidade (gPenG / L solvente)

385,00
179,79
4,59
0,24
Para a mistura etanol-gua, foram realizados os mesmos ensaios variando a

temperatura da soluo e os resultados esto apresentados na Figura 4.26.
Figura 4.27.: Solubilidade da penG em mistura de etanol-gua a pH 6,2 em diferentes temperaturas

( 0 , 8 e 16oC)
Os resultados do estudo de solubilidade mostram que penG altamente solvel na

mistura etanol-gua. A cristalizao da penG a partir da mistura etanol-gua ir assim
requerer sua concentrao, atravs da evaporao do etanol a vcuo, para evitar
degradao do antibitico. Contudo, ela dever ser obtida j com grande pureza,
diferentemente da penG importada, que se apresenta sempre com alto grau de impurezas,
requerendo sua dissoluo e recristalizao para separao das impurezas. O etanol teria
mesmo que ser recuperado, tal como j ocorre atualmente com o solvente utilizado na
extrao lquido-lquido. A cristalizao etapa dominada na indstria e no era objeto de
estudo neste trabalho. O estudo de solubilidade foi feito apenas com o intuito de gerar
dados fundamentais para a etapa seguinte de cristalizao. Um estudo mais aprofundado,
72
levando-se em conta a evaporao do etanol, deve ser realizado para obteno de penG
slida.
73
5 CONCLUSES
9 O mtodo enzimtico desenvolvido para a quantificao de penG apresentou boa
reprodutibilidade e exatido. Esses resultados foram possveis devido obteno da curva
de calibrao utilizando como solvente o caldo de cultivo, e tambm devido ao uso de
excesso de enzima no meio e sua especificidade. Assim, esse mtodo desenvolvido para
quantificar penG em caldo de cultivo, associada quantificao do 6-APA atravs de
reao com PDAB, foi utilizado neste trabalho de maneira satisfatria, visto que penG em
diferentes meios e em ampla faixa de concentrao foi determinada com exatido e
preciso.
9 Independente do tempo de cultivo, a composio do meio no apresenta influncia
na anlise de penG.
9 A adsoro de penG em resinas hidrofbicas favorecida em meio cido.
Entretanto, nesta condio ocorre degradao do antibitico. Os resultados obtidos nesse
trabalho indicam que penG estvel a 4 e 12C em valores de pH 4,0 a 7,0 por 1 hora.
Para valores de pH mais cidos esse tempo diminui, sendo necessrio um maior cuidado
para evitar a degradao.
9 A resina Amberlite XAD-4 o melhor adsorvente para extrao de penG presente
em caldo de cultivo. O estado de equilbrio da adsoro de penG na resina Amberlite
XAD-4 em valores de pH de 4,0; 5,0 e 7,0 em 4 e 12oC foi atingido com 45 minutos.
9 A isoterma de Langmuir foi o modelo que melhor representou a adsoro de penG
utilizando a resina Amberlite XAD-4, apresentando capacidade mxima de adsoro de
0,595g penG/g resina, a pH 4, 4C.
9 O uso de gradiente de pH durante o processo de adsoro de penG eficiente e
evita perdas por degradao, mas comparado ao processo sem gradiente mais demorado,
apresentando o mesmo nvel de eficincia.
9 Para se obter uma mxima dessoro, o processo deve ser realizado a 8oC e utilizar
como eluente uma mistura de 82,5 % etanol e 17,5 % gua em pH 6,2.
9
Os resultados obtidos indicam a viabilidade tcnica da utilizao de adsoro em
resina hidrofbica para recuperao de penG.
74
9 Resumo das condies definidas para o processo de purificao de penG por

adsoro em resina Amberlite XAD-4 em batelada (Tabela 5.1).
Tabela 5.1.: Resumo das condices definidas para o processo de purificao de penG por adsoro em
resina Amberlite XAD-4 em batelada
TEMPERATURA DE
OPERAO(oC)
pH
VARIAO DE pH
AGITAO
TEMPO DE OPERAO
(min)
EFICINCIA DA
OPERAO
COMPISIO DO
ELUENTE
ADSORO
DESSORO
4,0
SEM GRADIENTE
Agitador mecnico SEM P
(1250 rpm)
6,2
SEM GRADIENTE
Agitao em Shaker
(250 rpm)
45
60
91% de penG adsorvida
92% de penG dessorvida
82,5 % ETANOL E 17,5%

