PRACTICA N 4: DETERMINACION DE GLUCOSA POR METODO

ENZIMATICO
MATERIALES
-

Tubo de ensayo
Centrifugadora
Bao mara
micro pipetas
puntas descartables
glucosa

Estndar(glucosa,10
0/mg/dl)
Muestra
Reactivo
Mezclar
Leer en el
Espectrofotmetro a
540 nm

BLANCO

ESTNDAR

PROBLEMA

20 ul

2 ml

2ml
Incubar 15 min a 37

20 ul
2 ml

OBSERVACIONES
-

Se trabaj con suero sanguneo usando el reactivo enzimtico(la cual

tena dos enzimas acopladas la glucosa oxidasa y la peroxidaza)
Se trabaj con dos muestras problema de glucosa porque el primero se
someti a la enzima a una temperatura de 40c lo que probablemente
pudo haber desnaturalizado a la enzima.

RESULTADOS
-

Blanco: no se forma ninguna quinoneimina porque no hay glucosa.

Patrn: aqu si hay glucosa si ve en la formacin del complejo de la
quinoneimina coloreada (rosado salmn mas pronunciada)
Problema: se trabaj con dos muestras problema de glucosa porque el
primero se someti a la enzima a una temperatura de 40C lo que
probablemente pudo haber desnaturalizado a la enzima pero se vio en
las reacciones si se ha podido apreciar la formacin del complejo de la
quinoneimina coloreada (rosado salmn).
Tambin se volvi hacer otra vez la muestra problema a una
temperatura de 37 C y resulto igual que la primera muestra.

FUNDAMENTO:
Determinacin de glucosa (mtodo glucosa - oxidasa)
Este reactivo est pensado para uso diagnstico in vitro en la determinacin
cuantitativa de glucosa en el suero, plasma o en la orina humana.
La estimacin exacta de la glucosa resulta importante en el diagnstico y en la
gestin de las hiperglucemias y las hipoglucemias. Puede producirse una
hiperglucemia como resultado de la diabetes mellitus, en pacientes que
reciban lquidos que contengan glucosa por va intravenosa, durante los
episodios graves de estrs y en los accidentes cerebrovasculares.
La reaccin de la glucosa oxidasa junto con una reaccin auxiliar se ha utilizado
ampliamente para la determinacin de la glucosa en los fluidos biolgicos. Se
han desarrollado multitud de reacciones auxiliares distintas a fin
de mejorar la especificidad global del sistema de reaccin o para retener la
especificidad inherente de la glucosa oxidasa. El mtodo utilizado en este
reactivo se basa en la reaccin indicadora de perxido de hidrgeno que une 4aminoantipirina a un compuesto fenlico, como propuso inicialmente Trinder.
Glucosa oxidasa
1. Glucosa + O2 + H2O > cido glucnico + H2O2
Peroxidasa
2. H2O2 + HBA + 4-AAP > Tinte de quinonimina + H2O
1. La glucosa se oxida por accin de la glucosa oxidasa para dar cido
Glucnico y perxido de hidrgeno.
2. El perxido de hidrgeno reacciona en presencia de peroxidasa con HBA y
Con 4-aminoantipiridina (4-AAP) para dar lugar a un tinte de quinonimina rojo.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de glucosa
y se puede medir fotomtricamente entre 460 y 560 nm.
LA ALTERACIN DEL METABOLISMO DE LA GLUCOSA
Es un estado metablico intermedio, entre la ''normalidad'' y la diabetes. Es
factor de riesgo para diabetes y enfermedades cardiovasculares como la
hipertensin, derrame cerebral, angina de pecho entre otras. Estas, aunque no
estn asociadas directamente con el metabolismo de la glucosa son
enfermedades consecuentes a los trastornos que esta posee enfermedades
asociadas a la Diabetes. Las complicaciones micro vasculares tardas son la
retinopata, la nefropata y las neuropatas perifrica y autonmica. Las
complicaciones macro vasculares incluyen la arteriopata aterosclertica
coronaria y perifrica.
- Retinopata Diabtica: es causada por dao a los vasos sanguneos de la
retina, la capa de tejido en la parte posterior del interior del ojo.

