Guia de Practicas MICROBIOLOGIA UCSUR SIEVER 2015 PDF

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNICA
PRIMERA ACREDITADA A NIVEL NACIONAL
CMVZ.2015
GUA DE PRACTICA DE MICROBIOLOGA

VETERINARIA
Prof. Responsable |
MV. SIEVER MIGUEL MORALES CAUTI
Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

i
GLOSARIO
Acidfilo
Bacterias que desarrollan mejor a pH menor a 5.5
Aerbico
requiere oxgeno libre para la respiracin.
Aerobio facultativo
crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de oxigeno libre.
Alcalofilo
bacterias que desarrollan mejor a pH mayor a 8.0
Anaerobio
no requieren oxigeno libre para la respiracin.
Anaerobio obligado
muerte de bacterias en presencia de oxigeno, crecimiento solo

en ausencia del mismo.
Antibacteriano
agente que destruye a las bacterias.
Bactericida
con actividad letal antibacterial.
Bacteriosttico
agente que detiene el crecimiento bacterial.
Colonia bacteriana
agrupacin de un tipo de clulas bacterianas sobre un medio de

cultivo.
Cultivo diferencial
Crecimiento de los microorganismos, causando un

visual en el medio de cultivo.
Cultivo selectivo
permite el crecimiento particular de una bacteria, por que hace

uso de inhibidores.
Fisin binaria
proceso a travs del cual, las clulas bacterianas se replican.
UFC
unidad formadora de colonias (en gramo o mililitro), esta es la

forma estndar de medir a nivel bacteriano.
Mesfilos
ptimo crecimiento entre 25 y 40 C
Microaerfilos
ptimo crecimiento en bajas concentraciones de oxigeno.
Psicrfilo
ptimo crecimiento entre 4 y 20 C algunos hasta 0C.
Termfilo
ptimo crecimiento entre 50 y 60 C algunos hasta 100 C
Sensibilidad
susceptibilidad de una bacteria hacia un antibacteriano.
Serologa
parte de la medicina que estudia los sueros y sus propiedades,

especialmente las inmunolgicas.
MV. Siever Miguel Morales Cauti
cambio

El trabajo con los microorganismos se clasifican segn cuatro grupos de riesgo individual y
comunitario, a saber:
Grupo de nivel de riesgo 1. (Riesgo individual y comunitario escaso o nulo).
Grupo de riesgo constituido por microorganismos que tienen pocas
probabilidades de provocar enfermedades en humanos o en animales.
Grupo de nivel de riesgo 2. (Riesgo individual moderado, riesgo comunitario
bajo).
Grupo de riesgo constituido por agentes patgenos que pueden
provocar enfermedades en humanos o en animales, pero que tiene pocas
probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la
comunidad, los animales o el ambiente. La exposicin en el laboratorio puede
provocar una infeccin, pero aplicando medidas eficaces de tratamiento y
prevencin, el riesgo de propagacin es limitado.
Grupo de nivel de riesgo 3. (Riesgo individual elevado, riesgo comunitario
moderado).
provocar enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo riesgo de
propagarse en la comunidad. Se aplicar al diagnstico, investigacin y
produccin en el cual se trabaja con agentes que pueden causar una
enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la
exposicin a aerosoles. Puede disponerse o no de medidas eficaces de
tratamiento y de prevencin.
Grupo de nivel de riesgo 4. (Riesgo individual y comunitario elevado).
provocar enfermedades graves en las personas o en los animales, con alto
riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de medidas
eficaces de tratamiento y prevencin.
A su vez los tipos de actividades u operaciones que se pueden realizar con los microorganismos se
definen como:
A: Actividad que no multiplica ni disemina el microorganismo

B: Actividad que multiplica y/o disemina el microorganismo.
C: Trabajo con animales potencialmente infectados.

De la interrelacin entre las dos clasificaciones anteriores se establece, para un listado de
microorganismos, el nivel de bioseguridad necesario entre los siguientes cuatro posibles:
Nivel de bioseguridad 1: Debe contemplar lo siguiente:
a) El trabajo es generalmente realizado sobre mesadas abiertas y se usan tcnicas
microbiolgicas adecuadas.
b) No se requiere equipamiento de contencin ni diseo especial de infraestructura.
c) El personal de laboratorio debe tener capacitacin continua y supervisin de un
profesional habilitado.
d) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.
Nivel de bioseguridad 2: Debe contemplar lo siguiente:
a) El personal de laboratorio debe tener entrenamiento especfico para manipular agentes
patgenos y estar supervisado por un profesional habilitado.
b) El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado.
c) Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto-punzantes.
d) Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser
realizadas con equipamiento y/o procedimientos de contencin fsica.
e) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.
Nivel de bioseguridad 3: (Laboratorios de contencin).
Se debe aplicar al diagnstico, investigacin y produccin cuando se trabaja con
agentes que puedan causar una enfermedad grave o potencialmente letal,
principalmente como resultado de la exposicin a aerosoles. Debe contemplar lo
siguiente:
a) La capacitacin debe ser especfica.
b) Todos los procesos que involucran manipulacin de este nivel de material infeccioso
deben ser realizados en cabinas de seguridad biolgica.
c) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada y disponer de vestuario
doble con ducha.
d) El laboratorio debe tener diseo e instalaciones adecuadas para la contencin.
e) Es necesario el tratamiento de los efluentes lquidos.
f) Se debe usar filtracin absoluta HEPA del aire extrado y presin negativa en el
laboratorio.
Nivel de bioseguridad 4: (Laboratorio de mxima contencin) Debe contemplar lo siguiente:
a) El acceso al laboratorio debe ser estrictamente controlado (ingreso y egreso
documentados) y debe estar aislado del resto de las instalaciones.
b) Dentro de las reas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de seguridad
biolgica Clase 3 o gabinetes de seguridad biolgica Clase 2 con traje presurizado para el
operador.
c) Se debe realizar el tratamiento in situ de los efluentes.
d) Se debe usar filtracin absoluta doble HEPA del aire extrado, y aplicar presin negativa
en el laboratorio.
Cada nivel de bioseguridad incluye las medidas del nivel anterior. La norma aclara que
en el caso que durante una investigacin microbiolgica se produzca evidencia de la presencia
de un microorganismo que requiera un nivel de bioseguridad superior al del mbito donde se
efecta el trabajo, toda manipulacin posterior con dicho microorganismo se realizar
nicamente en un mbito de nivel de bioseguridad correspondiente o se proceder a su
destruccin de acuerdo con las reglamentaciones legales vigentes.
PRCTICA N 1
BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE

LABORATORIO
BIOSEGURIDAD: Es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la salud de adquirir infecciones en el
medio laboral. Son todos aquellos principios, normas y estrategias de disminucin de riesgos.
Seal de
peligro
biolgico
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estndares rutinariamente
para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro
fluido corporal del paciente (muestras orgnicas), cultivos bacterianos vivos, etc.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros

fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, mediante la utilizacin de materiales
adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras (Ej.
Guantes, mascarillas) no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen
las consecuencias de dicho accidente.
C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de

dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales utilizados en la
obtencin de muestras y procesamiento de las mismas, son depositados y eliminados sin
riesgo.

RECOMENDACIONES A SEGUIR EN EL LABORATORIO:
1.
Proteccin de la piel: Usar guantes limpios, no necesariamente estriles, previo al

contacto con: sangre, fluidos corporales, secreciones, excreciones, mucosas y
materiales contaminados. Para procedimientos invasivos se deben usar guantes de
ltex, estriles y luego descartarlos.
2.
Proteccin ocular: La proteccin ocular y el uso de mascarillas tiene como objetivo

proteger membranas mucosas (ojos, nariz y boca) durante procedimientos que puedan
generar aerosoles y salpicaduras de sangre, de fluidos corporales, secreciones y
excreciones. Los lentes y mascarillas deben ser amplios y ajustados al rostro para
cumplir eficazmente con la proteccin
3.
Proteccin corporal: A travs del mandil blanco de manga larga.
4.
No comer, beber, ni fumar en el laboratorio
5.
No manipular el sistema elctrico con las manos hmedas.
6.
Las mesas de trabajo deben estar desinfectadas antes de inicio y trmino de la prctica.
Para ello, se puede emplear amonio cuaternario, bicloruro de mercurio al 1%, formol
al 2%, cido fnico al 5%, alcohol yodado, etc. Las cuales son soluciones
desinfectantes no corrosivas para la piel.
7.
Ser cuidadosos en el manejo de los equipos y material de trabajo.
8.
Coordinar permanentemente con el responsable de la prctica el manejo de material

infeccioso.
9.
Antes de realizar observaciones en el microscopio, analizar previamente las

condiciones en que se encuentra el microscopio (espejo, diafragma abierto o cerrado,
etc.) Para la observacin, usar el objetivo de 100 x con aceite de inmersin. Al finalizar
las observaciones limpiar el objetivo de 100x con papel lente.
10. Revisar que los grifos queden cerrados.

11. Tomar atencin de las zonas protegidas para casos de sismos.

RECOMENDACIONES PARA ALUMNOS:
1.-
La asistencia a las prcticas es obligatoria: si pierde una prctica no tendr oportunidad de

repetirla.
2.-
El estudiante ingresar al saln de prctica llevando consigo, mandil blanco y el manual

de prcticas.
3.-
El alumno deber leer con anticipacin la prctica correspondiente a la fecha, a fin de

verificar el material necesario.
4.-
Los alumnos se agruparn en las mesas de trabajo y realizarn las experiencias bajo la
direccin de un profesor instructor.
5.-
No efectu las experiencias mecnicamente, sino entendiendo el fundamento de las

mismas.
6.-
No se debe comer, fumar ni beber agua de los grifos.
7.-
Debe cuidarse el equipo y material, cumpliendo las instrucciones del profesor para evitar
accidentes y rotura de material.
8.-
Cualquier accidente como rotura de tubos con medios o derrame de alguno de los
cultivos deber comunicarse a la persona responsable de la prctica, para que se tomen
las medidas adecuadas.
9.-
Durante la prctica anotar todas las ocurrencias en el manejo de las tcnicas utilizadas.
10.-
Las mesas de trabajo deben mantenerse libres de material innecesario (prendas de vestir,
libros y otros).
11.-
Etiquetar el material cuando sea necesario para que pueda ser fcilmente identificado.
12.-
Tener especial cuidado cuando maneje material contaminado y descartarlo en los

recipientes que se colocarn para este fin.
13.-
Al finalizar la prctica deber ordenar el material utilizado sobre la mesa de trabajo y,

cuidar que los grifos de agua estn cerrados as como las llaves de gas.

EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
Para trabajar en las prcticas de microbiologa, se requiere de equipos y materiales

especiales, as como de un comportamiento y normas estrictas.
OBJETIVO:
Reconocer el material y la utilidad de los mismos en el laboratorio.
EQUIPOS:
Microscopio ptico, Flujo laminar, Refrigeradoras, Congeladora, Lector de ELISA,
Centrfuga, Bao Mara, Autoclave, Estufas, Homogenizador, Potencimetro, Agitador
magntico, Contador de colonias, Balanza, Estereoscopio, Equipo de PCR en tiempo real
MATERIAL DE VIDRIO:
Laminas portaobjetos, Campana de Anaerobiosis, Laminillas, Placas petri, Tubos de ensayo,
Tubos de centrfuga, Pipetas graduadas, Pipetas, Micro pipetas, Beakers, Pipetas Pasteur,
Erlenmeyer, Embudos, Probetas.
MATERIAL DE CIRUGA
Tijera punta recta y curva, Pinza simple, Pinza ranurada, Esptula, Bistur, Mango de bistur,
Bandejas, Bolsas estriles, Guantes
OTROS
Filtros, Frascos con desinfectante, Ansas de siembra, Gradillas, Mecheros, Medios de cultivo,
Porta lminas, Magnetos, Papel lente, Goteros, Colorantes, Papel toalla, Jeringas, Gas pack,
Refrigerante, Reactivos.
PRCTICA N 2
DESCONTAMINACIN, LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

1.
ESTERILIZACIN:
Puede definirse la esterilizacin la como destruccin completa de todas las
formas de vida microbiana (virus, bacterias y hongos), en trminos de la capacidad del
microorganismo para reproducirse, incluidas las esporas contenidas en un producto.
No existen grados de esterilidad. Un objeto es estril o no lo es. La esterilizacin se
consigue por una serie de agentes fsicos o qumicos.
ESTERILIZACIN POR MTODOS FSICOS:
CALOR SECO (HORNO)

Elimina bacterias y esporas por destruccin oxidativa de los componentes
celulares a temperaturas de 160 C por una hora, tiempo en el que las bacterias
ms resistentes y las esporas mueren.
CALOR HMEDO:
- Ebullicin: El agua hirviendo a temperatura de 100C por 10 minutos destruye
todos los microorganismos no esporulados.
- Autoclave: El vapor a 15 libras de presin y una temperatura de 121 C., el cual

es capaz matar a las esporas en 15 minutos.
FILTRACIN:
FILTROS:
Se realiza a travs de filtros de membrana. Estos poseen varios grados de
porosidad. El dimetro de los poros oscila desde 0.22 a 0.10 um. Se emplean para
la purificacin de medios a travs de la retencin de bacterias. Ej: filtros Seitz.
10
RADIACIN:
La luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas vegetativas de los
microorganismos que carecen de proteccin. La accin bactericida de la luz solar
se debe a la banda ultravioleta del espectro.
LUZ ULTRAVIOLETA:
Es utilizada en flujo laminar, quirfanos y otras zonas, con el fin de disminuir las
infecciones transmitidas a travs del aire.
ESTERILIZACION POR MTODOS QUMICOS

Pueden utilizarse como desinfectantes muchas sustancias qumicas, dado que el
nmero y la variedad de productos es cada vez mayor; deben elegirse cuidadosamente las
formulaciones de acuerdo a las necesidades concretas.
La actividad germicida de muchas sustancias qumicas pueden ser modificadas u optimizadas
por factores externos como: La temperatura, pH, tiempo de actividad, naturaleza del
microorganismo, presencia de material extrao, etc.
2.
DESINFECCIN:
Proceso mediante el cual un agente qumico destruye microorganismos capaces
de producir una infeccin, eliminando o disminuyendo a cantidades mnimas los
microorganismos patgenos existentes. Todos los desinfectantes son eficaces frente a
las formas vegetativas, pero no necesariamente actan frente a las esporas.
Pasteurizacin: En la pasteurizacin lenta, la temperatura alcanza los 63C y debe

permanecer durante 30 minutos y en la pasteurizacin rpida la temperatura debe estar
a 72 C durante 15 minutos. Sobreviven algunas bacterias en forma vegetativa que
resisten al calentamiento.
OBJETIVOS:
Aprender a utilizar las tcnicas de esterilizacin.

Controlar y verificar la esterilizacin de los materiales usados.
TRABAJO PRCTICO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Caldo tripticasa de soya (TSB)100 ml

08 Tubos de ensayo con algodn
Ansas de siembra
Lminas portaobjeto
Inoculo bacteriano
04 Placas petri
Filtros Seitz para lquidos 0.22 u
Algodn
Papel craft
Cinta de autoclave
Autoclave
Horno
Flujo laminar

1. ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE:
PROCEDIMIENTO:
Hacer coloracin Gram a partir del tubo con Escherichia coli.
Observar al microscopio.
Autoclavar (15 lbs/15m) los tubos para su esterilizacin.
Hacer la coloracin Gram del cultivo ya esterilizado.
Observar al microscopio.
Sembrar los tubos con el cultivo ya esterilizado en tubos con caldo Trypticasa de
soya (TSB).
Utilizar un tubo con caldo nutritivo e inoculo sin autoclavar (control)
Incubar a 37 C por 24 horas.
Observar y evaluar las diferencias, causas y efectos.
2. ESTERILIZACIN EN EL HORNO:
MATERIAL DE CIRUGA:
Envolver por separado (tijeras, pinzas, etc.) con papel kraft.
Placa petri
Porta placas
Pipetas
Porta pipetas
Tubos
Algodn
Papel kraft
Cinta de autoclave
PROCEDIMIENTO:
-
Envolver con el papel kraft las placas individualmente.

Tapar los tubos con algodn y luego envolverlos en grupos.
Llevar al horno a 160 C por una hora.
Evaluar las causas y efectos del procedimiento.
Cuestionario
1. Enumere las utilidades de uso de tres mtodos de esterilizacin respecto a materiales
y equipos de laboratorio?
2. Cules son los factores externos que afectan la potencia desinfectante de los
diferentes agentes qumicos y como modifican su actividad?
3. Recomendaciones de uso de desinfectantes comerciales (principios activos) en
actividades pecuarias.
12

PRCTICA N 3
MEDIOS DE CULTIVO Y TIPOS DE SIEMBRA
MEDIOS DE CULTIVO
Estos contienen una base mineral, fuente de carbono, nitrgeno y azufre, atmsfera
adecuada y factores de crecimiento necesarios para el desarrollo de las diferentes especies
bacterianas u hongos. La mayora de estos desarrollan en medios neutros o ligeramente
alcalinos, mientras que existe un grupo minoritario que prefiere un medio cido. La
temperatura adecuada para el desarrollo de microorganismos mesfilos vara entre los 15 y 43
C. En cambio, los microorganismos psicrfilos desarrollan hasta los 0C; y otros, como los
termfilos, pueden crecer hasta los 80 C. Los microorganismos patgenos en general, estn
limitados por una escala de temperaturas, comparativamente estrecha, alrededor de 37C.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. POR SU CONSISTENCIA
a) MEDIOS LQUIDOS (CALDO)
Es un medio de cultivo lquido, libre de Agar que contiene productos crnicos
o proteicos (peptonas, extractos), con adicin de algn tampn para mantener el pH
adecuado. Ej.: Caldo Trypticasa de Soya, Caldo Infusin Cerebro-Corazn, Caldo
Thyoglicolato.
En la siembra de medios lquidos se observan, pelcula,

sedimento y turbidez

b) MEDIOS SLIDOS (AGAR)
Es un medio para verter en placas petri o en tubos, donde un el 1 a 2% es agar.
En estos medios, se obtienen colonias aisladas (conjunto de bacterias que provienen
de una clula madre), las cuales presentan las mismas caractersticas morfologicas,
genticas y fisiolgicas.
Ejemplo: Agar trypticasa de soya, Agar sangre, Agar chocolate, Agar Mac Conkey y
Agar Salmonella-Shigella.
c) MEDIOS SEMISLIDOS (MEDIO)

Un medio es semislido cuando contiene menos del 1% de Agar en su composicin.
Ej.: Medio SIM.
Agar sangre, Agar Trypticasa, Agar Mac Conkey
2. POR SU ESPECIFICIDAD
a) MEDIOS GENERALES
Son medios que carecen de inhibidores, por tanto, permiten el desarrollo en el
cultivo de un sin nmero de bacterias, tanto grampositivas como gram negativas. Ej.:
Agar TSA.
b) MEDIOS SELECTIVOS
Son medios que contienen sustancias inhibidoras o antibiticos, que permiten
el desarrollo selectivo de determinados microorganismos.
Ejemplo: Agar Mac Conkey (permite unicamente el crecimiento de bacterias
gramnegativas).
14
c) MEDIOS ESPECFICOS
Son medios que permiten el desarrollo de un microorganismo determinado a
partir de poblaciones mixtas, ya que contienen nutrientes que favorecen el desarrollo
de microorganismos especficos.
Agar
SS.
Baird Parker.
Agar Corynebacterium.
Agar Verde Brillante.
Agar SPS.
Agar XLD.
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA PREPARACIN DE DIVERSOS

MEDIOS DE CULTIVO
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
En una probeta medir 100ml de agua destilada.

Pesar el medio de cultivo segn indicacin del frasco y colocarlo en un
Erlenmeyer.
Agregar los 100 ml de agua destilada al Erlenmeyer y mezclar.
Hervir el medio hasta disolver los ingredientes agitando suavemente.
Ajustar el pH a 7.3 +/- 0.2 a temperatura de 25 C, o segn la indicacin.
Tapar y rotular el frasco con el medio de cultivo.
Esterilizar (si es necesario) en autoclave a 15lbs de presin durante 15 minutos
a 1210 C.
PROCEDIMIENTO PARA EL LLENADO DE PLACAS PETRI.

Se vierte el agar en placas petri con mucho cuidado, esta operacin se realiza en el
flujo laminar y/o al lado del mechero, sin hablar (de preferencia con mascarilla), para
evitar que se contamine.
Inmediatamente despus (antes que comience a solidificarse) se flamea la superficie
del agar con la llama del mechero. El fin de esta operacin es eliminar las burbujas
de la superficie del agar.
Cuando el agar este solidificado, invertir las placas e incubarlas a 37 C durante 24-48
horas y verificar la esterilidad; eliminando la placa que estuviera contaminada.
Las placas se conservarn a 4 C hasta el momento de ser utilizado.
MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL:

a. MEDIO DE AGAR SANGRE
Es un medio diferencial que permite revelar caractersticas de diversos
microorganismos. Permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no
exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin
para anaerobios.
Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies
bacterianas debido a la accin de sus hemolisinas sobre la sangre contenida en el agar. La
hemlisis observada puede ser completa (hemlisis beta, produce un halo transparente
alrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de
la colonia) o ausencia de hemlisis (hemlisis gamma).
Hemlisis producida por cepas

de Streptococcus sp.
Preparacin
Placa de agar sangre con

colonias de bacterias
hemolticas
Se prepara a partir de agar trypticasa de soya. Este se esteriliza, y cuando se

encuentre a una temperatura entre 40 a 45 C, se adiciona de 5% a 10% de sangre estril
preferentemente de ovino.
b. MEDIO AGAR MAC CONKEY

Generalmente es usado para el aislamiento selectivo de bacilos gramnegativos
(enterobacterias y coliformes). Las sales biliares y el cristal violeta inhiben bacterias
grampositivas
Para el cultivo en este medio se toma como muestra sobretodo rganos, muestra de
agua para contaje de coliformes y diferenciacin de bacterias patgenas en productos
lcteos, realizndose una siembra directa de dichas muestras.
La lactosa y el indicador rojo neutro presentes permiten diferenciar a las bacterias
fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de lactosa, las que le imparten un color
rosado transparente a un pH 8, como Salmonella spp. (lactosa -). Las colonias
16

fermentadoras de lactosa producen una cada localizada del pH a 6.8, seguido por la
absorcin del rojo neutro, lo que le imparte un color rojo-fucsia.
Ej.: colonia de Escherichia coli (lactosa +).
Preparacin.
Pesar 5g de agar mac conkey y colocar en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta disolver el Agar.
Medir el pH 7.1+/-0.2.
Esterilizar en autoclave.
c. MEDIO AGAR MUELLER HINTON

ste medio carece de inhibidores e indicadores, lo que permite el crecimiento
de una gran variedad de microorganismos, tanto grampositivos como gramnegativos.
Se utiliza para realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma).
Preparacin:
Pesar 3.8g de Mueller hinton y colocarlo en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta disolver agitndolo.
d. MEDIO AGAR SABOURAUD (Agar glucosado de Sabouraud)

