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Cintica Enzimtica

I.

Construo da curva padro de acar redutor:

1. Objetivo:
Construo da curva padro de acar redutor (glicose) para
determinar a
concentrao de glicose produzida pela reao da invertase.
2. Introduo:
As reaes qumicas conduzidas pelos organismos vivos so, na
sua maioria, catalisadas por enzimas, tornando a velocidade das
mesmas compatveis com as exigncias metablicas.
Para esse estudo, utilizaremos a invertase da levedura que
catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade de acar redutor
formado por clculo estequiomtrico, pode-se determinar a
quantidade correspondente de sacarose hidrolisada.
Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo
substrato da reao catasilada atravs de seu Km (concentrao de
substrato necessria para atingir metade da velocidade mxima da
reao catalisada pela enzima em questo).
A unio da enzima com o substrato forma o complexo enzimasubstrato, reao reversvel, podendo voltar a liberar a enzima e o
substrato ou liberando a enzima na mesma proporo em que foi
utilizada mais o produto.
Michaelis e Menten, desenvolveram ento a expresso:

onde [S] a concentrao de substrato e Vmx a velovicade


mxima da reao, em mol (de produto formado) por unidade de
tempo.
Assim, a levedura por intermdio da invertase hidrolisa a
sacarose, resultando numa mistura equimolecular de glicose e
frutose, acares esses que so absorvidos pela clula. A membrana
plasmtica impermevel sacarose, e a levedura acaba excretando
a invertase para a hidrlise ocorrer fora da clula da levedura.
Neste experimento, a invertase ser obtida de levedura de
panificao (fermento fleischmann) e adicionada sacarose (acar
no redutor), cuja hidrlise resulta na formao de acares
redutores (glicose e frutose) que sero estimados pela reao de
Somogyl-Nelson.
Para isso, se colocar a enzima frente diferentes concentraes

de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de


reao enzimtica, permitindo determinar graficamente os valores de
Km e Vm para a reao enzimtica da levedura
3. Material:
Pipetas
Tubos de ensaio
Espectrofmetro
Reativo de Somoggy
Reativo de Nelson
Glicose
4.

Metodologia:
Indentificar os tubos; o primeiro com a letra B, o segundo com o
nmero 1, o terceiro com nmero 2, e assim por diante at o nmero
5. Adicionar gua aos tubos de ensaio. No tubo B foi adicionado 1ml
de gua, no tubo 1 foi adicionado 0,8ml, no tubo seguinte 0,6ml, o
tubo 3 adicionou-se 0,4ml, no tubo 4 foi adicionado 0,2ml, e no ultimo
tubo no foi adicionada a gua.
Em seguida, adicionou-se glicose em cada um dos tubos, com
exceo do tubo de ensaio B. No tubo 1 foi adicionado 0,2ml, no 2 foi
0,4ml, no 3 foi 0,6ml, no 4 foi 0,8ml, e no tubo 5 foi adicionado 1ml
de glicose. Logo depois foi adicionado 1ml de reativo de Somoggy em
todos os tubos. Aps essa parte da prtica, os tubos foram agitados e
levados ao banho-maria fervente (100C) por 10 minutos.
Aps o banho-maria, foi adicionado 1ml de reativo de nelson em
todos os tubos de ensaio, e depois, 7ml de gua em cada um dos
tubos de ensaio.
Depois foi medida a absorbncia dos tubos no comprimento de onda
de 530nm. Foram encontrados os seguintes valores de absorbncia,
comeando pelo tubo B, 0,04; no tubo 1 foi 0,107; no tubo 2 foi
0,122; no tubo 3, 0,138; no tubo 4, 0,178; no tubo 5 foi 0,294.
Tubos

H2O
(ml)

Glicose
0,2mg\
ml (ml)

Reativ
o de
Somog
gy

1,0

1,0

0,8

0,2

1,0

0,6

0,4

1,0

0,4

0,6

1,0

Agitar
bem e
levar
ao
banho
-maria
ferven
te
(100
C) por
10
min.

Reati
vo de
Nelso
n

H2O
(ml)

Glico
se
(mg)

ABS
(530
nm)

1,0

7,0

0,04

1,0

7,0

0,10
7

1,0

7,0

0,12
2

1,0

7,0

0,13

8
4

0,2

0,8

1,0

1,0

7,0

0,17
8

1,0

1,0

1,0

7,0

0,29
4

5. Resultados:

II.

Construo da curva de Michaelis-Menten e clculo do


grfico de Lineweaver-Burk:
1.

Objetivo:

Determinao dos parmetros cintivos Km (constante de


Michaelis) e Vmx (velocidade mxima) atravs da construo dos
grficos de Michaellis-Menten e de Lineweaver-Burk.
2.

Material:
Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores.

3.

Metodologia:

Identificar os tubos na seguinte ordem: B1, 1, B2, 2, B3, 3, B4,


4, B5, 5. Adiconou-se, respectivamente, as seguintes quantidades de
tampo em cada um dos tubos: 2,3ml, 1,8ml, 2,1ml, 1,6ml, 1,7ml, 1,2ml,

0,9ml, 0,4ml, 0,5ml e 0ml. Em seguida, adicionou-se sacarose 0,4M em cada


um dos tubos, respectivamente: 0,2ml, 0,2ml, 0,4ml, 0,4ml, 0,8ml, 0,8ml,
1,6ml, 1,6ml, 2,0ml, 2,0ml. Ento, adicionou-se 0,5ml de enzima apenas nos
tubos 1, 2, 3, 4 e 5. Agitou-se bem os tubos e estes foram colocador em
banho-maria(37C) por 15minutos. Em seguida, adicionou-se 1ml de reativo
de Somoggy em todos os tubos e, ento, foram agitados e levados ao
banho-maria fervente (100C) por 10 minutos. Depois dos 10 minutos,
adicionou-se 1ml de reativo de Nelson em todos os tubos. Depois, foram
adicionados 5,5ml de gua em cada um dos tubos. Aps esse processo, foi
medida a absorbncia dos tubos no comprimento de onda de 530nm. No
tubo 1 foi obtido 0,322, no tubo 2 foi 0,404, no tubo 3 foi 0,441, no tubo 4
foi 0,502, e no tubo 5 foi obtido o valor de 0,557.
Tamp
o (ml)

Sacaro
se
0,4M
(ml)

Enzi
ma
(ml)

Agitar
bem e
levar
ao
banho
-maria
por 15
minut
os a
37C.

Reativ
o de
Somog
gy (ml)

B1

2,3

0,2

Reati
vo de
Nelso
n (ml)

H20
(ml)

1,0

5,5

1,8

0,2

0,5

1,0

5,5

B2

2,1

0,4

1,0

5,5

1,6

0.4

0,5

1,0

1,0

5,5

B3

1,7

0,8

1,0

1,0

5,5

1,2

0,8

0,5

1,0

1,0

5,5

B4

0,9

1,6

1,0

1,0

5,5

0,4

1,6

0,5

1,0

1,0

5,5

B5

0,5

2,0

1,0

2,0

0,5

1,0

1,0
1,0
1,0

Agitar
bem e
levar
ao
banhomaria
ferven
te
(100C
) por
10
minuto
s.

ABS
a
530
nm

0,32
2

0,40
4

0,44
1

0,50
2

0,55
7

4. Resultados:
1.
Tubo

[sacarose]

Atividade (ml\min)

0,008

0,0018

0,016

0,0024

0,032

0,0026

0,064

0,0030

0,080

0,0034

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