Nefropata Diabtica: Es un dao o enfermedad renal que ocurre en

personas con diabetes.
- Neuropata Diabtica: Es un dao a los nervios del cuerpo que ocurre
debido a niveles altos de azcar en la sangre por la diabetes.
Hay grupos de sujetos con niveles de glucosa en sangre (glucemia) que,
aunque no cumplen con los criterios diagnsticos de la diabetes, son
demasiado altos para ser considerados normales. Estos grupos se definen por:
Glucemia basal alterada
Tener glucosa plasmtica en ayunas superior a 110 mg/dl (6.1 mmol/l),
pero inferior a 126 mg/dl (7.0 mmol/l).
Tolerancia anormal a la glucosa
Tener una glucosa superior a 140 mg/dl (7.8 mmol/l) e inferior a 200
mg/dl (11.1mmol/l), a las dos horas de someterse a una sobrecarga oral
de glucosa de 75 gramos.
De acuerdo con la glucemia plasmtica basal (en ayunas), se pueden
establecer las siguientes categoras:
Glucosa basal normal: <110 mg/dl (6.1 mmol/l)
Glucosa basal alterada: > 110 mg/dl (6.1 mmol/l) y < 126 mg/dl (7.0
mmol/l)
Diagnstico provisional de diabetes: > 126 mg/dl (7.0 mmol/l). El
diagnstico debe ser confirmado de acuerdo con los criterios
vigentes. Las categoras correspondientes cuando se realiza una
medicin de glucosa plasmtica, a las dos horas de someterse a una
sobrecarga oral de 75 gramos de glucosa, son:
- Tolerancia normal a la glucosa: < 140 mg/dl (7.8 mmol/l).
- Tolerancia anormal a la glucosa: > 140 mg/dl (7.8 mmol/l) y < 200 mg/dl
(11.1 mmol/l).
- Diagnstico provisional de diabetes: > 200 mg/dl (11.1 mmol/l). El
diagnstico debe ser confirmado de acuerdo con los criterios vigentes.
Patologa
Diabetes mellitus
CONCLUSIONES
-

Si comparamos la tonalidad de la muestra patrn con la de la muestra

problema, aparentemente son iguales lo que nos da a entender que
aparentemente que esta muestra problema est cerca a la
concentracin de la de la muestra patrn( su concentracin es de
100mg/dl).Lo que significa que esta glucosa de la muestra problema
aparentemente est cerca de los 100mg/dl cualitativamente, lo cual nos
indica que est dentro del parmetro normal (60 120 mg/dl de sangre)
y se podra descartar que el paciente sufre de diabetes mellitus.
A los 40 C de temperatura la enzima fue termoestable, ya que no se
degrado y se logr la formacin del complejo de la quinoneimina(rosado
salmn).

PRACTICA N 5: DETERMINACION DEL CONTENIDO DE ACIDO PIRUVICO

EN SANGRE POR EL METODO MDE JHONSON

MATERIALES:
-

3 tubos de ensayo
Solucin acido pirvico
cido tricloroacetico 5%
Solucin de cido sulfrico 0.1N
Reactivo de 2,4 dinitrofenilhidrazina
Hidrxido de sodio al 8%
Sangre venosa
Centrifugadora
Micro pipetas
Puntas descartables

REACTIVOS
Sobrenadante
desproteinizado
cido
tricloroactico 5%
Solucin patrn
diluida de cido
pirvico
Agua destilada
Solucin de cido
sulfrico 0.1 N
Reactivo de 2,4
dinitrofenilhidrazi
na
Mezclar por
agitacin,
reposar en
oscuridad por
15 minutos
Solucin de
hidrxido de sodio
al 8%
Agua destilada

PROBLEMA
3 ml

BLANCO
00

PATRN
00

00

3ml

00

00

00

1.5ml

00
3ml

00
3ml

1.5ml
3ml

0.5

0.5

0.5ml

Simultneamente a oscuridad

5ml

5ml

5ml

1ml

1ml

00

Leer en el
Espectrofotmetr
o a 540 nm

OBSERVACIONES:
-

La sangre la acidificamos y le agregamos cidotricloro actico volumen

de 4.5 ml para desproteinizando a la muestra y dndole el medio acido
al sistema para liberar el pirvico, porque se est estimulando a la
enzima a que esta forme pirvico en el medio.
El cido pirvico estaba concentrado as que haba que diluirlo 0.6 ml en
100 ml.
Se prepar la muestra problema, blanco y patrn los cuales despus de
agregar 2,4 dinitrofenilhidrazina al 0.1% y los hacemos reposar por 15
minutos en la oscuridad.
Luego del tiempo dado estabilizamos la hidrazona agregndole hidrxido
de sodio al 8%.
Lo correspondiente era leer en el Espectrofotmetro a 540 nm, pero el
equipo estaba malogrado.

