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Uso de Pequeos
Roedores de
Laboratorio
Unidad de Animales Transgnicos
y de Experimentacin
G
MSScc
Geerraallddiinnee SScchhllaapppp,, M
AAnnaa PPaauullaa AArrvvaalloo,, TTM
MN
N
INDICE
PRO
SECCION 1 .............................................................................................................................................................5
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES..................................................................................................................5
TCNICAS BSICAS DE OBTENCIN DE MUESTRAS IN VIVO ............................................................................... 6
1. EXTRACCIN DE SANGRE ..........................................................................................................................6
1.1. Vena submandibular..........................................................................................................................6
1.2. Puncin intracardaca ........................................................................................................................7
2. BIOPSIA DE COLA ...................................................................................................................................8
3. MARCADO DE OREJAS.............................................................................................................................9
4. PERFUSIN INTRACARDACA IN VIVO.................................................................................................. 10
TCNICAS DE ADMINISTRACIN DE SUSTANCIAS ............................................................................................. 11
VIAS DE ADMINISTRACION PARENTERAL .................................................................................................. 11
5. SUBCUTNEA (SC).............................................................................................................................. 12
6. INTRAPERITONEAL (IP) ...................................................................................................................... 13
7. INTRAMUSCULAR (IM) ....................................................................................................................... 14
8. INTRADRMICA (ID) ........................................................................................................................... 15
9. INTRAVENOSA (IV) ............................................................................................................................ 16
10. ALMOHADILLAS PLANTARES ........................................................................................................... 17
VIA DE ADMINISTRACION ENTERAL .......................................................................................................... 17
11. ORAL ................................................................................................................................................ 17
IMPACTO DE LOS PROCEDIMIENTOS EN EL BIENESTAR ANIMAL.............................................................. 19
ANEXO SECCION 1 ..................................................................................................................................... 20
TABLA 1 - Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante) ................................................ 20
TABLA 2 - Volmenes de extraccin referidos a Vt (Volumen total)......................................................... 20
TABLA 3 - Tamao de aguja para la administracin de sustancias............................................................ 20
TABLA 4 - Volmenes de inoculacin ........................................................................................................ 21
Valores de pH de las soluciones a inyectar ............................................................................................... 21
REFERENCIAS SECCION 1 ................................................................................................................................... 22
SECCION 2 .......................................................................................................................................................... 23
RECONOCIMIENTO Y ALIVIO DEL ESTRS Y EL DOLOR ...................................................................................... 23
SITUACIONES QUE CAUSAN DOLOR .................................................................................................................. 23
2
2.
Dislocacin cervical........................................................................................................................ 38
3
3.
Decapitacin .................................................................................................................................. 38
2.
3.
Estudios toxicolgicos.................................................................................................................... 41
4.
SECCION 1
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
PRINCIPIOS DE LAS BUENAS PRCTICAS
Cuando se administra una sustancia a un animal por cualquier va, el objeto debe ser conseguir la mejor
prctica, puesto que los errores pueden provocar un sufrimiento evitable y/o un gasto de animales vivos. La
mejor prctica se basa en minimizar o evitar efectos adversos, disminuir cuanto se pueda el nmero de
animales utilizados y maximizar la calidad y aplicabilidad de los resultados.
Objetivos:
Refinar los procedimientos de administracin de sustancias para asegurar un buen nivel de bienestar
para los animales.
Obtener la mayor precisin en los datos cientficos obtenidos.
Subcutnea
6.
Intraperitoneal
7.
Intramuscular
8.
Intradrmica
9.
Intravenosa
Vc (ml)
1% (ml)
7.5% (ml)
10% (ml)
20
1.10 -1.40
0.011 - 0.014
0.082 - 0.105
0.11 - 0.14
25
1.37 - 1.75
0.014 - 0.018
0.10 - 0.13
0.14 - 0.18
30
1.65 - 2.10
0.017 - 0.021
0.12 - 0.16
0.17 - 0.21
35
1.93 - 2.45
0.019 - 0.025
0.14 - 0.18
0.19 - 0.25
40
2.20 - 2.80
0.022 - 0.028
0.16 - 0.21
0.22 - 0.28
Tabla 2
Extraccin nica
Extracciones mltiples
% Vc extrado
Perodo de
recuperacin
% Vc extrado en
24h
Perodo de
recuperacin
7.5 %
1 semana
7.5 %
1 semana
10 %
2 semanas
10 %
2 semanas
15 %
4 semanas
15 %
3 semanas
Descripcin de la tcnica:
1) Sujetar firmemente el ratn de manera que la cabeza quede alineada con el cuerpo.
2) Usando una aguja 19-21G, dependiendo de la edad y/o tamao del ratn, realizar la puncin en
la zona indicada en la figura 1. La profundidad ptima es de 2-3 mm.
3) Recoger la sangre en un tubo tipo Eppendorf teniendo en cuenta que el flujo ser de
aproximadamente una gota (20l) por segundo.
4) Una vez obtenida la muestra ejercer una leve presin sobre la zona de puncin para detener la
hemorragia y luego retornar el ratn a su caja. El sangrado se detendr automticamente.
Figura 1
www.medipoint.com
3) Empleando las tijeras de diseccin, realizar un corte longitudinal desde la parte media del
abdomen hasta el cuello. Despejar la zona y generar una abertura en la caja torcica sobre la lnea
media, hasta dejar completamente destapado el corazn.
4) Ingresar al corazn introduciendo la aguja en el pice del ventrculo izquierdo y realizar la
extraccin.