Es un excelente medio basal, al cual se le puede aadir antibiticos y otros
inhibidores para el cultivo selectivo de varios grupos de hongos (levaduras y mohos).
El contenido de glucosa y el pH cido facilitan el crecimiento de los mismos.
Preparacin:
Pesar 6.5g de Agar Sabouraud, colocarlo en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada.
Calentar hasta disolver agitndolo.
Antes de colocar en placas, adicionar antibitico si es necesario.
1. MTODOS DE SIEMBRA
Los mtodos de siembra varan de acuerdo al medio y al tipo de muestra a utilizar; por
ejemplo, se pueden utilizar agares en placas petri, caldos, medios semislidos y slidos en
tubos; y cada uno puede ser inoculado con la muestra de manera distinta.
A. Inoculacin de medios slidos en placas petri

La superficie del agar de las placas de petri se puede inocular con la muestra por varios
mtodos. El inoculo primario se puede efectuar con un ansa, un hisopo, o directamente con
una impronta del rgano. Una vez hecho el inoculo primario, se emplea un ansa a fin de
diseminar el material en toda la placa. La siembra puede realizarse de 2 maneras:
a. Por estras:
El inoculo se disemina en la placa a travs de estras sucesivas, con un movimiento
hacia los lados asemejando una S. El propsito de esta tcnica es reducir el inoculo lo
suficiente hasta obtener colonias bacterianas aisladas, las que posteriormente se podrn
cultivar en medios diferenciales para su posterior identificacin.
b. Por agotamiento
Esta tcnica se utiliza sobretodo en ocasiones donde las muestras son copiosas o densas
(moco, heces, etc.), se toma con el ansa una pequea cantidad de la muestra y se esparce
hacia los lados dndole la vuelta a la placa en ngulos de 90. El ansa se debe esterilizar
entre las sucesivas estras y esparciendo la muestra desde el ltimo punto donde se coloc;
de esa manera, tendremos colonias que crecern aisladas unas de otras, como se muestra
en el siguiente esquema.
Mtodos de Siembra: Por
agotamiento
18
B. Medios semislidos slidos en tubos

Los tubos con medios en picos de flauta se inoculan primero, atravesando el agar en
profundidad con un ansa recta y se contina sembrando por estras en la parte inclinada de
abajo hacia arriba. Cuando se inoculen medios semislidos para pruebas de movilidad el
ansa se sumergir en profundidad en ngulo recto y se retirar cuidando que sea por el
mismo trayecto de entrada.
Siembra de medios slidos en tubos
A. Atravesar el agar con el ansa
recta.
B. Retirar el ansa y sembrar por
estras la superficie del agar
C. Medios lquidos
Los medios lquidos se pueden inocular inclinando el tubo a un ngulo de
aproximadamente 30 y acercar un ansa con el inoculo a la superficie del vidrio justo en el
punto que se muestra en el esquema y diluir el inculo poco a poco con el caldo.
Inoculacin de un tubo con caldo

A. Inclinar el tubo e inocular en el sitio
indicado
B. Volver el tubo y diluir la muestra con
el caldo.
Cuestionario
1.
Fundamente y esquematice los medios y mtodos de siembra para cinco diferentes
muestras de secreciones y excreciones de diferentes animales de importancia pecuaria.
2. Existen otros mtodos de aislamiento y cuantificacin de bacterias en muestras
microbiolgicas?
3. Enumere las utilidades de ocho diferentes medios de cultivo.

PRCTICA N 4 y 5
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA. RECONOCIMIENTO DE
ESTRUCTURAS BACTERIANAS.
Los mtodos de coloracin han servido en el conocimiento de las clulas, determinando
e identificando las diversas estructuras y componentes qumicos que poseen stas. En nuestro
estudio se utilizan para determinar la morfologa bacteriana por afinidad de algunas estructuras
por ciertos colorantes. Los colorantes normalmente son soluciones acuosas, por lo cual
utilizan alcohol y mayor proporcin de agua destilada, ya que el exceso del primero
deshidratara demasiado a las clulas objetivo. Estos compuestos qumicos son utilizados para
aumentar el contraste.
Para la observacin se usa el microscopio con el objetivo de 100X y aceite de inmersin,
observndose los microorganismos teidos. Casi todos los colorantes son sales (compuestos
formados por iones cargados). Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que
tie es el in cargado positivamente; mientras que en los cidos, el colorante es el in cargado
negativamente.
OBJETIVOS:
Realizar las coloraciones con la finalidad de observar caractersticas estructurales como
cpsula, espora, etc. de los diversos gneros bacterianos, as como, comprender el fundamento
de las reacciones qumicas que se presentan.
Existen 3 tcnicas de coloracin:
1. Coloracin simple:
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. El empleo de ste colorante es
slo para incrementar el contraste. Ej. Azul de metileno
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar el frotis.
Fijar a la llama.
Colorear: colocando azul de metileno (2 3).
Lavar con agua corriente, secar.
Observando al microscopio con objetivo de 100x y aceite de inmersin las bacterias
se tien de color azul.
2. Coloracin diferencial
Se usa dos o ms colorantes para distinguir tipos de microorganismos, esta tcnica
consta de dos etapas, una tincin primaria seguida de una tincin de contraste. En la
tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie los microorganismos no teidas por
el primer colorante.
Ej. Tincin Gram, Tincin cido alcohol resistente.
20
2.1. Mtodo de coloracin GRAM

Este mtodo tiene utilidad prctica, porque nos permite diferenciar la morfologa
bacteriana (cocos, bacilos, espiroquetas). Sobre la base de su reaccin a la tincin de gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
a. Si la muestra proviene de un lquido:

Se toma una gota del liquido con el aro de ansa de siembra y se coloca en el centro del
portaobjetos, se procede a extenderla en forma circular en un rea de 1 x 1cm; se fija a la
llama, pasando suavemente a unos centmetros por encima de ella evitando que no ebulla
o se queme (el calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus
protenas).
b. Si la muestra proviene de un slido:

Primero, se coloca una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y luego, con el ansa
de siembra se coloca una cantidad pequea de muestra (colonia bacteriana) y se hacen las
extensiones mezclando con el agua, luego se fija a la llama hasta secar. En caso de tratarse
de rganos se hacen improntas directamente a la lmina.
Pasos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Preparar el frotis.
Fijar por calor (en la llama).
Colorear con cristal violeta, dejar un minuto.
Lavar con agua corriente.
Cubrir el preparado con lugol y dejar un minuto.
Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lmina con alcohol-acetona hasta observar que
ya no sale ms colorante.
7. Lavar la lmina con agua corriente.
8. Coloracin de contraste: colocar fucsina bsica o safranina por 1 minuto.
9. Lavar la lmina con agua corriente, secar y observar al microscopio con aceite de
inmersin (100X).
10.
FUNDAMENTO DEL MTODO DE GRAM
Las bacterias grampositivas protegen su membrana con una gruesa pared celular. El
principal constituyente de la pared es un polmero complejo de azcares y aminocidos
denominado murena o peptidoglucano.
La murena es el componente crtico para el mantenimiento de la forma y la rigidez de
los microorganismos grampositivos y gramnegativos, pero desempea un papel importante en
la proteccin de la membrana celular de los microorganismos Gram positivos, que poseen una
pared celular muy gruesa.

Los microorganismos gramnegativos han optado por una solucin radicalmente
diferente para el problema de la proteccin de la membrana citoplasmtica. Elaboran una
estructura totalmente diferente, una membrana externa, que es construida fuera de la pared
celular de murena. La membrana externa es qumicamente diferente de las membranas
biolgicas habituales y tiene la capacidad de resistir a las sustancias qumicas lesivas.
La membrana externa es una estructura de dos capas, pero su hoja externa contiene un
componente nico adems de los fosfolpidos. Se trata de un lipopolisacrido bacteriano o
LPS, una molcula compleja que no se halla en otros sitios en la naturaleza.
22
Espacio
Periplasmtic
o
Membran
a
Pared celular bacteriana

Envoltura de una bacteria grampositiva
Envoltura de una bacteria gramnegativa
a.
Las bacterias gramnegativas poseen ms cantidad de lpidos en su pared celular.
Las bacterias grampositivas poseen una capa de glucopptido ms gruesa que las
hace ms resistentes a los agentes mecnicos.
Coloracin Alcohol-cido Resistente (Tincin de ZielhNeelsen Modificado)

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con
colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Tienen un alto
contenido lipdico, fundamentalmente fosfolpidos y ceras.
Es til para el diagnstico de Mycobacterium sp. y Brucella sp. El complejo
fucsina-fenol resiste la decoloracin (alcohol cido) porque est ligado a los lpidos y se
consigue por el calor o aumentando el tiempo de contacto para que la fucsina penetre
profundamente y pueda resistir la accin decolorante del alcohol-cido, resultando los
bacilos de color fucsia sobre un fondo azul.
Procedimiento
1. Hacer el frotis y fijar a la llama.
2. Colorear con Fucsina fenicada por 5 minutos.
3. Calentar a la llama hasta que empiece a desprender vapor, evitando que ebulla o
se seque.
4. Dejar enfriar, luego lavar con agua corriente.
5. Decolorar con alcohol-cido.
6. Coloracin de contraste: vertiendo azul de metileno, dejar por 30.
7. Lavar con agua, secar y observar al microscopio.
3. Coloracin especfica:
Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares,
entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y las cpsulas. Ej. Tincin de cpsula
(tinta china) y esporas de Wirtz-Conklin.
3.1 Coloracin de Cpsula por el Mtodo de la Tinta China:
Esta es una tcnica de coloracin considerada como tincin negativa, ya que, las
clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve,
por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente
rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono
coloidal).
Materiales

1.
2.
3.
4.
5.
Lminas limpias
Tinta china
Suspensin bacteriana
Ansa de siembra
Laminilla cubre objetos
Procedimiento
1. Poner en una lmina una gota del microorganismo diludo, bien mezclado.
2. Aadir una gota de tinta china.
3. Mezclar bien.
4. Cubrir con una laminilla.
5. Observar al microscopio con lente de inmersin reduciendo la luz (bajando el
condensador).
3.2 Coloracin de Espora: Mtodo de Wirtz:

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
producen en su interior forma resistentes denominadas esporas. Estas se producen
cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una
espora en cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula
vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la
espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos.
Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con
agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo
colorante.
Materiales
1. Lminas porta objetos
2. Suspensin del microorganismo
3. Ansa de siembra
4. Colorante verde malaquita
5. Colorante safranina
24

Procedimiento
1.
2.
3.
4.
Hacer el frotis y fijarlo al calor.

Aadir verde Malaquita y calentar a llama dbil por 2 a 3 (evitar ebullicin).
Lavar con agua corriente ms o menos 30.
Aadir fucsina o safranina por 30. Lavar y observar con objetivo de 100x y
aceite de inmersin.
Se observarn las esporas de color verde brillante y el resto color rosado.
Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus sp.
Cuestionario
1.
Cules son las fases de la esporulacin?
2. Describa los tres tipos de esporas segn su localizacin y de ejemplos de estos.

