Métodos Moleculares para A Análise Do Dna

1
DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO
MTODOS MOLECULARES PARA ANLISE DO

DNA
CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS

SO JOO DA BOA VISTA, SP, 2004
DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO
MTODOS MOLECULARES PARA A ANLISE DO DNA
Nome do orientador: Maurcio Bacci Jnior

Monografia
apresentada
como
requisito
da
Disciplina de Estgio supervisionado do Curso de

Cincias Biolgicas
CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS

SO JOO DA BOA VISTA, SP, 2004
PGINA DE APROVAO
Autor: Douglas de Oliveira Luciano
Ttulo da monografia: Mtodos moleculares para a anlise do DNA
Monografia aprovada em________ de ______________de ______________, pela

banca examinadora.
________________________________
Orientador: Prof. Dr. Maurcio Bacci Jnior
________________________________
Bilogo Joaquim Martins Jnior
_______________________________
Farmacutica Danyelle Cristine Marini
________________________________
4
Douglas de Oliveira Luciano
DEDICATRIA
Dedico este trabalho de concluso de curso a minha me Oneide e ao meu

pai Jos Mrio pelo amor, dedicao, amizade e apoio. A eles muito devo e espero
que esta monografia seja-lhes motivo de orgulho, por ser mais uma realizao e
mais uma etapa que concluir em minha vida.
AGRADECIMENTO
Para realizar um trabalho como este, foi necessria a ajuda de muitas

pessoas. Agradec-las somente uma das formas de mostrar-lhes minha gratido.
Deixo meus agradecimentos aos meus amigos Joaquim e Dani que

colaboraram imensamente com a realizao desta monografia.
Agradeo ainda a todos os amigos do laboratrio da UNESP (CEIS) pelo

apoio e companheirismo ao longo dessa pesquisa.
Agradeo, em especial, ao professor Dr. Maurcio Bacci Jnior, no somente

por ter sido o orientador desta monografia, mas tambm por sua amizade e por tudo
que fez para me ajudar na concretizao deste trabalho.
RESUMO
O seqenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos

nucleotdeos, molculas que constituem o DNA. Existem vrios mtodos disponveis,
e cada um apresenta vantagens e desvantagens. O processo realizado a partir de
uma cadeia simples (no dupla) do DNA a ser seqenciado; esta servir de molde
para gerar a outra metade complementar da dupla hlice. Isto obtido pela
desnaturao da molcula nativa. O mtodo pode ser automatizado atravs de
seqenciador automtico gerenciado por computadores com softwares que analisam
seqencialmente e identificam os produtos. Isto permitir executar o processo em
grande escala. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmenta, aps
iluminao com um feixe de laser, identificar os produtos baseados na diferena de
comprimento de onda. Quando os fragmentos gerados numa reao de
seqenciamento so separados por eletroforese, os fragmentos menores vo
frente, seguidos dos demais, sendo distncia entre as bandas aproximadamente
iguais, pois representa sempre a diferena de uma base a mais ou a menos.
Palavras-chave: DNA, seqenciamento, fluorescncia, mtodos, fluorescente.
** - colocar sobre extrao, purificao, e outros.
ABSTRACT
The sequencing of DNA is a process that determines the order of the

nucleotideos, molecules that constitute the molecule of DNA in a sample. Some
methods available each one presents advantages and disadvantages. The process
is carried through from a simple chain (not double) of the DNA to be sequenced; this
will serve of form to generate to another complementary half of the double helix.
That is gotten for the denaturation of molecule native. The method can be automat
zed through would it schemes appropriate managed for computers with softs that
they to read sequentially and they identify the products. This will allow executing the
large-scale process. The distinguishing fluorescent signal emitted by each fragment,
after illumination with a laser beam, will identify the products based in the difference
of wavelength. When the piece generated in a sequence reaction are separate for
electrophoreses, the lesser fragment go to the front, followed of excessively, being in
the distance enter the bands approximately equal, therefore it always represents the
difference of a base more or less.
Keywords: DNA, sequence, fluorescence, methods, electrophoreses.
*** no colocar para traduzir em site ou em programas.
LISTA DE FIGURAS
Figura
1
Estrutura
qumica
dos
quatro
nucleotdeos
.......................................................................................................................
12
Figura 2 - (a) Modelo simplificado da estrutura helicoidal do DNA,
mostrando as pontes de hidrognio que unem as bases purnicas Adenina
(A) e Guanina (G) s bases purimidnicas Timina (T) e Citosina (C),
respectivamente; b) Estrutura tridimensional da dupla hlice de DNA, com
suas fitas de polaridade inversa, tendo uma o sentido 3 5 e outra o
sentido 5 3 e c) Viso esquemtica da dupla hlice do DNA formadas
por nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister
e pelas bases
nitrogenadas ligadas por pontes de hidrognio, de forma que A se liga T
por 2 pontes de hidrognio e G e C
so ligadas por 3 pontes de
hidrognio.
.......................................................................................................................
13
Figura 3 - Thomas D. Brock no Lago do Yellowstone National Park
.......................................................................................................................
24
Figura
4Termocicladores
.......................................................................................................................
25
Figura 5 - Representao esquemtica de algumas etapas da tcnica
PCR
.......................................................................................................................
26
Figura 6 - Esquema para a obteno de plasmdeos recombinantes

.......................................................................................................................
36
Figura 7 Processo conhecido com rplica.......................................................38
9
Figura
Seqenciamento
41
Figura 9 - DNA ligase catalisa a juno de duas fitas de DNA que so
partes
da
molcula
da
dupla-hlice.
.......................................................................................................................
43
Figura 10 - Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem
ser transformadas em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).
44
Figura 11. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas.
.......................................................................................................................
45
Figura
12
A
reao
de
sntese
.......................................................................................................................
.47
Figura
13
Terminadores
.......................................................................................................................
48
Figura
14
Autoradiograma
.......................................................................................................................
49
Figura
15
Fragmentos
de
diferentes
comprimentos
.......................................................................................................................
52
Figura 16 -Os fragmentos de diferentes comprimentos que migram no gel
.......................................................................................................................
53
Figura 17- Eletroferograma parcial de uma sequncia de DNA
.......................................................................................................................
54
10
SUMRIO
1. INTRODUO..........................................................................................11
1
ESTRUTURA E FUNO DO DNA.........................................................11
1.1
EXTRAO DE DNA...............................................................................13
1. Eletroforese em Gel de Agarose..............................................................16
11
2.
Espectrofotometria....................................................................................20
3.
Fluorometria..............................................................................................20
AMPLIFICAO.......................................................................................24
2.1
REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)....................................24
PURIFICAO DA AMPLIFICAO........................................................27
CLONAGEM.............................................................................................30
4.1
CLONAGEM DE DNA...............................................................................30
4.2
CICLO CELULAR.....................................................................................31
4.3
ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA.........................................32
4.4
PREPARAO DO PLASMDEO (PREP)........................................................33
4.4.1 Clonando DNA de um Plasmdeo...................................................................35

5 REAO DE SEQENCIAMENTO...............................................................39
5.1
Seqenciamento Automtico....................................................................40
6 PURIFICAO DA REAO........................................................................42
6.1
DNA LIGASE.............................................................................................43
6.1.1 Tipos de Fragmentos de DNA que so ligados pela DNA Ligase............43

7 SEQENCIAMENTO DE DNA......................................................................46
7.1
PRODUO DE UM DNA PARA SEQENCIAMENTO E A TCNICA DIDEOXI

..................................................................................................................49
CONCLUSO......................................................................................................54
REFERNCIAS...................................................................................................55
RELATRIO DE ESTGIO.................................................................................61
INTRODUO
12
Todos os seres vivos so formados de clulas e as formas mais simples de
vida so clulas individualizadas, que se propagam por cissiparidade. Porm,
organismos superiores, como vegetais e animais, so constitudos de grupos
celulares que tm tarefas especializadas e so ligadas por um complexo sistema de
comunicaes.
As clulas so constitudas de molculas e ocupam um ponto intermedirio na
escala da complexidade biolgica. O estudo das molculas e a compreenso do
funcionamento delas revelam a maneira pela qual a cooperao intercelular origina
os organismos mais complexos.
Milhares de reaes diferentes e intimamente coordenadas so realizados
simultaneamente por uma clula e uma variedade de mecanismos-controle regulam
as atividades de enzimas-chave em respostas a mudanas de condies da clula.
A evoluo de grandes animais e plantas dependeu da evoluo de muitos
tipos de clulas especializadas, assim como de uma maior coordenao entre elas,
refletindo um crescente e elaborado sistema de controle da expresso gnica nas
clulas individuais.
Na maioria dos seres vivos as informaes genticas so transportadas na
seqncia linear de nucleotdeos no DNA, com exceo de alguns vrus, cujo
material gentico o RNA. Cada molcula de DNA uma dupla-hlice formada por
duas fitas complementares de nucleotdeos unidas por pontes de hidrognio entre os
pares de bases G-C (citosina e guanina) e A-T (adenina e timina). A duplicao da
informao gentica ocorre pela polimerizao de uma nova fita complementar de
cada uma das fitas originais da dupla-hlice, durante a replicao de DNA.
At o inicio da dcada de 70, o DNA era a molcula celular mais difcil de ser
analisada pelo bioqumico. Extremamente longa e quimicamente montona, a
seqncia de nucleotdeos do DNA somente podia ser estudada atravs de
abordagens indiretas, como seqenciamento de protenas ou RNA ou por analise
gentica. Atualmente possvel manipular uma regio especifica do DNA, produzir
um numero virtualmente ilimitado de copias da mesma e determinar a sua seqncia
nucleotdica num ritmo bastante acelerado. Variaes das mesmas tcnicas
permitem que um gene isolado seja alterado (engenharia do DNA) de acordo com o
interesse e, posteriormente, reintroduzido em clula de cultura. Com um pouco mais
de dificuldade, possvel inserir um gene modificado na linhagem germinativa de um
13
animal ou de um vegetal, de modo que ele se torne funcional e que seja herdado
como parte do genoma do organismo que o recebeu.
Estes estudos levaram descoberta de novas classes de genes e protenas,
e revelaram que muitas protenas foram altamente conservadas ao longo do
processo evolutivo, num grau bem maior do que se suspeitava anteriormente.
O DNA ento, tornou-se a molcula mais fcil de ser analisada, sendo
possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a
sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia.
**A capacidade das clulas de manter a ordem em um universo catico
depende da informao gentica que expressa, mantida, replicada e,
ocasionalmente, melhorada, atravs dos processos genticos bsicos: sntese de
RNA e de protenas, reparao do DNA, replicao do DNA e recombinao
gentica.
Gentica o estudo dos genes em todos os nveis, desde as molculas at
as populaes. Os primrdios desta disciplina datam da dcada de 1860, com o
trabalho de Gregor Mendel, que formulou a idia da existncia dos genes
(chamados por ele de partculas ou fatores). Hoje sabemos que os genes
correspondem a regies especficas da longa molcula de DNA que constitui a
estrutura fundamental do cromossomo.
1 ESTRUTURA E FUNO DO DNA
14
A vida depende da capacidade das clulas de armazenar, resgatar e traduzir
as instrues genticas necessrias para fazer e manter um organismo.
No incio do sculo XX, reconheceu-se que os genes esto nos
cromossomos, estruturas ento conhecidas como filamentos no ncleo de uma
clula. Anlises bioqumicas mostraram que os cromossomos continham DNA e
protena.
Conduzindo seus experimentos com linhagens virulentas e no-virulentas da
bactria Streptococcus pneumoniae, Frederick Griffith, em 1928, demonstrou que o
DNA o princpio transformante. A demonstrao de que o DNA o princpio
transformante foi primeira de que os genes so compostos por DNA.
Os bilogos da dcada de 40 tinham dificuldades em aceitar que o DNA era o
material gentico devido sua simplicidade qumica, frente enorme diversidade de
caractersticas apresentadas pelos organismos. Porm, em 1952 Allfred Hershey e
Martha Chase, a partir de seus experimentos com bactrias Escherichia coli
infectadas por fagos T2, apresentaram argumentos conclusivos de que o DNA era o
material gentico.
A estrutura fsica do DNA ainda no era conhecida, mas os blocos
estruturais (as quatro molculas bsicas, conhecidas por nucleotdeos, contendo
um fosfato, uma pentose e uma das quatro diferentes bases nitrogenadas: Adenina,
Citosina, Guanina e Timina) j eram conhecidos (Figura 1). Entretanto, a
compreenso ainda era difcil, pois os conceitos sobre o cdigo gentico ainda no
estavam estabelecidos.
15
Figura 1 - Estrutura qumica dos quatro nucleotdeos que formam os blocos estruturais do DNA.
Cada nucleotdeo constitudo por um fosfato, uma pentose (desoxirribose) e uma base nitrogenada,
que podem ser purnicas (guanina e adenina) ou pirimidnicas (citosina e timina). (Griffiths et al.,
2000).
No incio da dcada de 50, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins examinaram