5) Proceder a la inmediata eutanasia del animal una vez concluido el procedimiento.
2. BIOPSIA DE COLA
Anestesia: segn la edad y longitud de cola que se quiera obtener (ver Seccin Anestesia)
Material: tijeras pequeas
Tener en cuenta:
1) La longitud mxima a cortar es de 0.5 cm. De este fragmento se obtiene 50 g de ADN, suficiente
para mltiples ensayos de genotipado.
2) La edad ptima para la realizacin de este procedimiento es de 15 a 21 das, antes de la calcificacin
de las ltimas vrtebras.
3) Requerimientos de anestesia:
-
4) Este procedimiento no debe ser desarrollado ms de dos veces en el mismo ratn, salvo autorizacin
de la CEUA (Comisin de tica en el Uso de Animales) institucional.
Descripcin de la tcnica:
1) Inmovilizar al ratn con la mano o introducirlo en un cepo.
2) Seccionar 0.2-0.5 cm de cola usando las tijeras (previamente desinfectadas).
3) Presionar la zona de corte con papel o cauterizar para detener la hemorragia.
4) No devolver el ratn a su jaula hasta comprobar que el sangrado se detuvo completamente.
5) Limpiar las tijeras por friccin (toalla de papel mojada en alcohol 70%). Este procedimiento es
importante tambin en el caso de que se realicen varias biopsias contiguas usando el mismo
instrumento con el fin de eliminar posibles restos de tejido del animal anterior.
3. MARCADO DE OREJAS
Anestesia: no requerida
Material: sacabocados
Descripcin de la tcnica:
1) Inmovilizar al ratn con la mano de forma que las orejas queden accesibles.
2) Proceder al marcado siguiendo el cdigo indicado en la figura 2. En la oreja derecha del ratn se marcan
las unidades, desde el 1 en la regin ventral hasta la 9 en la regin dorsal. Las decenas se marcan en la oreja
izquierda del ratn siguiendo la misma disposicin de las unidades.
UATE - IPMon
EJEMPLOS:
Figura 2
10
Figura 3
msculos (va intramuscular IM), en venas (va intravenosa IV), o en cavidades como la peritoneal (va
intraperitoneal IP).
5. SUBCUTNEA (SC)
Esta va es la ms sencilla y mejor tolerada de todas. Presenta una absorcin lenta porque el depsito de las
sustancias se realiza en tejidos poco irrigados.
Anestesia: no requerida
Material: aguja 25 G (ratn y rata)
Lugar de inyeccin: zona dorsal
Volumen mximo: 2-3 ml (ratn), 5-10 ml (rata)
Inyecciones mximas: 2-3 /da
pH de solucin a inyectar: fisiolgico (aprox. 7), consultar Anexo
Descripcin de la tcnica:
1) Depositar al ratn sobre la rejilla permitindole agarrarse de ella con las patas delanteras, y sujetarlo
por la cola.
2) Introducir la aguja por debajo de la piel a 45 en el cuadrante inferior derecho o izquierdo, y
posicionarla de forma paralela al animal para evitar inyectar capas ms profundas (figura 4). No se
debe sentir resistencia al mover la aguja.
3) Inyectar el volumen total de muestra a una velocidad moderada.
4) Antes de retirar la aguja girarla 90 y proceder a su extraccin, esto previene el reflujo de la
sustancia inyectada.
5) Si la sustancia fue inyectada correctamente, se observar la formacin de un abultamiento en el sitio
de inyeccin que ir desapareciendo a medida que el fluido se dispersa.
UATE - IPMon
Figura 4
12
6. INTRAPERITONEAL (IP)
Se utiliza para administrar volmenes relativamente grandes de sustancias solubles. Su utilizacin es muy
comn en pequeos roedores.
Anestesia: no requerida
Material: aguja 27-25 G (ratn)
Lugar de inyeccin: zona ventral, cuadrante inferior derecho
Volumen mximo: 2-3 ml (ratn), 5-10 ml (rata)
pH inoculacin: consultar Anexo
Descripcin de la tcnica:
1) Con el ratn correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento durante el procedimiento)
inclinarlo caudalmente y trazar una lnea imaginaria que cruce su abdomen transversalmente justo
sobre sus rodillas tal y como se muestra en la figura 5 (lnea negra).
2) Insertar la aguja en el cuadrante inferior, en el lado derecho del animal apenas alejado de la lnea
media (lnea roja). De esta manera se disminuye el riesgo de inyectar en ciego o vejiga urinaria.
3) La aguja debe alcanzar una profundidad de aproximadamente 0.5 cm (ratn) y debe insertarse con
una inclinacin de unos 30 con respecto a la superficie del abdomen.
4) Si ningn fluido es aspirado, proceder a la inyeccin de la muestra.
5) Retirar la aguja y presionar ligeramente la zona de inyeccin.
UATE - IPMon
Figura 5
Algunos disolventes acuosos pueden producir inflamacin de los bordes de los lbulos hepticos.
Produce dolor, fibrosis y adherencias.
13
No se puede asegurar que la sustancia se est administrando en la cavidad en lugar del intestino, vejiga,
msculo u otro rgano
Pueden daarse vasos sanguneos
7. INTRAMUSCULAR (IM)
Se utiliza como una va de administracin sistmica, en estudios de liberacin lenta (formulaciones oleosas) y
en valoracin de vacunas. Se desaconseja esta tcnica en animales pequeos (Ej.: rata, ratn o hmster).