3. Cual es el concepto de endoespora?
PRCTICA N 6
PRINCIPALES MTODOS Y TCNICAS UTILIZADOS EN LA
IDENTIFICACIN MICROBIANA
La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin
dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la
comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin
considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de
bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. El sistema de clasificacin de bacterias
mas comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology en el cual se
detallan los nombres cientficos y su relacin con otras bacterias.
La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes
combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Para
evaluar caractersticas bacterianas se pueden utilizar diversos mtodos, uno de los mas
conocidos son los ensayos bioqumicos, llamadas pruebas bioqumicas convencionales,
generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas)
a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o
ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va
metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de
cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata
de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el
medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el
microorganismo en estudio es exigente.
REQUISITOS PARA IDENTIFICAR UNA BACTERIA MEDIANTE PRUEBAS

BIOQUIMICAS
La realizacin de una prueba bioqumica implica:
1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o
inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de
la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.
26

2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de
una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica.
3. Tener un cultivo fresco de la bacteria (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el
microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y
temperatura adecuados.
4. LLevar a cabo los correspondientes controles de calidad de los medios de cultivo
utilizados, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese
prueba.
MEDIOS UTILIZADOS PARA LA DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE LAS

BACTERIAS:
Citrato de Simmons
TSI y/o Kliger
Caldo de rea
Lisina
Rojo de Metileno (RM)
Voges-Proskauer (VP)
Caldo Malonato
Esculina
SIM
LIA
Nitratos
Medios de carbohidratos
Gelatina
Leche tornasolada
Prueba de oxidasa
Reactivo de Kovacs o James
Prueba de la Catalasa
PRINCIPALES
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
IDENTIFICACION BACTERIANA.
UTILIZADAS
EN
LA
Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de
identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente,
agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente.
1) Enzimas vinculadas con la respiracin
a) oxidasa
b) catalasa
2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros
2.1) Requerimientos de oxgeno

a. OF (xido-fermentacin)
b. Crecimiento en caldo tioglicolato
2.2) Produccin de cido, o cido y gas
a. Fermentacin de carbohidratos
2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas
a. RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)
b. Gluconato
c. O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico)
d. Esculina
e. Hipurato
3) Fuente nica de carbono
a. citrato
b. malonato
c. hipurato para coliformes
4) Utilizacin de compuestos nitrogenados
4.1) Reduccin de nitrato
a. Asimilacin
b. Denitrificacin
4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros
a. Indol
b. H2S
c. Fenilalanina
d. Lisina, arginina, ornitina
e. Urea
5) Ensayos combinados
a. TSI (Agar Hierro Tres Azucares)
b. LIA (Agar Hierro Lisina)
c. Bilis esculina
6) Deteccin de exoenzimas
a. lecitinasa
b. proteasas, coagulasa
c. amilasas
d. celulasas
e. desoxirribonucleasas
f. accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)
7) Miscelneos
a. KCN
b. Bilis
c. Produccin de pigmentos
28

1. Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin el perxido de hidrgeno en
agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y
anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos.
1.1. Material
Agua oxigenada de 30 volmenes, cultivo bacteriano y portaobjetos.
1.2. Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con
desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y
oxgeno molecular.
Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros: Micrococcus y Staphylococcus (catalasa
positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).
2. Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de
electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al oxgeno, con la formacin
final de agua.
2.1. Material
Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipeta Pasteur y cultivo microbiano.
2.2. Tcnica
Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada de bacterias, se trazan rayas sobre una tira
de papel impregnada en solucin acuosa al 1% de cloruro de tetrametil para-fenilendiamina.
2.3. Interpretacin
En caso positivo el papel cambia de color pasando a prpura y negro en 10-20
segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en presencia de citocromo c oxidasa
formndose azul de Wuster. En caso negativo la tira de papel no cambia de color.
3. Fermentacin de azucares
Esta prueba se suele usar en la identificacin inicial de bacilos Gram negativos y
especialmente de enterobacterias.
En este estudio se observa la fermentacin de lactosa y/o glucosa y/o sacarosa con
produccin de cido y/o gas y la produccin de H2S.
3.1. Material
Asa e hilo de siembra, tubos con medio TSI y cultivo bacteriano.
3.2. Tcnica
Con el asa recto se toma de la colonia y se siembra en picadura; despus se siembra en
la superficie por estra. Incubar a 37C durante 24 horas. Observar los resultados.
3.3. Interpretacin
La interpretacin de los resultados se har de la forma siguiente:
Fermentacin de glucosa: fondo amarillo.
Fermentacin de sacarosa: parte central amarilla.
Fermentacin de lactosa: superficie amarilla.
Produccin de SH2: picadura negra.
Produccin de gas: burbujas o rotura del agar.
3.4. Fundamentos de la fermentacin de azucares

3.4.1. Fermentacin de glucosa
Se aprecia en el viraje a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol) nicamente en la
parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequea proporcin de glucosa que existe en el
medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de
anaerobiosis, produce suficiente cido para que vire el indicador, pero no a medida que nos
aproximemos a la superficie, donde las condiciones son ms aerbicas, all la bacteria respira y
la produccin de cido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo
sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo toma una coloracin
roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los
aminocidos, liberndose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser ms
intenso.
3.4.2. Fermentacin de lactosa

Se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador, tanto en el fondo del tubo
como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez veces mayor que la de glucosa, con
lo que la produccin de cido formado es tan elevada que hace virar el indicador en todo el
tubo. El hecho de que la fermentacin de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene
importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar
glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido
degradada, como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminocidos,
liberndose aminas, que neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en la porcin
inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecer de color
rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la fermentacin previa de la glucosa.
30
3.4.3. Produccin de gas

La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de burbujas,
rotura o elevacin del agar en el fondo del tubo.
3.4.4. Produccin de SH2

Para detectar la produccin de H2S a partir de tiosulfato sdico debe incorporarse al
medio de cultivo un indicador, dado que el H2S es incoloro. Para tal fin se suele utilizar alguna
sal de hierro que reacciona con el H2S, para producir un precipitado negro de sulfuro de
hierro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que el precipitado negro se
concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un fondo
negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya
enmascarado con el precipitado negro.
4. Reduccin de nitratos
La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de varios
microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiracin
anaerbica. Esta prueba es til en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las
enterobacterias aunque tambin sirve para identificar otros microorganismos.
4.1. Material
Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de cido sulfanlico al 8 por
mil y solucin de -naftilamina al 5 por mil (ambos en cido actico 5N) y polvo de zinc.
4.2. Tcnica
Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 24-48 horas. Pasado ese tiempo,
aadir al cultivo unas gotas de solucin de -naftilamina y unas gotas de solucin de cido
sulfanlico.
4.3. Interpretacin y fundamento
El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la adicin de los
reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reduccin de
nitratos se considera positiva. Este color se debe a la formacin de un compuesto coloreado,
denominado p-sulfobencenoazo--naftilamina.
Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se han reducido los
nitratos) o bien se han reducido originando otros compuestos (amonaco, nitrgeno
molecular, xido ntrico u xido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso
negativo. En este caso se puede aadir al medio de cultivo una pequea cantidad de polvo de
zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la
existencia de nitratos en el medio y confirma que la reaccin es negativa.
5. Produccin de indol
El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido
triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrlisis del
triptfano y su desaminacin, produciendo indol, cido pirvico y amonaco.
5.1. Material
Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich o kovac.
5.2. Tcnica
32
Inocular el caldo con el microorganismo e incubar a 37C durante 24-48 horas.

Transcurrido ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich (para-dimetilamino
benzaldehido en etanol), resbalando por la pared del tubo sin agitar.
5.3. Interpretacin
La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase
entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera
positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un
complejo de color rojo.
Prueba del Indol

(Formacin del anillo)
6. Movilidad
Es otra caracterstica til en la identificacin de los microorganismos. Se puede llevar a
cabo observando el crecimiento en un medio semislido.
6.1. Material
Hilo de siembra, medio semislido (agar movilidad), y cultivo bacteriano.
6.2. Tcnica
Sembrar, por picadura, con hilo de siembra en medio semislido, incubando a 37C
durante 48 horas.

6.3. Interpretacin
La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si
son mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los
lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.
7. Crecimiento en citrato
Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como
nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante en la identificacin de
microorganismos pertenecientes a las enterobacterias.
7.1. Material
Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivo bacteriano.
7.2. Tcnica
Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C durante 24-48 horas.
En caso positivo, el medio de cultivo vira de color verde a azul. Si el microorganismo
utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin utiliza las sales de amonio como fuente de
nitrgeno, con produccin de amonaco, lo que da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto
se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul
intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie.
8. Produccin de ureasa
La ureasa es una enzima presente en numerosos microorganismos. Esta enzima
cataliza la hidrlisis de la urea, con produccin de dixido de carbono y amonaco, lo que
causa una alcalinizacin del medio.
8.1 Material
Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.
8.2. Tcnica
Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e incubar a 37C durante 24
horas.
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color
fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que
se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).
9. Descarboxilacin de aminocidos
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato-especificas, capaces de actuar
sobre la porcin carboxilo de los aminocidos, con formacin de aminas de reaccin alcalina.
Esta reaccin conocida como descarboxilacin produce dixido de carbono como producto
secundario. Cada uno de las descarboxilasas es especfica para un aminocido lisina, ornitina y
arginina son los tres aminocidos ensayados habitualmente en la identificacin de las
enterobacterias y producen las siguientes aminas especficas:
Lisina cadaverina
Ornitina putrescina
Arginina citrulina
En la conversin de arginina a citrulina interviene una dihidrolasa ms bien que una

descarboxilasa ya que en primer trmino un grupo NH2 es eliminado de la arginina. La
citrulina es transformada en ornitina, que luego sufre descarboxilacin para formar putrescina.
9.1. Materiales
Caldo descarboxilasas, asa de siembra, cultivo bacteriano, parafina liquida
9.2. Tcnica
Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro al caldo lisina. Incube a
37C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estril.
Las enterobacterias, por fermentacin de la glucosa producen cido, el cual hace virar
el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la
descarboxilacin de la lisina se producir una amina, la cual neutralizar el cido producido
por la fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.
Cuestionario
1. Escriba el fundamento de las siguientes pruebas bioqumicas para la identificacin
bacteriana: Prueba de CAMP y Prueba de la Coagulasa, Prueba de la Esculina, Prueba
de Voges Proskauer, Hidrlisis de la Gelatina,
34

KITS COMERCIALES DE IDENTIFICACION BACTERIANA
Una de las pruebas que se utilizan para la identificacin de enterobacterias es el Kit API20E (Laboratorios Bio.Merieux), el cual las identifica en forma fcil y rpida. Esto es
importante porque el diagnstico es efectivo, permitiendo un tratamiento rpido y apropiado.
Ej. API 20E consiste en una tira de 20 microtubos conteniendo substratos deshidratados para
la demostracin de la actividad enzimtica o la fermentacin de estos azcares.
Los microorganismos reaccionan con el contenido de los microtubos entre 24 y 48
horas de incubacin.
MATERIALES
Kits API 20E (tira de 20 microtubos).

Suero fisiolgico 0.85%.
Bacteria problema.
Aceite mineral o parafina lquida.
Hidrxido de Potasio 40%.
Alfa naftol.
Reactivo de Kovac.
Manual para la identificacin del API 20E.
Estufa a 37 C.
Escala de Mc Farland.
Tiras para la prueba de oxidasa.
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Tomar la cepa problema (previa determinacin de la prueba de oxidasa) y

colocarla dentro de un tubo con suero fisiolgico.
Observar que la turbidez del tubo con la cepa problema este en 0.5 de la escala
de Mc Farland.
Llenar los pocitos de la cmara de plstico con agua destilada.
Colocar la tira de API 20 E dentro del estuche.
Inocular la cepa problema a cada microtubo de la tira de API 20E, usar pipeta
Pasteur llenando la parte cerrada del micro tubo.
Para la prueba de citrato llenar todo el microtubo.
Las pruebas de LDC, ODC, URE se completa con aceite mineral.
Las pruebas de IND, VP llenarlas completamente.
Tapar el estuche de plstico e incubar a 37 por 24 horas segn indicacin del
Kit comercial.

