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METODO DE SANGER

En 1975, Frederick Sanger desarroll el mtodo de secuenciacin de ADN conocido


como mtodo de Sanger. Dos aos ms tarde emple esta tcnica para secuenciar el
genoma del bacterifago Phi-X174, el primer cido nucleico secuenciado totalmente en la
historia. Realiz este trabajo manualmente, sin ayuda de ningn automatismo. Este trabajo fue
base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el Proyecto Genoma Humano, y por l
se le concedi su segundo Premio Nobel en 1980, que comparti con Walter Gilbert.
El mtodo de secuenciacin por dideoxinucletidos, mejor conocido como el mtodo Sanger
se basa en el proceso biolgico de la replicacin del DNA. El mtodo de secuenciacin ideado
por Sanger est basado en el empleo de dideoxinucletidos que carecen del grupo
hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a una
cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongndose. Esto es as ya
que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3 OH para aadir el siguiente nucletido y
el dideoxinucletido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
El mtodo comienza una vez se asla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA
se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciacin. En la secuenciacin se
utiliza un cebador o primer que se encarga de suministrar el terminal 3OH que necesita
la DNA polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reaccin, cada uno
con el DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el
primer y con los cuatro nucletidos trifosfatados.
A cada tubo se le aade una pequea proporcin de un dideoxinucletido trifosfato; un tubo
con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de
estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en el
lugar en el que se incorpor el dideoxinucletido correspondiente aadido al tubo. Los
productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequea cantidad de uno de los
cuatro dideoxinucletidos, son cargados en un gel de agarosa y sometidos a electroforesis.
As, obtendremos un patrn de bandas en orden, del cual es posible deducir la secuencia del
ADN introducido.

METODO DE MAXAM-GILBERT
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN
basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas 8 Aunque
Maxam y Gilber publicaron su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental

artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de secuenciacin "ms-menos", 9 10 la


secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar
ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo de
lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y
mejora del mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de
Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de
productos qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del mtodo
de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo de Maxam y Gilbert no
se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar. En resumen, el mtodo
requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que
se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de
uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T).
Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina
(C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a
partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los
fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando
los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra.
El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que
vara entre un 6 y un 20 %. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se
hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas
oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las
cuales se puede inferir la secuencia.
Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio
de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos
nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene
aplicaciones importantes.

SECUENCIACION POR HIBRIDACIN


La tcnica de hibridacin in situ est basada en la capacidad que poseen los cidos
nucleicos para hibridarse entre s, es decir, la existencia de determinada secuencia
deADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia. Su utilidad reside en la
capacidad de poder demostrar mediante la utilizacin de una sonda (formada por una
secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un istopo radiactivo, la presencia de
determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar. Lo que se
produce

mediante

la

utilizacin

de

esta

tcnica

es:

La

hibridacin

(unin),

de

la sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y

posteriormente mediante tcnicas especficas (autoradiografa o inmunohistoqumica), la


transformacin de la secuencia en algo visible. Esta tcnica es muy til, por ejemplo, para
identificar la secuencia de nucletidos, en determinadas enfermedades de origen gentico.

SECUENCIACION POR ION TORRENT


La secuenciacin por Ion Torrent es un mtodo de secuenciacin de ADN basado en la
deteccin de protones liberados durante la polimerizacin del ADN. Por lo tanto, este mtodo
se gua a travs de las polimerizaciones que se llevan a cabo en las cadenas simples de ADN
en estudio. Este tipo de secuenciacin difiere de los dems tipos en que no usan nucletidos
modificados y que la deteccin no se realiza va ptica, sino por deteccin de pH. La
incorporacin de desoxirribonucletidos trifosforilados (dNTP) en el ADN en replicacin implica
la generacin de un enlace covalente y la liberacin de un pirofosfato y un protn. El dNTP se
incorpora exclusivamente en casos de complementariedad con el nucletido de la cadena
molde. Este principio es en el que se basa esta tcnica de secuenciacin. En primer lugar, se
aisla el ADN y se corta en fragmentos, los cuales se unen a pequeas bolas
denominadas bead. Cada una de ellas, unidas con millones de fragmentos de ADN, entran en
los micropocillos de un microchip. A continuacin, se baa el micro-chip con una solucin de
uno de los nucletidos. Si el nucletido se incorpora en la cadena de ADN, se libera un protn,
el cual es detectado por la base del pocillo, la cual acta como un mini-pHmetro (sensor
inico ISFET). Gracias a que cada lmina del microchip es semiconductora, se pueden
detectar estos pequeos cambio inicos. 2 Este proceso se repite cada 15 segundos con una
nueva solucin de cada nucletido.
Las seales generadas en los pocillos se transmiten directamente a un ordenador, sin
necesidad de ser procesadas durante la transferencia. La exactitud que ha alcanzado el
secuenciador en febrero de 2011 era de un 99.6% basada en lecturas de 50 bases, con
100Mb por cada ronda. La longitud de lectura en la misma fecha era de 100 pb. La exactitud
para las repeticiones de homopolmeros de 5 repeticiones de longitud era de 98%. Se debe
tener en cuenta que dichas cifras no se han verificado independientemente fuera de la
empresa Ion Torrent. La principal ventaja de este proceso es la velocidad de secuenciacin,
as como los bajos costes de operacin. Esto ha sido posible gracias a que no se utilizan
nucletidos modificados y a que la seal no es ptica. Dado que el sistema registra las
incorporaciones de nucletidos mediadas por polimerasa, la secuenciacin ocurre a tiempo
real. De hecho, la tasa de secuenciacin est limitada por el la velocidad en que pasan los
nucletidos sustrato. Ion Torrent afirma que cada medida tarda 4 segundos y cada ronda de

secuenciacin aproximadamente una hora, tiempo en el que se secuencia entre 100-200


nucletidos. Asimismo, cuenta con una escalabilidad enorme, pues simplemente se basa en
reacciones que ocurren en la naturaleza pero llevadas a cabo en microchips semiconductores.
Adems, el precio es considerablemente bajo, siendo de unos 50,000 USD hacerse con un
equipo y de alrededor de 1,000 USD realizar una ronde de secuenciacin. No obstante,
existen algunas limitaciones. Una de ellas son las repeticiones de bases. Si hay ms de una
base idntica seguida en la cadena molde, se aadirn ms dNTPs en el mismo momento,
generando un cambio de pH ms pronunciado, lo cual, actualmente, no se detecta con mucha
precisin. Otra limitacin sera la longitud de los fragmentos de ADN que se estudian. stos no
pueden pasar de las 400 pares de bases, aunque esta limitacin est bajo estudio por la
compaa

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