Anestesia: no requerida
Material: aguja 27 G (ratn), 25 G (rata)
Lugar de inyeccin: cudriceps, parte anterolateral del muslo
Volumen mximo: 50 l por sitio de inyeccin (ratn), 300 l (rata)
Inyecciones mximas: 2 por da
pH inoculacin: fisiolgico (aprox. 7), consultar Anexo
Descripcin de la tcnica:
1) Pueden ser necesarias dos personas para el correcto procedimiento de esta tcnica, una para sujetar
al animal y otra para la inoculacin.
2) Inmovilizar al ratn, sujetar firmemente la pata trasera del animal y proceder a la insercin de la
aguja en el sitio de inoculacin (figura 6).
3) Siempre antes de la inoculacin, aspirar ligeramente para comprobar que no fluye sangre en la
jeringa y as evitar la inyeccin en vasos sanguneos.
4) El contenido de la jeringa debe ser expulsado muy lentamente y se debe masajear la zona de
inyeccin cuidadosamente una vez realizada la inoculacin.
Figura 6
8. INTRADRMICA (ID)
Se utiliza frecuentemente en estudios de inflamacin, sensibilizacin, diagnstico de flujo sanguneo cutneo
y en inmunologa.
Anestesia: no requerida, pero facilita el procedimiento
Material: aguja 30 G (ratn y rata)
Lugar de inyeccin: zona dorsal
Volumen mximo: 50-100 l por sitio de inyeccin (ratn y rata)
Inyecciones mximas: 6 sitios de inoculacin. Nunca inyectar en el mismo sitio ms de una vez
pH inoculacin: fisiolgico (aprox. 7), consultar Anexo
Descripcin de la tcnica:
1) Pueden ser necesarias dos personas para el correcto procedimiento de esta tcnica, una para sujetar
al animal y otra para la inoculacin
2) Afeitar la/las zona/s a inyectar. La aguja debe situarse casi paralela a la superficie de la piel e
introducirla cuidadosamente unos pocos milmetros dentro de ella, dejando el bisel de la aguja hacia
abajo (figura 7).
3) Una prdida de resistencia al paso de la aguja demuestra que se ha ingresado en la capa subcutnea.
En este caso, retirar la aguja y proceder de nuevo a la inoculacin.
4) Realizar una ligera rotacin de la aguja despus de la inoculacin antes de extraerla, lo que ayudar
a minimizar la prdida del compuesto inyectado.
A
www.bioterios.com
Figura 7
15
9. INTRAVENOSA (IV)
Se usa con frecuencia en experimentos farmacolgicos y toxicolgicos de biodisponibilidad inmediata. Es la
va elegida cuando se requiere una muy rpida absorcin de la sustancia o cuando se administran sustancias
irritantes que producen malestar o dolor (pH muy bajo o muy alto). Se debe tener en cuenta la dosis
empleada porque existe posibilidad de que las sustancias lleguen rpidamente y a concentraciones altas a
rganos o sistemas sensibles y vitales. Por ej. las sustancias que producen depresin cardiomuscular o
respiratoria pueden producir efectos fatales.
Anestesia: no requerida
Material: aguja 27-30 G (ratn y rata) y cepo
Lugar de inyeccin: vena lateral de la cola
Volmenes recomendados: 200 -300 l (ratn), 500 l (rata)
pH inoculacin: consultar Anexo
Descripcin de la tcnica:
1) Colocar el animal en el cepo, manteniendo la cola hacia afuera (figura 8). Realizar una correcta
vasodilatacin (usar agua tibia o una luz caliente).
2) Insertar la aguja, con el bisel hacia arriba, en una de las venas laterales de la cola, las cuales se
localizan a ambos lados de la lnea central de manera superficial, de forma paralela a la superficie.
3) Asegurarse de haber ingresado en la vena (aspirar) antes de inocular la sustancia. Si la aguja ha sido
alojada en el lumen de la vena, no se apreciar resistencia al presionar el mbolo de la jeringa de
modo que la muestra fluir sin dificultad en el torrente sanguneo.
4) Una vez inoculada la muestra retirar la aguja y presionar la zona de inyeccin con un algodn para
detener la hemorragia.
UATE - IPMon
Figura 8
16
3)
Los animales no deben ser alojados en cajas desprovistas de viruta (ej. cajas tipo metablicas)
La monitorizacin del sitio de inyeccin deber ser tan frecuente como sea necesario para detectar de
inmediato reacciones adversas que puedan impedir el acceso del animal al agua y/o comida. En caso de
aparicin de las mismas se proceder con el protocolo de punto final previsto en la CEUA.
11. ORAL
Comnmente usada para la administracin de compuestos irritantes o imposibles de ser administrados por
otras vas.
Anestesia: no usada porque se requiere el reflejo de deglucin
Material: sonda o catter recto o curvo, con extremo abotonado, de 0.8 mm (ratn), 1-2 mm (rata, cobayo).
Hay sondas metlicas y plsticas, se recomienda el uso de estas ltimas dado que son ms flexibles.
pH de inoculacin: fisiolgico (aprox. 7)
Descripcin de la tcnica:
1) Inmovilizar el animal de forma que la cabeza, el cuello y el trax formen una lnea recta.
2) Medir el tamao de la sonda. Tomar puntos de referencia (figura 9).
17
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Figura 9
Problemas potenciales
Ingreso en vas respiratorias (trquea), lo que se confirma por presencia de tos, dificultad
respiratoria (gorjeos o carraspeos), dificultad para avanzar la sonda. Si esto ocurre,
retirar la sonda y volver a intentarlo.