pela primeira vez a molcula de DNA por difrao de raio X, uma tcnica que
permite determinar a estrutura atmica tridimensional de uma molcula. Os
resultados indicaram que DNA era composto de duas fitas enroladas em uma hlice.
Erwin Chargaff, por sua vez, estabelecera regras empricas sobre as quantidades de
cada componente do DNA, a qual definia que a quantidade total de nucleotdeos
pirimidnicos (T+C) sempre igual quantidade total de nucleotdeos purnicos
(A+G).
Em 1953, James Watson e Francis Crick deduziram e propuseram, a partir
destas informaes, a estrutura de dupla hlice do DNA, onde cada hlice uma
cadeia de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister e cujas hlices esto ligadas
por pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas, por pareamento especfico
entre uma base purnica com uma base pirimidnica. Estabeleceram tambm que
apenas os pareamentos T-A e C-G tinham complementaridade tipo chavefechadura, necessria para um pareamento eficiente por pontes de hidrognio
(Figura 2).
O modo como as subunidades de nucleotdeos esto ligadas d fita de DNA
uma polaridade qumica que caracteriza uma extremidade como 3 e a outra como
extremidade 5, esta conveno baseada nos detalhes da ligao qumica entre os
nucleotdeos.
16
Figura 2 - (a) Modelo simplificado da estrutura helicoidal do DNA, mostrando as pontes de hidrognio
que unem as bases purnicas Adenina (A) e Guanina (G) s bases purimidnicas Timina (T) e Citosina
(C), respectivamente; b) Estrutura tridimensional da dupla hlice de DNA, com suas fitas de
polaridade inversa, tendo uma o sentido 3 5 e outra o sentido 5 3 e c) Viso esquemtica da
dupla hlice do DNA formada por nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister e pelas bases
nitrogenadas ligadas por pontes de hidrognio, de forma que A se liga T por 2 pontes de hidrognio
e G e C so ligadas por 3 pontes de hidrognio. (Extrado de Griffiths et al., 2000).
O gene uma regio do DNA que controla uma caracterstica hereditria

especfica. A seqncia especifica das bases que compe o gene geralmente
corresponde a uma nica protena ou RNA complementar.
1.1
EXTRAO DE DNA
Para o isolamento e purificao de cidos nuclicos, necessrio separ-los

efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos cidos
nuclicos, tambm fundamental manter a integridade das molculas, que devem
permanecer inalteradas durante o procedimento de extrao, pois as informaes
contidas no DNA/RNA dependem da seqncia diretamente. Alguns protocolos
resultam na quebra dos polmeros de DNA ou RNA, causando a perda de
informaes. Portanto, extremamente importante que os cidos nuclicos sejam
extrados num estado mais intacto e inteiro possvel. Para DNA, teoricamente, a
extrao de molculas do tamanho de cromossomo seria ideal. Apesar de ser
possvel, especialmente para algumas aplicaes, tais como eletroforese de campo
pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis), as quantidades obtidas no so
17
suficientes para a maioria dos usos. Existe, portanto, um balano entre a qualidade e
praticidade. Existem vrios mtodos descritos na literatura, e a escolha depende do
balano entre a praticidade, qualidade e a finalidade de uso do acido nuclico. De
modo geral, os mtodos e extrao consistem dos seguintes passos:
a) ruptura dos tecidos atravs da triturao de tecidos congelados na presena de
nitrognio liquido ou gelo seco.
b) liberao de componentes celulares num tampo de lise da membrana com
detergentes (SDS, sodium dodecil sufato; ou CTAB, cetiltrimetilamonio brometo).
O tampo de extrao deve possuir Ph entre 8,0 e 9,0, desfavorvel ao de
nuclease.
c) inativao de nuclease por esses detergentes e agentes quelantes (EDTA,
ethilenodiamonotetraacetato). Este agente quelante imobiliza ction de Mg, que
so cofatores para varias endonucleases. A emulsificao da mistura de tampo
e tecido com fenol ou clorofrmio leva a desnaturao das protenas. Na
extrao de DNA de plantas, utiliza-se o PVP (polivinilpirrolidona) por possuir
efeito antioxidante, e adicionado para evitar a oxidao de polifenis. O agente
redutor -mercaptoetanol inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases.
d) remoo dos resduos celulares e precipitao das protenas por centrifugao.
A desproteinizao obtida atravs de um tratamento com fenol ou clorofrmio,
pois esses solventes orgnicos desnaturam as protenas e enzimas, e so
separadas aps centrifugao, permanecendo na interface entre a fase aquosa
(superior) contendo os cidos nuclicos e a fase orgnica (inferior). Alguns
protocolos incorporam proteases (protena K) para facilitar a separao do DNA
das protenas da cromatina.
e) recuperao dos cidos nuclicos totais por precipitao em lcool (etanol ou
isopropanol).
f) eliminao do RNA por digesto com RNAse, ou separao de RNA e DNA por
solubilidade diferencial em sais. Sob condies de alta concentrao de sais (Ex:
7,5 M de Acetato de Sdio), DNA e os RNA pequenos (principalmente Trna)
permanecem em soluo, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.
Os cidos nuclicos so polinions solveis em gua. Os sais de sdio e
potssio de cidos nuclicos so solveis na maioria dos solventes orgnicos,
18
incluindo numa mistura de etanol e gua, mas eles no so desnaturados por
solventes orgnicos. O detergente catinico CTAB solubiliza membranas celulares, e
dependendo da concentrao de NaCl no tampo, CTAB forma um complexo com o
DNA, e utilizado para precipitar DNA seletivamente.
Para analise de DNA, utilizando a digesto por enzimas de restrio (Ex:
RFLP), existe a necessidade de obter-se DNA de boa qualidade. Contaminantes
(polifenis e polissacardeos) interferem na atividade dessa enzima, reduzindo a
eficincia. A contaminao por polissacardeos consiste na principal contaminao
afetando a pureza do DNA extrado de plantas. Esses carboidratos podem inibir a
atividade de vrias enzimas usadas em manipulaes biolgicas de DNA, tas como,
ligase, polimerase, e enzimas de restrio. A maioria dos mtodos de extrao
empregada no separa eficientemente o DNA dos polissacardeos, provavelmente
devido similaridade estrutural entre esses dois tipos de polmeros. A contaminao
por polissacardeos depende da espcie, tecido e condies fisiolgicas da planta
amestrada. Certas espcies produzem um DNA muito contaminado por
polissacardeo, tornando difcil a ressuspenso do pelet. Vrios mtodos tm sido
propostos tentando superar esse problema. A contaminao por fenis, e a
conseqente oxidao do DNA, pode ser evitada agregando PVP, -mercaptoetanol
ao tampo de extrao. Em casos extremos, o composto dietilditiocarbonato (0,1 M)
pode ser adicionado.
Os mtodos de extrao de DNA mais antigos empregavam gradientes em
CsCl, que produzem DNA de alta qualidade, mas so caros e trabalhosos,
requerendo uma ultracentrfuga. Solues com alta concentrao de cloreto de csio
(5M) formam um gradiente de densidade sob alta centrifugao, e o sal de csio de
DNA possui uma densidade intermediria entre os extremos de concentrao (e,
portanto de densidade) desse gradiente. possvel a separao de RNA do DNA,
assim como espcies de DNA com densidade diferente devido a composio de
bases e estrutura terciria. Esses mtodos de extrao de DNA necessitam maiores
quantidades de tecido, um problema quando se trabalha com um grande nmero de
indivduos em anlises genticas. Mais recentemente, com o advento do PCR,
vrios mtodos foram propostos, que utilizam pouca quantidade de tecido na
extrao, resultando num DNA com qualidade inferior, mas bem aceitveis. A maior
parte dos protocolos de extrao disponveis deriva basicamente do mtodo descrito
19
por Dellaporta et al. (1983) e aqueles que utilizam o detergente CTAB (brometo de
hexadeciltetrametilamnio), onde o DNA solvel sob altas concentraes de sal.
1.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose
Sob influncia de uma diferena de potencial eltrico, tomos, molculas e

