C 268 Oc

OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE LA OLEORESINA DEL AJO
(Allium sativum)
LEONARDO CARDONA PAREJA

PAULA ANDREA GONZLEZ PATIO
DIRECTOR:
MELVIN AROLDO DURN
ASESOR:
GLORIA EDITH GUERRERO
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE QUMICA

(Allium sativum)
TRABAJO DE GRADO
Requisito final para optar al titulo de tecnlogo qumico
Presentado por:
DIRECTOR:
MELVIN AROLDO DURN
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE QUMICA
NOTA DE ACEPTACIN DE TRABAJO DE GRADO

(Allium sativum)
Presentado por:
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada
la versin escrita y presenciado la sustentacin oral, decidimos otorgar:
La nota de
Con la connotacin:
________________________________
_________________________________
Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:

Director:
Melvin Aroldo Durn
_________________________________
Jurado:
Firma:
_________________________________
Jurado:
Firma:
_________________________________
DEDICATORIA
Dedicado a nuestras familias por su esmero en formarnos como
seres integrales, a nuestros ms especiales y queridos amigos
quienes nos acompaaron en este proceso.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a todas aquellas personas que intervinieron en la realizacin de
este trabajo de grado, entre ellos el personal administrativo y docente, el
personal encargado de la sala de reactivos, almacn y dems dependencias de
la escuela de qumica, a los jurados por su disposicin al calificar este trabajo
de grado, a nuestros amigos y compaeros, al grupo de investigacin de
Oleoqumica, a nuestro director Melvin Aroldo Durn y muy especialmente a
nuestra asesora la doctora Gloria Guerrero.
CONTENIDO
Pg.
NDICE DE TABLAS
NDICE DE FIGURAS
RESUMEN
10
JUSTIFICACIN
12
OBJETIVOS
14
1. MARCO TERICO
15
1.1 Generalidades del Ajo (Allium Sativum)
15
1.2 Qumica del ajo
17
1.3 Bioqumica del ajo
22
1.4 Metodologas de anlisis
26
1.4.1 Anlisis fisicoqumicos
26
1.4.2 Anlisis microbiolgicos
28
1.5 Mtodos de extraccin
30
1.5.1 Extraccin soxhlet
30
1.5.2 Extraccin en fro
31
1.6 Anlisis instrumental
31
1.6.1 Mtodos de separacin cromatogrfica
31
1.6.2 Espectrometra de masas
32
1.6.3 Cromatografia/Espectrometria de masas GC/MS
33
2. MARCO DE REFERENCIA
34
2.1 Las oleorresinas
34
2.1.1 Oleorresina de ajo
37
3. SECCIN EXPERIMENTAL
39
3.1 Material vegetal
39
3.2 Preparacin de la muestra
39
3.3 Solventes utilizados
39
3.4 Extraccin
39
3.5 Separacin del extracto
40
3.6 Anlisis fisicoqumicos
40
3.6.1 Materia seca
40
3.6.2 Cenizas
40
3.6.3 ndice de refraccin
41
3.6.4 ndice de acidez
41
3.7 ANALISIS GC/MS
41
3.7.1 Preparacin de la muestra
41
3.7.2 Condiciones de anlisis
41
3.8 Anlisis microbiolgicos
42
3.8.1 Determinacin de Mesfilos aerobios viables
42
3.8.2 Determinacin de Mohos y Levaduras
43
3.8.3 Determinacin de Coliformes totales
43
3.8.4 Determinacin de Coliformes fecales
43
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
44
4.1 Extraccin de la oleorresina
44
4.2 Anlisis fisicoqumicos
49
4.2.1 ndice de acidez
49
4.2.2 Materia seca
49
4.2.3 Cenizas
50
4.2.4 ndice de refraccin
51
4.3 ANLISIS GC/MS
51
4.4 Anlisis microbiolgicos
56
4.4.1 Analisis de Mesofilos, mohos y levaduras
56
4.4.2 Determinacin de coliformes totales y coliformes fecales E-coli
57
5. CONCLUSIONES
61
6. RECOMENDACIONES
63
7. BIBLIOGRAFA
64
8. ANEXOS
69
8.1 Cromatograma de gases de voltiles en la oleorresina
69
8.2 Fragmentogramas de masas de las sustancias separadas por GC
70
NDICE DE TABLAS
Pg.
Tabla No. 1: Composicin nutritiva del ajo
20
Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo
24
Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo
25
Tabla No. 4: Parmetros microbiolgicos de las especias y sus derivados 36

Tabla No. 5: Extraccin en fro con ajo blanco
47
Tabla No. 6: Extraccin en fro con ajo rojo
47
TablaNo.7: Extraccin soxhlet con ajo blanco
48
Tabla No. 8: Extraccin soxhlet con ajo rojo
48
Tabla No. 9: ndice de acidez
49
Tabla No. 10: Materia seca
50
Tabla No. 11: Cenizas
50
Tabla No. 12: ndice de refraccin y grados Brix
51
Tabla No. 13: Caractersticas de los picos cromatogrficos
52
Tabla No. 14: Interpretacin de los principales fragmentos de los

espectrode masas de cada una de las sustancias presentes en
el cromatograma
53
Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras
56
Tabla No. 16: Recuento de mesfilos aerobios viables
57
Tabla No. 17: Determinacin de Coliformes totales, prueba presuntiva

(sin desinfeccin previa del material vegetal)
58
Tabla No. 18: Determinacin de Coliformes fecales (sin desinfeccin previa

del material vegetal)
59
Tabla No. 19: Determinacin de Coliformes fecales, prueba presuntiva (con

desinfeccin previa del material vegetal)
59
Tabla No. 20: Determinacin de Coliformes fecales (con desinfeccin previa

del material vegetal)
60
NDICE DE FIGURAS
Pg.
Figura No. 1: Descomposicin de la alicina en ajoenos
17
Figura No. 2: Efectos del procesado en la formacin de diferentes

compuestos bioactivos del ajo
19
Figura No. 3: Diagrama de flujo de la extraccin de la oleorresina
46
Figura No. 4: Degradacin de la alicina en Ditiinas
56
RESUMEN
En los ltimos aos se ha incrementado la demanda de oleorresinas a nivel
mundial, a pesar de esto, en nuestro pas la mayora de especias se consumen
en forma molida a sin ningn tratamiento previo; desaprovechando las mltiples
ventajas que brindan las oleorresinas.
Por esta razn se desarrollo un mtodo de extraccin eficaz y eficiente para la
especia del ajo (Allium sativum). Eligiendo esta especia principalmente por su
fuerte demanda como condimento, por su rico aporte a nivel medicinal, como
nutriente y como agente antimicrobiano.
Para desarrollar el mtodo se realizaron comparaciones entre dos tipos de
extraccin:
-Extraccin soxhlet: consiste en un mtodo de extraccin slido-liquido, que
se utiliza generalmente para aislar los componentes lipdicos de una muestra,
por medio de un solvente apolar.
-Extraccin en fro con agitacin: consiste en un mtodo de extraccin
slido-liquido, en el que ambas fases (slida y liquida) se encuentran en
contacto directo, por lo que los componentes del slido que son afines al
solvente quedaran disueltos en el mismo.
Se compararon el ajo morado y ajo blanco, as como tres clases de solvente
extractor: etanol 75%, hexano, y etanol 95%: hexano (1:1). Los solventes
fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extraccin de componentes del
ajo a diferentes polaridades. El nico tratamiento previo que sufri la muestra
fue la maceracin y el volumen de solvente que se utiliz para cada ensayo fue
de 100 mL. Cada ensayo se hizo por triplicado y bajo las condiciones ms
uniformemente posibles.
10
Para purificar la oleorresina extrada, el solvente fue evaporado en

rotaevaporador.
En conclusin el extracto que present las mejores caractersticas fsicas y
mayor rendimiento es el obtenidos de la extraccin en fri con agitacin usando
como solvente etanol al 75% y como material vegetativo ajo blanco. Este
mtodo de extraccin mostr buena precisin.
Sobre esta oleorresina se aplicaron anlisis posteriores para realizar una
caracterizacin qumica, estos fueron: ndice de refraccin (ntD), materia seca,
cenizas y acidez. Se utilizo la cromatografa/espectrometra de masas GC/MS
para realizar el anlisis de voltiles, encontrndose sustancias azufradas
importantes caractersticas del ajo, y para asegurar que cumpliera con la
resolucin 4241 de 1991 del ministerio de salud pblica colombiana se
realizaron las pruebas microbiolgicas correspondientes a alimentos y
aplicables a oleorresinas, de esta se tienen: recuento de mohos y levaduras,
recuento de mesfilos aerobios viables, determinacin de coliformes totales y
Determinacin de Coliformes fecales.
Segn los resultados obtenidos en la extraccin de la oleorresina, las
caractersticas
encontradas
guardan
consistencia
con
los
reportes
bibliogrficos, garantizando poder condimentante uniforme, las caractersticas

fisicoqumicas, microbiolgicas adecuadas y fuerte esencia caracterstica del
ajo.
El mtodo de extraccin de la oleorresina proporciona buen rendimiento en
extracto, lo que puede favorecer su implementacin en la industria alimentaria.
11
JUSTIFICACIN
En Colombia el comercio de oleorresinas no ha tenido una amplia explotacin a
pesar de contar con una gran y diversa gama de productos agrcolas, de los
cuales se podra tener un mejor aprovechamiento extrayendo este tipo de
derivados; caso contrario ha ocurrido en otros pases tales como Estados
Unidos, Canad, Reino Unido, Alemania, Francia, y Japn (1).
Las oleorresinas tomaron gran importancia a nivel industrial como especia para
alimentos a partir de 1960, desde entonces, este mercado ha evolucionado
ampliamente dndoles mayor uso y aumentando la variedad de oleorresinas
extradas (1).
En nuestro pas el comercio de las especias es poco tecnificado ya que estas
se consumen casi en su totalidad en forma molida o sin ningn tratamiento
previo, un ejemplo de esta situacin es el ajo (Allium sativum) que a pesar de
tener un alto consumo, su produccin se realiza con baja tecnificacin y en no
muy amplias extensiones de terreno, debido en parte a que sus condiciones de
cultivo exigen temperaturas optimas promedio de 14 a 20 C y con baja
humedad relativa(2), lo que restringe en gran medida su produccin en muchas
zonas del pas, razn por la cual es necesario realizar grandes importaciones
de este producto, desde pases pioneros en produccin tecnificada que ofrecen
buenas ofertas de costos y un producto con caractersticas de alta calidad
fsica.
A nivel local, en Risaralda no existe produccin agrcola de ajo; el producto
consumido en esta regin proviene de dos fuentes: una es la produccin
nacional
(especialmente
de
ajo
morado),
12
la
otra
de
importaciones
(especialmente de ajo blanco) de pases con grandes producciones como la

China.
Teniendo en cuenta estos aspectos se observa la oportunidad de realizar un
mayor aprovechamiento a la cantidad importada y producida nacionalmente
mediante la extraccin de su oleorresina, ya que este tipo de derivados ofrece
mltiples ventajas tales como ser 100% naturales, libres de residuos de
solventes y de residuos de pesticidas, de impurezas y materia extraa, exentos
de bacterias y enzimas, con alta uniformidad en su composicin y siendo la
caracterstica ms importante el rendimiento econmico, ya que dependiendo
de la concentracin de la oleorresina, puede sustituir hasta 100 Kg. de producto
en polvo por 1 a 2 Kg. de oleorresina, tambin asegura una mayor durabilidad
del producto (1,3).
De aqu la pertinencia e importancia de extraer y caracterizar ste producto que
podra tener intereses comerciales debido a su fuerte demanda.
13
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Obtener la oleorresina del ajo (Allium sativum).
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar una metodologa eficaz de extraccin para la oleorresina del
ajo (Allium sativum).
Realizar anlisis fisicoqumicos para determinar las propiedades
generales de la oleorresina.
Realizar anlisis microbiolgicos para determinar la inocuidad de la
oleorresina.
14
1. MARCO TEORICO
1.1 GENERALIDADES DEL AJO (Allium sativum)
Vegetal perteneciente a la familia de las liliceas y a la
subfamilia de las Allioideas , la planta esta provista de hojas
largas, estrechas y planas en su mitad inferior, sus flores son de
color blanco-verdoso en forma de sombrilla ubicadas en el
nacimiento de las hojas superiores, los bulbos
crecen
subterrneamente en la base del tallo.