18
N de
dosis
Inmovilizacin
Intra-articular
Intra-cerebral
Intradrmica
Intramuscular
Intranasal
Intraperitoneal
Intra-traqueal
Intravaginal
Intravenosa (no
reodores)
Intravenosa
roedores
En dieta/agua
Cpsulas
Sonda
R
R
M
M
A: anestesia;
* Leve
M : manual;
** Medio
Comentario
Puede daar la articulacin. Es esencial llevarla a
cabo en condiciones estriles. Utilizar solo una vez
Tcnicamente difcil en neonatos. Puede producir
muerte si no se realiza correctamente
Esencial realizarla correctamente para asegurar que
no sea subcutnea
Los efectos irritantes pueden ser un grave problema.
Posible lesin en los nervios. Evitar inyectar en la
fascia o vasos sanguneos. Precaucin con los
adyuvantes. Mltiples inyecciones en diferentes
lugares
No es fcil garantizar que toda la dosis ingrese en las
fosas nasales. Efectos adversos improbables
Las sustancias irritantes producen problemas
graves. Es posible que se inocule algn rgano. No
recomendada en especies mayores a los roedores
Puede producir muerte si la sustancia se administra
equivocadamente o es irritante
Puede resultar difcil retener la sustancia en la vagina
Los efectos tromboembolicos sobre el SNC son
relativamente habituales
Si se inyecta rpido puede que algn trombo alcance
el SNC u otro rgano ocasionando la muerte
Variacin en la dosis ingerida. Baja palatabilidad.
Posible angustia por sed. Es necesario buen
conocimiento de las pautas nutricionales
Depende de la especie. Fcil de administrar
Impacto sobre el
bienestar
***
***
**
**
*
**
***
*
**
**
*
*
**
19
ANEXO SECCION 1
TABLA 1 - Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante)
Extraccin nica
Extracciones mltiples
% Vc extrado
Perodo de
recuperacin
% Vc extrado en 24h
Perodo de
recuperacin
7.5 %
1 semana
7.5 %
1 semana
10 %
2 semanas
10 %
2 semanas
15 %
4 semanas
15 %
3 semanas
Vc ratn: 72 ml/kg
Vc rata: 68 ml/kg
7.5 % (ml)
10 % (ml)
15 % (ml)
Ratn (25g)
1.8
0.1
0.2
0.3
0.4
Rata (250g)
16
1.2
1.6
2.4
3.2
Intradrmica
27 G
27 G
25 G
25 G
Subcutnea
25 G
25 G
23-25 G
21-25 G
20
IV (Bolo)
IV Perf.
(25)
Rata
(20)
10 (40)
SC
IP
5 (10) 10 (20)
IM
0.1* (0.2)*
( ) Volmenes mximos
- No ms de 2 inoculaciones IM por da
- No ms de 2 3 inoculaciones SC por da
- IV: no exceder 4% volumen circulante (bolus) o 4 ml/kg/h en perfusin
21
REFERENCIAS SECCION 1
A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including
routes and volumes. Diehl, KH; Hull, R; Morton, D; Pfister, R; Rabemampianina, Y; Smith, D;
Vidal, JM; Van De Vorstenbosch, C. J Appl Toxicol 2001; 21:15-23.
Ciencia y Tecnologa del Animal de Laboratorio. Ziga, JM; Orellana, JM; Tur, JA. Volumen 2.
Ed. Univ. de Alcal, SECAL, 2008.
Guide for the Care and Use of Lab Animals. Committee for the Update of the Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals; National Research Council.
Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. OACU, NIH, 2005.
Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual (3rd ed.). Nagy, A; Gertsenstein, M;
Vintersten, K; Behringer, R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2003.
Refining procedures for the administration of substances. Report of the BVAAWF/ FRAME/
RSPCA/ UFAW joint working group on refinement. Morton, DB; Jennings, M; Buckwell, A;
Ewbank, R; Godfrey, C; Holgate, B; Inglis, I; James, R; Page, C; Sharman, I; Verschoyle, R;
Westall, L; Wilson, AB. Lab Anim 2001; 35:1-41.
Tcnicas de obtencin e inoculacin de muestras. CSIC. CNB. Madrid, Espaa.
Vas de administracin de sustancias en animales de laboratorio. Candela Mariana Ferron.
Extrado de www.bioterios.com
Working with the Laboratory Mouse. AALAS.
22
SECCION 2
RECONOCIMIENTO Y ALIVIO DEL ESTRS Y EL DOLOR
La prevencin y alivio del dolor y estrs en animales de laboratorio es un deber tico y moral,
siendo una de las bases en las que se fundamenta el bienestar animal y las 3Rs de Russell y Burch
(1959). Adems son variables no deseadas en la experimentacin animal por la posible
interferencia con la interpretacin de los resultados. Investigadores, veterinarios y tcnicos
bioteristas son responsables por informarse sobre el correcto reconocimiento, prevencin y manejo
de estos estados en los animales y de tomar las medidas necesarias en cada caso.
De manera general se considera que un procedimiento que causa dolor en los humanos, tambin
ser doloroso en animales de experimentacin, sin importar la edad o la especie.
23
Condiciones o procedimientos
Abdominal
Cardiotorcico
Dermatolgico
Musculo-esqueltico
Neurolgico
Ocular
Orofacial
Sistmico
Urogenital
neumona,
Esta tabla es ilustrativa, no incluye todos los posibles procedimientos que pueden causar dolor.
24
2.
3.
Aislamiento social
4.
Agresividad
5.
6.
7.
Miccin/defecacin alterada
8.
Automutilacin
9.
11.
