Centro de Bachillerato Tecnolgico Industrial y de Servicios No.

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Mdulo II: Ejecuta tcnicas de anlisis cualitativos qumicos y microbiolgicos con

base en las normas.

Submdulo: 3: ejecuta mtodos de identificacin de microorganismos en base a

normas.
Practica: preparacin y medios de cultivo.
Integrantes:
Itzel Guadalupe Cano Snchez, Juan Carlos Duarte Prez. Alexis Quiroz Frausto,
Kareni Andrea Almaraz Martnez, Karen Leticia De la torre Arellano, Baltazar
Bonilla Borrego, Leslie Alessandra Atilano Cruz, Jennifer Meliza Carrasco Salcido
Selkhet Ailed Contreras Mendoza Jos Mario Castaeda Serrano.
Asesor: Ing. Jessica Alicia Acosta Bezada

Fundamento
El medio de cultivo contribuye con una gran cantidad de nutrientes que son
indispensables para el crecimiento de microorganismos.
La composicin de estos depende de que se cultivara en ellos ya que todos los
microorganismos
tienen
necesidades
nutrimentales
diferentes.
Hay
microorganismos que no necesitan tanto cuidado como otros que requieren
cuidados especiales ya sean con vitaminas, sueros nutrimentales o sangre para
que tengan un crecimiento ptimo ya adecuado.

Introduccin
Tincin de Gram : El cristal violeta
(colorante catinico) penetra en todas las
Un medio de cultivo es un conjunto declulas bacterianas (tanto gram positivas
nutrientes especficos, estos ayudan a un como gram negativas) a travs de la
crecimiento
ptimo
de
lospared bacteriana. El lugol es un
microorganismos que se analizarn para compuesto formado por I2 (yodo) en
determinar que bacteria por medio de equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl
(Siulterio), los cuales estn presente
cultivo se desarroll.
para solubilizar el yodo, y actan de
Los diversos metabolismos que existenmordiente, haciendo que el cristal violeta
entre los microorganismos dan
se fije con mayor intensidad a la pared
como efecto una gran cantidad dede la clula bacteriana. El I2 entra en las
medios de cultivo para su crecimiento, no clulas y forma un complejo insoluble en
existe un medio de cultivo estndar parasolucin acuosa con el cristal violeta..
que todos crezcan en este, ni siquiera
refirindose a bacterias que tiene
La mezcla de alcohol-acetona que se
exclusividad de agar.

agrega,
sirve
para
realizar
la
decoloracin, ya que en la misma es
soluble el complejo I2/cristal violeta. Los Algunos microorganismos retienen el
organismos gram positivos no se colorante violeta, an despus de
decoloran, mientras que los gramtratarlos con un decolorante, y el color no
se modifica al aadir ste; otros pierden
negativos s lo hacen.
con facilidad el primer tinte, y toman el
segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de gram positivos, y los que
Para poner de manifiesto las clulaspierden la primera coloracin y retienen
gram negativas se utiliza una coloracinla segunda, de gram negativos.
de contraste. Habitualmente es unBasndonos pues, en la reaccin gram,
colorante de color rojo, como la safranina podemos
clasificar
a
los
o la fucsina. Despus de la coloracin demicroorganismos en uno de los dos
contraste las clulas gram negativas son grupos. Los colorantes de p-rosanilina
rojas, mientras que las gram positivasson los que mejores resultados dan en la
permanecen violetas.
coloracin gram. Los representantes ms
usados de este grupo son violeta de
metilo y violeta cristal o de genciana. En
La safranina puede o no utilizarse, no es realidad, violeta de metilo es el nombre
crucial para la tcnica. Sirve para haceratribuido al compuesto tetrametil-puna tincin de contraste que pone de rosanilina.
manifiesto las bacterias gram negativas.
Al trmino del protocolo, las gram
positivas se vern azul-violceas y lasEl matiz de color de la p-rosanilina se
gram negativas, se vern rosas (si no se intensifica al aumentar el nmero de
hizo la tincin de contraste) o rojas (si se grupos metilo en la molcula; por
us, por ejemplo, safranina).
consiguiente, de los tres grupos, el tono
ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina
(violeta cristal), y el tinte ms ligero, la
Esta importante coloracin diferencial fuetetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo).
descubierta por Hans Christian Gram en Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R,
1884. En este mtodo de tincin, la B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de
extensin bacteriana se cubre congrupos metilo contenidos. La letra R
solucin de uno de los colorantes de indica matices rojos, y la letra B, tonos
violeta de metilo, que se deja actuar azules. El violeta de cristal contiene seis
durante un lapso determinado. Se grupos metilo, y se considera como el
escurre luego el exceso de violeta demejor colorante primario para teir por el
metilo y se aade luego una solucin de mtodo de Gram.
yodo, que se deja durante el mismo
tiempo que la anterior; despus se lava
el portaobjetos con alcohol hasta que La facultad de las clulas para tomar la
ste no arrastre ms colorante. Sigue acoloracin gram no es propia de toda
tal tratamiento una coloracin desustancia viviente, sino que se limita casi
contraste, como safranina, fucsinaen absoluto a hongos y bacterias. As
fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin vemos que las clulas de plantas y
B o hasta inclusive verde de malaquita. animales superiores no conservan la