RESULTADOS
Blanco: no contiene pirvico por eso no se forma ninguna hidrazona.
Problema: posiblemente hay pirvico y formado en hidrazona (si es no se
ah metabolizado en sangre).Complejo marrn de color tenue.
Patrn: si contiene pirvico esta tiene una concentracin conocida 0.009
mg/dl.Complejo marrn bien marcado.
FUNDAMENTO
El mtodo est basado en la determinacin de formacin del piruvato en el
transcurso de la oxidacin del lactato.

El piruvato en conjunto con el 2.4 dinitrofenilhidrazina forma la correspondiente

hidrazona:

+
Hidrazona del
cido pirvico
cido pirvico.

dinitrofenilhidrazina

El papel de la 2,4 dinitrofenilhidrazina es la de identificar los grupos carbonilos

presentes en el cido pirvico a partir de una reaccin de condensacin donde
se unirn las dos molculas y se desechara agua.
El grupo NH2 presente en la 2,4dinitrofenilhidrazina se enlaza al grupo
carbonilo con la siguiente remocin de una molcula de agua dando una
coloracin rojo amarillenta indicativa de la formacin de la hidrazona.
Esta reaccin se llevara a cabo en la oscuridad porque la luz interfiere en la
formacin de la hidrazona.

Tras reposar 15 minutos vertemos el hidrxido de sodio ya que este nos

permite estabilizar la hidrazona.
CUL ES EL PAPEL DEL CIDO TRICLOROACETICO EN ESTA PRCTICA?
El cido tricloroacetico es un cido orgnico, derivado del cido actico, en el
cual tres tomos de hidrgeno del grupo metilo han sido reemplazados por
tomos de cloro.

Es utilizado en bioqumica por el poder que tiene de precipitar macromolculas

como protenas, cidos desoxirribonucleicos y acido ribonucleicos. De esta
forma obtendremos un sobrenadante desproteinizado que nos servir como
muestra problema en la identificacin del cido pirvico.
PATOLOGA DEL ACIDO PIRUVICO
La patologa es como sigue si hay mucha concentracin de piruvato en sangre
quiere decir q no se est metabolizando acetilscoa por lo tanto el cuerpo no
tiene energa para cumplir sus funciones
Lo normal es q no se encuentra cido piruvato en ese caso podramos decir q el
cuerpo forma el acetilscoa para que vaya a llenar y de energa al cuerpo.
Enfermedades:
- Astenia
- Hipoxia
- Muerte celular,etc.
CONCLUSIONES
-

Al comparar el color de la muestra patrn que es un complejo marrn

bien marcado de una concentracin de 0.009mg/dl con la muestra
problema que es un complejo de marrn tenue, estos son diferentes
pues se ve ms concentracin de pirvico en la muestra patrn, lo que
nos da entender que en esta muestra problema hay menos de
0.009mg/dl de pirvico. As que probablemente este pirvico se est
metabolizando completamente en sangre desde un punto de vista
cualitativo. Si queremos ver cuantitativamente se podr por medio de un
espectrofotmetro pero su lmpara esta quemada.
El parmetro normal de pirvico es de 1 a 2 por dl en sangre, pero
nuestro resultado est por debajo de este parmetro lo cual es normal

ya que nos quiere decir que pirvico se est metabolizando. Es patologa

cuando es ms de lo que el parmetro lo indica.
CRITICAS CONSTRUCTIVAS
-

Es menester la utilizacin del espectrofotmetro por desgracia durante

nuestra practica el espectrofotmetro estaba descompuesto.
Una hora y 40 minutos (dos horas acadmicas) resultan insuficientes
para los procedimientos en laboratorio sobretodo de un curso de carrera
como lo es Bioqumica.

BIBLIOGRAFA

http://equipo-2-6a-lab-clinicoexposiciones.blogspot.com/2013/03/identificar-la-patologia-del.html
https://es.scribd.com/doc/88427800/INFORME-DE-LABORTORIO-N
%C2%BA-1
equipo7laboratorioclinico.blogspot.com/.../identificar-la-patologia-de-la-...
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000386.htm
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003507.htm
http://www.ecured.cu/index.php/%C3%81cido_pir%C3%BAvico