Los bulbos constituyen una raz redondeada y su conjunto es conocido como
cabeza de ajo, los dientes de ajo son de color blanco o
amarillento y estn recubiertos por una serie de capas
delgadas, las cuales pueden variar de color segn el tipo de
ajo (4,5).
Su nombre botnico Allium sativum procede de la palabra celta all, que significa
caliente o ardiente y sativum, trmino latino que significa cultivado. Esta planta
es originaria de Asia Central, desde all se extendi hacia el Este hasta
alcanzar la China y hacia el Oeste en direccin a Europa
(5)
. El comercio
europeo facilit su distribucin, lo que hizo del ajo un condimento bsico en

muchos alimentos. Los espaoles introdujeron el ajo en el continente
americano a finales del siglo XIX (5).
Existen diversas variedades de este vegetal, las ms comunes identificados por
su cubierta son (5):
-Ajo blanco o comn: es de mayor tamao que el ajo morado,
es
resistente
carnoso,
de
buena
productividad
conservacin, tiene un sabor marcado y aroma persistente.
15
-Ajo rosado o morado: no se conserva en buen estado por

largos periodos de tiempo y son ms precoses que el ajo
blanco.
-Ajo rojo: al igual que el ajo morado el color de su cubierta le da su
nombre. Est constituido por un solo diente gigante. Se conoce como ajo
macho.
La variedad que prevalece en todos los pases es el ajo blanco, pero existen
otras variedades tales como: la italiana, chilena, californiana, espaola y
mexicana (6).
El cultivo del ajo requiere un clima templado para lograr su mejor
desarrollo, soporta temperaturas mas bajas que la cebolla, y
durante la formacin del bulbo las temperaturas requeridas van
de 0 a 10 grados centgrados, requiere humedad relativa del 6070 %, el suelo mas apropiado es el franco-arcilloso con muy buen
drenaje y con un moderado contenido de materia orgnica, el pH ptimo del
suelo esta entre 6.5 a 6.6 y requieren buenas cantidades de abono, el manejo
inadecuado del nitrgeno produce acebollamiento de la planta (los bulbos no
adquieren solidez). Los dientes de ajo que se siembran deben haber cumplido
un proceso de desinfeccin pertinente y una hiemacin. La madurez del ajo se
logra en un periodo de aproximadamente 6 meses y su cosecha se inicia
cuando las hojas de la planta comienzan a marchitarse y el tallo palidece. Las
plagas que mas atacan el cultivo son el piojo o candelilla (Thrips Tabaci) ,
Sclerotium sp, nemtodo del tallo y
trozadores (grillos, gusanos, caros,
pulgones y hormiga arriera). Dentro de las enfermedades ms comunes estn

las manchas en las hojas, royas y pudricin de bulbos causados por hongos
(2,6)
En Colombia el ajo se debe cultiva en terrenos entre 1700-3000 m.s.n.m., con

temperaturas que oscilen entre los 12 y 18 grados centgrados. Cundinamarca,
Boyac, y Nario son los departamentos con mayor produccin de ajo en
16
Colombia, mientras que Antioquia, Cesar, Santanderes y Cauca son

productores menores (2).
1.2 QUMICA DEL AJO
El anlisis de la composicin qumica de la parte comestible del ajo arroja una
riqueza importante en hidratos de carbono (cerca del 30%) y protenas
(aproximadamente el 6%), su riqueza mineral esta constituida por potasio,
fsforo, magnesio, zinc, yodo, y dentro del contenido vitamnico se destacan las
vitaminas del grupo B, como la B1, B3, B6 y con cantidades pequeas de
vitamina C y E. Adems estn contenidas sales de selenio, azucares, lpidos,
saponsidos, terpenos, enzimas, flavonoides y otros compuestos fenlicos. Sin
embargo el contenido energtico y nutritivo es marginal, ya que se consume en
muy baja cantidad (7).
Las cualidades qumicas caractersticas del ajo y sus propiedades salutferas
se deben en realidad a compuestos azufrados, de los cuales se destaca la
aliina, la cual por si misma constituye hasta un 0.24% del peso global del ajo.
Esta sustancia es poco olorosa y con mnimos efectos teraputicos, sin
embargo, cuando se corta o machaca el ajo, la aliina entra en contacto con la
enzima alinasa (alrededor del 1% del diente del ajo), y se descompone dando
lugar al cido 2-propensulfnico. El cido 2-propensulfnico se dimeriza a su
vez con otra molcula de cido 2-propensulfnico, dando lugar a la alicina, la
cual proporciona el olor caracterstico del ajo, la alicina es muy reactiva y
produce derivados qumicos denominados ajoenos y ditiinas (8,9).
Alicina
O
S
H 2C
S
O
S
O
S
H 2C
Cis-ajoeno
Figura No. 1: Descomposicin de la alicina en ajoenos(8)
17
S
S
CH 2
S
CH 2
CH 2
H 2C
Trans-ajoeno
H 2C
H 2C
CH 2
CH 2
La alicina, de frmula molecular C6H10OS2 y peso molecular de 162.27 g/mol,

es un liquido amarillo de densidad 1.112 g/ml e ndice de refraccin a 20oC y
con la lnea D del sodio de 1.561; Su pH esta cerca de 6.5, tiene solubilidad en
agua a 10oC de alrededor de 2.5% m/m, tambin es soluble en alcohol, ter y
benceno. Presenta inestabilidad en lcali caliente, pero es estable a cidos. En
general tiene estabilidad limitada en solucin (10).
Otros componentes sobresalientes son la alicina ajoeno, trans-ajoeno, zajoeno, cis-ajoeno, disulfuro de alilo y sulfuro de alilo (8,9).
Las investigaciones hechas hasta el presente han identificado alrededor de 30
componentes en el ajo con algn efecto beneficioso a la salud con una amplia
gama de actividades metablicas (9).
En los extractos de ajo, el tipo y concentracin de sustancias extradas,
depende de factores como: grado de madurez del ajo, prcticas de produccin
y cultivo, localizacin de la planta y condiciones de procesamiento. As, las
propiedades biolgicas y las caractersticas fisico-qumicas pueden variar de
acuerdo a condiciones de pH (la aliinasa se inactiva en pH cido), solvente
(aumento o disminucin de la vida media de la alicina), el almacenamiento
tiene influencia sobre el incremento de componentes azufrados, por la posible
formacin de S-alk(en)il-L-cistein sulfxidos a partir de precursores con gglutmico. En general los compuestos azufrados generan una gran cantidad de
reacciones qumicas caractersticas, las cuales producen muchos de los
efectos metablicos (7).
El aceite esencial de ajo que se obtiene por arrastre de vapor no posee
propiedades bactericidas o antitrombticas, pero si propiedades antioxidantes
(7)
18
V AP O R
H 2C
100 C
O
AL C O H O L
Y AG U A
E T ILIC O
CH2
Disulfuro de dialilo
CH2
S
H 2C
Alicina
25C
O
AL C O H O L E T IL IC O
< 0 C
NH2
H 2C
O
Aliina
OH
Figura No. 2: Efectos del procesado en la formacin de diferentes compuestos bioactivos

del ajo (7)
Es de notar que la mayora de los componentes azufrados del ajo no se

encuentran como tal en las clulas intactas, sino que se generan a partir de
varios de los componentes azufrados que se liberan cuando el ajo es cortado,
partido o macerado. La gran cantidad de reacciones qumicas
de unos
componentes con otros, generan as mismo una variedad amplia de sustancias;

entre estas reacciones se encuentra la formacin de diferentes tiosulfinatos y
compuestos derivados, relacionados con el cido sulfnico a partir de la
reaccin entre la enzima aliinasa y precursores voltiles
(S-alkenilcisteina
sulfxido y cido sulfnico). La descomposicin de sulfinatos puede ocurrir por

diferentes vas metablicas, una de las cuales combina dos molculas de
alicina para formar tres molculas de ajoeno. Por medio de degradaciones no
enzimticos se producen otros compuestos azufrados como los tiosulfinatos,
cepenos, mono, di, tri y tetrasulfuros , tioles, tiofenos y anhdrido sulfuroso , a
partir de tiosulfinatos (7,8).
Los componentes sulfurados del ajo se han estudiado con detalle en fracciones
voltiles extradas por diferentes mtodos, implementando GC-MS, para la
identificacin de diversas sustancias; sin embargo a las condiciones del anlisis
(especialmente la temperatura) pueden ocurrir muy diversas reacciones de
degradacin, por lo que no se detectan las sustancias originales de la muestra
en su totalidad. Para ello se han implementado otros mtodos utilizado HPLC y
19
GCMS criognico, evitando as las mltiples degradaciones de dichos

compuestos azufrados (11).
Tabla No. 1: Composicin nutritiva del ajo (7)
Componentes
Ingredientes
principales
Medida
Promedio (en
100g de porcin
comestible).
Variacin
64.00
63.00 - 64.60
6.05
5.30 - 6.76
0.12
0.06 - 0.20
28.41
_______________
1.42
1.40 - 1.44
mg
38.00
_______________
460.00
_______________
1.40
37.00-260.00
149.00
150.00-1000.00
575.00
______________
10.00
______________
70.00
______________
1.80
______________
mg
134.000
______________
mg
30.000
______________
2.70
340.00-630.00
Agua
Protenas
Lpidos
Carbohidratos
(utilizables)
Minerales
Minerales y
elementos traza
Calcio
mg
Manganeso
Hierro
Cobre
Zinc
Nquel
Molibdeno
Aluminio
Fsforo
20
Cloro
440.00
Yodo
5.69
Boro
4.40-28.00
Selenio
Vitaminas
10.90
______________
Vitamina E
100.00
______________
otal tocoferol
10.00
______________
TAlfa-tocoferol
90.00
______________
Vitamina B1
200.00
180.00-210.00
Vitamina B2
80.00
______________
mg
600.00
______________
14.00
9.00-18.00
100.00
______________
Acido salicilico
Acidos grasos
!!!!! g
500.00
_______________
Acido larico
mg
24.00
_______________
Acido palmtico
mg
Trazas
Trazas
Acido esterico
mg
3.00
_______________
Acido oleico
mg
62.00
_______________
5.50
_______________
Nicotinamida
Vitamina C
Acidos
Acido linoleico
Acido linolnico
21
1.3 BIOQUMICA DEL AJO