primera coloracin; los mohos se tiennutrient agar, 12 bright green bile

con cierta irregularidad; los grnulos de previously inoculated with beef, chicken,
micelios propenden retener el colorante.cold meats and water, with help of an
La reaccin de Gram no es infalible ni platinum loop for the preparation of the
constante; puede variar con el tiempo delcrops It was used a security triangle in its
cultivo y el pH del medio, y quiz por position with three Bunsen burners, this
otras causas.
for the zone is sterile and there werent
contamination. Later of that these
returned of the incubator for proceed to
submit to do the colony morphology. At
Resumen
the end we proceeded to submit at the
En esta prctica lo que se hizo fueGram stain for identify through colors
preparar una serio de cultivos, como lo what type of bacterium is and why is it
fue el agar nutritivo, el VBB y eldeveloped in this agar, have to discard
McConkey estos se distribuyeron por that the crops help us study the
equipos para hacer los agares en total se microorganisms and by that have to have
llevaron a incubar 36 agares nutritivos, care in its manipulation and at moment to
12 VBB y 12 McConkey estosthrow off these.
previamente inoculados con carne de res
, pollo , carnes fras y agua potable, con
ayuda de una asa de platino para la
preparacin de los cultivos se utiliz un
tringulo de seguridad puesto con tres
mecheros de bunsen ,esto para que la
zona estuviera estril y no hubiera Materiales
contaminacin. Luego de ello estas se
3 mangueras de ltex
regresaron a la incubadora para
proceder hacer la morfologa de las
Trpoide metlico
colonias. Al finalizar se procedi a
Guante de asbesto
someterlas a la tincin de Gram para
identificar por medio de los colores que
2 matraces Erlenmeyer de 500ml
tipo de bacteria era y porque se
desarrollaba en ese agar, hay que
Vaso de precipitado de 500ml
destacar que los medios de cultivo nos
ayudan a estudiar los microorganismos y
Asa de platino
por lo que hay que tener cuidado en su
Balanza
manipulacin y al momento de
deshacerse de estas.
Vidrio de reloj
Summary
Esptula
In this practice what it was done was
3 Mecheros bussen
prepare a crops series, how it was the
nutrient agar, the bright green bile and
Porta objetos
the McConkey, these are distributed by
teams to do the agares and they took to
Cubre objetos
incubate 36 nutrient agares, they are 12

Microscopio

Incubadora

Cajas Petri

Auto clave

4 Mecheros Fisher

No permitir que la presin del auto

clave supere las 15 lbs.

Dejar las cajas a esta temperatura

durante 10 a 15 minutos

Sacar las cajas Petri y colocarlas en

el refrigerador

Preparar dos matraces: el primero

con 400ml de agua y 9.2 gramos de
agar nutritivo el segundo con 300ml
de agua y 8.05 gramos de agar
nutritivo.

