Introduccin

La cromatografa es uno de los principales

mtodos para la separacin de especies
qumicas estrechamente relacionadas en
mezclas complejas. La cromatografa es un
mtodo fsico de separacin basada en la
distribucin de los componentes de una
mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil. En todas las
separaciones cromatografas la muestra se disuelve en una fase mvil, que puedes
ser un gas lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar a travs de
una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie slida. Las fases se elegir de tal forma que los componentes de la muestra
se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria se mueven
lamentablemente con el flujo; por el contrario los componentes que unen dbilmente a
la fase estacionaria, se mueve con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que
pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativa.
CROMATOGRAFA
La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de los mtodos fsicos
y qumicos de separacin, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente
inmiscibles. La fase estacionaria y la mvil. Una muestra que se introduce en la fase
mvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria
distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas
(repartos) entre la fase mvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han
escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan
gradualmente en bandas en la fase mvil. Al final del proceso los componentes
separados emergen en orden creciente de interaccin con la fase estacionaria. El
componente menos retardado emerge primero, el retenido ms fuertemente efluye al
ltimo. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades
fsicas y/o qumicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes
(picos) se separan cuando el pico que sale despus es retardado lo suficiente para
impedir la sobre posicin con el pico que emergi antes.

Una amplia gama de seleccin de materiales para las fases mvil y estacionaria,
permite separar molculas que difieren muy poco en sus propiedades fsicas y
qumicas. En un sentido amplio, la distribucin de un soluto entre dos fases es el
resultado del balance de fuerzas entre las molculas del soluto y las molculas de
cada fase. Refleja la atraccin o repulsin relativas que presentan las molculas o
iones de las fases competidoras por el soluto y entre s. Estas fuerzas pueden ser de
naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o
pueden deberse a fuerzas de dispersin del tipo London.

Objetivos

Reconocer los equipos cromatograficos e identificar sus partes HPLC,

Cromatgrafo de gases y UPLC Masa Masa.

Identificar y aplicar la lgica de manejo de los equipos, as como los cuidados

que se deben tener antes, durante y despus de su manejo.

Marco terico
CROMATOGRAFA
Principios de cromatografa
La cromatografa es uno de los principales mtodos para la separacin de especies
qumicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografa es un
mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una
mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil.
En todas las separaciones cromatogrficas la muestra se disuelve en una fase mvil,
que puede ser un gas un lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar
a travs de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija en una columna
o sobre una superficie slida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de
la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son retenidos con ms fuerza por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen dbilmente
a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta

movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que

pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
En el laboratorio de tcnicas instrumentales de la Universidad de Valladolid
disponemos de las siguientes tcnicas cromatogrficas:
a. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS HPLC
b. CROMATOGRAFA DE GASES
c. CROMATOGRAFA INICA

a.CROMATOGRAFA DE LQUIDOS HPLC

Principios de la tcnica
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el
resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas
fases, mvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto
rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por
la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos
naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro
parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase
estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

HPLC preparativa

Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las

industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la
bioqumica. La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de
aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin
espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100
g.

Aplicaciones
Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,

aditivos

Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,

propulsores, colorantes

Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos

Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de

muestras de orina

Purificacin y separacin de enantimeros

Purificacin de compuestos naturales

Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

Funcionamiento del servicio

Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada en
esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El usuario debe rellenar
todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el
mejor resultado posible.
Equipos
o

HPLC analtico 1200 Series de Agilent Technologies

Bomba cuaternaria G1311

Detector de longitud de onda variable G1314B

Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D

Detector de ndice de refraccin G1362A

Detector de fluorescencia G1321A

HPLC preparativo 1200 Series de Agilent Technologies

Dos Bombas preparativas G1361A

Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D

Mostrador automtico G1329A

Colector de fracciones G1364B

b. CROMATOGRAFA DE GASES
Principios de la tcnica
En cromatografa de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una
columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil que es
un gas inerte, y a diferencia de la mayora de los tipos de cromatografa, la fase mvil
no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el
analito a travs de la columna.
Respecto a la cromatografa lquida, la cromatografa de gases tiene la ventaja de
disponer de detectores mucho ms universales (por ejemplo, el de ionizacin de
llama). Adems, para numerosas aplicaciones, los mtodos son ms simples, ms
rpidos y ms sensibles que los correspondientes a la cromatografa lquida de alta
resolucin. La instrumentacin requerida para cromatografa de gases tambin es
mucho ms sencilla y econmica que la empleada en HPLC. Sin embargo, en
cromatografa de gases, la influencia de la temperatura sobre la distribucin del
equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografa lquida. Por ello, la
cromatografa de gases presenta limitaciones en tres casos:

compuestos poco voltiles, generalmente los de peso molecular

superior a 300 u.m.a.