partculas com carga, em soluo aquosa, migram na direo do eletrodo com carga
oposta. Como as molculas tm cargas e massas variveis, a migrao em um meio
de viscosidade definida se dar em diferentes velocidades, com separao das
vrias fraes de uma mistura.
A mobilidade eletrofortica, que a velocidade de migrao por unidade de
campo eltrico, um parmetro caracterstico da molcula em um determinado meio
de eletroforese. Este parmetro depende da densidade de cargas da molcula e do
seu tamanho. Depende, portanto, do pH do grupo ionizvel e do pH do tampo que
dissolve a amostra. Como a viscosidade do gel determina o atrito, limitando a
velocidade de propagao, a mobilidade eletrofortica ser dependente da
temperatura. O que normalmente analisamos a mobilidade eletrofortica relativa
da molcula, comparando-se as distncias de migrao com as de uma substncia
padro, aplicada na mesma corrida eletrofortica. Estas substncias constituiro
marcadores que tornam a avaliao da separao eletrofortica relativamente
independente de variaes na diferena de potencial eltrico e do tempo de
eletroforese.
As amostras para eletroforese no podero conter partculas grandes ou
gotculas de leo em suspenso, pois estas interferem com a separao por
bloquear os poros da matriz de eletroforese. Pode-se centrifugar as solues antes
de coloc-las no gel.
Separar substncias que tm ou cargas positivas ou cargas negativas, como
os cidos nuclicos, que s tm cargas negativas, no constituem, em geral,
problema. As molculas como as protenas cuja carga resultante dependente do pH
do meio tero as migraes eletrofortica fortemente influenciadas pelo pH do
tampo.
20
A fora inica (concentrao total de ons) do tampo utilizado deve ser to
baixa quanto possvel (o mnimo que garanta um pH constante), reduzindo-se, desta
forma, as correntes inicas que fluem pelo gel e a dissipao trmica excessiva
(lembrar que os ons que constituem o tampo tambm migram eletroforeticamente,
contribuindo para a corrente total).
Para se avaliar o progresso da separao e reconhecer o fim da corrida,
corantes com alta mobilidade eletrofortica so adicionados juntamente com a
amostra.
A matriz do gel de eletroforese deve ter poros de tamanhos regulares e
ajustveis, deve ser quimicamente inerte. A eletro-osmose, que o arraste do
solvente pela migrao eletrofortica do soluto, quando os poros so pequenos, no
deve ocorrer, pois alteraria a mobilidade dos ons.
Os gis de agarose, um polissardeo extrado de algas marinhas, so
adequados para separar molculas com dimetro igual ou superior a 10 nm. Com a
remoo da agaropectina, se obtm tipos de agarose com diferentes graus de
pureza e de eletrosmose. As diferentes agaroses se caracterizam pelo seu ponto de
fuso (melting point), que pode variar entre 35 oC e 95oC e pelo grau de eletrosmose
(mr), que depende do nmero de grupos polares que persistem aps a purificao.
O tamanho dos poros depende da concentrao de agarose. A concentrao
em geral dada como peso de agarose por volume de gua. Em geral, gis a 1%
tm poros em torno de 150 nm e gis a 0,16% tm poros em torno de 500 nm. A
agarose dissolvida em gua fervendo e forma um gel quando esfria. Durante esse
processo h formao de duplas hlices que se juntam lateralmente, de modo a
formar filamentos finos. Durante a geleificao h formao de polmeros.
Eletroforese em gel de agarose o mtodo de escolha para separao,
purificao e identificao DNA e RNA. So utilizados, para isso, gis horizontais,
submarinos: o gel fica diretamente mergulhado no tampo. O gel de agarose tem
menor resoluo que o de acrilamida (que veremos posteriormente), mas tem uma
faixa de separao maior (entre 200 pb e cerca de 50 kpb).
A eletroforese em gel de agarose consiste no mtodo padro usado para
separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA.
eletroforese em gel de acrilamida usada em menor escala. A tcnica simples,

rpida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que no podem ser
separados por outros mtodos, tais como centrifugao com densidade de gradiente
21
ou por velocidade de sedimentao.
determinada diretamente.
A localizao do DNA no gel pode ser
As bandas no gel so coloridas principalmente por
Brometo de Etdeo a baixa concentrao, que colore por intercalar-se na dupla fita
de DNA. Concentraes de at 1 ng de DNA podem ser visualizadas por exame
direto de gel na luz ultravioleta.
Uma molcula de DNA, quando exposta a um campo eltrico, migra para o
eletrodo na velocidade ou mobilidade eletrofortica, proporcional a fora do campo e
a carga lquida da molcula. A mobilidade eletrofortica tambm inversamente
proporcional ao coeficiente friccional da molcula, que, por sua vez funo do
tamanho e forma da molcula e da viscosidade do meio. Portanto, uma mistura de
molculas diferentes pode ser separada eletroforeticamente com base em:
a) tamanho da molcula
b) forma ou conformao da molcula
c) magnitude das cargas eltricas lquidas na molcula
Quando aplicadas na mesma posio num campo eltrico, as molculas
sero separadas em bandas e migraro a velocidades diferentes para posies
diferentes no meio.
Sob condies fisiolgicas, os grupos fosfatos dos cidos nuclicos
encontram-se ionizados. Cadeias de polinucleotdeos de DNA e RNA so chamadas
de polinions e migram para o eletrodo POSITIVO (anodo) quando colocados em
campo eltrico. Devido natureza repetitiva dos fosfatos, o DNA dupla fita possuem
aproximadamente a mesma relao de massa e carga lquida.
Ajustando a
viscosidade do meio, entretanto, os efeitos da frico e o formato das molculas

podem ser usados permitindo separar os cidos nuclicos eletroforeticamente por
tamanho. A viscosidade do meio pode ser determinada pelo tamanho dos poros do
meio atravs da concentrao de agarose ou poliacrilamida.
Portanto, a taxa de migrao de DNA atravs de gel de agarose dependente
de quatro parmetros:
1. Tamanho da molcula de DNA: uma molcula linear de DNA dupla fita move-se
atravs da matriz de agarose numa taxa inversamente proporcional ao log 10 do
seu peso molecular (ver figura).
22
2. Concentrao de Agarose: O fragmento de DNA de um determinado peso migra
em velocidade distinta atravs de gis de diferentes concentraes de agarose.
Existe uma relao linear entre o logaritmo da mobilidade eletrofortica do DNA e
a concentrao do gel
3. Conformao de DNA: DNA circular fechado e tenso supercoiled (Forma I),
circular relaxado com corte nick (Forma II), e linear (forma III) com o mesmo
peso molecular migra atravs de gis a velocidades diferentes. A mobilidade
relativa das trs formas depende primeiramente da concentrao de agarose no
gel, mas tambm influenciada pela voltagem aplicada, a fora inica do
tampo, e a densidade de toro do DNA na Forma I. Sob algumas condies, a
Forma I migra mais rapidamente que a Forma III; e sob outras condies, a
ordem invertida.
4. Corrente aplicada: Sob baixa voltagem, a taxa de migrao de fragmentos de
DNA linear proporcional voltagem aplicada. Entretanto, com um aumento no
campo de fora aplicado, a mobilidade de fragmentos de alto peso molecular
aumenta diferencialmente. Portanto, a faixa efetiva de separao por gel de
agarose decresce com um aumento na voltagem. Para obter a maior resoluo
de fragmentos de DNA, os gis no devem ser submetidos a voltagens maiores
que 5 V/cm.
5. Composio de Bases e Temperatura: O comportamento eletrofortico de DNA
em gis de agarose (em contraste a gis de poliacrilamida) no muito afetado
tanto pela composio de bases do DNA, nem pela temperatura em que o gel
corrido. Portanto, a mobilidade eletrofortica relativa de fragmentos de DNA em
gis de agarose no muito afetada por temperaturas entre 4 e 30 oC. De modo
geral, gis de agarose so corridos na temperatura ambiente. Entretanto, gis
contendo menos de 0,5% de agarose so muito frgeis e devem ser corridos a
4oC, para terem maior rigidez.
1.1.2 Espectrofotometria
Nessa prtica utilizou-se o espectrofotmetro, gel de agarose, fluormetro e
placa de Petri com padro.
23
Ligar o espectrofotmetro 15 minutos antes. Colocar o comprimento de
1.
onda para 320 nm.

2.
Fazer uma soluo diluda em gua da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou

at 1: 1000).
3.
Zerar o instrumento com gua em Abs320nm.
4.
Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm
5.
Estimar a concentrao de DNA pela frmula

(Abs260nm Abs320nm) x 50 x fator de diluio = [DNA] em mg ml-1
Obs. Existe um superestimativa da concentrao por espectrofotmetro

devido a impurezas na soluo.
6. Fazer um estoque de trabalho com a concentrao de 5 ng ml -1
1.1.3 Fluorometria
O equipamento que usamos foi o Hoefer DyNA Quant 200, que um fotmetro
com filtro de fluorescncia com uma fonte fixa de passagem de excitao a 365 nm
e um filtro de passagem de emisso a 460 nm.
Ele foi desenhado para a
quantificao de baixas concentraes de DNA usando o corante chamado de

Hoechst 33258, tambm chamadao de bisbenzimida. O corante Hoechst 33258
apresenta alteraes nas caractersticas de fluorescncia na presena de DNA, que
permite a estimativa da concentrao na soluo. Na ausncia de DNA, o espectro
de excitao do corante Hoechst 33258 possui um pico a 356 nm e o espectro de
emisso possui um pico fraco a 492 nm. Quando Hoechst 33258 liga-se ao DNA,
esses picos movem-se para 365 nm de excitao e 458 nm de emisso. No poo da
cuveta, a amostra exposta a luz filtrada (365 nm + 7 nm) de uma lmpada de
mercrio. Essa luz excita o complexo corante-DNA, causando a luz a emitir um pico
a 458 nm. O filtro de emisso colocado em frente ao fotodetector, permite apenas
fluorescncia de 460 + 15 nm ser detectada. Portanto, a fluorescncia medida um
indicador direto da concentrao de DNA. A medida de fluorescncia no uma
unidade absoluta e sim relativa a um branco e a um padro com concentrao
conhecida.
24
a) Preparar as solues necessrias para o ensaio e a soluo DNA padro
(calf thymus DNA)
SOLUES ESTOQUES
Tampo 10 x TNE Soluo Estoque
(100 mM Tris, 10 mM EDTA, 2 M NaCl, 100 ml)
Tris base (PM = 121,14)
1,211 g
EDTA, sal dissdico, dihidratado (PM = 372,20)
0,372 g
NaCl
11,689 g
Completar volume at 70 ml com gua mQ

HCl concentrado at pH 7,4
Completar volume at 100 ml
Filtrar antes do uso (0,45 m). Armazenar a 4oC por at 3 meses.
Soluo de Corante Hoescht 33258 ( 1mg/ml)
USE MSCARA E LUVAS
Hoescht 33258
10 mg
gua mQ
10 ml
No filtrar. Armazenar a 4oC por at 6 meses protegendo da luz.