Los efectos antimicrobianos del ajo son conocidos desde la antigedad. La
sustancia activa mas importante es la alicina la cual tiene efectos inhibitorios
potentes sobre ciertas enzimas como las cistein-proteinasas y alcoholdeshidrogenasas, las cuales cumplen papeles importantes en las infecciones
por hongos, bacterias y virus. La aliina tambin inhibe ciertas enzimas con
grupos tioles (azufrados), que influyen en la biosntesis de colesterol. Este
hecho podra explicar el postulado efecto hipocolesterolmico del ajo y sus
saludables efectos cardiovasculares (12).
Numerosas investigaciones (5,12) han revelado diversos efectos tales como:
-Potente depurativo: propiedades antispticas, fungicidas, bactericidas y
depurativas. Se ha recomendado en casos de parsitos intestinales,
disenteras
infecciones
gastrointestinales.
Tambin
se
le
atribuyen
propiedades para el tratamiento de congestiones e infecciones respiratorias.

-Efectos cardiovasculares: disminucin de los niveles de colesterol y
triglicridos sanguneos provenientes del consumo de grasas saturadas, poder
antioxidante, incremento de la actividad tibrinolitica
y accin antiagregante
plaquetaria, efectos hipotensores (vasodilatador) y benficos efectos sobre la

elasticidad vascular.
-Prevencin de tumores: inhibicin de la bacteria Helicobacter pylori cuya
accin esta asociada a la aparicin de ulcera gastroduodenal y cncer gstrico.
As mismo otras investigaciones indican que el consumo de ajo reduce
notablemente los riesgos de padecer cncer de estomago y cncer de colon.
- Acta como estimulante del apetito: estimula las mucosas gastrointestinales
Por las investigaciones realizadas in vitro e in vivo (en animales), se ha
revelado que el ajo fresco y muchos de sus preparados poseen efecto
antioxidante, ya que sus componentes presentan mltiples efectos frente a la
inactivacin y control de los radicales libres. Al parecer todos los componentes
22
del ajo presentan actividad antioxidante, pero los componentes con mayor
capacidad podran ser S-alil-cistena y alicina (13).
Cabe sealar que en las investigaciones realizadas sobre los beneficios
mdicos de la ingesta de ajo, se han encontrado resultados contradictorios o no
congruentes, debido a que las condiciones de los ensayos y la presentacin del
ajo no son las mismas en todos los casos, lo que modifica el contenido en
sustancias activas. Por este hecho se ha recomendado realizar ms estudios y
bajo condiciones rigurosamente uniformes para confirmar los efectos reales de
los compuestos azufrados (7).
Se han realizado ensayos diversos para utilizar extractos etanlicos y acuosos
de ajo como aditivos en alimentos, que adems de otorgar sabor, cumplan un
papel como conservante frente a la accin de microorganismos. Estudios sobre
la inhibicin de Escherichia coli y Listeria innocua usando dichos extractos,
muestran resultados efectivos con concentracin mnima letal (CML) para Ecoli y Listeria innocua de 0.25g de ajo/ml agua y 0.125 g de ajo/ml agua
respectivamente; as mismo una concentracin mnima inhibitoria (CMI) para
ambos microorganismos de 0.25g de ajo/ml etanol (14).
Otra serie de microorganismos que presentan sensibilidad a la alicina son las
especies bacterianas: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Klebsiella pneunoniae, Shigella dysenteriae, Enterococcus. Tambin inhibe la
accin de hongos de especies de Candida, Crytococcus, Trichophyton,
Epidermophytom y Microsporum. La accin antiparasitaria se da en:
Entamoeba histolytica, Giardia lambia, Leishmania major, Leptomonas
colosoma. Los virus que presentan sensibilidad al ajoeno son citomegalovirus
humano, influenza B, virus del herpes simple tipo I y tipo II, el parainfluenza, y
el de la estomatitis vesicular (9).
23
Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo (7)
Compuesto
Posible actividad biolgica
Alina
Hipotensora, hipoglucemiante
Ajoeno (ajocistena)
Previene la formacin de cogulos,

ayuda a disolverlos.
Anti-inflamatorio, vasodilatador,
hipotensor, antibitico
Alicina y Tiosulfinatos
Antibitica, antifngica, antiviral
Alil mercaptano
Hipocolesterolemiante, previene la
aterosclerosis, antitumora,
antidiabtica, hipotensora
Sulfuro de dialilo y afines
Hipocolesterolemiante. Aumento la
produccin de enzimas
desintoxicantes. Anticancergeno.
Previene los daos qumicos del
DNA.
S-alil-cistena y compuestos al Hipocolesterolemiantes,

glutmico
antioxidantes, quimioprotectores
frente al cncer. Favorecen la
accin desintoxicante del hgado
frente a sustancias qumicas.
24
Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo (7)
Compuesto
Posible actividad biolgica
Adenosina
Vasodilatadora, hipotensora,
miorelajante. Estimula la sntesis
de hormonas esterodicas
Estimula la liberacin de
glucagn
Fructanos (Escorodosa)
Efectos cardiorotectores
Fraccin proteica F-4
Estimula el sistema inmune por

medio de macrfagos y clulas
esplnicas
Quercitina
Estabiliza los mastocitos. Ejerce

por tanto efectos beneficiosos en
el asma y la alergia
Saponinas (Gitonina F,
Hipotensoras. La Gitonina F es
Eurobsico B) Escordina
antivrica, el Erubsito B
antifngico
Hipotensora en conejos y perros.
Factor de crecimiento en dosis
elevadas. Incrementa la
utilizacin de la vitamina B1.
Antibacteriana
Selenio
Antioxidantes. Antiinflamatorios.
cidos fenlicos
Antivricos y antibacterianos
25
1.4 METODOLOGAS DE ANLISIS

1.4.1 Anlisis Fisico-qumicos: la amplia utilizacin de extractos, aceites
esenciales y oleorresinas provenientes de diversas fuentes, en algunas
industrias como es el caso de la alimentaria, exige que dichos materiales sean
caracterizados, para concluir sobre aspectos como su identidad, composicin
(pureza, autenticidad) y calidad (frescura, vida til) (15).
-ndice de refraccin (ntD):
se define como el cociente entre el seno del
ngulo de incidencia y el seno del ngulo de refraccin de la luz

monocromtica al pasar del aire a un medio pticamente ms denso. El ndice
de refraccin depende de la composicin de la muestra, la temperatura y la
longitud de onda de la radiacin utilizada. Generalmente se mide a 20, 25 o 40
grados centgrados, tomando como referencia la lnea D del sodio (589 nm), y
se realizan como mnimo dos mediciones de donde se toma la media, por lo
general con cuatro cifras decimales.
Su utilidad radica en casos como la
identificacin
lquidos
caracterizacin
de
puros,
grasas
aceites,
comprobacin de la pureza de diversos alimentos, determinacin del contenido

de agua en miel o en extractos de alimentos ricos en sacarosa (confituras, miel,
jarabe de almidn, zumos, etc.). Se denota ntD
(15,16)
-Materia seca: en un alimento la materia seca esta constituida por todos

aquellos
componentes
no
voltiles
del
mismo,
tales
como:
lpidos,
carbohidratos, protenas y minerales entre otros. La determinacin se realiza

por la prdida de humedad o sustancias voltiles (cido carbnico, alcoholes,
aceites etreos) por medio de la elevacin de la temperatura y con la eventual
utilizacin de vaco. Dependiendo del alimento se pueden utilizar otras
metodologas en las que se mide ndice de refraccin o densidad. El contenido
de humedad o material voltil es de vital importancia en alimentos ya que este
parmetro determina muchas de las caractersticas fsicas del producto,
adems de que el contenido de humedad por encima de ciertos niveles, influye
26
en posibles degradaciones de los constituyentes qumicos o desarrollo de

microorganismos. Se expresa en % m/m (15,16).
-Cenizas: son el residuo resultante de la incineracin, a ciertas condiciones, de
todo el contenido de material orgnico en la muestra. La combustin es
completa y el residuo corresponde al contenido total en minerales. Las cenizas
normalmente no son las mismas sustancias inorgnicas presentes en la
muestra original, debido a las perdidas por volatilizacin o a las interacciones
qumicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinacin de
cenizas es que supone un mtodo sencillo para determinar la calidad de
muchos alimentos. Se expresa en % m/m (15,16).
La reaccin qumica verificada en esta prueba corresponde a la oxidacin de
hidrocarburos, que en forma general es:
CnH2n+2 + (3n+1)/2 + O2
------------> nCO2 + (n+1)H2o
+ calor
-Acidez: es la medida del contenido de sustancias con carcter cido en una

matriz determinada. Su utilidad radica en que sirve como indicativo de pureza y
en ocasiones se puede concluir a partir de este resultado el nivel de
degradacin o tratamiento de la muestra. La acidez se puede expresar como
los mg de KOH que son necesarios para neutralizar los cidos presentes
(minerales, cidos grasos u orgnicos) o como la cantidad de cido oleico en la
muestra (15).
La base de esta prueba es la reaccin cido-base, en la cual el cambio de pH
produce el viraje del indicador utilizado:
H+ +
OH-
----------->
27
H2O
1.4.2 Anlisis microbiolgicos
(17,18)
: los microorganismos son seres
ampliamente extendidos por el medio ambiente, encontrndose en el aire, el