Movimientos repentinos (escape reflejo) y dificultad para mantener una postura, cuando estn
afectados los miembros (ataxia)
12.
25
ANALGESIA
El objetivo de la analgesia es alcanzar un estado balanceado en el que el animal no se encuentre
imposibilitado por el dolor pero tampoco sea afectado por los efectos secundarios de los
analgsicos.
El empleo de analgesia proporciona ms ventajas que desventajas, tanto del punto de vista tico o de
bienestar del animal, como del cientfico o de fiabilidad de resultados. Existe una amplia variedad de
frmacos y tcnicas analgsicas, y por lo tanto es posible encontrar una opcin adecuada para cada
experimento, sin interferir con los resultados experimentales. Adems es ms probable que las
consecuencias de los procedimientos dolorosos produzcan alteraciones fisiolgicas de mucha mayor
magnitud que las producidas por los analgsicos. Como regla general, los analgsicos deben emplearse antes
de que el animal perciba dolor, lo que se denomina analgesia preventiva. En caso contrario, se produce un
fenmeno de hipersensibilizacin que exacerba la percepcin dolorosa y hace ms difcil mantener una
adecuada analgesia y las dosis tienen que incrementarse.
Cada vez existen ms evidencias que indican que la administracin de analgsicos reduce las consecuencias
de la ciruga, retornndose mucho antes a la situacin prequirrgica; las alteraciones hormonales e
inmunitarias se reducen o normalizan, la ingesta del animal se recupera, la cicatrizacin de las heridas es
ms rpida. Puede considerarse que la anestesia y la analgesia actan como mecanismos protectores frente
a la agresin quirrgica o el manejo intenso.
Por lo general el uso de un nico analgsico es suficiente. Sin embargo en algunos estudios se han observado
resultados ms efectivos cuando se usa analgesia multimodal, as como fenmenos de sinergia. Por ej. el uso
de analgesia con adyuvantes (antidepresivos, antiepilpticos, antagonistas de receptores NMDA) resulta una
alternativa efectiva en el tratamiento del dolor crnico que no responde a la administracin de un nico
agente.
26
Tipo de analgesia
Bajo
Moderado
Fuerte
27
ANESTESIA
El objetivo principal de la anestesia es bloquear la sensibilidad tctil y dolorosa para la realizacin de
procedimientos quirrgicos u otros procedimientos dolorosos. Reduce al mnimo el sufrimiento asociado a la
manipulacin y evita situaciones de dolor, angustia y/o ansiedad en los animales.
La anestesia es un estado reversible producido por frmacos, caracterizado por la ausencia de cualquier tipo
de percepcin sensorial, ya sea dolorosa o no. La administracin de estos frmacos, bien sea uno solo (ej.
isofluorano) o la combinacin de varios (ej. ketamina y xilazina) produce una depresin del sistema nervioso
central (SNC) que impide la llegada o reconocimiento de cualquier estmulo sensorial. En funcin de la dosis,
son capaces de llegar a deprimir suficientemente los centros bulbares, vasomotor y respiratorio, y con ello la
muerte del animal.
Anestesia no equivale necesariamente a analgesia. La anestesia general produce prdida de conciencia y por
lo tanto el animal no puede percibir dolor en ese momento, pero el estmulo doloroso puede ser transmitido
y procesado por el SNC y ser percibido de forma posoperatoria. Algunos anestsicos poseen propiedades
analgsicas como los agonistas 2- adrenrgicos (xilazina); adems los analgsicos se pueden utilizar como
parte del rgimen anestsico.
Los componentes de la anestesia son:
Bloqueo de la actividad refleja, que impide respuestas del sistema nervioso autnomo e incluye
alteraciones en la frecuencia y ritmo cardaco, de la produccin de secreciones, etc
Un anestsico ideal debe incluir de forma estable los cuatro componentes antes indicados, sin afectar a
otras funciones orgnicas.
La valoracin del reflejo podal de retirada, provocado por la comprensin de la zona plantar de una
extremidad, as como del reflejo palpebral, permiten ver el grado de profundidad anestsica, que junto a la
evaluacin de las funciones fisiolgicas como frecuencia cardaca, tasa de saturacin de oxgeno y frecuencia
respiratoria, permiten reconocer un correcto funcionamiento de la misma.
La temperatura es un factor que se encuentra fuertemente afectado durante la anestesia, ya que la
depresin del centro termorregulador hipotalmico produce una disminucin de la temperatura corporal. En
animales pequeos como los ratones la prdida de calor durante la anestesia es muy notoria, disminuyendo
28
5-9 C / hora. Para evitar la hipotermia en estos animales se sugiere el uso de sistemas productores de calor
como mantas trmicas durante y despus de terminado el procedimiento.
Existen mtodos de anestesia inhalatoria e inyectable (fija), y diversas drogas de uso aceptado en ambos
casos. La seleccin del mtodo depende de varios factores incluyendo la especie y edad del animal; el tipo y
grado de dolor producido por el procedimiento; la naturaleza y duracin del procedimiento; los efectos
posibles del agente en rganos especficos en el caso de la administracin de drogas o procedimientos que
producen dficit fisiolgico.