GUA DEIONIZADA
75
6 SUGESTES
Um estudo mais detalhado do grau de pureza e a cristalizao da penG aps a
dessoro deve ser realizado para otimizar o processo. Outras resinas poderiam ser
testadas a fim de comparar a eficincia de adsoro e seletividade com os resultados
obtidos nesse trabalho.
O processo de utilizao de adsoro em resina hidrofbica para recuperao de penG
requer ainda estudo em coluna, para otimizao e posterior estudo de viabilidade
econmica. possvel que esse estudo resulte em custo maior do processo de adsoro em
relao extrao com solvente. Contudo, as presses ambientais so a cada dia mais
fortes e o processo proposto substitui solventes altamente hidrofbicos, cujo escape para o
ambiente altamente prejudicial, por etanol, um solvente de baixa hidrofobicidade,
amplamente disponvel e aceito ambientalmente.
Assim, mesmo com a hiptese de que essa substituio no seja economicamente
vivel no momento, ela poder se tornar imperativa nos prximos anos, o que justifica a
continuidade deste estudo para otimizao do processo.
76
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ALICINO, J.F. Iodometric assay of natural and synthetic penicillins, 6aminopenicillanic acid and cephalosporin C, Analytical Chemistry, v.33, p.648649, 1961
AKSU, Z., GONEN, F. Biosorption of phenol by immobilized actived sludge in a
continuous packed bed: prediction of breakthrough curves, Process Biochem., p.
1-16, 2003.
ARNOTT, I.A., WEATHERLEY, L. R.; The stability of penicillin g during recovery by
electrical enhanced extraction, Process Biochemistrys, v.30, n 5, p.447-455, 1995.
BALASINGHAM, K., WARBURTON, D., DUNNILL, P., AND LILLY, M.D; Biochimica et
Biophysica Acta, v.276, p. 250-256, 1972.
BARBOZA, M. Estudo cintico de adsoro, modelagem dinmica e otimizao de
processo contnuo de purificao de cefalosporina C, Tese Doutorado, Faculdade
de Engenharia de Alimentos - Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 1998.
BARBOZA, M.; HOKKA, C.O.; MAUGERI, F. Purificao de Cefalosporina C em
Coluna de leito fixo utilizando adsorvente polimrico no inico. Anais do XIII
SINAFERM (Simpsio Nacional de Fermentaes), Terespolis, RJ, Brasil, 45.145.6, 2000
BAUTISTA, L.F., MARTINEZ, M., ARACIL, J., Adsorption equilibrium of alphaamylase in aqueous solutions. Aiche Journal, 1999
BELTER, P.A.; Ion Exchange Recovery of Antibiotics. In: Moo-Young M ed.
Comprehensive Biotechnology, v. 2, p.473-480, Pergamon Press, New York, 1985.
BELTER, P.A.; CUSLLER, E.L.; WEI-SHOU, H., Bioseparations: downstream
processing for biotechnology, Wiley-intersience, 1988.
BENEDICT, R.G., SCHMIDT, W.H., COGHILL, R.D., OLESON, A.P., Penicillin III,
The stability of penicillin in aqueous solution. J. Bacterial, V. 49, p 85-95, 1945
BOOTHROYD, B. Recovery of antibiotics using column extraction methods. Bioactive
Microbial Products 3 Downstream Processing. J.D. Stowell; R.J. Bailey; D.J.
Winstanley Ed. Academic Press, p 59-75, 1986.
BORBA, C.E., Modelagem da remoo de metais pesados em coluna de adsoro de
leito fixo, Dissertao de Mestrado, Faculdade de Engenharia QumicaUniversidade Estadual de Campinas, Brasil, 2006.
BOX, G. E. P.; HUNTER, W. G.; HUNTER, J. S. Statistics for Experimenters. New
York, John Wiley & Sons Inc, 1978.
BOX, G. E. P.; DRAPER, N. R. Empirical Model-Building and Response Surfaces.
New York, John Wiley & Sons Inc, 1987.
CASEY, J. T.; WALSH P. K.; O'SHEA D. G. Characterisation of adsorbent resins for
the recovery of geldanamycin from fermentation broth. Separation and
purification technology , vol. 53, no3, pp. 281-288, 2007.
77
COLLINS, C.H.; BRAGA, B.L.; BONATO, P.S.; Introduo