LECTURA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Hacer la lectura de las reacciones observando el cambio de coloracin e

interpretar los resultados de acuerdo al manual.
Leer VP 5 a 10 minutos despus de la adicin de 1 gota de hidrxido de potasio
y Alfanaftol.
Adicionar 1 gota del reactivo de Kovacs al IND.
Anotar los resultados numricamente en la tarjeta de identificacin.
Sumar cada 3 reactivos, el cual nos dar un nmero con 7 dgitos (de acuerdo al
cdigo).
Usar la tabla de identificacin la cual contiene cdigos con el nombre de cada
enterobacteria correspondiente.
LECTURA DE RESULTADOS DEL SISTEMA DE IDENTIFICACION

BACTERIANO ESTANDARIZADO
RESULTADOS BIOQUIMICOS DE DIFERENTES AGENTES BACTERIANOS
Cuestionario
1. Indique los tipos de API que existen para la identificacin bacteriana.
2. Esquematice una tira de API con una bacteria inoculada indicando las reacciones
positivas y negativas para una bacteria.
36
PRACTICA N 7
ACCIN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
SISTEMA KIRBY - BAUER
La prueba de sensibilidad, incluye el uso del medio Mueller Hinton y discos de
antibiticos. Se utiliza para determinar la sensibilidad o resistencia de bacterias patgenas que
poseen un crecimiento rpido en relacin a la difusin radial de los antibiticos elegidos.
OBJETIVO
Realizar pruebas de sensibilidad de microorganismo grampositivas y gramnegativas
patgenos, causantes de los procesos infecciosos. Determinando el halo de inhibicin que
permita conocer la sensibilidad o resistencia de estas bacterias frente a cada uno de los
antibiticos.
MATERIALES
Placa petri con agar Mueller-Hinton estril
Discos con antibiticos
Colonia bacteriana
Suero fisiolgico
Hisopo estril
Pinza estril
Mechero
Regla Kirby Bauer.
Tablas con los estndares de interpretacin
Escala de Mc Farland
Estufa.
PROCEDIMIENTO:
1. Trabajar con el mechero encendido
2. Seleccionar 1 colonia caracteristica y colocarlas dentro de un tubo con suero
fisiolgico, hasta obtener una turbidez de 0.5 en la escala de Mc Farland.
3. Introducir un hisopo dentro del tubo, esperar 5.
4. Sembrar toda la superficie de la placa con el hisopo y mantenerlo a
temperatura ambiente hasta por 20 minutos.
5. Utilizar una pinza estril y depositar los discos de antibiticos sobre la siembra
manteniendo una equidistancia entre ellos.
6. Incubar la placa a 37 C por 18 24 horas aproximadamente.

7. Lectura: Medir milimtricamente los halos de inhibicin, comparndolos con los
estndares de sensibilidad y resistencia.
AGENTE ANTIMICROBIANO
SIGL POTENCI RESISTENCI SENSIBL
A
A
A
E
AMIKACINA
Ak
30mcg
14mm
17mm
AMPICILINA
A
10mcg
13mm
17mm
AMOXICILINA
AX
25mcg
11mm
14mm
AMOX-AC.CLAV
AMC
20/10mcg
13mm
18mm
AC. NALIDIXICO
W
30mcg
13mm
19mm
CEFADROXILO
CPH
30mcg
14mm
18mm
CEFALOTINA
CF
30mcg
14mm
18mm
CEFUROXIMA
CXM
5mcg
14mm
18mm
CLINDAMICINA
D
30mcg
14mm
21mm
CLORANFENICOL
C
1mcg
12mm
18mm
CLOXACILINA
CXM
10mcg
10mm
13mm
COLISTIN
CL
10mcg
8mm
11mm
DIBEKACINA
DK
30mcg
12mm
15mm
DOXICICLINA
DXS
10mcg
12mm
16mm
ENOXACINO
E
15mcg
14mm
18mm
ERITROMICINA
EM
10mcg
13mm
23mm
ESTREPTOMICINA
S
50mcg
11mm
15mm
FOSFOMICINA
FO
5mcg
11mm
15mm
FLUCLOXACILINA
FX
100mcg
10mm
18mm
FURAZOLIDONA
FZ
10mcg
14mm
17mm
GENTAMICINA
GE
30mcg
12mm
15mm
KANAMICINA
K
2mcg
13mm
18mm
LINCOMICINA
L
5mcg
14mm
21mm
NEOMICINA
N
30mcg
12mm
17mm
NITROFURANTOINA
NI
10mcg
14mm
17mm
NORFLOXACINO
NOR
1mcg
12mm
17mm
OXACILINA
OX
1mcg
10mm
13mm
PENICILINA G
P
10uof
28mm
29mm
PENICILINA G (Enterococo)
10 uof
14mm
15mm
RIFAMPICINA
R
5cmg
16mm
20mm
SULFATRIMETOPRIM
SX
250mcg
10mm
16mm
SULFONAMIDA
SF
30mcg
12mm
17mm
TETRACICLINA
T
5mcg
14mm
19mm
TRIMETOPRIM
TMP
30mcg
10mm
16mm
VANCOMICINA
VA
30mcg
9mm
12mm
VANCOMICINA (Enterococo)
30mcg
14mm
17mm
Cuestionario
1.
Cul es el fundamento y utilidades de la prueba de sensibilidad?
2.
Cul es la interpretacin, luego de la lectura de la prueba de una sensibilidad hecha a

una bacteria X con resultado sensible a una antibitico Y?
38
PRCTICA N 8
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN, A PARTIR DE
MUESTRAS CLNICAS, DE COCOS GRAMPOSITIVOS.
2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN BACTERIANA DE MUESTRAS DE
LECHE MASTTICA
La leche es un excelente medio de cultivo para una gran variedad de microorganismos.
Tanto los patgenos, oportunistas y saprofitos pueden llegar a reproducirse en ella.
La leche masttica se caracteriza por sufrir diversas alteraciones:
Fsicas (color, consistencia, viscosidad, densidad, etc.)

Qumicas (pH, etc.)
Existe un gran nmero de agentes infecciosos productores de mastitis, siendo los ms

frecuentes en bovinos:
Streptococcus (cocos)
Staphylococcus (cocos)
Corynebacterium (bacilos)
Pseudomonas (bacilo)
Klebsiella (cocobacilo)
Escherichia coli (bacilo)
OBJETVOS DE LA PRCTICA:
1. Sembrar las muestras de leche aplicando los mtodos de siembra.
2. Sembrar las muestras de leche en los medios de cultivo adecuados.
MATERIALES:
1. Placas con agar sangre (agar TSA (Merck) + 8% de sangre desfribrinada de ovino)
2. Placas de agar Mc Conkey
3. Ansas de siembra
4. Perxido de hidrogeno
5. Tiras reactivas de la prueba de oxidasa
6. Placa de agar DNAsa Oxoid/Merck
7. Laminas portaobjeto
8. Kit de coloracin gram
9. Muestra de leche con mastitis
10. Muestra de hisopado de otitis externa
11. Microscopio ptico
PROCEDIMIENTO
1. Prender el mechero.

2. Agitar el frasco para homogenizar la muestra.
3. Abrir y flamear la boca del frasco que contiene la muestra de leche.
4. Flamear el ansa de siembra, introducir el ansa dentro del frasco la muestra, y tomar
la muestra.
5. Sembrar por estra o por agotamiento en el agar, luego flamear el ansa de siembra.
6. Incubar por 24 horas a 37oC para que se desarrollen las colonias.
7. Observar las caractersticas de las colonias.
8. Hacer tincin gram a las colonias que hayan crecido y observar al microscopio.
9.Determinar la morfologa de las colonias bacterianas y orientar el diagnstico.
40
Cuestionario
1. Por qu se dan los cambios fsicos y qumicos de la leche, en infecciones bacterianas de
la ubre?
2. Qu caractersticas metablicas se utilizan en la identificacin y diferenciacin de especies
de Staphylococcus sp.?
PRCTICA N 9
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACILOS
GRAMPOSITIVOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS
Una de las principales bacterias causantes de enfermedades sistmicas, es el Bacillus anthracis,

que afecta principalmente a animales herbvoros y al hombre. Ocasiona un cuadro septicmico
de carcter grave caracterizado por la presencia de hemorragias por las aberturas naturales,
esplenomegalia y aspecto oscuro de la sangre (antrax=carbn).
Materiales:
Muestra (oreja).
Agar sangre.
Agar Tripticasa Soya (TSA).
Caldo Tripticasa Soya (TSB).
Ansa de siembra.
Mechero guantes.
Mascarilla
Cepa de Bacillus anthracis.
Presencia de esporas
Procesamiento de la muestra:
Tomar con el ansa una gota de la muestra de sangre, ponerla en la lmina

portaobjeto y realizar la coloracin azul de metileno o Gram. Observar con lente de
inmersin bacilos de bordes rectos, espora central no deformante, pequeas cadenas.
Sembrar en caldo tripticasa de soya y en agar sangre.
A las 24 horas observar en agar sangre colonias tpicas en forma de medusa, en agar
sangre se observa la misma morfologa pero no presenta hemlisis.
Colonia tipo cabeza de medusa
Las esporas son importantes porque pueden conservarse en estado de desecacin

durante muchos aos sin prdida de su viabilidad y se le puede encontrar en el suelo, agua o
aire de las zona contaminadas.
Los pastos conservan estos estadios durante aos; el heno producido en tales terrenos
puede transmitir la enfermedad; las esporas se difunden por aguas que inundan los campos
contaminados. Si bien hay variacin en la resistencia de las esporas de diferentes cepas de
Bacillus anthracis, todos ellas presentan resistencia extremadamente alta al calor. Soportan la
ebullicin durante varios minutos, de modo que para matarlos es necesario someterlos a una
temperatura de 135 C, sin humedad, durante 5 a 10 minutos.
El factor de virulencia del Bacillus anthracis est dado por una exotoxina que es la
actividad de los tres factores, el cual est constituido por:
Cuestionario
1. Enumere las especies ms susceptibles y resistentes a la infeccin por Bacillus anthracis.
2. Enumere 10 medidas de precaucin que se deben tener en cuenta en caso de
presentarse un animal sospechoso de ntrax.
3. Existe un programa de erradicacin de ntrax en el pas?, cuales son los aspectos ms
relevantes de esta norma
42
PRACTICA N 10 y 11
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN, A PARTIR DE
MUESTRAS CLNICAS, DE BACILOS GRAMNEGATIVOS.
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Las enterobacterias son un grupo de bacilos gramnegativos aerbicos y anaerbicos
facultativos que se encuentran difundidos en la naturaleza, siendo su hbitat principal el
intestino del hombre y animales. Existen especies capaces de producir enfermedades debido a
las toxinas que poseen y otras que causan enfermedades debido a la accin directa de estas
especies patgenas.
Las excretas son consideradas una de las causas de contaminacin del medio ambiente;
estos microorganismos se encuentran en el agua, tierra, vegetales, alimentos y medio ambiente.
Entre las principales enterobacterias se encuentran: Escherichia coli, Salmonella spp.,
Klebsiella sp., Yersinia sp., Citrobacter sp., Proteus sp. y Shigella sp.
Objetivo:
1. Conocer diferentes medios y mtodos de cultivo para muestras procedentes del
contenido intestinal.
2. Identificar los microorganismos causantes de los procesos diarreicos en animales
domsticos.
Materiales:
-
Placas con agar sangre (agar TSA (Merck) + 8 a 10% de sangre desfribrinada de ovino)
Placas con agar Mc Conkey
Tubos con caldo tetrationato activado
Ansas de siembra
Perxido de hidrogeno
Tiras reactivas de la prueba de oxidasa
Laminas portaobjeto
Kit de coloracin gram
Tubos de ensayo con pruebas bioqumicas: tres azucares, lisina, SIM, citrato de
simmons, caldo urea.
Muestra de intestino
Cepas aisladas conservadas
Microscopio ptico
SECUENCIA DE LAS TCNICAS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

DE ENTEROBACTERIAS
Heces, Intestino, Ganglio Mesentrico
Descartar
Salmonella
Siembra
Directa
Agar Mac Conkey

Agar sangre
Lactosa
+
Lactosa
-
Siembra directa:
Agar
VB, SS, XLD,
Mac C,
Enriquecimiento
en Caldo
tetrationato,
Caldo selenito
Resiembra en: Agar
VB, SS, XLT, Mac C,
Desarrollo de colonias tpicas

Sospecha de Salmonella
Pruebas Bioqumicas
confirmatorias
Ej:
Escherichia coli
Salmonella
Aglutinacin
Determinacin fimbrial
Pruebas de aglutinacin
PROCEDIMIENTO
1. Colocar el material biolgico en una fuente (intestino).
44

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Observar si los rganos muestran lesiones macroscpicas.

