Marco terico

Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que
son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica de una enzima
permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el
metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede
ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo
de molculas.
Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular
otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al
centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un
producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo
enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o
liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una
protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea
de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de
incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2).
Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos,
tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad
final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una
reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del
sustrato.

Fundamentos
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato
y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al
igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en
absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto. Sin embargo,
al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto
significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros
catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la
reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados.

En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y,

aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.
Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el
tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima
velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas
propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de

una

enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un

cambio de esas condiciones.

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la

concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. (Imagen. Standard
RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

Ensayos enzimticos
Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un
laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin
enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan,
los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en
la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin
de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar
estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la
absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la
concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin
de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo.
Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten
medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los
ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo
que

son

ensayos

discontinuos.

Sin

embargo,

estos

ensayos

son

extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de

actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas
para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el
sustrato es convertido en producto.
Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de
un

microscopio

para

observar

los

cambios

producidos

en

enzimas

individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar

cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el
mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares
especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos
durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin de la
cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los
estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se
mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de
enzima.
En

la

figura

derecha
observar

de

la

se

puede

la

tpica

evolucin de una curva

obtenida en un ensayo
enzimtico.
Inicialmente, la enzima
transforma el sustrato
en producto siguiendo
un

comportamiento

lineal.
A medida que avanza
la

reaccin,

agotando
de

la

sustrato

se

va

cantidad
y

disminuyendo

va
la

cantidad de producto
que

se

unidad

genera
de

por

tiempo

Curva de saturacin de una reaccin

enzimtica. La pendiente representa, en el
perodo inicial, la velocidad de la reaccin.
La ecuacin de Michaelis-Menten describe
cmo va variando la pendiente con la
concentracin de sustrato o de enzima.
(Standard
RF,
MedicalRF.com/Corbis.
1999)

(disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de

curva asinttica en la grfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y
del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta
horas. Los ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el
perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas
ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de
lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya
duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.
La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo
inicial, es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo,
tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a
una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es
denominada anlisis de la curva de progreso. Esta aproximacin es muy til
como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es
demasiado rpido para ser medido con precisin.

Factores

fsico-qumicos

que

pueden

modificar

la

actividad

enzimtica
Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse
modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos
pueden

llegar a variar sustancialmente

de

unas enzimas a otras.

Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver

incrementada su actividad hasta el momento en que comience la
desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva
de dicha actividad.
pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes
enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver
modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar
la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.
Concentracin

salina:

al

igual

que

en

los

casos

anteriormente

mencionados, la concentracin de sales del medio es crucial para una

ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de

sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las

enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para mantener
su carga y su estructura.
-Amilasa (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa;
glucogenasa)
Las -amylasas son metaloenzimas de calcio, completamente afuncionales
en ausencia de calcio. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de
los carbohidratos, descomponindolos en maltotriosa y maltosa desde la
amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado que
puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo
est entre 6.7 y 7.0.
En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica
son -Amylasas. Puede encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias.
Cintica de Michaelis-Menten
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de
catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la
concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a
una determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la
velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el
aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando
aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad
mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso, independientemente
de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin

enzimtica. k1, k-1 y k2 son las constantes cinticas
para cada una de las etapas de la reaccin. (Standard
RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

El modelo de cintica micheliana para una reaccin de nico sustrato se

puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una
reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose
el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una
reaccin unimolecular

puede ser bastante complejo, existe

una etapa enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea

simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2.
(Ecuacin 1)
k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo
nmero de reacciones enzimticas catalizadas por segundo.
A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio
constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES.
Aumentando la [S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E],
desplazando el equilibrio de la reaccin hacia la derecha. Puesto que la
velocidad de reaccin depende de la [ES], la velocidad es sensible a
pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y
solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la
velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeos
cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E] tot) es
aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:

La

ecuacin

de

Michaelis-Menten7
describe

como

la

velocidad

de

la

reaccin depende del

equilibrio entre la [S] y
la constante k2. Leonor
Michaelis

MaudMenten
demostraron que si k2
es mucho menor que k1
(aproximacin
equilibrio)
deducir

del

se
la

puede

siguiente

ecuacin:

Representacin grfica de la curva de

saturacin de una enzima donde se puede
observar como evoluciona la relacin entre
la concentracin de sustrato y la velocidad
de
la
reaccin.
(Standard
RF,
MedicalRF.com/Corbis. 1999)

(Ecuacin 2)
Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas
de sustrato nico.

BIOQUMICA, Legninger, Edit. Omega. Segunda edicin. 1981. Madrid.

BIOQUMICA PRCTICA, Plummer. Edit. McGraw-Hill.
GUA DE PRCTICAS DE BIOQUMICA, Garca Alayo, Fred, FQIQIA, UNMSM,
Per, 2011.