compuestos sensibles a una elevacin de la temperatura incluso

moderada (determinados compuestos de inters biolgico)

compuestos que se encuentran en forma inica (puesto que son e n

general poco voltiles)

Por esta razn, la cromatografa de gases se emplea cuando los componentes de la

mezcla problema son voltiles o semivoltiles y trmicamente estables a temperaturas
de hasta 350-400C. En cambio, cuando los compuestos a analizar son poco voltiles

y/o termolbiles, la tcnica separativa adecuada suele ser la cromatografa lquida de

alta resolucin (HPLC).
A menudo la cromatografa de gases se emplea para confirmar de la presencia o
ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
Aplicaciones
Medioambientales: Anlisis de pesticidas y herbicidas, anlisis de hidrocarburos,
semivoltiles y voltiles, anlisis del aire...
Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, cidos orgnicos,
azcares, FAMES, steres metlicos, triglicridos, alcoholes...
Qumica Industrial: alcoholes, cidos orgnicos, aminas, aldehdos y cetonas, steres
y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas, gases inorgnicos...
Biociencia: drogas, frmacos, alcoholes y contaminantes en sangre, disolventes
residuales...
Derivadas del petrleo: gas natural, gases permanentes, gas de refinera, gasolinas,
gasleos, parafinas.
Funcionamiento del servicio
Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada en
esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El usuario debe rellenar
todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el
mejor resultado posible.
Equipos
Cromatgrafos de gases Agilent Technologies 7890A

Detector de captura electrnica (ECD)

Detector de ionizacin de llama (FID)

c. CROMATOGRAFA INICA
Principios de la tcnica
En las ltimas dcadas, la cromatografa inica se ha convertido en uno de los
mtodos ms importantes para el anlisis de trazas de aniones y cationes. Tcnica
absolutamente imprescindible en el anlisis de aguas y medio ambiente

Se basa en el uso de resinas de intercambio inico. Cuando una muestra inica

atraviesa estas columnas, los iones presentes se separan debido a las diferentes
retenciones que sufren al interactuar con la fase fija de las columnas analticas. Una
vez separada, la muestra pasa a travs de un detector (conductimtrico,
amperomtrico, UV...) donde se registra la seal obtenida respecto al tiempo de
retencin. El resultado son unos cromatogrmas donde la posicin de los mximos
nos indica el ion presente (carcter cualitativo) y su rea nos indica que cantidad
existente de dicho ion (carcter cuantitativo).
Potencial analtico de la cromatografa inica
- Aniones inorgnicos y orgnicos: Fluoruros, cloruros, nitritos, bromuros, nitratos,
fosfatos, sulfatos, bromatos, cloritos, cloratos, actico, ctrico, tartrico, lctico, srbico,
benzoico
- Azcares y polialcoholes: Monosacridos, disacridos, oligosacridos, polisacridos.
- Cationes: Sodio, amonio, potasio, calcio, magnesio.
Aplicaciones

Aguas de consumo

Aguas minerales

Bebidas

Productos crnicos

Productos vegetales

Alimentacin infantil

Funcionamiento del servicio

Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada en
esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El usuario debe rellenar
todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el
mejor resultado posible.
Equipo
Cromatgrafo Inico IC Professional 850 de Metrohm con sistema de
ultrafiltracin

Detector de conductividad. Supresin qumica secuencial

Detector amperomtrico de pulsos (PAD)

Materiales:

High Performance
Liquid
Chromatograph

HPLC

UPLC

MS MS

Ultra Performance Liquid Chromatograph acoplado a un detector

MASA/MASA

GCC

MS - DETECTORES

Cromatgrafo de Gases acoplado a un detector

Procedimiento:

1. Es importante saber el funcionamiento y partes de cada equipo.

(Exterior).

2. Dentro del laboratorio se pudieron observar las mquinas y el software.

Detector arreglo de
diodos

UPLC MS/MS

Resultados:
A. CROMATOGRAFO DE GASES (GC)
Fundamento de la tcnica
En cromatografa de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de
una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil
que es un gas inerte, y a diferencia de la mayora de los tipos de cromatografa, la
fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de
transportar el analito a travs de la columna.
Respecto a la cromatografa lquida, la cromatografa de gases tiene la ventaja de
disponer de detectores mucho ms universales (por ejemplo, el de ionizacin de
llama). Adems, para numerosas aplicaciones, los mtodos son ms simples, ms
rpidos y ms sensibles que los correspondientes a la cromatografa lquida de
alta resolucin. La instrumentacin requerida para cromatografa de gases
tambin es mucho ms sencilla y econmica que la empleada en HPLC. Sin
embargo, en cromatografa de gases, la influencia de la temperatura sobre la
distribucin del equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografa lquida.
Por ello, la cromatografa de gases presenta limitaciones en tres casos:
compuestos poco voltiles, generalmente los de peso molecular superior a