suelo y el agua; bajo diversas condiciones de presin, ph, temperatura, etc. En
la industria alimentaria, los microorganismos (especialmente las bacterias) se
constituyen en uno de los mas importantes problemas a enfrentar, ya que la
inocuidad del alimento es necesaria para un consumo seguro.
Dentro de los factores que influencian el crecimiento bacteriano estn:
- Alimento: fuente de energa y materiales estructurales.
- Temperatura: factor que determina la velocidad de crecimiento y
reproduccin, ya que influye en las reacciones qumicas y la accin de las
enzimas.
- Humedad: agua disponible para favorecer el crecimiento microbiano
(actividad de agua)
- Oxigeno: su necesidad se ve restringida al tipo de microorganismo, y por esto
existen las clasificaciones de aerobios estrictos, anaerobios estrictos, aerobios
facultativos y microaerobios
- pH: es un factor decisivo en el desarrollo de microorganismos, y el rango
aceptable para el desarrollo de estos depende del tipo de microorganismo, sin
embargo existe la tendencia a pH desde 6.8 a 7.5.
- Sustancias inhibidoras: determinadas sustancias (originales del producto o
adicionadas) resultan txicas para los microorganismos, afectando su
crecimiento y reproduccin.
Las determinaciones ms generales realizadas en alimentos son:
-Mesfilos aerobios viables: Dentro de este grupo se incluyen todas las
bacterias, mohos y levaduras, que se desarrollan a 30o centgrados y debido a
que esta temperatura es optima para muchas formas de vida libre, estn muy
difundidos en el medio ambiente, la mayora de estos microorganismos se
encuentran en todos los productos. Los resultados de su recuento reflejan la
28
calidad sanitaria del producto examinado, sus condiciones de manipulacin y

condiciones higinicas de la materia prima.
En general no son recomendables recuentos elevados (excepto en productos
obtenidos por fermentacin). Un recuento bajo no asegura ni implica
la
ausencia de patgenos o sus toxinas, as mismo un recuento alto no implica la

presencia de flora patgena, sin embargo puede significar la contaminacin de
la materia prima o del producto en proceso, la inmediata alteracin del producto
o la presencia de mesfilos patgenos (17,18).
-Mohos y Levaduras: los hongos constituyen un grupo amplio de organismos
unicelulares y pluricelulares, los cuales se alimentan mediante la absorcin
directa de nutrientes. Los hongos, adems de las bacterias, son causantes de
la descomposicin y putrefaccin de la materia orgnica. En su mayora, los
hongos estn constituidos por hifas (finas fibras que contienen protoplasma), a
menudo divididas en tabiques denominados septos; as mismo, la proliferacin
de hifas forman el micelio. Se reproducen generalmente por esporas, son
acompaantes muy comunes de toda forma de vida, en algunas ocasiones
como parsitos patgenos
(17,18)
. Las levaduras son a menudo difciles de
reconocer, pueden tener efectos beneficiosos y perjudiciales. Un ejemplo de

esto son las fermentaciones producidas por levaduras en la fabricacin de
alimentos (pan, cerveza, queso), adems, de obtencin de enzimas. Tambin
pueden producir alteraciones de zumos de frutas, almbares, miel, entre otros.
Se desarrollan mejor en medios abundantes en agua y en condiciones
aerobias; el rango de temperaturas de crecimiento es similar al de los hongos,
con un optimo entre los 25-30oC y un mximo entre los 35-47oC. Algunos tipos
especiales pueden crecer a 0oC o menos. En general el crecimiento se ve
favorecido por pH prximos a 4 - 4.5, su desarrollo se dificulta en medios
alcalinos y es lento en condiciones anaerobias (levaduras fermentativas) (17,18).
-Coliformes totales: son un grupo constituido por bacilos aerobios estrictos o
aerobios facultativos, gram-negativos no esporulados, que tienen la capacidad
29
de fermentar lactosa con formacin de gas. Los gneros que se incluyen en

este
grupo
son:
Escherichia,
Aerobacter,
Klebsiella,
Enterobacter
Paracolobactrum, as mismo las dos especies mas importantes son:

Escherichia coli (principalmente de origen intestinal) y Aerobacter aerogenes
(principalmente de origen vegetal). Su recuento es importante ya que las
bacterias Coliformes son perjudiciales al organismo, y su presencia se
considera como signo de mala calidad de la higiene de los procesos o los
manipuladores y/o contaminacin cruzada. Su crecimiento inutiliza los
alimentos (17,18).
-Coliformes fecales (E-coli): Se considera en este grupo al bacilo de la
especie Escherichia coli, el cual forma parte de la flora intestinal del hombre y
de animales de sangre caliente, de cuyo tracto intestinal se asla dicho
microorganismo. Es gram-negativo, con temperatura optima de crecimiento de
37o C (existe multiplicacin entre 10oC y 40oC), y pH optimo de 7 a 7.5
(soportando pH del rango de 4 a 8.5). Es muy perjudicial para la salud humana
fuera de su hbitat usual (intestino), y su presencia en alimentos indica una
contaminacin de origen fecal. Se puede destruir por pasteurizacin. Tambin
pertenecen a este grupo la Salmonella y la Shiguella (17,18).
1.5 METODOS DE EXTRACCIN

1.5.1 Extraccin soxhlet: consiste en un mtodo de extraccin slido-liquido,
que se utiliza generalmente para aislar los componentes lipdicos de una
muestra, por medio de un solvente apolar. Es un mtodo de extraccin directa,
aplicable a alimentos en general, aunque con excepcin de aquellos en los que
la grasa esta recubierta (como los productos lcteos), y para la obtencin de la
fraccin de grasa libre de la muestra para su posterior caracterizacin. Los
solventes mas utilizados para extraer la grasa libre son el ter dietlico o el ter
de petrleo, y para fines de cuantificacin de grasa se requiere una muestra
anhidra, para no extraer adems azucares y otros compuestos. El equipo esta
30
integrado por un extractor, un condensador especial de tipo bulbo y un matraz

(15)
1.5.2 Extraccin en fro: consiste en un mtodo de extraccin slido-liquido,

en el que ambas fases (slida y liquida) se encuentran en un contacto directo,
por lo que los componentes del slido que son afines al solvente quedaran
disueltos en el mismo. La polaridad del solvente depende del tipo de
compuestos que se requiere extraer, el material slido se encuentra
generalmente macerado para obtener una mayor superficie de contacto y el
proceso se cumple a temperatura ambiente. Se puede realizar con agitacin o
sin ella (denominado precolacin).
1.6 ANALISIS INSTRUMENTAL

1.6.1 Mtodos de separacin cromatogrfica
(15)
: los procedimientos
cromatogrfcos en general, son procesos de separacin que consisten en

obligar a la sustancia problema a sufrir una migracin diferencial entre dos
fases: fase mvil y fase estacionaria. Durante la separacin, la fase mvil
atraviesa la fase estacionaria. La fase estacionaria es un slido (adsorbente o
sorbente) o un lquido. La fase mvil es un gas insoluble o un lquido inmiscible
con la fase estacionaria. Existe tambin una nueva variante denominada gas
supercrtico (fluido).
Los procedimientos cromatogrficos se clasifican de acuerdo a los siguientes
principios:
-Segn la constitucin fsica del soporte
-Segn la combinacin de los diferentes tipos de fases
-Segn el tipo de separacin.
-Cromatografa de Gases CG: Se constituye en un procedimiento para la
separacin de compuestos voltiles, los cuales fluyen en una corriente gaseosa
31
sobre o a travs de una fase estacionaria fijada en el interior de un tubo largo y

fino, la cual puede ser un slido adsorbente de empaquetamiento, o un lquido
viscoso no voltil que recubre las paredes internas de la columna. El gas
portador es un gas inerte (nitrgeno, helio, hidrogeno, argn), y transporta una
muestra representativa de la sustancia inyectada. Los diversos componentes
son retenidos o retrazados por la fase estacionaria con mayor o menor fuerza y
alcanzaran correspondientemente el final de la columna donde se encuentra el
detector. Los tiempos de flujo del gas portador son relativamente largos.
La GC permite realizar anlisis tanto cualitativos, como cuantitativos de
sustancias que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las
cuales se obtienen derivados voltiles reproducibles. La eleccin del modo de
inyeccin de la muestra, la temperatura de la columna y el tipo de detector,
determinan los resultados del procedimiento.
1.6.2 Espectrometra de masas MS(19): la MS es de las herramientas
analticas quiz la de mayor aplicacin, ya que es capaz de proporcionar
informacin acerca de la composicin elemental de las muestras, estructura de
las molculas orgnicas, inorgnicas y biolgicas, composicin cualitativa y
cuantitativa de mezclas complejas, estructura y composicin de superficies
slidas y relaciones isotpicas de tomos en las muestras, etc. En forma
general, la MS consiste en introducir una pequea cantidad de muestra (igual o
inferior a un micromol) por medio de un sistema de entrada, donde los
componentes se convierten en iones gaseosos (muestras slidas o lquidas),
en un proceso llamado volatilizacin. Por medio de una fuente de iones, los
tomos se convierten en iones, normalmente positivos, acelerados hacia el
interior del analizador de masas. El analizador de masas mide la relacin
masa/carga de los iones del analito, as mismo el detector convierte el haz de
iones en una seal elctrica que puede ser procesada y almacenada en la
memoria de un ordenador, mostrada o registrada de diferentes maneras. El
espectro de masas de un compuesto particular proporciona diversos tipos de
datos que son tiles para su identificacin; en primer lugar el peso molecular y
32
en segundo la frmula molecular. Adems, el estudio de los modelos de

fragmentacin que se pone en manifiesto en el espectro de masas proporciona
a menudo informacin sobre la presencia o ausencia de grupos funcionales.
As mismo la identidad real de un compuesto se puede establecer mediante la
comparacin de su espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta
llegar a una total o muy cercana coincidencia. Con excepcin del procesador
de seal y el dispositivo de lectura, el equipo en su interior debe conservar
bajas presiones (10-8 a 10-4 torr), ya que las partculas cargadas, incluyendo los
electrones, interaccionan con los componentes de la atmsfera, siendo como
consecuencia destruidos.
1.6.3 Cromatografa/espectrometra de masas GC/MS
(19)
: una de las
mejores herramientas para el anlisis de mezclas orgnicas y bioqumicas

complejas es la cromatografa de gases/espectrometra de masas (GC/MS),
mtodo de anlisis acoplado en el cual se toma el espectro de masas de cada
uno de los compuestos que salen de la columna cromatogrfica; siendo stos
guardados en un ordenador para su subsiguiente procesado. As mismo, la
espectrometra de masas se puede acoplar a la cromatografa liquida para el
anlisis de muestras que contienen componentes no voltiles. Es importante el
desarrollo de mtodos para la eliminacin del eluente antes de la introduccin
de la muestra en el espectrmetro de masas, ya que la muestra est muy
diluida por el lquido o el gas portador en el interior de la columna.
33
2. MARCO DE REFERECIA
2.1 LAS OLEORRESINAS
Las oleorresinas son extractos que se obtienen a partir de especias y otros
vegetales (plantas aromticas) mediante la extraccin con solventes orgnicos.
Estos extractos tienen naturaleza oleosa y las sustancias voltiles y no voltiles
extradas proporcionan al producto las caractersticas concentradas de olor,
sabor y/o color de la especie vegetal. Por tal razn son productos
preferentemente utilizados como condimento en los alimentos
(18)
Estn
constituidas en general por una mezcla entre resina (principios aromatizantes

no voltiles, aceites grasos, ingredientes picantes) y aceite esencial, el cual
contiene principios odorferos voltiles. Las proporciones en la mezcla
dependen fuertemente de la forma de extraccin y de la planta o fruto de donde
provienen. Las oleorresinas son de muy diversa composicin, ya que al lado de
los aceites esenciales existen otras sustancias orgnicas y aceites grasos; los
extractos gozan de una mayor estabilidad ya que sus resinas preservan de la
autooxidacin a los aceites grasos (18,21).
Cuando se realiza la extraccin, se debe seleccionar un solvente,
generalmente de punto de ebullicin bajo, lo cual permita volver a separarlo en
forma sencilla (21).
Son varias las ventajas que posen las oleorresinas frente a vegetales crudos,
cuando se utilizan en alimentos (3):
-Econmicamente es rentable ya que sustituye sobradamente al vegetal, en
cuanto a caractersticas de olor y/o sabor
-Son uniformes en sus caractersticas
-Son naturales en el sentido de que no poseen rastros de solventes o trazas de
pesticidas
34
-Presentan una alta pureza