Colocarlos en un trpode metlico y

ponerlos a la llama de un mechero
bunsen, mantenerlos en constante
agitacin hacia un solo sentido para
evitar que estos comienzan a
burbujear

Cuando el agar est terminado se

mete a la auto clave para su
esterilizacin previamente con sus
respectivos capuchones colocados

Tener las 36 cajas Petri listar para

verter el agar en ellas

Una vez extrado el agar del

autoclave, colocar el tringulo de
seguridad para verter 20ml de agar
nutritivo en cada caja, nuca sacar las
cajas del triangul de seguridad para
evitar que estas se contaminen al
igual que el agar en los matraces

Reactivos y muestras

Carne de res

Carne de pollo

H2O

Agar nutritivo

Agar VBB ( verde bilis brllate)

Agar McConkey

Cristal violeta

Fucsina

Alcohcol-acetona

Aceite inmersin

Lugol

Cuando las cajas tengan el agar

esperar a que estas se cuajen
para proceder a meterlas al
congelador

Preparar las muestras para

proceder a inocular los agares.

Moler 2gr de carne de res, de

pollo y de carnes fras en este
caso winnie y agua

Procedimiento

Se prepara el auto clave, se llena con

un litro de agua y se le introducen 10
cajas Petri previamente envueltas en
papel estraza
Montar el autoclave en su base y
conectar 4 mecheros Fisher

Con el asa de platino tomar

muestra e inocular las cajas de
agar nutritivo individualmente

una gota de aceite de inmersin y

ponerle el cubre objetos

Al terminar la tincin de Gram

Nota: cada vez que se utilice la

asa de platino se tiene que
esterilizar en la punta de la llama
del mechero se sabe que esta
esterilizada cuando el color es rojo
intenso.

En los dos VBB dividirlos a la

mitad de distribuir las muestras
del 1-4 hacer lo mimos con los
dos agares McConkey

Al terminar de inocular meter las

cajas en la incubadora

Observar el crecimiento de estar

despus e 24 horas en la
incubadora, observar las cajas y
hacer la morfologa de la coloniasResultados:
dependiendo de cuantas colonias
En cada agar se pudieron encontrar
se hayan desarrollado en cada
entre 1 o 2 colonias al hacer la tincin
caja, volver a meter las cajas en la
gram y analizarla en el microscopio nos
incubadora
pudimos percatar que la mayora de
eran
gram
positivas
que
Sacar las cajas de la incubadora, estas
lavar los porta objetos y los cubre permanecieron de color violeta y las de
gram negativas color rojo como se puede
objetos
observar en las imgenes.
Con el asa de platino tomar una
muestra de las colonias todos
estos procedimientos se hacen en
el tringulo de seguridad, cuando
la muestra este en la asa de
dicromo untarlo en el porta objetos
( este procedimiento se har con
todas la colonias)
Gram
Cuando se tengas todas las
negativa
muestras se les echara una gota
de agua para que estas se
solidifique y dejar que seque,
verter cristal violeta durante 1min
y se remover con agua al igual
que lugol durante 1min y se
remover con agua, 30seg con
alcohol-acetona es de suma
instancia que este no dure ms ya
Gram
que puede reventar las clulas al
Positiva
igual que los dems lavarlo con
agua y 30seg con safranina
removerlo con agua y agregarle