Agentes inyectables
Barbitricos (pentobarbital sdico, tiopental sdico)
Histricamente han sido los anestsicos ms usados en roedores. Se usan principalmente en estudios
terminales debido a que la recuperacin es prolongada y puede estar acompaada por excitacin. Tienen
bajo efecto analgsico por lo cual es necesario el uso concomitante de otros frmacos. Como ventaja
presentan una duracin prolongada (aprox. 45 min), mayor a la de cualquier otro anestsico inyectable,
siendo la del pentobarbital mayor a la del tiopental; adems causan una mnima depresin cardaca cuando
se usan en las dosis adecuadas. Las desventajas de los barbitricos son que causan depresin respiratoria e
hipotermia pronunciadas; inducen el sistema enzimtico microsomal heptico; la sensacin de dolor se
reduce nicamente en los planos de inconsciencia y puede ser hasta aumentado (hiperalgesia) a dosis
subanestsicas.
Tribromoetanol
En la mayora de los roedores el tribromoetanol produce una buena anestesia quirrgica, con una buena
relajacin muscular y slo una moderada depresin respiratoria. Tiene bajo costo y su venta no es
controlada. Cuando se expone a la luz o a temperaturas >40C esta droga se descompone en 2 productos
altamente irritantes y cuando son administrados va IP pueden causar peritonitis y hasta la muerte. Si se
tienen los cuidados necesarios, esta droga puede usarse satisfactoriamente, por una nica vez en cada
animal.
29
Ketamina
La ketamina pertenece al grupo de las arilciclohexaminas, fenciclidinas o anestsicos disociativos, es un
anestsico general de uso muy amplio en la prctica clnica veterinaria. Farmacolgicamente se define como
un antagonista no competitivo de glutamato sobre receptores NMDA, induce amnesia y anestesia por
disociacin funcional del SNC induciendo una prdida de conciencia, y produce analgesia mediada por su
interaccin con receptores opiceos. Se caracteriza por la produccin de un estado caracterizado por
disociacin y desconexin del individuo con su entorno. Sin embargo, estos compuestos tienen una marcada
tendencia a inducir agitacin y alucinaciones durante el perodo de recuperacin anestsica. Se considera un
anestsico de extraordinaria seguridad y eficacia combinado con otras sustancia depresoras del SNC. Cuando
se usa sola tiene un efecto muy limitado en ratones y otras especies, incluso a dosis elevadas no suele
alcanzar una profundidad anestsica adecuada. Nunca debe usarse sola como anestsico para cirugas
mayores.
A diferencia de otros anestsicos, mantiene reflejos como la deglucin pero produce un grado variable de
rigidez muscular, que puede contrarrestarse si se combina con tranquilizantes. Otro efecto caracterstico de
este frmaco es que induce la produccin de secreciones. En ratn y otros animales de laboratorio, es muy
frecuente el uso de combinaciones de ketamina con acepromazina, diazepam, medetomidina midazolam o
xilazina. La combinacin de frmacos tranquilizantes no slo disminuye los efectos adversos de la ketamina
sino que permiten reducir la dosis empleada y proporcionar una analgesia adecuada.
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Modo de preparacin: para obtener un volumen final de anestesia de 2 ml, mezclar 0.4 ml de
ketamina (Vetanarkol, Knig, 50 mg/ml), 0.1 ml de xilacina (Seton, Calier, 20 mg/ml) y 1.5 ml de
agua agua bidestilada apirgena estril. Usar 0.1 ml por cada 10 g de peso del animal. Conservar
esta mezcla a 4C, protegida de la luz, no ms de 1 mes despus de preparado.
Modo de administracin: pesar el animal y cargar la jeringa segn la relacin 0.1 ml/ 10 g de peso,
usando una aguja 25-27 G. Sujetar el animal e inyectar la solucin por va IP (ver Seccin 1, inciso 6).
La administracin por va subcutnea no es recomendable porque produce una demora en el
proceso.
A tener en cuenta
La administracin de anestesia produce:
Falta de reflejo palpebral, por lo que es necesario colocar un ungento oftalmolgico en los ojos para
evitar la desecacin y posible ceguera.
Disminucin de la temperatura corporal, lo que en los ratones esta muy acentuado. Es importante
colocar los animales sobre mantas trmicas y recubrirlos con toallas de papel luego de finalizado el
procedimiento para favorecer su recuperacin, y si es posible tambin durante el mismo.
Anestesia insuficiente?
Debe constatarse en primera instancia falta absoluta de reflejo palpebral. En caso de persistir o
comprobarse una relajacin muscular pobre, movimientos en respuesta a la estimulacin quirrgica y/o
vocalizaciones se deber realizar una redosificacin (ver ms arriba).
Monitoreo de los animales
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Enfermedad o condicin que produce dolor severo o sufrimiento, ej. fracturas, auto-mutilacin,
postura o movimientos anormales, heridas abiertas o lceras, vocalizacin anormal, que no son
aliviados con sedantes o analgsicos.
Disminucin del acicalamiento y apariencia anormal observados en un perodo de tiempo extenso,
ej. pelo hirsuto, alopecia extensa, diarrea prolongada, pelo manchado de orina, prolapso rectal,
extremidades hinchadas, parlisis, u otras anomalas neurolgicas (convulsiones, posicin anormal
de la cabeza, movimientos en crculo).
Condiciones respiratorias severas o continuas, ej. tos, estornudos, descarga nasal con sangre, tasa
respiratoria aumentada, respiracin trabajosa.
Sangrado incontrolable.
Evidencia de infecciones microbianas u otras enfermedades que interfieren con el protocolo
experimental o causan cualquiera de las condiciones anteriores.
Las fichas de puntaje clnico (scoring sheets) pueden ser de utilidad para evaluar la condicin del
animal y determinar el punto final apropiado.