Padro de DNA calf thymus (100 mg/ml)
Soluo estoque 1 mg/ml de padro 100 ml
10 x TNE
100 ml
gua mQ
800 ml
Soluo de Trabalho 1 x TNE Baixa concentrao (A)

(concentrao final do DNA a medir entre 10 a 500 ng/ml)
0,1 mg/ml de H 33258 em 1 x TNE (0,2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA,
pH 7,4)
soluo estoque de H 33258
10 ml
25
10 x TNE
10 ml
gua mQ destilada
90 ml
b) Zerar o instrumento.
Prepare um branco usando 2 ml da soluo de
trabalho A (baixa concentrao). Seque o lado da cubeta com leno de papel.

Insira a cubeta no poo, feche a tampa, e aperte o boto <ZERO>. Depois
que aparecer 0 no display, remova a cubeta.
c) Calibrar o instrumento. Aplique 2 ml da soluo de DNA padro nos 2 ml de
Soluo de Trabalho A. Misture com pipetagem vrias vezes. Coloque a
cubeta no poo, feche a tampa e aperte o boto <CALIB>. Digite 100 e
aperte <ENTER>. Depois que o valor aparecer no display, remova a cubeta.
d) Zerar o instrumento. Retire a cubeta, esvazie e rinse. Seque a cubeta
sobre leno de papel.
Adicione 2 ml da soluo de trabalho A (baixa
concentrao) .Insira a cubeta no poo, feche a tampa, e aperte o boto

<ZERO>. Depois que aparecer 0 no display, remova a cubeta.
e) Ler a amostra. Adicionar 2 ml da amostra e misture bem. Coloque a cubeta
no poo, feche a tampa e registre a leitura.
f) Ler as amostras subseqentes.
Repetir os passos 4 e 5 para cada
amostra.
Importante:
-
ligue o instrumento 15 minutos para estabilizar a lmpada antes de medir
use luvas pois o corante pode ser mutagnico.
Toda as solues devem estar temperatura ambiente antes de medir a

fluorescncia
Preparar soluo de trabalho fresca para uso do dia
Filtrar o tampo TNE antes de acrescentar o corante
26
2 AMPLIFICAO
2.1 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A tcnica reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain

Reaction), foi concebida por Kary Mullis em meados da dcada de 80. Desde a sua
concepo causou uma verdadeira revoluo nas pesquisas. O impacto da PCR e
seus mtodos derivados deram a Kary Mullis o prmio Nobel.
Reao em cadeia da polimerase (PCR) uma tcnica que envolve a sntese
in vitro de milhes de cpias de um segmento de DNA na presena da enzima DNA
polimerase
Um importante avano tcnico no processo surgiu com a descoberta da Taq
polimerase oriunda da bactria Thermus aquaticus a qual vive em fontes de gua
temperatura de 75C encontrada no do Yellowstone National Park (figura 3).
27
Figura 3 - Thomas D. Brock no Lago do Yellowstone National Park
A enzima tem uma temperatura tima de ao a 72C, mas permanece

razoavelmente estvel mesmo a 94C e com isto, a enzima e adicionada uma nica
vez. Devido a este fato, foi possvel a automatizao do processo nos chamados
termocicladores (figura 4).
Figura 4- Termocicladores
A maior aplicao desta metodologia a possibilidade de se amplificar numa

determinada seqncia do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais tcnicas
de clonagem molecular. Uma simples copia de um gene especifico dentro de um
genoma pode ser amplificada para alguns microgramas, partindo-se de quantidades
mnimas como picogramas de DNA total. A condio bsica para a aplicao da
tcnica, depende da construo de oligonucleotidoes iniciadores (primers) os quais
28
so complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a
seqncia a ser amplificada.
Como podemos ver, no processo basicamente ocorre em 3 fases:
desnaturao, anelamento e extenso, os quais, constituem um ciclo de reao de
amplificao.
O processo inicia-se com a desnaturao da dupla fita do DNA que contm a
seqncia a ser amplificada. Geralmente, a desnaturao realizada a uma
temperatura de 94C durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do
DNA separam-se (figura 5).
Figura 5 - Representao esquemtica de algumas etapas da tcnica PCR, mostrando a ligao dos
iniciadores (primers) ao segmento de interesse e a amplificao em progresso geomtrica dos
fragmentos a cada ciclo. (Griffiths et al., 2000).
O passo seguinte consiste em baixar a temperatura de acordo com o primer

especifico (usualmente 5C abaixo do TM real dos primers), permitindo que os
oligonucleotideos
iniciadores
anelem-se
especificamente
nas
extremidades
flanqueadas da seqncia alvo e nas fitas opostas.

Finalmente,
no
terceiro
passo
temperatura
elevada
para
aproximadamente 72C e nesta temperatura, h incorporao de 35 a 100

nucleotideos por segundo, dependendo da enzima, do tampo, do pH, da
29
concentrao de sal e da natureza do DNA-template e com isto a polimerase copia a
seqncia alvo a partir dos oligonucleotideos iniciadores a fase de extenso.
3 PURIFICAO DA AMPLIFICAO
Qualquer anlise em gentica molecular requer, obviamente, o estudo do
DNA ou do RNA, pelo que o primeiro passo em qualquer tcnica gentica consiste
no isolamento e purificao de uma ou mesmo das duas espcies de cidos
nuclicos.
Para o isolamento e purificao dos cidos nuclicos, encontram-se
disponveis vrias tcnicas alternativas as quais originam DNA ou RNA com
diferentes graus de pureza e de integridade fsica. Na maioria dos casos, estas
tcnicas iniciam-se com o processo de libertao dos cidos nuclicos, o que
envolve a lise das clulas a estudar, seguida de ataques enzimticos e/ou qumicos
para destruir os componentes proticos da mistura. J no que diz respeito ao
processo de purificao dos cidos, vrias alternativas se encontram disponveis. O
processo de purificao mais econmico e simples denominado de salting-out e
consiste na insolubilizao dos longos filamentos de DNA por ao da concentrao
salina da soluo . Neste mtodo, o DNA obtido de baixa pureza, sendo recolhido
por suave enrolamento com uma vareta de vidro aps adio de um sal. O DNA
assim preparado necessita depois de ser submetido a um longo processo de
ressolubilizao, aps o que se encontra pronto para ser estudado. Note-se que
apesar do baixo custo envolvido, este um processo muito ineficiente devido
30
baixa pureza do DNA obtido, ao elevado teor de mo de obra necessrio, e ao longo
tempo de preparao que envolve. O processo tradicional de preparao de DNA de
elevada pureza e integridade fisica denominado de fenol-clorofrmio.Este
processo deve o seu nome ao fato de envolver o ataque qumico de protenas e
outros compostos celulares por ao do fenol dissolvido em clorofrmio. Esta
mistura contm ainda habitualmente -hidroxiquinelona como corante (facultativo) e
lcool isoamilico como regulador da densidade. Neste processo, aps a libertao
dos cidos nuclicos, a soluo aquosa misturada com igual volume de soluo de
fenol/clorofrmio, e aps homogeneizao suave, centrifugada. Como as solues
aquosa (contendo o DNA) e orgnica (contendo o fenol) so imiscveis, aps a
centrifugao podemos facilmente recolher a fase aquosa (no topo do tubo) e rejeitar
a fase orgnica (no fundo do tubo) e a interfase contendo um anel esbranquiado
protenas oxidadas e precipitadas. Note-se que a remoo da fase aquosa deve ser
executada com muito cuidado, para que a alta viscosidade no acarrete o
arrastamento de interfase protica. O processo repete-se ciclicamente at no ser
observvel a presena de interfase protica. No final, o DNA precipitado com a
adio de um sal e um lcool, e depois de centrifugados e secos brevemente
ento redissolvido. Este processo, apesar de permitir obter DNA de elevada pureza,
concentrao e integridade fsica, tem como o salting out a desvantagem de ser
exigente do ponto de vista da mo-de-obra e do
tempo de execuo, envolvendo ainda a manipulao de compostos txicos
como o fenol e o clorofrmio, o que exige condies no facilmente compatveis com
um laboratrio de rotina de anlises clinicas.
PROTOCOLO
Segue abaixo o protocolo de purificao de DNA ULTRACLEAN PCR CLEAN UP
KIT da MO BIO Laboratories, Inc.:
1. Adicione a soluo SpinBind na reao de PCR na proporo de 5:1. Exemplo: se

sua reao de PCR for de 100ul, adicione 500ul da soluo.
2. Misture muito bem. Se voc utilizar leo mineral, ver duas camadas, sendo a
31
superior correspondente ao leo.
3. Transfira ento a reao para o filtro, evitando pegar a fase de leo.
4. Centrifugue de 10 - 30 segundos a no mnimo 10.000g
5. Remova o filtro e descarte o filtrado do microtubo. Coloque o filtro de volta
neste mesmo tubo.
6. Adicione 300 l da soluo SpinClean buffer no filtro.
8 . Remova o filtro e discarte o filtrado que esta no microtubo e coloque o filtro
novamente no mesmo tubo.
9. Centrifugue novamente de 30 - 60 segundos a 10.000g, no mnimo
10. Transfira o filtro para um novo tubo que acompanha o Kit.
11. Adicione 50ul de Elution Buffer (10mM Tris) que acompanha o kit ou ento gua
milli Q autoclavada no centro do filtro. Recomenda o uso do tampo fornecido com o
kit.
13. Descarte o filtro. Armazene o tubo com DNA em freezer -20C ou -80C
32
4 CLONAGEM
Clone o organismo ou grupo de organismos que derivam de outro atravs

de um processo de reproduo assexuada. O termo tem sido aplicado tanto a
clulas quanto a organismo, de modo que um grupo de clulas que procedem de
uma clula nica tambm recebe este nome. Em geral, os clones tm caractersticas
hereditrias idnticas, ou seja, os seus genes so iguais. Por exemplo, os gmeos
idnticos so parte de um clone, os procariontes,
a maioria dos protozorios e
algumas leveduras reproduzem-se por clonagem.