clnicas. Se utiliza para poder referirse a

la morfologa celular bacteriana, para
poder realizar una primera aproximacin
a
la
diferenciacin
bacteriana,
considerndose bacterias gran positivas
Conclusiones:
a las que se visualizan de color morado,
Carrasco Salcido Jennifer Meliza
y bacterias gran negativas a las que se
En esta prctica lo que pude observar y visualizan de color rosa, rojo o grosella.
aprender fue como se prepara cada uno
de los tipos y medios de cultivo, las tipos Concluimos que las muestras que
de tincin que hay y para qu sirve cada realizamos contenan bacterias gran
una de ellas, como se tiene que inocular negativas, ya que estas tenan un color
cada uno de los agares y el porqu, el
rosa. Observamos tambin como en las
metabolismo de las bacterias que tipos
de bacterias son las que hay, pudecolonias haba diferencias entre ellas. El
percatarme para qu sirve un tringuloprocedimiento para realizar la tincin de
de seguridad y como se utiliza elGram fue un poco sencillo pero tenia que
microscopio pude observar tambin el ser rpido ya que al poner cada muestra
crecimiento de las colonias y entender un de la tincin tenia su tiempo limite.
poco ms la vida de las bacterias.
Duarte Perez Juan Carlos
Aprendimos uno de los sistemas ms
importantes para la identificacin de
Al hacer esta prctica aprendimos a
microorganismos el cual es observar su
identificar el tipo de bacterias, a manejar
adecuadamente
los
organismoscrecimiento en sustancias alimenticias
microbianos desde su cultivo hasta su preparadas en el laboratorio. El material
anlisis que viene siendo la preparacinen el que crecen los microorganismos es
del agar, la inoculacin de las bacterias el Medio de Cultivo y el crecimiento de
de una muestra designada, la tincin,los microorganismos es el Cultivo.
observacin
al
microscopio,
suAprendimos que para que las bacterias
identificacin ya sea gram positiva o
crezcan adecuadamente en un medio de
gram negativa, el numero de colonias
encontradas en el cultivo, ademscultivo debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura,
aprendimos a enfocar el microscopio.
grado de humedad y presin de oxgeno
Almaraz Martinez Kareni Andrea
adecuadas. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de
En esta prctica pudimos observar que lacrecimiento necesarios y debe estar
de
todo
microorganismo
tincin de Gram es un tipo de tincin exento
diferencial que se emplea mayormente contaminante. Tambin aprendimos que
en bacteriologa para la visualizacin dela mayora de las bacterias patgenas
bacterias, sobre todo en muestrasrequieren nutrientes complejos similares
en composicin del cuerpo humano. Por
De la Torre Arellano Karen Leticia

eso, la base de muchos medios decomo la recoleccin de muestras y los

cultivo es carne. Aprendimos tambin sembrados para que las bacterias se
que el agar es un elemento muy
desarrollen bien y podamos identificar las
empleado para la preparacin de medios
de cultivo, en est prctica, aun que colonias. Tambin logre aprender ms
tuvimos algunos errores, aprendimossobre la esterilizacin de materiales de
como no volver a cometerlos y poder
laboratorio por medio de la Autoclave y
mejorar y realizar medios de cultivos ms
sobre el correcto manejo de sta para
completos.
prevenir lecciones o accidentes.

Quiroz Frausto Alexis

Puedo concluir que durante las diversasAtilano Cruz Leslie Alessandra

investigaciones y usos

de diversas

tcnicas relacionadas con los medios de

cultivo y el anlisis de las bacterias
resultantes de estos, logre aprender de
manera

ms eficaz estos procesos,

ponindolos en prctica en el laboratorio

de microbiologa. Logre aprender ms
respecto de cmo esterilizar materiales
de laboratorio, eliminacin de bacterias
de los diversos medios de cultivo,
preparar agares para el cultivo, los
diversos tipos de agares y su respectivo
funcionamiento as como entender que
estos son de gran importancia para el
conocimiento\identificacin de diversas
bacterias en

diversos alimentos o

lugares donde sea posible que crezcan

Llegu a la conclusin de que es de

importancia

saber

que

manejar

todos los

procesos e

investigaciones estn relacionadas con

esta prctica, tambin aprend todas
estas tcnicas de manera eficiente y
clara ponindolas en prctica en el
laboratorio de microbiologa. Reforc los
conocimientos bsicos que tena sobre la
esterilizacin de materiales, medios de
cultivo, como tambin a preparar agares
diferentes tipos de agares, y entender
para que y porque se utilizan cada uno
de ellos, como tambin que estos son de
gran importancia para la identificacin de
diversas bacterias que viven en nuestro
alrededor, puesto que son de suma
importancia
progreso

para

nuestra

bioqumico,

desconocen

Castaeda Serrano Jos Mario

suma

Conclu

gran

ya

salud
que

cantidad

y
se
de

microorganismos habitantes en nuestro

planeta.