300 u.m.a.
compuestos sensibles a una elevacin de la temperatura incluso
moderada (determinados compuestos de inters biolgico)

compuestos que se encuentran en forma inica (puesto que son en

general poco voltiles)

Por esta razn, la cromatografa de gases se emplea cuando los componentes de

la mezcla problema son voltiles o semivoltiles y trmicamente estables a
temperaturas de hasta 350-400C. En cambio, cuando los compuestos a analizar
son poco voltiles y/o termolbiles, la tcnica separativa adecuada suele ser la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
.
A menudo la cromatografa de gases se emplea para confirmar de la presencia o
ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
DESCRIPCION DEL CROMATOGRAFO DE GASES
Un cromatgrafo de gases consiste en varios mdulos bsicos ensamblados para:
1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase mvil), 2)
permitir la introduccin de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye,
3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la
temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar
los componentes de la muestra conforme e luyen de la columna, y 6) proveer una
seal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Los
mdulos del instrumento se muestran esquemticamente en la Fig. 1

Figura 1.:
Esquema de
un
cromatgrafo
de gases

Sistemas de inyeccin de muestra

ctor: en actualidad es un dispositivo

que evita
las interferencias en la corriente
de disolvente
Columna:
materialplsticocompresible
que elimina
los espacios muertos d
El modo estndar, adecuado para aproximadamente 95% de las aplicaciones de las
columnas empacadas (o empaquetadas), es la inyeccin directa. La muestra
es
Computadora
inyectada con una jeringa hipodrmica a travs de un septum de goma (o hule) de
silicona auto sellante, a un alineador de vidrio (glas inserta) contenido en un bloque
metlico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna (Fig. 2). El bloque se calienta
a una temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir
prcticamente en forma instantnea la muestra lquida en vapor. La cantidad de
muestra inyectada es del orden de L para lquidos y algo superior para gases.

caen forma de picos (cromatograma) que identifica las sustancias

analizadas
y sede
puede
calcular para elan
Figura
2. Esquema
un puerto

bsorbancia, el ndice derefraccin, la fluorescencia

de

inyeccin

por

vaporizacin

instantnea tpico

Las muestras, lquidas y gaseosas, tambin pueden introducirse con un lazo (o bucle)
calibrado, introducindolas despus a la corriente del gas que fluye por medio de una
vlvula

st.de inyeccin

HPLC
UPLC MASA MASA

Automuestreado
ctor: en actualidad es un dispositivo
que evita
las interferencias en la corriente
de disolvente
Columna:
materialplsticocompresible
que elimina
los espacios muertos d

Computadora
Detector

caen forma de picos (cromatograma) que identifica las sustancias analizadas y se puede calcular para elan

bsorbancia, el ndice derefraccin, la fluorescencia

Bombas

Conclusiones:

El sistema HPLC es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente

utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de
especies no voltiles o termolbiles y su gran adaptabilidad a sustancias que
son de gran inters para la industria, la ciencia y la sociedad. El empleo de
HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho. Algunas
aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas,
cidos

nuclicos,

hidrocarburos,

carbohidratos,

frmacos,

terpenos,

plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies rgano metlicas y una gran

variedad de sustancias inorgnicas. La HPLC analtica ha adquirido una
especial importancia en el campo de la investigacin y desarrollo cientfico,

encargndose del control de calidad farmacutico y el anlisis medioambiental.

En la industria actual la necesidad de resultados rpidos y fiables hacen que el
mercado de instrumental de laboratorio sea cada da ms dinmico. Por este
motivo, los proveedores estn dando una rpida respuesta a las exigencias de
automatizacin, permitiendo determinaciones a niveles inferiores, mayor
especificidad y mayor facilidad en la deteccin de cualquier fallo que pueda
presentar un producto. Hoy en da, todos los centros de anlisis comienzan a
disponer de equipos sofisticados, como por ejemplo espectrmetros de masas,
que hasta hace poco slo se encontraban en centros de investigacin. En la
instrumentacin, la investigacin se enfoca en dotar al mercado de nuevos
equipos que permiten conocer los resultados en tiempo real y cada vez con

ms precisin.
La cromatografa de gases es una tcnica muy til para de separacin y
determinacin de compuestos orgnicos voltiles y semivoltiles que sean

trmicamente estables.
Para evaluar la importancia de la cromatografa lquida, es necesario distinguir
entre los dos papeles que desempea la tcnica. El primero como herramienta
para realizar separaciones; en este sentido, resulta inmejorable cuando se
aplica a muestras orgnicas complejas, a organometlicos y a sistemas
bioqumicos. El segundo, una funcin claramente distinta, es el de proporcionar
un medio para llevar a cabo un anlisis. En este caso se emplean los tiempos o
volmenes de retencin para la identificacin cualitativa, mientras que las
alturas de los picos o sus reas dan informacin cuantitativa. Con fines

cualitativos, la cromatografa lquida es una tcnica mucho ms limitada que

otros mtodos. En consecuencia, una tendencia importante en este campo ha
consistido

en

la

combinacin

de

las

notables

cualidades

para

el

fraccionamiento que tiene la cromatografa liquida con las mejores propiedades

para la identificacin que tienen algunos instrumentos como los espectrmetros
de masas, infrarrojo y NMR.