Cromatogrficos. Editora Unicamp, Campinas, 1995.
Mtodos
CRUEGER, W.; CRUEGER, A.; Biotechnology: A Textbook of Industrial

Microbiology. Sunderland, Sinauer Associates Inc., cap. 13, 1984.
DO, DUONG D., Adsorption Analysis: Equilibrium and Kinetics. London: Imperial
College Press, 1998
DOULIA, D.; RIGAS, F.; GIMOUHOPOULOS, C., Removal of amino acids from
water by adsorption on polystyrene resins, Journal of Chemical Technology and
Biotechnology, v.76, p.83-89, 2001.
DROUGUETT, S. E. Elementos de Catalisis Heterognea. Washington, D.C. Editora
Eva V. Chesneau, 1983.
DUTTA, M. DUTTA, N.N. BHATTACHARYA K.G. Aqueous phase adsorption
certain semi-synthetic antibiotics onto polymeric resins and activated carbon.
Separation and Purification Technology, v. 16, p.213-224, 1999.
ERNEST Jr., M. V., WHITLEY, R. D., MA, Z., LINDA WANG, N. H. Effects of mass
action equilibria in fixed bed multicomponent on exchange dynamics, Industrial
Engineering Chemical Research, v. 36, p. 212-226, 1997.
GHOSH, A.C.; BORA, M.M.; DUTTA.N.N. Development in liquid membrane
separation of beta-lactam antibiotics. Bioseparation, v. 6, p 91-105, 1996
GRIME, J.K., TAN, B. Direct titration of antibiotics with iodate solution. Analytica
Chimica Acta,v.105, p 361-368, 1979
GRZEGORCZYK, D. S.; CARTA, G., Adsorption of amino acids on porous polymeric
adsorbents I. Equilibrium, Chemical Engineering Science, v. 51, n. 5, p.807-817,
1996.
GUDE, M. T.; LUUK, A. M.; VAN DER WIELEN; LUYBEN, K. Ch. A. M. Phase
Behavior of -aminoacids in multicomponent aqueous alkanol solutions. Fluid
Phase Equilibria. Amsterdam, v.116, n. 1-2, p. 110-117, 1996
HERSCHBACH G.J.M., VAN DER BEEK C.P., VAN DIJK P.W.M. The penicillins:
properties, biosynthesis, and fermentation. In: Vandamme EJ, editor.
Biotechnology of Industrial Antibiotics. New York: Marcel Dekker, p. 45104,
1984.
HILLENGA, D. J.; VERSANTVOORT, H. J. M; VAN DER MOLEN, S.; DRIESSEN, A.
J. M.; KONINGS, W. N.. Penicillium chrysogenum takes up the penicillin G
precursor phenylacetic acid by passive diffusion. Appl. Environ. Microbiol. v. 61;
p 25892595, 1995.
HINES, A. L., MADDOX, R. N., Mass Transfer: Fundamentals and Applications,
Prentice-Hall PTR, New Jersey, p 542 , 1985
HOMEM, E. M. Remoo de chumbo, nquel e zinco em zelita utilizando sistema de
leito fluidizado, Dissertao de Mestrado, Faculdade de Engenharia Qumica,
Universidade Estadual de Campinas, p 112, 2001.
78
KENNEDY, J.F. CABRAL, J.M.S. Recovery Processes for Biological Materials. John
Wiley and Soons, New York, 1995.
KHEIROLOMOOM, A., KAZEMI-VAYSARI, A., ARDJMAND, M., BARADARKHOSHFETRAT, A., The combined effect of pH and temperature on penicillin
G decomposition and its stability modeling. Process Biochem. V. 35, p. 205211,
1999.
KO, D. C. K., PORTER, J. F., McKAY, G. Film-pore diffusion model for the fixed bed
sorption of copper and cadmium ions onto bone char, Wat. Res., v.35, p. 38763886, 2001.
LIGON, B.L. Penicillin: Its Discovery and Early Development. Seminars in Pediatric
Infectious Diseases, v. 15, n 1, p. 52-57, 2004
MENEZES, J.C. Anlise e Modelao da Produo de Penicilina-G Escala PilotoIndustrial, Tese Doutorado, Universidade Tcnica de Lisboa, Lisboa, 1996.
MENEZES, J.C.; ALVES, T.P.; CARDOSO, J.P.; Biotecnologia Microbiana: A
Produo de Penicilina, Biotecnologia: Fundamentos e Aplicaes, cap. 12, pp 15,
N. Lima e M. Mota (eds.), DIFEL, 2000.
MICHNIK, A.; MICHALIC, K.; MARCOIN W., Influence of magnesium glutamate on
stability of penicillin G aqueous solution, International Journal of Pharmaceutics,
v.273, p.149-158, 2004.
NAVARRO, P.G.; MARTINEZ, J.H.; GARCIA, A.A.M.; DE LAS PARRAS, P.J.M., lactam degradation catalyzed by Cd2+ ion in methanol, International Journal of
Biological Macromolecules, v.25, p.337-343, 1999.
NAVARRO, P.G.; BLSQUEZ, I.H.; OSSO, B.Q.; GARCIA, A.A.M.; DE LAS
PARRAS, P.J.M., PUENTEDURA, M.I.M., Penicillin degradation catalyzed by
Zn2+ ion in methanol, International Journal of Biological Macromolecules, v.33,
p.159-166, 2003.
NATHWANI, D. WOOD, M.J. Penicillins: A current review of their clinical
pharmacology and therapeutic use. Drugs, v.45, p.866-894, 1993.
ORNELAS, N.J.R., Separao e purificao de amoxicilina produzida por sntese
enzimtica, Dissertao de Mestrado, Departamento de Engenharia Qumica,
Universidade Federal do Cear, 2003.
PELKZAR, J.R.; CHAN, E.; KRIEG, N.R. Microbiology, Mc Graw-Hill, 5 ed. New
York, 1986
PIKAL, M.J., LUKES, A.L., LANG, J.E., GAINES, K., Quantitative crystallinity
determinations for -lactam antibiotics by solution calorimetry: correlations
with stability. J. Pharm. Sci., v. 67, p. 767 772, 1978.
PRASAD, R.; GUPTA, A.K.; BAJPAI, R.K. Adsorpiton of Streptomycin on ion
exchange resins: equilibrium and kinetic studies.
Journal of Chemical
Technology and Biotechnology, v.30, p. 324-331, 1980.
79
REED, B. E., MATSUMOTO, M. R., Modeling cadmium adsorption by active carbon