4. Protenas de fase aguda:
El aumento de los niveles sricos de citoquinas y protenas de fase aguda (PFAs) se produce de
manera temprana en respuesta a una infeccin, antes de que se observen cambios etolgicos y/o
fisiolgicos. En animales sanos, las PFAs se encuentran en valores muy bajos o indetectables en el
plasma, las cuales aumentan rpidamente despus de su activacin. En ratones, la citoquina ms
abundante es la amielodie srica A. De todas maneras, se requieren de ms estudios para que la
medida de PFAs se emplee como mtodo prctico para la prediccin de una enfermedad.
En el Anexo 2, se encuentra la descripcin de los parmetros empleados para definir el punto final en reas
especficas de investigacin.
Observacin de los animales. Para poder identificar el punto final en un animal y decidir su eutanasia es
imprescindible la observacin del mismo. Cuando un animal se encuentra en estado potencialmente crtico
durante un experimento, la frecuencia de observacin debe aumentar.
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animal presente las condiciones definidas como criterio de punto final para el estudio en cuestin
ser retirado del bioterio y se proceder a su eutanasia.
3. En conjunto con el usuario determinar la finalizacin temprana de los experimentos en caso que:
(i) Se hayan cumplido los objetivos del estudio antes de lo pensado
(ii) Sea evidente que los objetivos no se cumplirn debido a una condicin deteriorada de los animales
debido a la experimentacin (por ej. falla de un rgano) o la aparicin de condiciones de salud no
relacionadas (infecciones no inducidas) o un diseo experimental errneo, etc.
EUTANASIA
Los animales de experimentacin se sacrifican por diversos motivos: al final de un experimento; si
un experimento en curso provoca efectos indeseados sobre el animal que pueden interferir
disminuyendo el grado de bienestar del individuo, afectando su integridad y posible validez del
ensayo; para obtener sangre u otros tejidos con un fin cientfico; cuando los niveles de dolor,
angustia y sufrimiento sobrepasan el nivel previsto; cuando ya no sean aptos para la cra; animales
no utilizados o aquellos cuyas caractersticas no sean adecuadas (por ej tipo de sexo).
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Los animales recin nacidos son ms resistentes a la hipoxia, por ello hay que utilizar
mtodos fsicos.
A concentraciones superiores a 60% el dixido de carbono acta como anestsico y produce rpida
prdida de conciencia. Es muy eficaz para la eutanasia de animales pequeos. Para ratones se
recomienda colocarlos en una atmsfera 70 % CO2, ya que pierden conciencia rpidamente
debido al efecto narctico en el cerebro. En animales conscientes, el 100 % de CO2 puede causar
disnea y angustia. En cambio en cobayos se recomienda el uso de 100 % de CO2.
Los neonatos son particularmente tolerantes al CO2 por lo que no es posible emplear esta
metodologa de eutanasia en animales de hasta 10 das de edad, debindose proceder a utilizar un
mtodo fsico.
Inconvenientes: el CO2 estimula el centro respiratorio, lo que puede causar estrs y ansiedad en el
animal; este gas puede formar cido carbnico al contactar las membranas mucosas nasales lo que
puede producir un efecto de hormigueo o picazn e irritacin moderada.
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Protocolo empleado en la UATE: la eutanasia mediante CO2 se realiza en el lavadero del bioterio.
Mantener los animales en su caja para evitar estrs (mximo 10 ratones). Si esto no es posible,
colocarlos en la caja dispuesta en el lugar para tal fin. Colocar una rejilla y la tapa conectada al
tanque de CO2, manteniendo un espacio abierto suficiente que permita el escape de la presin del
gas al exterior. Inicialmente permitir la salida de un volumen mnimo de gas, de esta manera se
induce la prdida de conciencia en los animales, se reduce el estrs causado por la disnea y el ruido
de la salida del gas. Una vez que los animales estn inconscientes permitir la salida de un mayor
volumen de CO2 a la caja. Cerrar la vlvula del tanque cuando se observe que todos los animales
presentan ausencia de reflejos, y cese de respiracin y latido cardaco. Dejar los animales en
observacin al menos 10 minutos para certificar su deceso antes de proceder al descarte o en su
defecto practicar un mtodo fsico adicional de eutanasia. Descartar los animales segn los
procedimientos de rutina para el material biolgico en la unidad. Es necesario que el operario
permanezca en la sala de la eutanasia durante todo el procedimiento.
2.
Dislocacin cervical
Este mtodo es muy eficaz pero requiere prctica del operador. Se debe asegurar que se produce
una separacin total; cuando se realiza correctamente produce graves lesiones al tronco enceflico
y una inconsciencia inmediata y muerte. En cobayos es ms difcil que en ratones debido a sus
cuellos cortos, con msculos ms fuertes. En ratones y ratas se sita el pulgar e ndice a cada lado
del cuello junto a la base del crneo, y en ese momento con la otra mano se tira rpidamente de la
base de la cola o de los miembros posteriores, produciendo la separacin de las vrtebras
cervicales y el crneo. Corroborar la muerte del animal como se mencion anteriormente.
3.
Decapitacin
La falta inmediata de riego sanguneo al cerebro y la anoxia subsiguiente se cree que dejan la
cabeza rpidamente insensible. En la UATE se emplea la decapitacin nicamente para la eutanasia
de neonatos. Se realiza empleando tijeras afiladas que produzcan un corte inmediato.