correctamente los medios de cultivo as Cano Sanchez Itzel Guadalupe

Esta prctica fue muy importante ya que el

complejo
cristal
violeta-lugol
gracias a ella tuvimos la oportunidad de conserva el colorante bsico aun
aprender a realizar distintos agares, el despus del decolorante, en cambio las
cmo realizar los cultivos en ellas de una bacterias Gram negativas pierden el
forma adecuada, adems de conocer lacolorante bsico debido a que el alcohol
toma de las muestras al momento dedisuelve el contenido lipdico de la pared
realizar las tinciones y realizar estas celular, por lo cual toma un color ms
ltimas.
rojizo al microscopio.
Tambin pudimos ver lo importante queContreras Mendoza Selkhet Ailed
es la utilizacin de un tringulo de
seguridad ya que si no se tiene uno se Durante la prctica hemos aprendido a
preparar medios de cultivo e inocular.
puede contaminar el cultivo y se podra
tener el patgeno errneo en desarrollo. En esta prctica elaboramos distintos
Al momento de realizar el sembrado medios de cultivo, McConkey, BVB y
tuvimos la oportunidad de aprender a agar nutritivo, despus sembramos en
cada medios varios microorganismos y
utilizar apropiadamente el asa dedejamos incubar para ver si exista
dicromo y no quemar ni romper loscrecimiento.
agares que utilizamos, tambin cuando Aprendimos como preparar agares y
tomamos la muestra de la coloniapara que se requeran cada uno de
tuvimos la oportunidad de hacerlo de una estos, como para la identificacin de
forma
adecuada,
gracias
a
lasbacterias.
Tambin se aprendi a esterilizar el
indicaciones que nos ofreci la ingeniera.
material en la autoclave, y el
Cuando procedimos a realizar lasprocedimiento de ello, para un correcto
manejo, y no sufrir accidentes.
tinciones, en este caso la Tincin de
Gram tuvimos que hacer el proceso Bonilla Borrego Baltazar
contra reloj ya que si no la tincin podra
fallar y hubiramos tenido una mala
tincin, una vez que ya estuvo terminada Con la ayuda de los conocimientos
otorgados al leer las tareas que la
la tincin tuvimos la oportunidad de
maestra nos encarga es mas fcil
observar si las bacterias eran Gram identificar las diferentes bacterias que
positivas o Gram negativas gracias a la crecen en estos agares pudimos
coloracin que tomaban gracias a que en reafirmar la esterilizacin de los
el caso de las bacterias Gram positivas materiales y la gran importancia de hacer
este paso para posteriormente cultivar.

Anexo 1

Nutritivo
Muestra 1

Color
T. luz
Viscosidad
Tamao
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
# de colonias

Colonia 1
Beige
No
No

Colonia 2
Naranja
No
Si
Mediano
Irregular
Ondulado
Convexa
Lisa
27

Muestra 2
Color
T. luz
Viscosidad
Tama6
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
# de colonias

Colonia 1
Beige
No
No
Mediano
Irregular
Ondulado
Plana
Lisa
3

Colonia 2
Blanco
Si
No
Pequeo
Circular
Entero
Plano
Lisa
1

Muestra 3
Color
T. luz
Viscosidad
Tamao
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
# de colonias

Colonia 1
Beige
Si
No

Colonia 2
Blanco
No
No
Mediana
Irregular
Ondulado
Convexa
Lisa
50

Muestra 4
Color
T. luz
Viscosidad
Tamao
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
# de colonias

Colonia 1
Blanco
No
No
Pequea
Circular
Entera
Plana
Lisa
1