Discusiones
1. Segn: (J.M.Casas, J.Garca, J.M:Guadayol), La cromatografa de
gases-masas es una tcnica que combina la capacidad de separacin que
presenta la cromatografa de gases con la sensibilidad y capacidad selectiva
del detector de masas. Esta combinacin permite analizar y cuantificar
compuestos trazas en mezclas complejas con un alto grado de efectividad.
2. Segn: (Colum, A. et al., 2001). La cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC) es la tcnica de separacin de sustancias ms ampliamente utilizada.
Los sistemas HPLC-MS facilitan el anlisis de muestras que tradicionalmente
han sido difciles de analizar por GC-MS es decir, analitos poco voltiles. Como
resultado, la tcnica es ampliamente utilizada en el anlisis de frmacos,
protenas, etc.
3. La cromatografa de gases tiene una amplia aplicacin en la identificacin y
cuantificacin de molculas orgnicas voltiles.
En la industria se enfoca principalmente a evaluar la pureza de reactantes y
productos de reaccin o bien a monitorizar la secuencia de reaccin. En la
industria del petrleo juega una funcin primordial, por medio de la
cromatografa se puede analizar constituyentes de las gasolinas, las mezclas
de gases de refinera, gases de combustin, etc. (Krynitsky, A. J.; Lehotay, S.
J., 2003)
4. Segn: (Lambropoulou, D. A.; Albanis, T. A., 2007). LC-MS es muy comn en
farmacocinticas estudios de los productos farmacuticos y por lo tanto la
tcnica ms frecuentemente utilizada en el mbito de bioanlisis. As mismo se
utiliza en el desarrollo de drogas e identificacin de las mismas. La alta
sensibilidad y la selectividad y el alto rendimiento de LC / MS / MS que sea
eficaz para la determinacin de trazas en matrices biolgicas complejas.
Es de aplicacin en estudios medioambientales en distintos medios: residuos
farmacuticos, residuos de medicamentos veterinarios y plaguicidas, as como

metabolitos de estos productos. As mismo, se aplica en la determinacin de

trazas de residuos de contaminantes en productos alimenticios.
5. cromatografa de gases espectrometra de masa/masa (GC-MS/MS) Las
ventajas principales de esta metodologa se centran en su selectividad y
sensibilidad a concentraciones traza (ppm y ppb) adems es sencilla, tiene una
alta confiabilidad y es rpida (Kotretsou, S. I.; Koutsodimou, A., 2006;
Walorczyk, S., 2007; Fernndez-Moreno, J. L. et al., 2008).
6. Segn: (Lehotay, S. J. et al., 2008). La MS da nombre a un conjunto de
tcnicas utilizadas para la medida de la masa de los iones y su abundancia en
la fase gaseosa. Su versatilidad se debe en parte al amplio abanico de
posibilidades de las secciones de un espectrmetro de masa que son la fuente
de ionizacin, el analizador de masa y el detector.
7. La MS/MS puede usarse para elucidar estructuras complicadas de iones
originales y determinar componentes de una mezcla de analitos en matrices
complejas como los alimentos. (Garrido-Frenich, A. et al., 2005).
8. Para establecer la calidad de la tcnica de GC-MS/MS, se consideran los
coeficientes de variacin, el lmite de deteccin (LDD) y el lmite de
cuantificacin (LDC). (Garrido-Frenich, A. et al., 2005, 2007 y 2008).

Referencias bibliogrficas:
1) J.M.Casas, J.Garca, J.M: Guadayol, J.Oliv. Anlisis instrumental 2:
Cromatografa i electroforesis. Ediciones UPC, Barcelona, 250p. (1994).
2) L. Esteban. La Espectrometra de masas en imgenes. ACK editores, Madrid,
261 p. (1993).
3) Rubinson, K. A.; Rubinson, J. F. 2001. Anlisis instrumental. 1ra. Edicin.
Pearson Editorial, S. A. Madrid, Espaa. Pp. 872
4) R. Cela, R. A. Lorenz o, M. C. Casais (2002), Tcnicas de Separacin en
Qumica Analtica, Editorial Sntesis, Madrid.
5) Claude flancy. (2003) Fundamento cientficos y tecnolgicos. A.M.V Ediciones.
Espaa