Devido aos recentes progressos da engenharia gentica, os cientistas podem
isolar um gene individual (ou grupo de genes) de um organismo e implant-lo em
outro de uma espcie diferente.
Na dcada de 90, cientistas comearam a clonar organismos inteiros. O
primeiro deles foi uma ovelha, que ficou conhecida como Dolly, clonada a partir de
uma clula mamria de outra ovelha. No final de 1998, cientistas japoneses
anunciaram xito numa experincia de clonagem de vacas.
4.1 CLONAGEM DE DNA
33
Produo de cpias exatas (clones) de um gene em particular ao conjunto de

genes utilizando tcnicas de engenharia gentica. O DNA contendo os genes "alvo"
dividido em fragmentos utilizando enzimas de restrio.
Estes fragmentos so inseridos em vetores de clonagem, que transferem o
DNA recombinante para as clulas receptoras. Alternativamente o DNA pode ser
diretamente adquirido pelas clulas receptoras do meio (mtodo menos eficaz do
que utilizando vetores).
Dentro da clula receptora o DNA recombinante sofre replicao. Assim, a
clula receptora vai dar origem a uma colnia de clulas contendo o gene alvo
clonado. Podem ser usados vrios mtodos para identificar essas colnias,
permitindo a sua seleo e cultura.
A clonagem de DNA facilita a seqenciao; tambm permite que grandes
quantidades de uma protena desejada sejam produzidas (exemplo: insulina
humana)
CICLO CELULAR
Perodo que compreende todo o tempo da vida de uma clula, desde a sua
formao, sua subdiviso em clulas filhas.
A durao do ciclo celular varia de clulas para clulas, mas constante em
clulas do mesmo tipo.
a) enzima de restrio
Enzima que percorre a molcula de DNA, fragmentando-a sempre que
reconhece seqncias de bases especficas.
So j bem conhecidas mais de 100 enzimas de restrio e cada uma
delas corta o DNA quando reconhece determinada seqncias de bases.
b) Vetor de clonagem
o "veculo" utilizado na clonagem de DNA para introduzir o fragmento
de DNA estranho no genoma da clula receptora (por exemplo: plasmdeos ou
fagos)
34
c) Quiescncia
o estado no qual as funes mais bsicas de uma clula ou conjunto
de clulas deixam de se realizar. normalmente uma resposta a uma
condio ambiental desfavorvel, tal como a falta de alimento. A clula tornase dormente at que o seu ambiente se torna favorvel. Neste estado os
genes que definem a funo da clula diferenciada encontram-se desativado o
que torna a clula propicia para a transferncia nuclear.
d) Transferncia nuclear
O ncleo de um ovcito removido e introduz-se nesta clula o ncleo
de uma clula corporal preparada especialmente. A fuso entre o ncleo e o
ovcito anucleado provocado por um impulso eltrico ou introduo de
qumicos, o que provoca o incio do desenvolvimento do ovo. Este processo
ainda no muito bem conhecido e muitas tentativas falham logo ao incio.
e) "Gene targeting"
As tcnicas da biologia molecular moderna fornecem-nos uma
ferramenta capaz de efetuar mudanas muito precisas na informao
gentica de uma clula. Isso pode envolver remoo, substituio ou adio
de uma seqncia de DNA. O que pode ser til para modificar as
caractersticas de uma clula para ser usada num processo de transferncia
nuclear.
4.3 ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA
A estimativa da concentrao de DNA depende do tipo e quantidade de

amostra disponvel. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nvel de
contaminao por protenas, fenis, polissacardeos, lcool, ou outros cido
nuclicos, a estimativa por espectrofotmetro, medida pela absorbncia das bases a
260 nm consiste num mtodo simples, rpido e com certa preciso.
Para
quantificao de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm at 320 nm. A
35
leitura a A260nm permite o clculo da concentrao da cidos nuclicos na amostra.
Uma DO (Densidade ptica) de l corresponde aproximadamente a 50 mg ml -1 para
DNA dupla fita, 40 mg ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 mg ml -1 para
oligonucleotdeos.
A relao entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma
estimativa da pureza dos cidos nuclicos. Solues puras de DNA e RNA possuem
valores de DO260/DO280 entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminao com
fenol ou protenas, a relao DO 260/DO280 ser muito menor, e a preciso nas
quantidades de cidos nuclicos ser baixa.
O uso de protocolos de extrao de DNA simplificados, que utilizam pouco
material de origem, ou possuem poucos passos de purificao, tendem a produzir
cidos nuclicos com maior contaminao. Em plantas tropicais, existe um grande
problema de contaminao com polifenis e polissacardeos.
Nesses casos, a
estimativa por espectrofotometria no permitem uma determinao acurada da

concentrao de DNA. Nesse caso, o mtodo de escolha consiste na fluorometria.
A amostra de DNA a ser estimada tratada com um corante especfico para DNA
dupla fita (ex. Hoechst 33258), e esse corante excitado a um comprimento de onda
(365 nm) e com emisso a 460 nm proporcional a concentrao de DNA. RNA,
protenas e nucleotdeos no afetam as leituras. (FERREIRA E GRATTAPAGLIA,
1995: 124-125).
Outros mtodos empregados utilizam a caracterstica da fluorescncia em
ultravioleta induzida pela intercalao de brometo de etdeo na dupla fita de DNA. A
fluorescncia proporcional concentrao de DNA, e pode-se determinar a
quantidade de DNA numa amostra por comparao com padres conhecidos. A
comparao de fluorescncia pode ser feita num mini-gel, que permite tambm a
separao de DNA do RNA. Uma outra possibilidade aplicar a amostra numa
placa de petri com 1% agarose contendo brometo de etdeo (0,5 mg ml -1), e
comparar com padres. Manter a placa a 37C por cerca de 30 minutos e observar
no transiluminador (usar 0,5 g de agarose 1% em 50 ml de tampo TAE, adicionar 5
l de brometo de etdeo 10 mg/ml e analisar alquotas de 2 L).
4.4 PREPARAO DO PLASMDEO (PREP)
O desenvolvimento de terapias moleculares como a terapia gnica e as

vacinas de DNA levaram ao aumento da necessidade de obteno de grandes
36
quantidades de plasmdeos puros. Embora existam diversos mtodos para purificar
plasmdeos, baseados nos procedimentos utilizados em biologia molecular, a maior
parte no adequada para utilizao em larga escala. Alm disso, estes utilizam
geralmente reagentes txicos impossibilitando a sua utilizao na purificao de
produtos teraputicos. Nos ltimos anos foram feitos alguns progressos nesta rea
tendo-se desenvolvido novos mtodos cromatogrficos. Contudo existem ainda
algumas metodologias a serem exploradas. Uma das mais promissoras parecem ser
os sistemas de duas fases aquosas (SDFA). Estes se formam quando dois
polmeros ou um polmero e um sal se misturam em gua acima de uma
determinada concentrao crtica. As duas fases que se formam tm diferentes
caractersticas fsico-qumicas o que permite a separao de componentes de uma
mistura complexa. A variao dos parmetros do sistema como o pH, a
concentrao, peso molecular e tipo de polmeros e sais permitem a definio de
condies para a purificao do composto pretendido. As suas condies suaves,
simplicidade tcnica, baixo custo, no toxicidade dos reagentes, facilidade de
aumento de escala e operao em contnuo torna-os adequados para a purificao
de biomolculas em larga escala.
********Este projeto pretende desenvolver um processo de purificao de
plasmdeos baseado em SDFA contendo polmeros catinicos. Sendo o DNA um
polinion em soluo esperado que nestes sistemas os plasmdeos sejam
extrados para a fase em que o polmero catinico se acumula. Embora existam
outras espcies aninicas na preparao impura de plasmdeo o teste de diversos
sistemas e condies permitiro a seleo das condies apropriadas para a sua
purificao. Vrios SDFA sero testado para avaliar a sua capacidade para purificar
o plasmdeo modelo pVax1LacZ um vector utilizado para a produo de vacinas de
DNA.
Antes deste estudo os sistemas sero caracterizados pela determinao do
seu diagrama de fases. Os polmeros catinicos sero utilizados como polmero
dominante numa das fases e tambm adicionados em pequenas quantidades a
sistemas polmero-polmero de modo a atuarem como ligados de afinidade e
direcionarem a partio do plasmdeo para uma das fases.
Em ambos o caso esperado que o plasmdeo condense com o polmero
catinico formando um poliplexo. Estes poliplexos sero depois isolados utilizando
mtodos cromatogrficos. Sero testadas a cromatografia de troca aninica, de
37
excluso molecular e de interao hidrfoba previamente utilizado para purificar os
plasmdeos e selecionado o melhor mtodo. Os polmeros catinicos utilizados
sero a polietileneimina, o poli-L-lisina e polmeros de poliamidoamina. Estes
polmeros tm sido referidos como eficientes vectores na terapia gnica e deste
modo o desenvolvimento deste procedimento permitir a definio de um processo
fcil de produo de agentes para terapia molecular.
4.4.1 Inserindo DNA num Plasmdeo para clonagem

Finalmente podem-se discutir as bases da clonagem de DNA. Para
exemplificar o procedimento empregou-se um plasmdeo como vetor de clonagem e
cortou-se o plasmdeo e o DNA a ser clonado com uma enzima de restrio que
forma extremidades coesivas. preciso ter em mente, contudo, que existem vrios
outros vetores de clonagem e diferentes formas de fragmentar e clonar o DNA (com
enzimas de restrio que deixam extremidades cegas, com ou sem posterior
encaudeamento, com nebulizao e com prensa francesa).
O processo se inicia pela extrao do DNA das clulas doadoras e do
plasmdeo (neste exemplo, um plasmdeo pequeno, de aprox. 2,5 kpb, da bactria
E. coli). A extrao de DNA no um processo complexo: resumidamente, as
clulas so lisadas com um detergente, os restos celulares e boa parte das
protenas precipitadas por centrifugao em presena de uma concentrao elevada
de sal (em geral acetato de potssio) e o sobrenadante, transferido para outro tubo,
misturado com isopropanol. O DNA no solvel neste lcool, mesmo diludo com
gua, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a
13.000 rpm por alguns minutos e o precipitado ressuspenso em gua ou num
tampo adequado. O DNA que se obtm desta forma no muito limpo, mas serve
para uma boa parte das aplicaes corriqueiras de laboratrio. Atualmente kits
comerciais permitem a extrao rpida de DNA de praticamente qualquer tipo de
clula, em quantidades e grau de pureza que satisfaam ao mais exigentes
pesquisadores.
A extrao do plasmdeo semelhante descrita acima, mas preciso usar
um estratagema para separar o plasmdeo do DNA bacteriano. O DNA plasmidial
muito menor que os fragmentos de DNA cromossmico bacteriano. O truque ento
consiste em adicionar soluo de lise uma certa quantidade de lcali. O pH alto
38
desnatura o DNA. Logo em seguida adiciona-se cido actico glacial e acetato de
potssio: o cido neutraliza o lcali e os DNAs tendem a renaturar. Porm, a
presena de sal provoca a precipitao de todas as molculas que no forem muito
solveis em gua. O DNA desnaturado pouco solvel em gua e precipita. o
caso dos fragmentos grandes de DNA cromossmico, que no conseguem se
renaturar e precipitam (por centrifugao), junto com as protenas da bactria e
restos celulares. O DNA plasmidial, ao contrrio, renatura-se rapidamente e torna-se
muito solvel em gua, no podendo ser precipitado. Assim, recolhendo o
sobrenadante, teremos essencialmente DNA plasmidial, com uma contaminao
pequena de DNA cromossmico bacteriano.
Uma vez com os dois DNAs disponveis (doador e plasmidial), resta cortlos com a enzima de restrio escolhida e misturar os dois DNAs. A tendncia ser
parear as extremidades coesivas, formando construes hbridas, ou quimeras. A
adio de ligase completa a cadeia fosfodister em cada uma das fitas de DNA. Este
passo est representado na parte superior da (figura 6).
Figura 6 - Esquema para a obteno de plasmdeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima
de restrio que cria extremidades coesivas. Para maiores detalhes veja o texto acima.
Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir desta mistura. O