Determinar la zona afectada de la muestra (lesiones).
Proceder a quemar esta regin con esptula incandescente.
Usar la pinza y tijera estril, hacer un piquete y sacar una muestra con una pipeta
Pasteur o ansa.
Realizar coloracin Gram del contenido intestinal y observar al microscopio con
objetivo de inmersin (G +, G -, cpsulas, esporas, etc.)
Colocar la muestra en el medio de cultivo adecuado (Agar Sangre, Mac Conkey, Caldo
tetrationato). Ver grfico.
Con un ansa sembrar por agotamiento en medios slidos.
Si el medio es lquido usar pipetas pasteur estril.
Si los microorganismos pertenecen al grupo entrico (Salmonella spp.), colocar en
medios de enriquecimiento (caldo tetrationato, caldo selenito) a 42 C y si se sospecha
de Escherichia coli llevar a estufa a 37 C (ver el grfico anterior).
1. Agar Mac Conkey, SS, XLD:
Observar las colonias (color). Diferenciar las colonias: lactosa + como

Escherichia coli y Klebsiella sp. (fermentadoras de lactosa).
Diferenciar las colonias: lactosa - como Salmonella sp y Shigella sp. (no
fermentadoras de lactosa).
Hacer coloracin Gram y observar.
Realizar la prueba de aglutinacin si se sospecha de Salmonella.
Sembrar las colonias en LIA, Agar Citrato de Simmons, TSI, Urea y SIM.
Hacer la lectura a las 24 horas.
Coloracin GRAM:
Enterobacterias
Cuestionario
1.
Cul es la importancia del uso de medios de enriquecimiento?, ejemplos
2.
Cules son los medios de cultivo elegidos para el aislamiento e identificacin del agente
causal bacteriano en un proceso infeccioso del sistema digestivo? porque?

PRCTICA N 12
MTODOS DE DIAGNOSTICO
Brucella abortus, B. suis, B. melitensis

Dentro de las enfermedades infecciosas del ganado, son de carcter importante dentro
de las explotaciones pecuarias, las que causan trastornos de tipo reproductivo como el aborto,
nacimiento de cras muertas, cras que se mueren en pocas horas de nacidas (12-24 h),
infertilidad, retenciones placentarias, reabsorciones fetales o muerte embrionaria. As como la
prdida econmica tan fuerte por la baja produccin de recra, ya que la nica justificante que
tiene una hembra dentro de la granja es que produzca un nmero de cras al ao. Todo esto
repercute en prdidas por retraso en el mejoramiento gentico y gastos por medicamentos,
siendo todo esto englobado a prdidas econmicas elevadas y baja eficiencia en la
productividad de las explotaciones.
La mayora de los problemas abortivos en el ganado y muerte de animales recin
nacidos se deben a problemas no infecciosos (que normalmente no se toman en cuenta)
desbalances nutricionales, problemas genticos, agentes teratognicos, plantas txicas, factores
traumticos, problemas hormonales, administracin de medicamentos, micotoxinas y
endotoxinas.
Testculo ovino:
Superior: Normal
Inf: Epididimitis y orquitis B. ovis
OBJETIVO
-
Reconocer las diferentes bacterias que causan aborto

Conocer tcnicas para el diagnstico de bacterias causantes de aborto y formas
adecuadas de remisin de una muestra.
MATERIALES:
-
Placa de aglutinacin
Suero sanguneo de canino, bovino, y caprino
Frasco de Reactivo de rosa de bengala (INS)
46

-
Homogenizadores
Micropipetas de 20 a 200ul
Racks de tips o puntas de 200ul
Lmpara de lectura
PROCEDIMIENTO:
Antgeno de Brucella abortus utilizado en la

prueba de Rosa de Bengala.
sta prueba de aglutinacin consiste en cuantificar por inmunodifusin radial, la

concentracin de las Igs G en la muestra problema, el agar gel difusin frente a las muestras y
patrones, mediante lavado, secado y tincin del gel, se determina por la medida de los aros de
precipitacin. Con estos resultados, se realiza una recta de calibrado para calcular la
concentracin de Igs G en los sueros problemas.
o REACCION POSITIVA: se identifica con el signo +
Los sueros que presentan formacin de arenilla a manera de
precipitados sern positivos.
o REACCION NEGATIVA: se identifica con el signo Los sueros que no presentan ningn tipo de precipitacin sern
negativos. No se admite la clasificacin de sospechoso.
Cuestionario
1. Que implica una reaccin positiva a una prueba de Rosa de bengala.
2. Existe un programa de erradicacin de Brucella en el pas?, cuales son los aspectos
ms relevantes de esta norma
PRCTICA N 13
TCNICA DE MICROAGLUTINACION PARA DIAGNSTICO DE Leptospira sp.
Esta tcnica se emplea para detectar anticuerpos anti-leptospiras en el suero, identificar
los aislamientos, clasificar cepas y servir de base para evaluar cualquier otro mtodo serolgico
para el diagnstico de esta enfermedad.
La batera que se usa como antgeno est representada por los serovares ms
prevalentes del rea. Sin embargo, en aquellas regiones en donde no se conoce los serovares
circulantes, la OMS recomienda por lo menos una cepa de referencia de los serovares ms
representativos de las especies ms frecuentes.
Se emplean como antgeno las cepas de referencia que deben ser replicados
semanalmente para realizar la prueba. Una vez revisado los cultivos, se eligen aquellos que
tengan buen crecimiento y no formen aglutinaciones entre ellas. Cuando los cultivos estn
muy densos se deben diluir con buffer fosfato salino PBS pH 7,2-7,4 o solucin salina
fisiolgica 0,85%.
Para que el antgeno sea ptimo para la prueba tiene que observarse en el microscopio
de campo oscuro entre 150 a 200 leptospiras por campo o hasta lograr una opalescencia de 0,5
de la escala de Mc Farland.
La prueba se basa en enfrentar diluciones seriadas de suero con igual volumen de una
suspensin de leptospiras (antgeno) para luego observarse en microscopio de campo oscuro
para estimar el 50% de aglutinacin como el punto final de la reaccin antgeno-anticuerpo.
REACTIVOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Suero fisiolgico estril.

Medio Fletcher (DIFCO)
Medio Stuart (DIFCO)
Na2HPO4 anhidro
KH2PO4
Glicerina
Agua destilada estril
MATERIALES Y EQUIPOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Erlemeyer de 1-2 litros

Pipetas serolgicas
Pipetas pasteur
Portapipetas
Micropipetas simples y multicanales
Tips o puntas
48

7.
8.
9.
10.
11.
12.
Estufa a 28 C
Medidor de pH
Bao mara
Autoclave
Recipientes para descarte.
Solucin desinfectante de hipoclorito de sodio
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACION
En una microplaca de 96 pozo, colocar en la columna

No. 1 la primera dilucin de los sueros 1:50
Con una micropipeta multicanal realizar diluciones dobles

de los sueros en las siguientes columnas
1.:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
Control
(Slo Leptospira)
Aadir el antgeno (serovar) en volumen de 50l
Incubar la microplaca por 2 horas a 28 C
Sacar de cada dilucin y del control 50 l y colocarlo

sobre un portaobjetos limpio
Observar en un microscopio de campo oscuro a 10X. El

50% o ms de Leptospiras aglutinadas se considera (+)
HOJA DE TRABAJO DE LOS CONTROLES Y MUESTRAS EN LA

PRUEBA DE MICROAGLUTINACIN PARA EL DIAGNOSTICO DE
Leptospira sp.
50
Cuestionario
1.
En base al fundamento de la prueba de Microaglutinacin, cuales son las utilidades en

Medicina Veterinaria.
PRACTICA N 14 y 15
MORFOLOGA Y TIPOS DE REPRODUCCIN
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS DE IMPORTANCIA EN MEDICINA
VETERINARIA
El diagnstico especfico de los hongos requiere principalmente de un estudio

microscpico y macroscpico de las estructuras vegetativas y/o reprodutivas, las cuales varan
de forma, dimensin, color, textura, etc. Se presentan en muchos casos estructuras especficas
de funcin definida, adems, en la actualidad los datos morfolgicos se complementan con los
aportes bioqumicos, serolgicos y moleculares para permitir una mejor clasificacin de
algunos hongos.
Cuando se recolectan raspados de piel para cultivo de dermatofitos, la lesin se limpia
con alcohol al 70 %; se realiza un raspado de la porcin marginal de la lesin, los pelos se
retiran con pinzas para cultivarse, las uas se obtienen por corte y la superficie de las
estructuras muy queratinizadas se raspan para tener acceso a porciones ms profundas. El
contenido de la pstula, ndulos, vesculas, se obtiene con jeringa estril. Si los hongos no
crecen pueden requerirse de biopsia; sta incluir tejido normal y porciones de la zona de
lesin. La orina se obtiene mejor por cistocentesis, la cual asegura que la muestra no se
contamine con la flora bacteriana mictica del tracto genitourinario inferior.
Las muestras que no se procesen pronto se refrigeran sin congelarlos por perodos de
hasta 12 a 15 horas.
Entre los hongos ms comunes causantes de micosis en veterinaria se encuentran:
- Epidermophyton floccosum
- Microsporum canis y M. gypseum
- Trichophyton mentagrophytes,
T. rubrum, y T. tonsurans
- Malassezia pachydermatis
- Candida albicans
Entre los hongos que afectan a los insumos
alimenticios se encuentran:
-
Aspergillus spp
Fusarium spp
Penicilium spp
Rhizopus spp
Aspergillus
ESTUDIO MACROSCPICO:
La descripcin de las caractersticas de los hongos son usualmente basadas en el
crecimiento de la colonia fngica estndar como los que crecen en el agar Sabouraud
Glucosado.
Estas caractersticas de crecimiento pueden variar de acuerdo al pH, temperatura, etc.;
por lo que es necesario considerar todos estos factores para una identificacin correcta de los
hongos.
52
Caractersticas de la Colonia
a. ASPECTO:
Se refiere a las caractersticas de crecimiento del micelio areo: elevacin y densidad.
Ejemplos: lanoso, algodonoso, aterciopelado, borde irregular, etc.
b. SUPERFICIE:
Se refiere a las caractersticas de crecimiento en la superficie: prominencias y
depresiones de la colonia. Ejemplos: planas, rugosa, monticulada, cerebriforme,
crateriforme, etc.
c. COLOR:
Varan de acuerdo a la especie del hongo: blanco, amarillo, verde, pardo, gris, marrn,
negro, etc. Adems la colonia puede difundirse en el medio de diferentes colores.
e. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO: rpida, moderada o lenta.
ESTUDIO MICROSCPICO:
1. ESTRUCTURAS VEGETATIVAS
a. LEVADURAS:
Son hongos unicelulares que presentan una forma redondeada u ovalada;
reproducindose asexualmente por medio de yemas o blastosporas. Ej.: Candida,
Saccharomices, Rhodotorula.
Poseen pseudomicelio, que son estructuras producto de la elongacin de una

blastospora o yema, presentando a su vez brotes sucesivos. Ejemplo Candida albicans.