using the Langmuir and Freundlich isotherm expressions, Separation Science
and Technology, v. 28, n. 13&14, p. 2179-2195, 1993.
REHM, H. J.; REED, G., Biotechnology, 3 Bioprocessing- VCH Publishers Inc., New
York, 1993.
RODRIGUES, M. L.; KALIL, S. J.; MAUGERI, F. Planejamento Fatorial e "Screening
Design" como ferramenta para Otimizao de Processos Bioquimicos . In : XII
SINAFERM - Simpsio Nacional de Fermentaes. Universidade Federal de
Uberlndia, Uberlndia - MG, 1998.
ROHM & HAAS Co. Ion Exchange Resin, Technical Notes Philadelphia,
U. S. A.,1965
ROHM & HAAS Co. Boletim Tcnico da resina Amberlite XAD -7, 2003
RUTHVEN, D. M., Principles of adsorption and adsorption processes, John Wiley &
Sons Canada, U. S. A., 1984.
SHULEN, L.M., KARGI, F. Bioprocess Engineering Basic Concepts. Prentice Hall,
1992.
SILVA, E. A., COSSICH, E. S., TAVARES, C. R. G., CARDOZO, L., GUIRARDELLO,
R. Modeling of copper (II) biosorption by marine alga Sargassum sp. in fixed
bed, Process Biochem., v. 38, p. 791-799, 2002.
SLEIJKO, L. F. Adsorption Technology: A Step-by-Step Approach to Process
Evaluation and Application. Marcel Dekker, 1985.
SMITH, A. Cephalosporins. Comprehensive Biotechnology, editado por Murray MooYoung, Pergamom Press, Oxford,v. 3, 1985.
STAEHELI, J. Variable Screening and Optimization. Developments in Biological
Standardization, v. 66, p. 143-153, 1987.
STROMINGER JL. Antibiotics; 1:706, 1967
TREYBAL, R.E., Mass Transfers Operation, McGraw-Hill, New York, 1980.
VERRAL, M., Downstream Processing of Natural Products, John Wiley & Sons England, 1996.
VIEIRA, M. F., BARBOZA, M., GIORDANO, R. L. C. Adsorption of components of
enzymatic synthesis of ampicillin on different hydrophobic resins. Applied
Biochemistry and Biotechnology, v.108, p.705 - 714, 2003.
VOSER, W., Isolation of hydrophilic fermentation products by adsorption
chromatography, J. Chem. Tech. Biotechnol, v.32, p.109-118, 1982
ZAMBON, G. A. Remoo de chumbo (Pb+2) utilizando zelita natural clinoptilolita,
Dissertao de Mestrado, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual
de Campinas, pp 97, 2003.
80
ZHU, Y.; HOOGMARTENS, J.; VAN SCHEPDAEL, A.; DALLE, J., Analysis of
benzylpenicillin by capillary eletrophoresis, Journal of Chromatography, v.792,
p.83-88, 1997.