-La inocuidad del producto es confiable
Existen bsicamente dos tipos de oleorresinas (3):
-Oleorresina liposoluble: la que se considera en estado puro y proviene
directamente del proceso de extraccin con el solvente orgnico. Est
preparada para su uso con otras materias oleosas o grasas.
-Oleorresina hidrosoluble: se utiliza especialmente en la industria alimentaria
(sopas, bebidas, conservas), y se consigue por la incorporacin a la oleorresina
liposoluble de un polisorbato vegetal, que la vuelve soluble en agua.
En la actualidad se pueden encontrar gran cantidad de oleorresinas de diversos
vegetales, como pimienta, cilantro, chile, apio, aj, ajo, nuez moscada, capullo
de clavo, cebolla, etc., las cuales se usan especialmente para la fabricacin de
alimentos. Su xito radica en que la industria alimentaria durante los ltimos
aos, ha aumentado la fabricacin de productos crnicos y platos preparados,
con lo cual, las oleorresinas o extractos de especias han alcanzado cada vez
ms relevancia (21).
Las especias naturales as como la tecnologa aplicada para la extraccin,
cumplen un papel esencial para la evaluacin de los extractos de especias. El
contenido de aceites esenciales, es el nico criterio de aplicacin general para
el anlisis de dichos extractos, los cuales se obtienen del extracto por medio de
una destilacin continua de vapor de agua (21).
Una de las oleorresinas mas conocidas es la proveniente del pimentn
(Capsicum annuuum L.), la cual se ha obtenido por medio de extraccin
soxhlet, comparando los resultados al utilizar diversos solventes apolares as
como las variables en la preparacin del material previo a la extraccin.
35
Los reportes muestran que se han aplicado anlisis fisico-qumicos bsicos

como son ndice de refraccin, ndices de acidez, saponificacin, yodo y
perxidos. Los anlisis instrumentales aplicados han sido la medida del color
(ASTA-20), cromatografa en capa fina (TLC), HPLC y espectrometra de
masas (MS) (22,23).
Adems de sus conocidas ventajas para su utilizacin en alimentos como
condimento y/o agentes con poderes antioxidantes, se han estudiado otros
usos en industrias como la farmacutica, y en la tincin de telas (22).
La resolucin 4241 de 1991 del ministerio de salud publica colombiana
(24)
define aspectos bsicos de sanidad y calidad de las caractersticas de las

especias o condimentos vegetales, contemplando que las oleorresinas de
especias solo pueden ser extradas de la especia con solventes grado
alimenticio, tales como el hexano y el dicloro-etileno.
En general las condiciones microbiolgicas que deben cumplir las especias y
los productos hechos a base de ellas son:
Tabla No. 4: Parmetros microbiolgicos de las especias y sus derivados(24).
n
NMP coliformes fecales
40
Esporaz clostridium sulfito reductor/g.
100
1.000
B. cereus/g
100
1.000
Hongos y levaduras
3.000 5.000
Las convenciones utilizadas son:

n = Nmero de muestras a examinar.
m = ndice mximo permisible para identificar nivel de buena calidad.
M = ndice mximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad.
c = Nmero mximo de muestras permisibles con resultados entre m y M.
36
Otras normas de generales calidad dictadas por la resolucin son:

-Organolpticas: Las propias de cada especia o de sus mezclas.
-Genuinidad: En las especias puras y productos hechos a base de ellas,
debern identificarse los elementos histolgicos caractersticos de cada una de
ellas.
Para la incorporacin de los extractos y oleorresinas se hace necesario diluirlas
previamente en una sustancia inocua formando emulsiones o dispersiones. Los
extractos se deben conservar protegidos del aire y la luz, as como de perdidas
de color y de procesos oxidativos (21).
Con
la
estandarizacin
de
extractos
se
puede
asegurar
un
poder
condimentante uniforme, aunque existe la desventaja concerniente al cuidado

de los restos de solventes de extraccin, como los hidrocarburos halogenados
que son muy txicos y no deben sobrepasar valores residuales de 30 ppm
(0.003%) (21).
2.1.1 LA OLEORRESINA DE AJO
La oleorresina de ajo se ofrece actualmente en el mercado de los derivados de
especias y condimentos. Los extractos de ajo tienen un modo de obtencin un
poco diferente, ya que se realiza mediante extraccin acuosa y se obtiene un
extracto consistente en azcar, agua, sustancias minerales, nitrogenadas y
cierto contenido de aroma. El aroma proviene del aceite esencial, el cual se
encuentra en el bulbo de ajo en un 0.5%. Cuando se realiza una evaluacin
objetiva del extracto, es importante tener en cuenta el contenido de agua,
azcar y la composicin de los azucares, as, como el contenido de sustancias
aromticas y colorantes (21).
En los extractos de ajo, el contenido de aceites esenciales es en general muy
bajo, por lo cual la recuperacin de dicho aceite por destilacin de vapor de
agua y separacin cromatogrfica subsiguiente no resulta eficaz para su
37
estudio, como si lo es para los dems extractos. Aplicando modificaciones a

dicho mtodo se pueden obtener resultados utilizables que permitan determinar
los componentes voltiles en su totalidad y los grupos individuales de
componentes en forma reproducible (21).
Referencias sobre la extraccin de la oleorresina de ajo hablan de una
extraccin slido-liquido en fro, a 75% de etanol y agitacin en el proceso,
con un tiempo total de 2 horas, obtenindose de esta manera un rendimiento
promedio en oleorresina de 28.2% y un contenido en aceite voltil de 0.17%.
As mismo, en este caso, se ha realizado una caracterizacin qumica y se
encontraron buenas propiedades sensoriales(25).
Por otra parte, ensayos de inhibicin de microorganismos con componentes
activos del ajo, se han realizado con extractos etanlicos del mismo (14).
38
3. SECCIN EXPERIMENTAL
3.1 MATERIAL VEGETAL
Como materiales vegetales de ajo (Allium sativum) a utilizar, se seleccionaron
las variedades de ajo blanco y de ajo morado, por ser estas las mas
comnmente encontradas en esta regin. Los ajos utilizados fueron obtenidos
del comercio normal de vegetales, seleccionando frutos sanos, sin rastros de
plagas, con buen tamao, dureza y humedad aparente adecuadas.
3.2 PREPARACIN DE LA MUESTRA
Los dientes de ajo fueron desligados de la cabeza de ajo, y se les fue retirada
la serie de capas envolventes. Despus de esto se procedi al pesaje de 25 g
de dientes de ajo, los cuales fueron macerados y trasladados cuantitativamente
al proceso de extraccin.
3.3 SOLVENTES UTILIZADOS
Para las extracciones se usaron los siguientes solventes:
- hexano: 100 mL para cada extraccin
- etanol acuoso al 75%: 100 mL para cada extraccin
- una mezcla monofsica de hexano: etanol de 95% en proporcin 1:1 en
volumen (50 mL de etanol mas 50 mL de hexano).
3.4 EXTRACCIN
-Extraccin soxhlet: la muestra macerada fue envuelta en papel filtro (110mm
de dimetro de poro), y dispuesta dentro del extractor de 100 mL de capacidad.
39
El condensador utilizado fue de tipo bulbo y el matraz de 250 mL, se utiliz una
manta elctrica de calentamiento y agua corriente para el condensador.
-Extraccin en fro: la muestra macerada y el solvente fueron dispuestos dentro
de un erlenmeyer de 250 ml. La boca de los erlenmeyers fue cubierta con papel
aluminio y se implemento agitacin magntica.
Se realizaron todos los procesos extractivos por triplicado con un tiempo de dos
horas cada uno, conjugando las dos variedades de ajo, los tres tipos de
solventes y los dos montajes de extraccin.
3.5 SEPARACIN DEL EXTRACTO
Al finalizar el tiempo de extraccin se comprimi el material vegetal para
recuperar el solvente permeado, luego fue filtrado para retirar partculas
pequeas arrastradas; el filtrado fue trasladado cuantitativamente a balones
previamente tarados y luego sometido a la separacin del solvente y el extracto
por rotaevaporacin, utilizando para el fin un equipo de marca HEIDOLPH.
La temperatura de eliminacin de solvente estuvo en el rango de 40oC a 45oC,
y las presiones de vaco dependieron del solvente a retirar. Despus del
proceso de rotaevaporacin, se secaron externamente los balones y
seguidamente fueron pesados junto con el extracto.
3.6 ANLISIS FISICO-QUMICOS
3.6.1 Materia seca: se utilizo el mtodo gravimtrico, midiendo la masa del
residuo remanente de someter al calor seco de una estufa a 110oC, una masa
pesada de la muestra en una cpsula de porcelana previamente tarada, y
posteriormente la determinacin del % de material seco.
3.6.2 Cenizas: Se realizo la cuantificacin por el mtodo gravimtrico del
contenido mineral, sometiendo una cantidad de muestra pesada a calcinacin
40
controlada en una mufla, a una temperatura de 550C, utilizando un crisol con

tapa previamente tarado. El pesaje del residuo permite obtener el % de material
mineral presente en la muestra
3.6.3 ndice de refraccin: realizado segn Norma ICONTEC 289
3.6.4 ndice de acidez: realizado segn la Norma ICONTEC 218, reportando
los resultados como % de cido oleico
3.7 ANLISIS GC/MS
3.7.1 Preparacin de la muestra: una muestra de dientes de ajo macerados
se coloc en contacto con etanol al 75% por un tiempo total de una hora,
aplicando agitacin. Despus de dicho periodo se realiz una filtracin del
etanol, tomando una parte del mismo (alrededor de 25 mL), con los cuales se
realizaron extracciones sucesivas liquido-liquido con ter etlico (alrededor de
15 mL). Al final del proceso de extraccin se seco el ter etlico con sulfato de
sodio anhidro, y con dicha muestra se realiz el anlisis por GC-MS en el
equipo marca SHIMADZU modelo GCMS QP2010.
3.7.2 Condiciones de anlisis:
"
Temperatura del inyector: 250 oC
"
Modo de inyeccin: Split
"
Radio del Split: 1:10
"
Temperatura inicial del horno de la columna: 35oC/5 min.
"
Rata de cambio de temperatura en el horno: 10oC/min.
"
Temperatura final del horno de la columna: 280oC/5 min.
"
Gas portador: Helio
"
Flujo total: 9.1mL/min.
"
Tiempo de anlisis: 34 min.
"
Detector: espectrmetro de masas
"
Modo de ionizacin: impacto electrnico (70ev)
41
3.8 ANLISIS MICROBIOLGICOS (24,25)