b. HONGOS FILAMENTOSOS:
Son hongos pluricelulares constituidos por hifas, pueden ser septadas (Ascomycetes,
Deuteromycetes) o aseptadas (Zygomicetes ejm Mucor, Rhizopus, Absidia, etc.).
2. ESTUCTURAS DE REPRODUCCIN:
La reproduccin de los hongos puede ser sexual o asexual, dependiendo de las
condiciones del substrato y condiciones ambientales. Los hongos pueden presentar una o
ambas formas de reproduccin.
Conidias:
Elementos fngicos externos que se originan a partir de una clula conidigena a
travs de una serie de eventos llamados conidiognesis, los cuales favorecen la propagacin de
los hongos.
Macroconidias de M. canis
PREPARACIN DE ACLARANTES , COLORANTES Y DESINFECTANTES

Para el estudio de los hongos es necesario el uso de reactivos o colorantes especiales. Si se
trata de una muestra patolgica (pus, esputo, escamas, etc.) es necesario el empleo de
aclarantes que permitan resaltar las estructuras fngicas al disolver la mucina o queratina de la
muestra; tambin se pueden utilizar los colorantes comunes de laboratorio.
1) ACLARANTE
Solucin acuosa de KOH al 10 o 20 %.
Perlas de KOH: 10 o 20 g.
Agua destilada: 100ml.
Disolver suavemente con ayuda del calor, las perlas de KOH en agua destilada.
2) COLORANTE
Azul de Metileno o Lactofenol.
Lactofenol de Amman: 100ml.

Azul de algodn: 0.05.
Agregar al lactofenol de Amman, el azul de algodn.
3) DESINFECTANTE
Alcohol corriente: 100ml

Yodo metlico: 2g
Agregar el yodo metlico al alcohol. Agitar hasta que se disuelva completamente.
Los dermatofitos son hongos filamentosos patgenos, estn agrupados en los gneros:
Microsporum, Epidermophyton y Trichopyton, estos microorganismos tienen tropismo por el
tegumento cutneo, en donde proliferan a expensas de la queratina, cistina y metionina.
PROCEDIMIENTO:
En preparaciones frescas se suspende el material (pelo o piel) de la muestra sobre el

portaobjeto en solucin de KOH al 10%.
Cubrir la muestra con una laminilla cubreobjeto.
La preparacin se pasa por la flama varias veces.
Evitar hervir la mezcla.
El KOH limpia la preparacin de los agregados de tejido y deja los elementos
micticos intactos.
El examen se inicia con el objetivo de menor aumento y el condensador en
posicin baja; para lograr un mximo contraste.
Observar estructuras micticos a 10x, luego pasar a 40x para mejor observacin.
La tincin GRAM se utiliza para muestras sospechosas de Cndida, Malassezia,

Geotrichum, Trichosporum, la forma de levadura de Sporothrix spp.
Cultivo de las muestras:

Con el ansa de siembra en ngulo, tomar una porcin de la muestra y sembrar por
puntos en la superficie del medio de cultivo, incubar a 26 C o temperatura ambiental
durante 7 a 21 das.
Tcnica del microcultivo:
-
Con el bistur, cortar un trozo de agar Sabouraud de 0.6 x 0.6cm y depositarlo sobre la
lmina portaobjetos.
Con el ansa de siembra en ngulo recto, coger una pequea porcin del cultivo de
hongos y depositarlos en uno de los lados del agar, repetir el procedimiento en los
lados restantes.
Cubrir con una laminilla y depositarla en una placa petri.
Depositar un trozo de algodn hmedo estril dentro de la placa petri.
54

-
Incubar al medio ambiente por 3 a 7 das, el hongo ambiental y los dermatofitos hasta
los 21 das.
Montaje de lminas
-
Con ayuda de una pinza, levantar la laminilla y depositarla sobre una lmina
portaobjetos donde previamente se ha colocado una gota de azul de metileno, retirar el
exceso de colorante, sellar la lmina con esmalte de uas.
Observar al microscopio, con lente de 100x y aceite de inmersin.
Cuestionario
1.
Describa 3 mtodos empleados en el aislamiento e identificacin de hongos.
2.
Mencione las principales caractersticas y utilidades de los diferentes agares usados en el

cultivo de hongos.

Prctica 18.
TCNICAS PARA CULTIVOS CELULARES
Las tcnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la
investigacin en virologa. La utilizacin de cultivos celulares para producir virus permiti
preparar virus purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de
los primeros productos producidos en masa usando tcnicas de cultivos celulares. Esta vacuna
fue posible gracias a la investigacin de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y
Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el
descubrimiento de un mtodo de crecimiento de virus en cultivos celulares de rin de mono.
56
La capacidad de tener muchas clulas eucariotas de crecer in Vitro formando una monocapa
ha sido aprovechada para la elaboracin de cultivos celulares, la cual constituye una
importante herramienta en la investigacin, y en el diagnostico de muchas enfermedades
virales.
El cultivo permite el cultivo e incluso el aislamiento de numerosos agentes virales, adems su
uso se ha extendido para el trabajo con ciertas toxinas bacterianas y en la preparacin de
vacunas para uso humano y animal.
Se puede definir a un cultivo celular primario como aquel que esta formado por clulas
recientemente aisladas a partir de tejidos u rganos; despus de un primer subcultivo o pasaje,
el cultivo celular llega a ser una lnea celular y puede ser cultivada hasta por 10 a 12 veces. Con
el tiempo una lnea celular llega a una etapa de envejecimiento puede llegar a sufrir un proceso
llamado: transformacin in Vitro formando las denominadas lneas celulares continuas o
inmortales. Las lneas celulares transformadas estn formadas por clulas que contienen un
origen tumoral o han sido manipuladas de algn modo (Transfeccin con oncogenes o
tratamientos con carcingenos).
Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagacin de los virus:
dentro de stos, los ms usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas
(cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc). Los
cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de clulas que crecen adheridas a la
superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original
u otra monocapa con un agente que dispersa las clulas (una enzima o un agente quelante, o
ambos combinados) para luego transferir la suspensin celular obtenida a un recipiente de
vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican.
Los cultivos celulares se dividen en:
CULTIVOS PRIMARIOS Son originados a partir de embriones, clulas de tejidos, u
rganos, tomados directamente del organismo.
LINEAS CELULARES Son de varios tipos:
1. Las que surgen de cultivos secundarios o terciarios originados de un cultivo primario. Estas
lneas surgen por pasajes sucesivos de clulas diploides (cultivo primario),
hasta
aproximadamente 50 subcultivos conservando por lo menos un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen.
2. Lnea continua permite un nmero indefinido de subcultivos, siendo en general clulas
heteroploides. El origen de stas lneas continuas, puede ser el producto de subcultivar una

lnea de clulas diploides ms all de 50 subcultivos (alrededor de unos 70 pasajes), lo cual
provoca una alteracin en la carga gentica de dichas clulas o por provenir de clulas
transformadas (tipo clulas cancerosas) cuya carga gentica ya est modificada (clulas
heteroploides). Tanto los cultivos primarios como los cultivos de lnea diploides, as como las
lneas celulares continuas ofrecen ventajas y desventajas que son evaluadas segn el tipo de
trabajo que se plantee.
Ejemplos de LINEAS CELULARES:
HEP-2: Clulas heteroploides humanas derivadas de carcinoma larngeo.
Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.
MDCK: Lnea celular diploide de rin canino; para INFLUENZA y ocasionalmente
PARAINFLUENZA.
LLC-MK2: Lnea celular heteroploide de rin de mono Rhesus. Se recomienda para
el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina
cristalina al medio.
MRC5: Lnea celular diploide fibroblstica de pulmn embrionario humano. Se
recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.
Materiales:
- 2 Feto bovino u ovino
- Un frasco de suero fisiolgico
- Un frasco de medio de crecimiento (10% de suero fetal Bovino)
- Material de ciruga estril (pinza y tijera)
- Alcohol al 70%
- Un frasco de vidrio de boca ancha
- Un Erlenmeyer de 250ml con magneto
- 2 placas petri
- Frasco para cultivo celular
- 2 pipetas de 10ml, 1 pipeta de 5ml
- 2 tubos de centrifuga de 10ml
- Centrifuga
- Agitador magntico
- Mechero
METODO POR EXPLANTE
1. Extraer el rgano a ser cultivado que podra ser: cornete nasal, plexo coroideo, bazo,
timo, o clulas de los fetos proporcionados
2. Colocar el pedazo de tejido extrado en una placa petri, cortar una seccin de
aproximadamente 1 x 1cm y colocarlo en un recipiente de boca ancha o en una placa
petri; luego cortar con una tijera estril en pedacitos tan pequeos como sea posible.
3. Aadir al tejido cortado 5ml de medio de crecimiento y colocarlos en un frasco para
cultivo celular.
4. Rotular el frasco con el tipo de tejido, el nmero del subgrupo y la fecha para ser llevado
a la estufa a 37C por 10 a 15 das.

Prctica 19.
INOCULACIN DE HUEVOS EMBRIONADOS Y SU COSECHA
Los huevos embrionados aviares, es un sistema que permite, el cultivo viral en el
laboratorio de una forma sencilla, barata y que no requiere de equipos sofisticados.
La inoculacin de los huevos embrionados fue uno de los mtodos empleados para el
cultivo de virus, por la susceptibilidad de sus diversos tejidos a una gran numero de virus tanto
aviares, como de otros animales domsticos y del hombre.
Los huevos embrinados de ave al igual que el cultivo celular sirve con fines de
diagnostico, investigacin, preparacin de vacunas, etc; debiendose emplear huevos libres de
agentes patogenos contaminantes.
Materiales:
-
Huevos embrionados de pollo de 6 a 10 das de edad

Taladro y broca de diverso dimetro
Jeringa hipodrmica de tuberculina y agujas
Viales conteniendo los inculos
Colorante Jimnez
Papel watman
Tubos de ensayo y viales estriles
Estufa
Ovoscopio
Desinfectantes (solucin yodada y alcohol al 70%)
Algodn
Bombillas de jebe
Pipetas Pasteur
58
I.
Inoculacin en saco vitelino:
La edad ms adecuada de los huevos embrionados es de 5 a 6 das.
La aguja correcta para la inoculacin : N 23 de 1 o 1 pulgadas
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Utilizando con un lpiz marcar X

la cscara del huevo sobre la sombra del embrin y delimitar la cmara de aire.
Desinfectar el rea con solucin yodada. Colocar el huevo embrionado sobre el

porta huevos, en posicin vertical y con cmara de aire hacia arriba.
Con el taladro realizar un pequeo agujero en el centro de la cmara de aire

mostrando en forma intacta la membrana de la cscara.
Tomar la jeringa de tuberculina y colocarle una aguja N 23 de 1 o 1 pulgadas.
Tomar el inoculo (Clamidia) y aspirarlo con la jeringa segn el numero de huevos

por trabajar (0.2ml de inoculo por huevo).
Eliminar las burbujas del inoculo: tomar la jeringa en forma vertical y colocarlo un
pedazo de algodn con alcohol sobre la aguja, presionar suavemente el embolo
hasta eliminar las burbujas.
Introducir la aguja en forma perpendicular sobre el agujero atravesando las

membranas hasta llegar al saco vitelino y con el dedo indice presionar el embolo e
inocular al saco vitelino de 0.2 a 0.3 ml del inoculo.
II.
Inoculacin en Cavidad Alantoidea
La aguja correcta para la inoculacin : N 25 de pulgadas
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Identificar la sombra del embrin y

la camara de aire, marcar X la cscara del huevo.