produto 1 o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmdeo
(vermelho). Mas, lamentavelmente, outras construes tambm aparecem: o
produto 2 o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmdeo vazio, fechado
39
sem inserto. Ele perfeitamente funcional e no pode ser descartado do processo.
O produto 3 a circularizao de vrios fragmentos de DNA do doador, numa ordem
qualquer. Este "lixo" no problemtico, porque no contm uma origem de
replicao bacteriana. um DNA que ser perdido ao longo do tempo. O produto 4
a unio de dois (ou mais) plasmdeos e no se replica to rpido quando o
plasmdeo vazio ou carregado com apenas um inserto, de forma que acaba
desaparecendo ao longo do tempo. O ltimo "lixo" o plasmdeo carregado com
vrios insertos concatenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande.
uma construo instvel, tambm, e tende a desaparecer. Assim, excetuando o
plasmdeo vazio, todos as outras quimeras "lixo", uma vez na bactria, tendem a
desaparecer e no so problemas para o experimentador.
Uma vez ligado o inserto com o plasmdeo (e produzidos os vrios possveis
lixos, tambm), preciso introduzir estas construes na bactria hospedeira. Isto
feito pela entrada passiva de DNA atravs da membrana de bactrias previamente
tratadas com uma soluo de cloreto de clcio, ou ativamente, atravs de choques
eltricos, num processo chamado eletroporao. A eficincia de transformao
(entrada de DNA na bactria) bastante baixa (10 -3 a 10-8), mas os transformantes
tero o plasmdeo dentro deles, o que lhes deve conferir propriedades novas, que
permitam uma seleo positiva. De fato, os plasmdeos tm um gene que confere
bactria a resistncia a um certo antibitico (suponhamos, ampicilina), de forma que
basta adicionar ampicilina ao meio e eliminaremos rapidamente todas as bactrias
que no tiverem plasmdeo (vazio ou carregado).
O plasmdeo vazio confere a mesma resistncia ao antibitico que o
plasmdeo carregado. Entretanto, possvel averiguar ao menos se, no conjunto de
plasmdeos formados, a maior parte est carregada (com inserto) ou, ao contrrio,
vazia. Para tal os plasmdeos de clonagem tm uma segunda marca de resistncia a
antibiticos (em geral, tetraclina), que perdida quando o plasmdeo aberto e o
inserto clonado. Significa dizer que o stio de clonagem interno ao gene para a
resistncia tetraciclina. Significa tambm dizer que as bactrias que tm
plasmdeos vazios so resistentes a ampicilina e tetraciclina, enquanto as que tm
plasmdeos com inserto s mostram resistncia a ampicilina. O procedimento
baseia-se na obteno de uma rplica de uma placa de Petri contendo colnias
crescidas em presena de ampicilina, que ento carimbada sobre uma nova placa
de Petri contendo tetraciclina. As colnias que crescerem tambm em tetracilcina
40
no interessam, mas podem ser contadas. A figura 7 mostra esquematicamente o
procedimento, desenvolvido para outros fins, h quase 50 anos, por Joshua
Lederberg, que tambm recebeu o Prmio Nobel pelos seus estudos (Joshua
Lederberg, George Beadle e Edward Tatum receberam o prmio Nobel de Fisiologia
ou Medicina em 1958. Lederberg provou a existncia da recombinao gentica em
bactrias e contribuiu de forma importante para o conhecimento da organizao
gnica de microrganismos. Beadle e Tatum mostraram que os genes agem
regulando eventos qumicos definidos).
Figura 7 - O processo conhecido como rplica, na qual um carimbo de veludo estril, facilmente
improvisado sobre um cilindro de madeira, serve para transferir um pouco de bactrias de cada
colnia de uma placa para outra. Aps 24 horas o crescimento na nova placa avaliado. Neste caso
a primeira placa contm meio de cultura adicionado de ampicilina, enquanto na segunda o meio
contm tetraciclina. Da figura pode-se concluir que a maior parte das bactrias da amostra sensvel
tetraciclina e alberga, portanto, plasmdeos recombinantes (quimricos, ou com inserto).
41
REAO DE SEQENCIAMENTO
O mtodo de Seqenciamento do DNA mais utilizado no momento foi
desenvolvido por Sanger e colaborador (1979), conhecido tambm como mtodo do

trmino do crescimento.
O seqenciamento do DNA atravs deste mtodo exige a clonagem do
fragmento de DNA e de seus subfragmentos a serem seqenciados em vetores
apropriados como os da serie M13mp os quais tm sido largamente utilizado parra
esta finalidade.
O principio do mtodo baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar
uma fita de DNA a partir do molde na presena de um iniciador. A reao de
seqenciamento consiste na hibridizao de um oligonucleotdeo sinttico
(iniciador), com uma regio conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao
inserto a ser seqenciado.
A seguir, promove-se a sntese da fita complementar empregando o
fragmento Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotdeos (dNTP),
sendo um deles marcado com 32P ou 35S.
No processo so realizadas quatro reaes independentes, sendo que em
cada uma delas adicionado um tipo de dideoxinucleotdeos (ddNTP). Em cada
reao, uns nmeros muito grandes de molculas de fita complementar esto sendo
copiados simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extenso, uma
pequena porcentagem de molculas ira incorporar um ddNTP e neste caso a reao
de alongamento da cadeia ser automaticamente interrompida naquele sitio, devido
a ausncia do grupamento 3OH do ddNTP. Por outro lado, em outras molculas a
reao de extenso continua a ocorrer at que um ddNTP seja incorporado.
Sendo assim, em cada uma das quatro reaes, haver fragmentos de todos
os tamanhos sendo que todos eles tm inicio comum, ou seja, adjacente ao
iniciador.
42
Uma vez terminada as reaes de extenso, cada fragmento recmsintetizado separado em gel desnaturado de poliacrilamida-uria e a seguir
autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de resoluo, possvel
ento visualizar na auto-radiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma
banda especifica. Desta forma, possvel analisar de 200 a 300 nucleotdeos por
gel.
5.1 Seqenciamento Automtico
A utilizao de seqenciadores automticos essencial quando se deseja

realizar seqenciamento em larga escala, como por exemplo, em projetos genoma.
O desenvolvimento e utilizao de seqenciadores automticos tornam mais
eficientes e rpidos o seqenciamento de DNA na medida em que as etapas de
leitura do gel e o processamento de seqncias so realizados atravs de
computadores. A reao de seqenciamento realizada atravs do mtodo de
Sanger (1979), do mesmo modo que no seqenciamento manual. Entretanto, no
seqenciamento automtico os nucleotdeos esto marcados com fluorocromos ao
invs de istopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos so empregados e
uma vez excitados por um feixe de laser emitem sinais luminosos de diferentes
comprimentos de onda. possvel marcar com este fluorocromos o primer
universal M13 ou ento cada um dos dideoxinucleotdeos (terminadores). Assim,
uma vez que em cada uma das reaes (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo
diferente possvel juntar estes produtos s reaes de seqenciamento, marcados
com fluorocromos, ao serem submetidos eletroforese passam pelo feixe de laser,
que promove a excitao dos fluorocromos. A luz emitida pelo fluorocromos
detectada por um fotomultiplicador e a informao processada atravs de um
computador.
No seqenciamento de DNA, as reaes com diferentes dideoxinucleotdeos
so realizadas em um plasmdeo M13, no qual encontra-se clonado o fragmento de
DNA a ser seqenciado. Cada uma das misturas de reao contm o primer
universal M13 marcado com um fluorocromo diferente. Os produtos de reao so
agrupados e submetidos eletroforese em uma nica raia de gel de
seqenciamento.
43
Figura 8 - Seqenciamento
44
PURIFICAO DA REAO
No seqenciamento de DNA vrias etapas so indispensveis para obteno
de seqncias de qualidade. Uma delas a purificao, empregada na remoo de

resduos provenientes da reao em cadeia da polimerase com ddntps, restos de
primers, sais entre outros resduos. Na transformao o DNA de interesse
ligado ao vetor geralmente plasmdeo que introduzido em clula hospedeira
compatvel, normalmente bactria E. coli. O arranjamento a etapa seguinte
consistindo na separao de clones da bactria, esses clones so distribudos
em 96 poos da placa de cultura permanente para ser amplificado. A
minipreparao de DNA (MINIPREP) consiste na separao do DNA plasmidial
dos demais componentes bacterianos retirando sais, desnaturando e
removendo compostos celulares da bactria, como membrana, parede celular,
entre outros compostos. A quantificao um mtodo de controle da
quantidade e qualidade do DNA extrado na minipreparao consiste na
confeco de um gel de agarose, onde se aplica amostras de DNA e um padro
de concentrao de DNA conhecido, um controle, onde se comparando os
mesmos avalia-se a quantidade de DNA presente. A reao em cadeia da
polimerase (PCR) mediada por uma mistura que contm primer especfico
responsvel pela amplificao do DNA produzindo novas fitas, um kit Big Dye
Terminator, responsvel pela formao fluorocromos no DNA que quando excitados
por um feixe de laser emitiro diferentes comprimentos onda capazes de serem
reconhecidos pelo seqenciador automtico. A mistura possui ainda um tampo
(save money) diludo em gua em igual concentrao. Normalmente a reao de
PCR produz milhes de cpias de um nico fragmento de DNA, anelamento, e
formao de fluorocromos nos nucleotdeos no DNA. Antes do seqenciamento, as
placas precisam passar por um processo de purificao onde so utilizados
isopropanol, e etanol por no mnimo duas vezes, este procedimento permite melhor
aproveitamento dos resultados j que elimina restos indesejveis resultantes do
PCR. O seqenciamento mediado por uma maquinaria automatizada comandada
por softwares onde cada comprimento de onda emitido pelos fluorocromos
captada pelo seqenciador e processada em um computador.
6.1 DNA LIGASE
45
Conforme mencionada anteriormente esta enzima promove a ligao dos

fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de
restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das
cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 9). A
E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com
dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactrias requer NAD+, enquanto
que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como cofator.
Figura 9 - DNA ligase catalisa a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da
dupla-hlice.
6.1.1 Tipos de Fragmentos de DNA que so ligados pela DNA Ligase

a) Fragmentos com extremidades coesivas
As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio
permitem dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, atravs da formao
de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases. Finalmente a
ligao covalente dos fragmentos realizada pela DNA ligase (figura 10).
46
Figura 10. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas
em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).
b) Fragmentos com extremidades no coesivas

DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito
menos eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma
concentrao muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos
necessria para que as molculas com extremidades no coesivas sofram
reao de ligao.
No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela
transformao prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este
procedimento pode ser feito atravs de dois processos:
Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3' de um fragmento de DNA e
polidesoxi (T) na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da

enzima desoxinucleotidil transferase terminal ou simplesmente transferase.
Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos
extremidade 3-OH de fragmentos fita simples proeminente de uma cadeia de
47
DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molcula tratada
previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns
nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos
complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas
preenchendo-se os espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selandoos com DNA ligase (Figura 11)
Figura11. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados

em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio
que reconhece o adaptador.
Adio de adaptadores s extremidades no coesivas.

Os adaptadores so oligonucleotdeos sintticos e complementares
que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrio.
Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase.
c) O terceiro mtodo utiliza T4 ligase em concentraes que pode ligar

molculas de DNA sem proeminncias.
48
SEQENCIAMENTO DE DNA

nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra. Existem
vrios mtodos disponveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.
At meados da dcada de 70 no era nada simples obter uma seqncia de DNA,
fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais
complicado do que com protenas e o conhecimento sobre os cidos nuclicos
avanava de forma lenta. No incio da dcada de 80 uma tcnica relativamente
rpida de seqenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de
uma cadeia de DNA com diferentes produtos qumicos e a visualizao dos
fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcao
radiativa das molculas porque a quantidade de material produzida era muito
pequena e no podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas
dificuldades houve ento um rpido progresso no conhecimento de seqncias de
DNA. Poucos anos depois um novo avano tecnolgico foi alcanado pela
introduo da tcnica de interrupo da seqncia pela incorporao aleatria de
um nucleotdeo modificado (sem a hidroxila na posio 3), que ficou conhecida
como tcnica de didesoxi ou dideoxi. Esta tcnica suplantou imediatamente a
anterior e permitiu o desenvolvimento de seqenciadores automticos de DNA,
sobre os quais versa este captulo. Ainda se faz eventualmente o seqenciamento
manual, mas muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substncias
radiativas. De uma forma geral quando se deseja saber uma seqncia de bases de
um fragmento qualquer de DNA, purifica-se o fragmento e enviamos para
seqenciamento numa empresa prestadora deste servio.
nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra. Existem
vrios mtodos disponveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.
Um dos mais utilizados o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de
terminadores de cadeia ou de Sanger; ele constitui a base da metodologia
empregada no seqenciamento do genoma humano. Sua estratgia consiste em
identificar, continuamente e seqencialmente durante o processo, o ltimo
nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da
49
reao devero tambm portar uma marca que permita detect-los na etapa de
anlise. Resumidamente, o processo realizado a partir de uma cadeia simples
(no dupla) do DNA a ser seqenciado; esta servir de molde para gerar a outra
metade complementar da dupla hlice. Isto obtido pela desnaturao da molcula
nativa (fig 12).
Figura 12 - A reao de sntese se processa em condies inicas e de pH apropriadas, na

presena da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotdeos sob a forma de
3-desoxinucleotdeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles
marcado radioativamente com P ou
; um dos mais utilizado o dATP P (fig 2a).
Como a enzima utilisada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente so
necessrios tambm, a presena na reao, de um pequeno fragmento de DNA sinttico
(XXX) complementar a uma regio conhecida (YYY) na extremidade 3 do DNA molde;
estas caractersticas permitiro sua hibridizao no local mencionado, e fornecero um
ponto de partida para a replicao do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou
primer", quando marcado, poder ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recm
sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo que ele executado em quatro
reaes separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um
(e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de anlogo, 2, 3didesoxinucleotdeo trifosfatos (ddNTPs) (fig 2b).
Figura 13. Terminadores
Estes anlogos conhecidos como terminadores quando incorporados

cadeia nascente, por no apresentarem 3OH que permita formar ligao com o
prximo dNTP a ser adicionado, bloquearo todo processo. Como todos os
nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o alongamento da cadeia
50
prosseguir at que a enzima DNA-polimerase insira um anlogo (ddNTP).
Conseqentemente, haver parado imediata da reao de sntese no ponto em que
seu alongamento foi interrompido: na extremidade e a molcula estar marcada com
P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resduo final conhecido,
pois se sabe em que tubo de reao o anlogo foi adicionado, so separados por
tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de anlise para cada
reao. O gel transferido para um suporte de nitrocelulose (filtro).
Aps auto-radiografia a ordem dos nucleotdeos, na cadeia de DNA recm
sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta complementar da
molcula seqenciada que serviu de molde. Levando estas observaes em
considerao, possvel conhecer a seqncia de nucleotdeos do DNA
seqenciado de 3 para 5 partindo-se da parte inferior para a superior do gel. O
resultado e as etapas do processo descrito acima, freqentemente mostrado em
fotografias nos livros especializados, pode ser observado no esquema da Fig 14.
Figura 14 - Autoradiograma
O mtodo pode ser automatizado atravs de maquinaria apropriada

gerenciada por computadores com softs que lm seqencialmente e identificam os
produtos. Isto permitir executar o processo em grande escala. Neste caso utilizamse simultaneamente os 4 didesoxinucleotdeos terminadores (ddNTPs) marcados
por fluorescncia fig 4a. Como cada reao (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo
diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um
nico canal do gel de seqenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido
por cada fragmento, aps iluminao com um feixe de laser, identificar os produtos
baseado na diferena de comprimento de onda. A luz emitida detectada por
51
escaneamento do gel e a seqncia deduzida por computador fig 4c. Variveis
mais modernas, conseqentemente mais rpidas e poderosas, incluem a
robotizao total do processo com a incluso das etapas de purificao e da reao
de sntese da cadeia do DNA.
7.1 PRODUO DE UM DNA PARA SEQUENCIAMENTO E A

TCNICA DE DIDEOXI
Para sequnciar uns trechos de DNA, tm que ter uma grande quantidade
dele no nosso tubo de ensaio. Duas formas corriqueiras de se obter grandes
quantidades de uma determinada seqncia de DNA so a clonagem em plasmdeo
e a PCR. Se o DNA que queremos sequnciar for o inserto de um plasmdeo, tudo o
que precisamos crescer 200 L da bactria com o plasmdeo e, empregando as
tcnicas j usuais de extrao de DNA, obter o plasmdeo purificado, que ser
empregado na reao de seqenciamento. Se ainda no tivermos o material
clonado, podemos empregar a PCR e amplificar o trecho a ser seqenciado,
purificando a banda do gel e usando o material assim obtido para iniciar a reao do
seqenciamento. Neste caso, precisamos saber apenas as seqncias das
extremidades do trecho a ser seqenciado.
Um didesoxinucleotdeo trifosfato, ou ddNTP. O precursor normal da sntese
de DNA o dNTP, ou desoxiribonucleotdeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila
na posio 3. a partir desta hidroxila que a fita nascente estendida. Um ddNTP,
entretanto, no tem esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA,
interrompe a incorporao de outros nucleotdeos a partir dele. Se o ddNTP for
marcado associado radiao ou fluorescncia, a fita interrompida ficar radiativa
ou fluorescente e poder ser detectada mais facilmente. Para fins vamos admitir que
52
cada didesoxibase est marcada com uma florescncia diferente. Portanto, as fitas
terminadas em A, T, G ou C vo emitir cores diferentes quando excitadas com luz de
um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).
Na figura 15 exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a partir
de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma seqncia especfica (em
vermelho) do plasmdeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto (azul)
entre os stios de restrio EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um
comprimento muito varivel, tipicamente entre 500 e 3000 pb (pares de base). No
exemplo estamos admitindo que, numa determinada posio na seqncia do
inserto, uma parte dele tem uma base A e outra uma base G. o que ocorre se
clonarmos um trecho de DNA de um alelo para o qual o doador heterozigoto.
Observe tambm que, do lado direito do inserto, h uma seqncia (em verde) na
qual pode parear um outro primer, que ser empregado no seqenciamento quando
quisermos vir da direita para a esquerda sobre o inserto. Jamais, contudo, os dois
primers so empregados simultaneamente, e por isto a reao de seqenciamento
Por isso, no temos tanta preocupao com contaminao como nas reaes de
PCR: podemos fazer mltiplas reaes de seqenciamento, lado a lado, numa placa
de 96 micropoos e mesmo reutilizar boa parte do material plstico empregado no
preparo do DNA ou na reao de seqenciamento, em si, bastando para isto lavar
bem o material.
Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos so
gerados, porm nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com
polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual
tamanho terminaro em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os
fragmentos representados na parte de cima esto organizados por ordem de
tamanho. Observe que:
a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do
primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminaro na mesma base (exceto no
caso do polimorfismo do DNA molde);
b) podem existir fitas terminadas na mesma base (afinal, s temos 4 opes,
A,T,G ou C), com comprimentos diferentes. No h qualquer restrio para isto.
53
c) h espaos mostrados na seqncia, onde no havia nenhum fragmento
gerado do tamanho esperado. Isto s acontece quando a reao gera poucos
fragmentos, mas uma reao deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de
cada tamanho e muito pouco provvel que existam seqncias no representadas
de um comprimento qualquer.
d) apenas onde h polimorfismo de base do DNA molde h fragmentos do
mesmo tamanho terminando em bases diferentes ( o caso A/G).
Figura 15. Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do primer,

interrompidos quando um didesoxinucleotdeos incorporado na fita. Os
didesoxinucleotdeos so marcados com substncias fluorescentes diferentes, conforme a
base (A,T,G ou C).
Quando os fragmentos gerados numa reao de seqenciamento so

separados por eletroforese, os fragmentos menores vo frente, seguidos dos
demais, sendo distncia entre as bandas aproximadamente iguais, pois representa
sempre a diferena de uma base a mais ou a menos. A figura 8.2 mostra
esquematicamente como esta separao acontece e como a fluorescncia nas
bandas identificada, na medida em que elas atravessam um trecho do gel que
iluminado por um feixe laser (representado pela barra verde na parte de baixo do
gel). Observe que distncia entre as bandas regular. Um gel pode permitir o
seqenciamento de 600-700 bases para cada reao, e podemos correr at 96
reaes por gel. H no mercado tambm seqenciadores de DNA de ltima gerao
nos quais o gel foi substitudo por um feixe de capilares, que so automaticamente
preenchidos por um polmero, ao invs de gel. Cada reao de seqenciamento
54
separada no seu capilar e a fluorescncia detectada individualmente, o que evita
uma eventual confuso entre seqncias causada pelos desalinhamentos das
corridas eletroforticas, comum nos gis. H mquinas com feixes de 1 a 384
capilares. As maiores so capazes de produzir mais de 2 mil seqncias em 24
horas.
Figura 16. Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na frente.

So iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando atravessam a janela do feixe. Um
gel pode resolver 96 seqncias simultaneamente. Os gis tm sido substitudos por
capilares preenchidos de polmero nas mquinas mais modernas. As bandas pretas indicam
ausncia de material e so apenas uns recursos grficos usado aqui para indicar o espao
aumentado entre bandas que aconteceria neste caso. Entretanto, isto no ocorre na reao
de sequenciamento finalizada, porque o nmero de fragmentos gerados muito grande e a
probabilidade de uma classe de tamanho no ser representada na reao praticamente
nula.
A fluorescncia emitida pela passagem de uma banda pela janela de

medio registrada por um sistema de microcmaras sensoras, que por sua vez
transforma o sinal num grfico, conhecido como eletroferograma. Os picos
representam as bandas, e quanto mais alta e aguda mais qualidade tem, isto ,
maior ser a probabilidade de que a base registrada seja correta. O valor de
qualidade medido por um programa chamado Phred, que leva em conta vrios
parmetros (espaamento entre bandas, largura e altura do pico, intensidade
absoluta do sinal, rudo de fundo, etc). Geralmente emprega-se como padro
aceitvel de qualidade o valor Phred 20, que corresponde a aprox. 99% de certeza
da base indicada. A figura 17 abaixo mostra um eletroferograma obtido no
seqenciamento de um inserto de cDNA do parasita Leishmania chagasi. Observe
que, neste trecho, a qualidade do seqenciamento muito alta, com espaamento
regular dos picos (que indica espaamento regular das bandas) e picos agudos. No
h qualquer polimorfismo de bases, nem poderia haver, pois esta seqncia foi
obtida a partir de um clone de cDNA.
55
Figura 17 Eletroferograma parcial de uma seqncia de DNA obtida no seqenciador automtico

ABI3100 Prism, da Applied Biosystems. Observe que os picos so agudos e regularmente separados,
o que indica alta qualidade do seqenciamento neste trecho.
CONCLUSO
Nos mtodos moleculares para analise do DNA so utilizados vrios

processos como Extrao (ruptura dos tecidos), Purificao (eliminao de resduos
provenientes da extrao ou da purificao), Amplificao ou PCR (sntese in vitro
de milhes de cpias de um segmento de DNA), Clonagem e Seqenciamento e
podem ser aplicado em todos os organismos vivos, com plantas e animais podendo
ou no ser o estudo direcionado filogenia.
As implicaes deste procedimento sempre sero de analisar e caracterizar
cada funo e localizao do gene, comparao filogentica, identificao de um
organismo, clonagem de DNA e em futuras pesquisas um melhoramento gentico
em humanos para que possam viver mais e sem doenas hereditrias e resistentes
a outras patogenias.
56
Estes procedimentos exigem uma enorme responsabilidade, alm de ter
equipamentos caros, qualquer erro pode ser crucial para a analise e a perda de
semanas de trabalho duro em laboratrio. Com estas tcnicas para se chegar ao
seqenciamento de DNA pode ser usado em varias reas de estudo para
identificao filogentica de organismos vivos.
Em toda essas pesquisas de analisar e sequnciar o DNA tem seus pontos
positivos e negativos. Os positivos so que em futuro prximo iremos saber
corretamente o local e qual a funo de cada gene e sim uma possvel precauo
contra doenas hereditrias e outras doenas sem cura. Os negativos que com
essas tcnicas muitos cientistas iro utilizar para transformar o ser humano em uma
mquina, ou seja, com as melhores caractersticas que um ser humano possa
adquirir.
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Estgio Supervisionado - 2004

Curso de Cincias Biolgicas
Formulrio para descrio de atividades de estgio
Aluno: Douglas de Oliveira Luciano
Entidade/Empresa/Instituio onde realizou os estgio: UNESP Rio Claro Laboratrio
CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais)
Responsvel/Orientador do estgio: Maurcio Bacci Jnior
Perodo (mm/aaaa): Maro de 2004 a Setembro de 2004
61
Tempo total do estgio (horas): 540 horas
Relato das atividades desenvolvidas:
As atividades desenvolvidas no Laboratrio do CEIS (Centro de Estudos de Insetos
Sociais) junto ao orientador Maurcio Bacci Jnior, foram direcionadas ao estudo de filogenia
das espcies de formigas Atta sexdens e Atta cephalote (Formiga Sava).
As coletas foram obtidas de vrios locais de amostragem, como nos Estados Unidos,
Brasil e Colmbia. Depois de coletadas as amostras eram levadas ao laboratrio para que
fossem analisadas geneticamente.Com os mtodos moleculares de anlise de DNA foi
conferida sua filogenia de acordo com os estudos sobre o trabalho desenvolvido por outros
pesquisadores.
O mtodo de extrao de DNA realizado para extra-lo atravs da ruptura dos
tecido e depois necessrio quantificar para verificar se h presena de DNA, para isso
usamos os mtodos de Gel de Agarose, Fluometria e Espectofotometria.
Aps a extrao faz-se uma amplificao do mesmo pelo mtodo de reao em
cadeia de polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction) que uma tcnica que envolve a
sntese in vitro de milhes de copias de um segmento do cido desoxirribonuclico na
presena da enzima DNA polimerase.
O passo seguinte feito uma clonagem do material, ou seja, produo de cpias
idnticas de uma nica clula. Feita a clonagem necessrio aplicar a tcnica de
purificao de DNA para remover resduos provenientes da Reao em cadeia (PCR) como
ddntps, restos de primers, sais entre outros resqucios.
Feito todos os procedimentos de mtodos moleculares preciso sequenciar a
amostra, e este processo feito atravs de aparelho chamado seqenciador, que pode ser
por Gel de poliacrilamida ou por Capilar, ambos com o mesmo efeito.

Com os dados obtidos faz-se uma comparao com dados obtidos com
pesquisas de diferentes pesquisadores do assunto e verificar a relao filogentica
entre as espcies coletadas em diversos locais do mundo e saber sua posio
geogrfica no globo terrestre.

Métodos Moleculares para A Análise Do Dna

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1

DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO

MTODOS MOLECULARES PARA ANLISE DO

CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS

DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO

MTODOS MOLECULARES PARA A ANLISE DO DNA

Nome do orientador: Maurcio Bacci Jnior

Disciplina de Estgio supervisionado do Curso de

CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS

Autor: Douglas de Oliveira Luciano

Ttulo da monografia: Mtodos moleculares para a anlise do DNA

Monografia aprovada em________ de ______________de ______________, pela

Dedico este trabalho de concluso de curso a minha me Oneide e ao meu

Para realizar um trabalho como este, foi necessria a ajuda de muitas

Deixo meus agradecimentos aos meus amigos Joaquim e Dani que

Agradeo ainda a todos os amigos do laboratrio da UNESP (CEIS) pelo

Agradeo, em especial, ao professor Dr. Maurcio Bacci Jnior, no somente

O seqenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos

** - colocar sobre extrao, purificao, e outros.

The sequencing of DNA is a process that determines the order of the

*** no colocar para traduzir em site ou em programas.

Figura 6 - Esquema para a obteno de plasmdeos recombinantes

ESTRUTURA E FUNO DO DNA.........................................................11

REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)....................................24

ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA.........................................32

PREPARAO DO PLASMDEO (PREP)........................................................33

4.4.1 Clonando DNA de um Plasmdeo...................................................................35

6.1.1 Tipos de Fragmentos de DNA que so ligados pela DNA Ligase............43

PRODUO DE UM DNA PARA SEQENCIAMENTO E A TCNICA DIDEOXI

1 ESTRUTURA E FUNO DO DNA

No incio da dcada de 50, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins examinaram

O gene uma regio do DNA que controla uma caracterstica hereditria

Para o isolamento e purificao de cidos nuclicos, necessrio separ-los

1.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose

Sob influncia de uma diferena de potencial eltrico, tomos, molculas e

eletroforese em gel de acrilamida usada em menor escala. A tcnica simples,

A localizao do DNA no gel pode ser

As bandas no gel so coloridas principalmente por

viscosidade do meio, entretanto, os efeitos da frico e o formato das molculas

Ligar o espectrofotmetro 15 minutos antes. Colocar o comprimento de

onda para 320 nm.

Fazer uma soluo diluda em gua da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou

Zerar o instrumento com gua em Abs320nm.

Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm

Estimar a concentrao de DNA pela frmula

Obs. Existe um superestimativa da concentrao por espectrofotmetro

Ele foi desenhado para a

quantificao de baixas concentraes de DNA usando o corante chamado de

EDTA, sal dissdico, dihidratado (PM = 372,20)

Completar volume at 70 ml com gua mQ

No filtrar. Armazenar a 4oC por at 6 meses protegendo da luz.

Soluo de Trabalho 1 x TNE Baixa concentrao (A)

Prepare um branco usando 2 ml da soluo de

trabalho A (baixa concentrao). Seque o lado da cubeta com leno de papel.

Adicione 2 ml da soluo de trabalho A (baixa

concentrao) .Insira a cubeta no poo, feche a tampa, e aperte o boto

Repetir os passos 4 e 5 para cada

ligue o instrumento 15 minutos para estabilizar a lmpada antes de medir

use luvas pois o corante pode ser mutagnico.

Toda as solues devem estar temperatura ambiente antes de medir a

Preparar soluo de trabalho fresca para uso do dia

Filtrar o tampo TNE antes de acrescentar o corante

A tcnica reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain

Monografia aprovada em de de ________, pela