Penicilina Industrial

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Penicilina Industrial

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

PURIFICAO DE PENICILINA G POR ADSORO

ANDR NOGUEIRA CASTRO DE BARROS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

PURIFICAO DE PENICILINA G POR ADSORO

ANDR NOGUEIRA CASTRO DE BARROS

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Barros, Andr Nogueira Castro de.

Dedico este trabalho aos meus pais, Idevar e Ceclia,

A penicilina cura os homens, mas o vinho que

A felicidade no est no fim da jornada, e sim em

Tenho muito a agradecer e a muitas pessoas que me auxiliaram at onde j cheguei. A

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

selecionada, XAD-4, foi ento investigada as cinticas de adsoro e determinadas as

A dessoro de penG foi estudada utilizando a tcnica de

planejamento experimental e investigou-se as variveis pH, temperatura e composio de

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

2.4 ADSORO ..............................................................................................................................12

2.5 DESSORO ............................................................................................................................28

3 MATERIAIS E MTODOS ...................................................................... 31

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) .........................................................32

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

3.2.6 ENSAIOS DE DESSORO EM BATELADA ..................................................................................37

4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................... 38

4.8 DESSORO DE PENICILINA G ................................................................................................59

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

Porcentagem de eficincia de adsoro

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

A utilizao de adsorventes polimricos para processos de purificao e para

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

ESTRUTURA QUMICA DAS PENICILINAS

As penicilinas compem uma classe teraputica de antibiticos com estruturas

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

Figura 2.1.: Estrutura bsica da molcula de penicilina.

Figura 2.2.: Estrutura do cido 6-amino penicilnico (6-APA)

O anel -lactmico, presente no 6-APA, responsvel pela atividade de todas as

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

PENICILINAS SEMI SINTTICAS

Em 1959, o 6-APA foi descoberto e sintetizado em quantidades apreciveis, o que

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

Uma caracterstica importante de penicilinas para seu processamento industrial sua

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

relatado que a ruptura do anel -lactmico exotrmica, por causa da grande

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

Figura 2.4.: Reao do anel -lactmico (Arnott et al, 1995)

Kheirolomoom et al (1999) estudaram a estabilidade da penG em funo da

Figura 2.5.: Esquema da degradao cida da penicilina. (Arnott et al, 1995)

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

PROCESSO DE PRODUO INDUSTRIAL

A penicilina produzida industrialmente pelo cultivo aerbico do fungo Penicillium

Figura 2.6.: Esquema da produo industrial de penicilina G (Menezes,1996).

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

SEPARAO DE PENG POR ADSORO EM RESINAS HIDROFBICAS

A corrente que contm a maior concentrao de penicilina a que est saindo no

Assim, o primeiro passo na extrao ajustar o pH da fase aquosa entre 2 - 2,5 e