Las metodologas de anlisis para el estudio microbiolgico de la oleorresina
de ajo, se basaron en los procedimientos indicados para determinaciones en
alimentos. La oleorresina, aunque fue extrada con un solvente de una
polaridad menor que la del agua, presenta una solubilidad adecuada en dicho
solvente, necesaria para poder realizar los anlisis.
La muestra analizada se tom directa e inmediatamente del baln, despus de
terminada la rotaevaporacin. Se pes 1g de la oleorresina y se aadieron
9 mL de agua peptonada estril (APE), y a partir de esta dilucin 10-1 se
prepararon diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 para los diferentes anlisis.
Los ensayos se realizaron por triplicado y en cmara de flujo laminar que
garantiza un ambiente estril, as mismo se realiz un control del medio de
cultivo, para observar posibles contaminaciones del mismo. Dentro de los
procesos de preparacin de los medios de cultivo y extraccin de la
oleorresina, se tomaron las medidas pertinentes para evitar posibles
contaminaciones, como la desinfeccin del material de vidrio con hipoclorito de
sodio y uso de guantes para la manipulacin. No se realiz desinfeccin de los
dientes de ajo a usar.
3.8.1 Determinacin de Mesfilos aerobios viables: se utiliz el mtodo
estndar de recuento en placa y siembra por profundidad. El medio de cultivo
utilizado fue el Agar Nutritivo Standadrd Plate Count (APHA), y la siembra se
realiz tomando 1 mL de cada una de las diluciones (10-1, 10-2, 10-3, 10-4),
vertindola en el fondo de la caja de petri y adicionando sobre esta el agar tibio
y lquido con una temperatura de 37oC. Se obtuvo una mezcla homognea del
agar y la dilucin con un movimiento leve en forma de 8. Cumplida la
solidificacin del medio, se incubaron las cajas invertidas a 37oC por 24 horas
(incluyendo los controles del medio).
42
3.8.2 Determinacin de Mohos y Levaduras: se realiz la preparacin de

placas con Agar Saboraud. Se tomaron 0.1 mL de cada dilucin (10-1, 10-2, 10-3
y 10-4), y se extendieron por medio de una varilla de jockey (rastrillo), sobre el
Agar solidificado. La incubacin se cumpli a 25oC (temperatura ambiente),
por un tiempo de 8 das.
3.8.3 Determinacin de Coliformes totales:
"
Prueba presuntiva: para el anlisis se utiliz el mtodo del nmero ms

probable empleando el medio lquido fluorocult. La siembra se realiz en
tubos de ensayo tapa rosca, en cuyo interior se dispuso una campana
invertida, adicionando a cada tubo 1 mL de las diluciones (10-1, 10-2,
10-3, 10-4). Los tubos se incubaron a 37oC por 24 horas, al final de las
cuales se observ la acumulacin o no de gas (CO2) en el interior de la
campana.
"
Prueba confirmativa: esta prueba se realiz, cuando los resultados de

la prueba presuntiva dieron positivo, con la acumulacin de gas en la
campana. Se tom 0.1 mL del tubo, y se sembr por superficie sobre el
agar Eosina Azul de Metileno (EMB), y la incubacin de las cajas
invertidas se llev a cabo a 37oC por 24 horas.
3.8.4 Determinacin de Coliformes fecales: la presencia de E-coli se

determin observando los tubos de la prueba presuntiva de coliformes totales,
a la luz UV. La presencia de fluorescencia azul indica que la bacteria est
presente. La fluorescencia se debe a que el cultivo microbiolgico contiene el
sustrato fluorgeno 4-metilumbeliferil-#-D-glucurnido (MUG), el cual es
degradado por la enzima #- D- glucuronidaza altamente especfica para E- coli;
Se libera el compuesto 4-metilumbeliferona, con fluorescencia azul verdosa al
ser iluminado con luz UV de 366 nm. (18)
43
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 EXTRACCIN DE LA OLEORRESINA
Se llev a cabo la extraccin de la oleorresina utilizando por separado el ajo
morado y el ajo blanco; los dos tipos de extraccin: soxhlet y en fro con
agitacin; y las tres clases de solvente extractor: etanol 75%, hexano, y la
mezcla etanol 95%-hexano (1:1).
Las condiciones de extraccin fueron
uniformes, para lograr obtener resultados precisos.

Los solventes fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extraccin de
componentes del ajo a diferentes polaridades, siendo el menos polar el hexano,
con polaridad media la mezcla de etanol-hexano, y polaridad mayor el etanol al
75%. Aunque la literatura habla de extracciones acuosas de la oleorresina
(21)
no se consideraron como solvente extractor el agua o soluciones etanlicas

mas diluidas, ya que la eliminacin del solvente es mas difcil (21).
Analizando en primer lugar las diferencias entre las formas de extraccin en
cuanto a porcentaje de rendimiento, se observa que en las extracciones
realizadas en fro con agitacin el mayor porcentaje se obtuvo con el ajo blanco
con un valor de 31.1774 % (tabla No. 5), en el caso de la extraccin en soxhlet
el mayor porcentaje se present con el ajo morado con un valor de 14.3678 %
(tabla No. 8).
Respecto a los solventes de extraccin, se nota que existe un aumento en el
porcentaje de rendimiento directamente proporcional al aumento de la
polaridad del solvente. En general se observan significativas diferencias entre
los porcentajes de rendimiento obtenidos con etanol al 75 % (polar) y los
obtenidos con hexano (apolar). Los porcentajes obtenidos con la mezcla
44
etanol-hexano tendieron a ocupar valores intermedios. Las mayores diferencias

de rendimientos se presentan en la tabla No.5, en donde el etanol al 75%
extrajo 29,0818 % ms que el hexano, y 19,6098 % ms que la mezcla etanolhexano.
Comparando las dos variedades de ajo, se observa que el ajo blanco present
un mejor rendimiento en la extraccin en fro que en soxhlet, superndola en
17,5280 %, diferencia tomada entre los mayores porcentajes obtenidos en fro
(tabla No. 5) y en soxhlet (tabla No. 7). Caso contrario ocurri con el ajo
morado, con el cual se obtuvo un mayor rendimiento en la extraccin en
soxhlet, con un incremento en el porcentaje de 4,5322 % respecto a la mejor
extraccin en fro (tabla No. 6). Se present una significativa diferencia entre
las mayores extracciones a nivel general comparando las dos variedades de
ajo, siendo la mejor para el ajo blanco de 31.1774 % (tabla No. 5) con
extraccin en fro y para el ajo morado de 14.3678 % (tabla No. 8) con
extraccin soxhlet.
Las caractersticas de los extractos fueron muy diferentes, con hexano solo se
recupero un extracto fluido traslucido, con la mezcla hexano-etanol el extracto
era ms viscoso y opaco, pero con el etanol al 75% se recuper un extracto
con una viscosidad mayor que el anterior y completamente opaco. Todos los
extractos presentaron coloraciones amarillas y el olor caracterstico fue mayor
en el extracto en hexano, y muy similar ente los dems extractos.
Por cuestiones de tiempo y disponibilidad de recursos, el nico parmetro
vlido medible que se tom en cuenta para la seleccin de la oleorresina a
analizar fue el porcentaje de rendimiento en extracto; las caractersticas fsicas
aparentes y el aroma particular a ajo, fueron tomados como factores
secundarios complementarios de diferenciacin cualitativa, pero no fueron
definitivos ya que no se realiz anlisis alguno de estos aspectos en los
extractos por separado. Adems, no se observaron las posibilidades de utilizar
otros solventes de extraccin que presentaran inconvenientes de mayor
45
toxicidad como los organoclorados, con costos ms elevados o que no

estuvieran reglamentados como solventes de grado alimenticio.
Teniendo en cuenta los anteriores aspectos, la oleorresina seleccionada para
los anlisis de caracterizacin, fue la obtenida del ajo blanco, en fro y con
etanol al 75% como solvente extractor, por presentar el mayor porcentaje de
rendimiento (31.1774 %), buenas caractersticas fsicas (viscosidad, aroma) y
precisin del mtodo con una baja desviacin estndar entre las extracciones
(0.1906).
En la figura siguiente se ilustra el proceso de extraccin de dicha oleorresina:
ajo fresco
anlisis de la oleorresina
pesaje de 25 g. de dientes
de ajo sin cubierta
separacin del solvente

y pesaje de la oleorresina
Figura No. 3: Extraccin de la oleorresina
46
maceracin de los
dientes de ajo
extraccin con 100 ml de etanol

75%, agitacin magntica por
2 horas.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Tabla No. 5: Extraccin en fro con ajo blanco

Masa
Masa ajo oleorresina Rendimiento Promedio Desviacin
Solvente
Etanol 75%
Etanol:Hexano
Hexano
Ensayos
(g)
(g)
(%)
25,4682
7,8901
30,9802
25,1953
7,9014
31,3606
25,1740
7,8521
31,1913
25,4155
3,0798
12,1178
25,3341
2,8287
11,1656
25,1931
2,8769
11,4194
24,9686
0,4982
1,9953
25,4780
0,5068
1,9892
24,8485
0,5721
2,3024
(%)
estndar
31,1774
0,1906
11,5676
0,4931
2,0956
0,1791
Tabla No. 6: Extraccin en fro con ajo morado.