Mtodos NO ACEPTABLES para la eutanasia de roedores
Bajo ninguna circunstancia se sacrificarn roedores mediante hipotermia (por ej. en congelador),
gas nitrgeno genera hipoxia pero tarda mucho en conseguir la inconsciencia; asfixia o
ahogamiento; ter o cloroformo son extremadamente
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ANEXO SECCION 2
2.1. Analgesia y anestesia
TABLA 1 - Analgsicos de uso comn en ratn
Droga
Buprenorfina*
Dosis
Duracin
6-12 hs
Butorfanol*
15 mg/kg SC
Morfina*
2 -5 mg/kg SC
Flunixin
Meloxicam
Carprofeno
4 hs
1-4 hs
2.5 mg/kg SC
12-24 hs
12-24 hs
5 mg/kg SC/IP
24 hs
Comentarios
Para corta duracin requiere una cmara
Para mantenimiento requiere
vaporizador calibrado
Costoso
Requiere vaporizador calibrado
Barato
Uso no autorizado
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Dosis y va
Duracin
Comentarios
Barbitricos sedantes/hipnticos
Tiopental sdico
Pentobarbital
25-50mg/kg IV
50 mg/kg IP
30-40mg/kg IP
sedacin
40-60mg/kg IP
5-10 min
Depresin respiratoria e
hipotermia. Analgesia pobre
30 min
Depresin respiratoria
Analgesia pobre
anestesia
100mg/kg ket +
5mg/kg diaz. IP
44mg/kg ket +
0.75mg/kg ace. IP
100mg/kg ket +
5mg/kg mid. IP
20-30 min
20-30 min
20-30 min
Sedacin/inmobilizacin
Analgesia adecuada
Solo sedacin
Analgesia adecuada
Inmobilizacin
Analgesia adecuada
Otros
Hidrato de cloral
60-90 mg/kg IP
No probada
Procedimientos terminales
Propofol
12-26mg/kg IV
5-7 min
Analgsico pobre
2. Investigacin en cncer
Puntos finales recomendados:
Cuando la masa tumoral alcanza un tamao tal que interfiere con funciones corporales normales o
produce dolor debido a su localizacin (tumores slidos)
Prdida de peso mayor a 20% comparado con animales control de igual edad y cepa
Ulceracin/infeccin en la zona del tumor
Trauma auto-inducido
El tamao del tumor no puede exceder el 5% del peso normal del animal para un pasaje tumoral rutinario o
10% para animales en experimentos teraputicos (10% representa un tumor subcutneo de flanco con un
dimetro de 17 mm en un ratn de 25g o 35 mm en una rata de 250g).
3. Estudios toxicolgicos
i. Toxicidad aguda
En la mayora de los estudios toxicolgicos, el investigador esta interesado en las interacciones primarias o
secundarias entre el compuesto y las clulas y tejidos del organismo y no en los efectos terciarios
(deshidratacin, anorexia, etc.) los cuales pueden causar la muerte del animal. Por ello es importante
recolectar datos en las primeras etapas de los efectos clnicos; datos recolectados de un animal moribundo o
cualquier animal sin observar representan informacin perdida.
Para el diseo experimental (lo que incluye la determinacin de puntos finales) es sumamente importante
contar con previa informacin sobre el compuesto a emplear respecto a los efectos que puede producir y el
tiempo que lleva en aparecer, y si estos no estn disponibles entonces es necesario buscar informacin
sobre compuestos de la misma clase o de estructuras qumicas similares.
El uso de experimentos piloto para determinar los puntos finales es de especial valor cuando se emplean
compuestos con efectos desconocidos. Adems, es necesario realizar estudios sobre rangos de dosis, lo cual
permite definir potenciales rganos blanco, efectos adversos y reducir el nmero de animales. Actualmente
el uso de la dosis letal 50 (LD50) no esta recomendada y esto ha sido avalado por las entidades que regulan la
produccin de compuestos farmacuticos (OECD, 1987; IRAC, 1993).
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Normal
Normal
Falta de acicalamiento
Normal
Auto-mutilacin,
vocalizaciones
iii. Comportamiento
inmovilidad
total,
Puntaje de punto final: cuando se alcanza un puntaje total 3, se proceder a la eutanasia del
animal.
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REFERENCIAS SECCION 2
Anestesia y analgesia
Ciencia y Tecnologa del Animal de Laboratorio. Ziga, JM; Orellana, JM; Tur, JA. Volumen 2. Ed.
Univ. de Alcal, SECAL, 2008.
Curso CHEA, Uruguay Uso y manejo de animales de laboratorio.
Depresores del sistema nervioso central y anestesia en roedores de experimentacin. Molina, AM;
Moyano, MR; Pea, FJ; Lora, AJ; Moreno, S; Serrano, JM. Dpto. Farmacologa, Toxicologa, y
Medicina legal y forense. Facultad de Veterinaria. Univ. de Crdoba, Espaa. RECVET. Vol. III, N 9,
2008.
Laboratory Animal Medicine and Science - Series II. Laboratory Animals: Rodent Anesthesia &
Analgesia. V-9054. Murray, KA; Pekow, C; Borkowski, GL, 2000.
Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, National Research Council, National
Academies Press, 2009.
Standard Operative Procedures: Mouse Anesthesia and Analgesia Guidelines, Univ. of Michigan,
USA, 2007.
Eutanasia
Recomendaciones para la eutanasia de los animales de experimentacin: Parte 1 y 2. Close, B;
Banister, K; Baumans, V; Bernoth, EM; Bromage, N; Bunyan, J; Erhardt, W; Flecknell, P; Gregory, N;
Hackbarth, H; Morton D; Warwick, C, 1995. Elaborado para la Comisin Europea.
Puntos finales
CCAC on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and
testing, 1998.
Guidelines and policy for determination of humane endpoints for animals used in research. Univ. of
Virginia, 2007.
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