Con el taladro realizar un pequeo agujero junto a la linea marcada de la cmara de

aire, dejando en forma intacta la membrana de la cscara.
Tomar la jeringa de tuberculina y colocarle una aguja N 25 de pulgadas.
Tomar el inoculo (Virus del New Castle) y aspirarlo con la jeringa segn el
numero de huevos por trabajar (0.2ml de inoculo por huevo).

membranas hasta llegar al saco vitelino y con el dedo ndice presionar el embolo e
inocular al saco vitelino de 0.2 ml del inoculo.
60

III.
Inoculacin en la cavidad corioalantoidea
La aguja correcta para la inoculacin : N 26 de pulgadas
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Identificar la sombra del embrin y

la camara de aire, marcar X la cscara del huevo.

Con el taladro realizar un pequeo agujero en el centro de la cmara de aire,

dejando en forma intacta la membrana de la cscara.
Tomar la jeringa de tuberculina y colocarle una aguja N 26 de pulgadas.
Tomar el inoculo (Virus de la viruela aviar) y aspirarlo con la jeringa segn el

numero de huevos por trabajar (0.2ml de inoculo por huevo).

membranas hasta llegar al saco vitelino y con el dedo indice presionar el embolo e
inocular al saco vitelino de 0.3 ml del inoculo.
Sellar la ventana con parafina o cinta masquintape.
PRCTICA N 23
PRUEBAS INMUNOHISTOQUMICAS
PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA
La Inmunofluorescencia es una tcnica de laboratorio y su exactitud puede variar
dependiendo del anticuerpo especfico que se est investigando y del laboratorio que la est
aplicando. Por lo general, las clulas, el tejido o alguna otra sustancia se coloca en el
portaobjeto de un microscopio, luego una pequea cantidad de muestra que contiene los
anticuerpos (tpicamente suero, parte lquida de la sangre).
Existen 2 mtodos para detectar anticuerpos fluorescentes:
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Se utiliza el isotiocianato de fluorescena, esta tcnica es empleada por su especificidad,
en la cual se puede observar la clula y comprobar que la reaccin inmunolgica se produce en
un sitio especfico con la sensibilidad de las tcnicas inmunolgicas. Esta tcnica utiliza
normalmente cultivos de microorganismos sobre la que se desea comprobar si hay o no
anticuerpos en el suero problema. Tras la incubacin con el suero problema; si hay
anticuerpos se unirn a las clulas infectadas pero no a las no infectadas (especificidad
histolgica observable).
La unin se visualiza tras la adicin de un conjugado anti-inmunoglobulina marcado
con isotiocianato y la posterior observacin al microscopio de fluorescencia o al convencional,
respectivamente.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD)

La prueba detecta positivos y negativos siendo positiva la muestra en la cual se
evidencia mediante la fluorescencia de la bacteria, lo cual se produce por la adhesin de los
anticuerpos presentes en los sueros a los que a su vez se adhiere el anti-anticuerpo de la
especie conjugado con la fluorescena.
TCNICA DE IFD
MATERIALES
-
Tubos de portaobjetos de 12 pocillos para IF

Cubreobjetos 24 x 48MM.
Tips.
Pipeta automtica de 20ml.
62

-
Cmara hmeda.
Estufa de cultivo.
Microscopio para IF.
Agitador rotativo.
Jarra de coplin.
SOLUCIONES Y REACTIVOS
-
Solucin bufferada (pH 7.2) fenolada o formolada al 0,51 (de muestreos: transporte en
refrigeracin).
Solucin de PBS (pH 7.2) (para dilucin y lavados) en refrigeracin.
Gamma Globulina anti-campylobacter conjugada con Isotiocianato de Fluorescena
(mantener en congeladora).
Glicerina bufferada pH 8.0.
Acetona.
Controles positivos y negativos de Campylobacter.
DILUCIN DE LA GAMMA GLOBULINA:

Se realiza de acuerdo al equipo y lmpara a utilizar con solucin de PBS (pH 7.2)
(estril); fraccionndola en volmenes pequeos para evitar manipuleos innecesarios.
CONSERVACIN
-
Conjugado puro: a 20 C
Conjugado diluido: 4- 8 C (7 das)
PROCEDIMIENTOS:
-
Identificar y rotular las muestras.

Centrifugacin de limpieza: a 500 (g) durante 5 minutos.
Se traspasa a tubos, descartando el sedimento.
Centrifugacin final: a 5,000 (g) durante 30m.
Se descarta el sobrenadante y se trabaja con el sedimento.
Montaje de la muestra.
En el portaobjeto de 52 pocillos limpios y desengrasados se coloca en el primer pozo 1
gota de control negativo y en los dems pozos una gota (20ul) del sedimento de las
muestras a investigar utilizando la pipeta automtica.
Secar los portaobjetos a temperatura ambiente.
Fijar los portaobjetos por 10 minutos en acetona.
Lavarlos con solucin de PBS (pH 7.2) x 10 minutos.
Secar en estufa.

-
Colocar 1 gota del conjugado diluido (10ml) en c/u de los pocillos e incubar en la
cmara hmeda a 37 C durante 30-45 minutos.
Lavar 2 veces el porta x 10 minutos con solucin de PBS (pH 7.2).
Secar en estufa.
Colocar el cubreobjeto con una gota de glicerina bufferada (pH 8.0).
Observar al microscopio con no menos de 400x.
Se confirma la presencia de formas compatibles con Campylobacter mediante la
observacin a 1000x.
64
Para la tcnica de Inmunofluorescencia pueden usarse diferentes marcadores de

fluorescencia como: Izquierda rodamina (rojo) y Derecha -fluorescena (verde)
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Se le aade la muestra
problema (suero)
Portaobjetos conteniendo
cultivos celulares infectados con
el virus o bacteria en estudio
Observacin en el microscopio
de Fluorescencia
Se realiza un lavado para

eliminar Acs no especficos
Se agrega conjugado conteniendo

antinmunoglobulina marcada con
isotiocianato de fluorescena
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Sobre un porta depositamos una

muestra en la que buscamos
presencia de un determinado
antgeno.
Aadimos un suero especfico del

antgeno problema marcado con
isotiocianato de fluorescena
(conjugado).
En caso contrario el conjugado se

elimina con un lavado del porta.
Si el antgeno problema se
encuentra presente en la
muestra, se une el conjugado.
BIBLIOGRAFA
1. Atlas, R.M. 1998. Microbiologa. Fundamentos y aplicaciones. Cia. El Cont. S. A. de C. V.
Mxico.
2. Bach, Jean Francois; Ph. Lesarve. Inmunologa. Ed. Masson 1990.
3. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 1994. Williams and Willking Co. Baltimore.
USA (8th.Ed.) 1,246p. (Biblioteca FMV)
4. Carter G.R. 1999. Bacteriologa y micologa veterinaria. Aspectos esenciales. Ed. Manual
Moderna. Mxico.
5. Daguet, G.L. y Col. 1997. Tcnicas en Bacteriologa. Vol 1. Aerobios, Edit. JINS.
Barcelona 2 p.
6. Jawetz, E. 1999. Manual de Microbiologa Mdica. Ed. El Manual moderno. Mxico.
7. Koneman, E.W. et al 1998. Diagnostico Microbiolgico. Edit. Medica Panamericana. Bs.
As. Argentina.
8. Nicolet, Jacques. 1998. Compendio de Bacteriologa Mdica y Veterinaria. Ed. Acribia.
S.A. Zaragoza. Espaa.
9. Olsen, R.G. et al. 1999. Inmunologa e inmunopatologa de los animales domsticos. Ed.
El manual Moderno. Mxico.
10. Pelczar, M.J., et al 2000. Microbiologa. Edit Mc Graw Hill.
11. Prescott, L.M, Harley, J.P, Klein D.A. 1999. Microbiologa Edit. Mc Graw-Hill
Companies, Inc. 1005 pp.
12. Tizard, I. 1999. Inmunologa Veterinaria. Edit. Interamericana. Mxico.
13. MICROBIOLOGY LAB INDEX. En lnea: http://www2.austin.cc.tx.us/Microbugz/
labindex.html
14. The Journal of bacteriology: http://jb.asm.org/
66

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CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNICA

PRIMERA ACREDITADA A NIVEL NACIONAL

GUA DE PRACTICA DE MICROBIOLOGA

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Bacterias que desarrollan mejor a pH menor a 5.5

requiere oxgeno libre para la respiracin.

crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de oxigeno libre.

bacterias que desarrollan mejor a pH mayor a 8.0

no requieren oxigeno libre para la respiracin.

muerte de bacterias en presencia de oxigeno, crecimiento solo

agente que destruye a las bacterias.

con actividad letal antibacterial.

agente que detiene el crecimiento bacterial.

agrupacin de un tipo de clulas bacterianas sobre un medio de

Crecimiento de los microorganismos, causando un

permite el crecimiento particular de una bacteria, por que hace

proceso a travs del cual, las clulas bacterianas se replican.

unidad formadora de colonias (en gramo o mililitro), esta es la

ptimo crecimiento entre 25 y 40 C

ptimo crecimiento en bajas concentraciones de oxigeno.

ptimo crecimiento entre 4 y 20 C algunos hasta 0C.

ptimo crecimiento entre 50 y 60 C algunos hasta 100 C

susceptibilidad de una bacteria hacia un antibacteriano.

parte de la medicina que estudia los sueros y sus propiedades,

MV. Siever Miguel Morales Cauti

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

A: Actividad que no multiplica ni disemina el microorganismo

MV. Siever Miguel Morales Cauti

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE

BIOSEGURIDAD: Es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros

C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de

MV. Siever Miguel Morales Cauti

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Proteccin de la piel: Usar guantes limpios, no necesariamente estriles, previo al

Proteccin ocular: La proteccin ocular y el uso de mascarillas tiene como objetivo

Proteccin corporal: A travs del mandil blanco de manga larga.

No comer, beber, ni fumar en el laboratorio

No manipular el sistema elctrico con las manos hmedas.

Ser cuidadosos en el manejo de los equipos y material de trabajo.

Coordinar permanentemente con el responsable de la prctica el manejo de material

Antes de realizar observaciones en el microscopio, analizar previamente las

10. Revisar que los grifos queden cerrados.

MV. Siever Miguel Morales Cauti

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

La asistencia a las prcticas es obligatoria: si pierde una prctica no tendr oportunidad de

El estudiante ingresar al saln de prctica llevando consigo, mandil blanco y el manual

El alumno deber leer con anticipacin la prctica correspondiente a la fecha, a fin de

No efectu las experiencias mecnicamente, sino entendiendo el fundamento de las

No se debe comer, fumar ni beber agua de los grifos.

Tener especial cuidado cuando maneje material contaminado y descartarlo en los

Al finalizar la prctica deber ordenar el material utilizado sobre la mesa de trabajo y,

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Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Para trabajar en las prcticas de microbiologa, se requiere de equipos y materiales

MV. Siever Miguel Morales Cauti

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DESCONTAMINACIN, LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

ESTERILIZACIN POR MTODOS FSICOS:

CALOR SECO (HORNO)