Masa
Masa ajo
Solvente
Etanol 75%
Etanol:Hexano
Hexano
Ensayos
(g)
oleorresina Rendimiento Promedio Desviacin

(g)
(%)
25,1055
2,4495
9,7568
25,6028
2,5642
10,0153
25,1915
2,4523
9,7346
25,2842
1,5205
6,0136
25,1436
1,8275
7,2683
25,1069
2,3045
9,1788
25,2160
0,7409
2,9382
25,0345
0,7262
2,9008
25,1508
0,6491
2,5808
47
(%)
estndar
9,8356
0,1560
7,4869
1,5938
2,8066
0,1964
Tabla No. 7: Extraccin soxhlet con ajo blanco

Masa
Masa ajo
Solvente
Etanol 75%
Etanol:Hexano
Hexano
Ensayos
oleorresina Rendimiento Promedio Desviacin
(g)
(g)
(%)
25,3795
3,5037
13,8052
25,3423
3,4569
13,6408
25,3181
3,4185
13,5022
25,2407
1,5559
6,1643
25,3108
1,3464
5,3195
25,0869
1,3322
5,3103
25,0666
0,8344
3,3287
25,6245
0,6529
2,5480
25,3660
0,6985
2,7537
(%)
estndar
13,6494
0,1517
5,5980
0,4904
2,8768
0,4047
Tabla No. 8: Extraccin soxhlet con ajo morado.

Masa
Solvente
Etanol 75%
Etanol:Hexano
Hexano
Ensayos
Masa ajo
oleorresina
(g)
(g)
Rendimiento Promedio Desviacin

(%)
25,1211
3,6003
14,3318
25,3423
3,6554
14,4241
25,3181
3,6325
14,3474
25,0979
1,6305
6,4966
25,3675
1,3593
5,3584
25,0735
1,9833
7,9099
25,1425
0,7373
2,9325
25,1732
0,7209
2,8638
25,1964
0,7039
2,7937
48
(%)
estndar
14,3678
0,0494
6,5883
1,2782
2,8633
0,0694
4.2 ANLISIS FISICO-QUMICOS

Como caracterizacin fisico-qumica general se aplicaron anlisis bsicos sobre
algunos aspectos del producto. Estos anlisis fueron realizados teniendo en
cuenta los reportes existentes sobre evaluaciones objetivas de extractos de ajo
(21)
, exceptuando el ndice de acidez y el ndice de refraccin.
4.2.1 ndice de acidez: acidez evaluada en esta prueba no se toma como un

indicativo de degradacin como sucede con las sustancias de naturaleza
lipdica (grasas y aceites), sino como la presencia de sustancias que producen
acidez
que
provienen
especficamente
del
ajo.
Posiblemente
los
responsables de dicha acidez sean los glucolpidos, fosfolpidos y cidos

sulfnicos, reportados en estudios de la composicin en sustancias azufradas y
cidos grasos en el ajo
(26)
, y que en parte pueden alcanzar a estar presentes
dentro de la composicin qumica de la oleorresina, ya que estas sustancias

pueden tener una solubilidad parcial en etanol al 75%, a las condiciones de
extraccin.
Tabla No. 9: ndice de acidez

Ensayos
% m/m cido oleico
0,4700
0,4730
0,4650
Promedio
0,4690
Desviacin estndar
0,0040
4.2.2 Materia seca: los slidos totales dentro de la composicin de la

oleorresina reflejan el grado alto de concentracin de material slido soluble o
en suspensin, que presentaron polaridad suficiente para quedar retenidos en
49
el solvente. Compuestos como, sustancias azufradas, carbohidratos, minerales,

son los que en forma mayoritaria se encuentran formando parte del material
seco total de la oleorresina. As mismo, la prdida de peso de debe a la
presencia de un muy buen contenido de sustancias voltiles, adems del agua
de hidratacin de compuestos, que no alcanza a ser extrada por rotaevaporacin,
Tabla No. 10: Materia seca
Ensayos
% m/m Materia seca
80,5740
80,9260
80,9670
Promedio
80,8220
Desviacin estndar
0,2160
4.2.3 Cenizas: la determinacin de cenizas en la oleorresina, muestra que bajo

las condiciones de extraccin, el solvente es capaz de extraer una importante
cantidad de minerales presentes en el ajo, ya que este vegetal contiene dentro
de su composicin de diversos minerales como fsforo y potasio.
Tabla No. 11: Cenizas
Ensayos
% m/m Cenizas
3,2210
3,2580
3,2590
Promedio
3,2460
Desviacin estndar
0,0217
50
4.2.4 ndice de refraccin: el ndice de refraccin se tom como un parmetro

fsico de caracterizacin de la oleorresina a la temperatura dada. As mismo la
medida de los grados Brix (Brix refractomtrico) representa la medida del % de
slidos solubles en la muestra. Con estos parmetros se puede controlar en
forma sencilla la uniformidad alcanzada al obtener la oleorresina.
Tabla No. 12: ndice de refraccin y grados Brix
nD24
Ensayos
Brix
1,4755
74,00%
1,4755
74,00%
1,4750
73,90%
1,4753
73,97%
0.236*10-3
0.0433
Promedio
Desviacin estndar
Para los resultados obtenidos en estos anlisis no se tienen patrones

cuantitativos de comparacin, ya que no se encontraron reportes especficos
sobre el tema, solo los nombres de determinaciones generales aplicables de
acuerdo a la composicin qumica. Tampoco se conoce de normas vigentes
para este tipo de derivados que regulen la caracterizacin fisico-qumica
realizada.
4.3 ANLISIS GC/MS
El anlisis cromatogrfico de los compuestos solubles en ter etlico, arroj el
cromatograma de gases (anexo No. 1), en el cual se observa la presencia de 7
compuestos principales con picos bien definidos, siendo los picos mayoritarios
el tercero (tr =14.678) y cuarto (tr =14.984). Los espectros de masas de cada
sustancia (anexo No. 2) fueron comparados automticamente con la biblioteca
de espectros de la base de datos del equipo. Los compuestos identificados de
esta manera con sus respectivos % de coincidencia de las rutas son los
51
siguientes: Disulfuro de dialilo (84%), Trimetil Tiourea (77%), 3-vinil-[4H]-1,2Ditiina (91%), 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina (90%), Trisulfuro de dialilo (94%) y 4-metil2,6-di-ter-butil fenol (93%). El Tiopentanal no fue identificado por comparacin
con la base de datos, ya que el % de coincidencia de la ruta fue de apenas un
67%, por lo que la interpretacin de su fragmentograma de masas se llevo a
cabo comparndolo con sustancias anteriormente identificadas en estudios
similares previos de la composicin qumica de voltiles en el ajo
(11)
. Los
tiempos de retencin se especifican en la tabla No. 13. La interpretacin de los

fragmentos que justifican las sustancias propuestas se describen el la tabla No.
14.
Tabla No. 13: Caractersticas de los picos cromatogrficos

Compuesto
Pico
tr
rea
% de rea
Disulfuro de dialilo
12.88
1223021
4.95
Trimetil Tiourea
13.21
2871109
11.61
3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina
14.68
2871109
21.19
2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina
14.98
11337822
45.86
Tiopentanal
15.92
735053
2.97
Trisulfuro de dialilo
16.03
2150657
8.70
18.66
1167049
4.72
! 24722777
! 100
4-metil-2,6-di-ter-butil
fenol
52
Tabla No.
14: Interpretacin de los principales fragmentos de los espectros de masas de

cada una de las sustancias presentes en el cromatograma
Pico
Catin Radical
m/z
%
abun
d
Prdida
Fragmento
+
$ HS %
disulfuro de dialilo
1
113
51
.
+
CH2
H 2C
105
CH2
37
$C3H5 %
$C5H5 %
m/z=146 (20%)
% coincidencia de ruta: 84%
H2S
81
100
$CH3 %
2 Trimetil Tiourea
103
21
NH
CH3
CH3
CH2
NH
NH
S
H3C
$ HS %
.
+
85
m/z=118 (100%)
H3C
16
72
77
H2C
$H2N(CH3)2%
+
S
3 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina
111
CH3
H3C
CH3
S
H3C
$ HS %
100
S
$ CH2SH %
S
S
CH2
m/z=144 (49%)
97
61
S
71
48
53
$ C3H3S %
CH2
$ HS %
4 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina
111
46
H2C
S
CH2
S
CH2SH %
97
m/z=144 (38%)
17
72
$ C3H4S %
H3C
$ OH %
.
+
103
H 3C
SH
$ H2O %
H2O
72
OH
H3C
100
H2C
55
35
H2C
CH3
$ C5H5 %
S
S
CH2
113
67
SH2
$ C3H5S2 %
73
100
54
H3C
m/z=178 (4%)
+
$ C2H6 %.
Trisulfuro de dialilo
S
$ H2 %.
+
$H2SCOH%.
SH
m/z=120 (90%)
CH2
100
Tiopentanal
H2C
CH2
H3C
CH3
$ CH3 %
OH
CH3
H3C
7 4-metil-2,6-diterbutil fenol
H3C
OH
205
100
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
$ C8H17O %
CH3
H3C
91
$ C12H19 %
m/z=220 (31%)
H2C
57
17
En estudios realizados de los componentes del aroma en el ajo (11), aparecen

reportados los compuestos: Disulfuro de Dialilo, 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil[4H]-1,3-Ditiina y Trisulfuro de dialilo. En dicho estudio tambin aparece
reportado el tiopropanal, pero no el tipoentanal encontrado en la muestra.
Por otro lado no se han encontrado reportes exactos sobre la composicin en
fenoles y sustancias nitrogenadas
(14,22)
diferentes a los aminocidos en el ajo,
pero en la muestra se identificaron la trimetil tiourea y el 4-metil-2,6-di-ter-butil

fenol. Es de resaltar que la alicina, componente azufrado mas importante, no
se detect en el anlisis de forma directa; sin embargo, como en estudios
anteriores, se detectaron las sustancias: 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil-[4H]-1,3Ditiina en altas proporciones y otros compuestos azufrados, los cuales son el
resultado de una rpida degradacin de la alicina a las condiciones del GC (11).
55
Alicina
O
S
O
S
cido
CH2
H 2C
H 2C
H 2C
Tioacroleina
CH2
+
S
CH2
2 -propenosulfnico
S
OH
OH
H 2C
CH2
CH2
O
S
H 2O
H 2C
CH2
H 2C
2 -v in y l-4 H -1 ,3 -d ith iin e

3 -v in y l-3 ,4 -d ih y d ro -1 ,2 -d ith iin e
Figura No. 4: Degradacin de la alicina en Ditiinas(8)

4.4 ANLISIS MICROBIOLGICOS
Los anlisis microbiolgicos bsicos aplicados a la oleorresina de ajo, son los
que se realizan en forma general sobre alimentos para evaluar su inocuidad.
Se consideraron adecuados ya que la aplicacin principal de la oleorresina de
ajo es como agente natural de sabor y/o olor en la industria alimentaria. Los
anlisis fueron llevados a cabo bajo procedimientos estndar y con oleorresina
recin extrada. Las diluciones se llevaron desde 100 hasta 10-4 por la
incertidumbre en el nivel de contaminacin de la muestra.
4.4.1 Anlisis de Mesfilos, mohos y levaduras: como se observa en las
tablas No. 15 y 16, los resultados no muestran la presencia en la oleorresina
fresca de microorganismos mesfilos, mohos o levaduras.
Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras:
Recuento
(Ensayos)
Pura
1
0
2
0
3
0
Recuento estndar en
placa UFC/g
0
10-1
10-2
10-3
10-4
Dilucin
56
Tabla No. 16: Recuento de mesfilos aerobios viables

Recuento
(Ensayos)
Pura
1
0
2
0
3
0
Recuento estndar en
placa UFC/g
0
10-1
10-2
10-3
10-4
Dilucin
4.4.2 Determinacin de coliformes totales y coliformes fecales E-coli: al

realizar el anlisis de coliformes totales, en la prueba presuntiva, la
acumulacin de gas en la campana invertida en casi todas las diluciones,
evidenci una alta contaminacin en la oleorresina (tabla No. 17), razn
suficiente para obviar la prueba confirmativa. La determinacin de coliformes
fecales-E-coli
por
fluorescencia
UV,
mostr
un
nivel
importante
de
contaminacin de la oleorresina en todas las diluciones (tabla No. 18). El

recuento microbiolgico para las dos pruebas anteriores se llev a cabo de
acuerdo a la tabla estadstica de nmero ms probable (NMP) estandarizada
(29)
, arroj valores de recuento mayor a 1100, valor que sobrepas la
normatividad vigente (24).

Esta alta contaminacin se present, debido a que el material vegetal no fue
desinfectado en forma previa a la extraccin, y su contaminacin provino de su
forma propia de cultivo, almacenamiento, transporte y/o manipulacin antes de
ser elegidos y tratados para el proceso de extraccin. Teniendo presente que
el ajo no tiene propiedades bactericidas, sino propiedades bacteriostticas, es
decir, no elimina los microorganismos sino que impide su crecimiento, la alta
contaminacin indica que la carga contaminante super el poder inhibitorio de
los componentes en la oleorresina. Este hecho no es evidencia de prdida de
57
poder inhibitorio en la oleorresina, ya que esto ocurre normalmente cuando

existe una desproporcin en la relacin carga contaminante y concentracin de
compuestos inhibitorios en cualquier tipo de compuesto con estas propiedades.
Se procedi entonces a realizar un segundo anlisis de coliformes, aadiendo
una desinfeccin de los dientes de ajo sin cubierta, utilizando una solucin de
hipoclorito de sodio con un aporte de concentracin de cloro disponible como
Cl2 de 150 ppm, por aproximadamente 5 minutos en tiempo de contacto (27,28) y
enjuague con agua destilada antes de realizar el proceso de extraccin, y
conservando las mismas medidas higinicas en los procedimientos de
extraccin y sembrado de los anteriores anlisis. En este caso, los resultados
mostraron una total eliminacin de la contaminacin en la oleorresina, al
presentarse una resultado negativo de presencia de coliformes en la prueba
presuntiva tanto a las 24 como al las 48 horas (tabla No. 19). As mismo, no se
detectaron coliformes fecales a las 24 horas de la siembra microbiolgica (tabla
No. 20). Bajo el mtodo del NMP, el recuento arroj un valor menor a 3, con lo
que se cumple la normatividad (24).
Tabla No. 17: Prueba presuntiva (sin desinfeccin previa del material vegetal)
Dilucin
Acumulacin
de gas
(Ensayos)
1
2
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento NMP
>1100
58
Tabla No. 18: Determinacin de Coliformes fecales (sin desinfeccin previa del material
vegetal)
Fluorescencia
azul al UV
(Ensayos)
1
2
Dilucin
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento NMP
>1100
Tabla No. 19: Prueba presuntiva (con desinfeccin previa del material vegetal)
Dilucin
Acumulacin
de gas
(Ensayos)
2
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento NMP
<3
59
Tabla No. 20: Determinacin de Coliformes fecales (con desinfeccin previa del material
vegetal)
Dilucin
Fluorescencia
azul al UV
(Ensayos)
2
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento NMP
<3
60
5. CONCLUSIONES
1. De acuerdo con la comparacin de los resultados de las extracciones
efectuadas a diferentes condiciones, se encontr que el mayor
rendimiento de extraccin de la oleorresina, se obtuvo en la realizada en
fro, con etanol al 75% y ajo blanco, con un rendimiento promedio de
31.18% y desviacin de 0.1906, por lo cual el mtodo presenta un buen
nivel de extraccin, comparado con rendimientos en anteriores estudios
de extraccin con etanol al 95%
(25)
, adems de buena precisin,
hacindolo adecuado para prximos estudios de estandarizacin y

posibles aplicaciones industriales.
2. Siendo la oleorresina una mezcla compleja; el tipo y cantidad de anlisis
a realizar se ven restringidos a determinaciones generales aplicadas a
alimentos. En este caso se determinaron la acidez con un valor de
0.469% en cido oleico, 80.82% en materia seca, 3.25% en cenizas,
ndice de refraccin nD24 =1.4753 y grados brix (slidos totales) de
73.97%, valores que sirven como referencia de sus caractersticas
fsicas y qumicas medibles en forma directa, los cuales pueden ser
tomados como referencia para posteriores estandarizaciones.
3. El anlisis por GC-MS de la fraccin voltil soluble en etanol al 75% y
separada en ter etlico, muestra la presencia, entre otros, de
importantes compuestos azufrados como los alil-sulfuros y las ditiinas,
compuestos responsables de la mayora de las propiedades salutferas
y organolpticas del ajo. Como es de suponer, la oleorresina contiene en
forma concentrada las sustancias de verdadero inters del ajo, por lo
que una pequea fraccin reemplaza ampliamente una cantidad
proporcionalmente mayor de dientes de ajo sin procesar, ofreciendo
61
ventajas en la rapidez al momento de su uso, mayor durabilidad y por su

completa dispersin no genera residuos slidos insolubles. Teniendo en
cuenta lo anterior y conociendo que su extraccin es razonablemente
econmica, la relacin costo-beneficio hace viable su obtencin.
4. La evaluacin de la inocuidad de la oleorresina recin extrada, muestra
importantes resultados al no presentar evidencia de microorganismos
mesfilos, mohos o levaduras, que puedan alterar fcilmente la
oleorresina. Por otro lado, la desinfeccin adecuada del material vegetal
garantiza la no presencia de coliformes totales y fecales. Estos
resultados aseguran que la oleorresina puede ser usada para el
consumo en forma segura.
5. En general, el mtodo de extraccin de la oleorresina proporciona un
buen rendimiento en extracto y no presenta grandes inconvenientes en
la
manipulacin,
adems,
tiene
caractersticas
fisico-qumicas,
microbiolgicas y fuerte esencia caracterstica del ajo, que pueden

favorecer su implementacin en la industria alimentaria.
62
6. RECOMENDACIONES
1. Evaluar la composicin y proporcin de los azcares presentes en la
oleorresina, mediante mtodos adecuados, teniendo en cuenta a
complejidad qumica de la oleorresina.
2. Evaluar la posible presencia de sustancias lipdicas o aceite esencial en
la oleorresina de ajo.
3. Analizar fracciones de la oleorresina solubles en solventes de diversa
polaridad, para detectar ms componentes qumicos extrados del ajo,
incluyendo sustancias minerales y compuestos azufrados.
4. Al realizar la extraccin de la oleorresina con fines de obtener un
producto adecuado para su utilizacin en alimentos, se recomienda,
realizar una desinfeccin previa al material vegetal a utilizar, por su alta
exposicin a las contaminaciones microbianas, tomando precauciones
respecto a la concentracin del desinfectante y el tiempo de contacto,
con el fin de prevenir su absorcin por parte del material vegetal.
5. Implementar un diseo de experimento en posteriores ensayos de
extraccin, que garantice un mayor control matemtico de las
condiciones de ensayo y de los valores obtenidos, lo cual permita tomar
determinaciones basados en varios parmetros medibles.
63
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68
8. ANEXOS
8.1 CROMATOGRAMA DE GASES DE VOLTILES EN LA OLEORRESINA.
69
8.2 FRAGMENTOGRAMAS DE MASAS DE LAS SUSTANCIAS SEPARADAS

POR GC.
70
71
72
73

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OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE LA OLEORESINA DEL AJO

LEONARDO CARDONA PAREJA

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE LA OLEORESINA DEL AJO

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

NOTA DE ACEPTACIN DE TRABAJO DE GRADO

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:

1.1 Generalidades del Ajo (Allium Sativum)

1.2 Qumica del ajo

1.3 Bioqumica del ajo

1.4 Metodologas de anlisis

1.4.1 Anlisis fisicoqumicos

1.4.2 Anlisis microbiolgicos

1.5 Mtodos de extraccin

1.5.1 Extraccin soxhlet

1.5.2 Extraccin en fro

1.6 Anlisis instrumental

1.6.1 Mtodos de separacin cromatogrfica

1.6.2 Espectrometra de masas

1.6.3 Cromatografia/Espectrometria de masas GC/MS

2.1 Las oleorresinas

2.1.1 Oleorresina de ajo

3.1 Material vegetal

3.2 Preparacin de la muestra

3.3 Solventes utilizados

3.5 Separacin del extracto

3.6 Anlisis fisicoqumicos

3.6.1 Materia seca

3.6.3 ndice de refraccin

3.6.4 ndice de acidez

3.7 ANALISIS GC/MS

3.7.1 Preparacin de la muestra

3.7.2 Condiciones de anlisis

3.8 Anlisis microbiolgicos

3.8.1 Determinacin de Mesfilos aerobios viables

3.8.2 Determinacin de Mohos y Levaduras

3.8.3 Determinacin de Coliformes totales

3.8.4 Determinacin de Coliformes fecales

4.1 Extraccin de la oleorresina

4.2 Anlisis fisicoqumicos

4.2.1 ndice de acidez

4.2.2 Materia seca

4.2.4 ndice de refraccin

4.3 ANLISIS GC/MS

4.4 Anlisis microbiolgicos

4.4.1 Analisis de Mesofilos, mohos y levaduras

4.4.2 Determinacin de coliformes totales y coliformes fecales E-coli

8.1 Cromatograma de gases de voltiles en la oleorresina

8.2 Fragmentogramas de masas de las sustancias separadas por GC

Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo

Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo

Tabla No. 4: Parmetros microbiolgicos de las especias y sus derivados 36

Tabla No. 6: Extraccin en fro con ajo rojo

TablaNo.7: Extraccin soxhlet con ajo blanco

Tabla No. 8: Extraccin soxhlet con ajo rojo

Tabla No. 9: ndice de acidez

Tabla No. 10: Materia seca

Tabla No. 11: Cenizas

Tabla No. 12: ndice de refraccin y grados Brix

Tabla No. 13: Caractersticas de los picos cromatogrficos

Tabla No. 14: Interpretacin de los principales fragmentos de los

Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras

Tabla No. 16: Recuento de mesfilos aerobios viables