Comparacin entre el polimorfismo del terminal-longitud

de los fragmentos de restriccin (T-RFLP) y la cultura

cuantitativa para el anlisis de la microbiota intestinal de
los bebs.
La microbiota intestinal infantil es un estmulo importante para la maduracin
inmunolgica. Tanto la cultura y mtodos basados en el ADN pueden ser utilizados
para la caracterizacin de la microbiota, pero pocos estudios han comparado
sistemticamente su rendimiento para el anlisis de la microbiota intestinal. Aqu,
se examinaron muestras fecales obtenidas en seis ocasiones entre una semana y
12 meses de edad de seis bebs por va vaginal. Despus de un cultivo aerbico y
anaerbico cuantitativo de las muestras en medios selectivos y no selectivos, se
extrajo ADN de las muestras fecales y se analiz con respecto a 16S rRNA
polimorfismo del gen por polimorfismo de restriccin de terminal de longitud de los
fragmentos (T-RFLP). Una base de datos se construy para la identificacin
directa de los picos de T-RFLP mediante el anlisis de las bacterias en el cultivo
puro y el anlisis de un nmero limitado de muestras por clonacin 16S rRNA y
secuenciacin. Bacteriana presente en gneros> 10 CFU / g heces, como se
determina por cultivo cuantitativo, en general se detectaron fcilmente por T-RFLP,
mientras que la cultura en un medio selectivo fue ms sensible en la deteccin de
anaerobios facultativos con recuentos de poblacin ms bajas. En contraste, TRFLP ms fcilmente que la cultura detectada de varias especies anaerobias,
tambin taxones que no pudieron ser identificados usando la base de datos. TRFLP fcilmente identific bacterias a nivel de gnero y tambin proporcion cierta
discriminacin subgnero. Tanto T-RFLP y la cultura identificaron Bifidobacterium,
Clostridium y Bacteroides spp. entre los colonizadores ms comunes de la
microbiota infantil durante todo el primer ao de vida. Anlisis T-RFLP mostr que
la complejidad de la microbiota fue alta en las primeras semanas de vida, se neg
a un mnimo en 1-2 meses de edad, y despus volvi a aumentar. Anlisis de
componentes principales revel que las muestras tempranas (1 semana 6 meses)
principalmente diferan entre lactantes individuales, mientras que las muestras de
12 meses fueron similares entre los nios, pero diferente de las primeras
muestras. Nuestros resultados indican que T-RFLP tiene una alta sensibilidad y
capacidad de discriminacin taxonmica adecuada para el anlisis de la
composicin de la microbiota intestinal, pero que tanto la cultura y el anlisis
basado molecular tienen limitaciones y se pueden necesitar ambos enfoques para
obtener una imagen completa de la compleja microbiota intestinal.

1.- INTRODUCCIN
El tracto gastrointestinal humano alberga un ecosistema microbiano complejo,
compuesto principalmente de especies estrictamente anaerobias. La microbiota
intestinal es un estmulo importante para el sistema inmunolgico y se ha
demostrado que una baja complejidad de la microbiota intestinal en los pequeos
lactantes se asocia con un mayor riesgo de desarrollo de alergias tardas.
La microbiota se va estableciendo gradualmente cuando los infantes van
adquiriendo bacterias por medio del canal de nacimiento, contacto fsico con el
personal del hospital, con familiares, por medio de los alimentos y del aire.
Debido al contenido inicialmente alta de oxgeno, las bacterias facultativas, como
Streptococcus, Enterococcus, enterobacterias y especies de Staphylococcus son
los primeros en establecerse en el intestino del beb. Seguidos por las bacterias
anaerbicas, comenzando con grupos relativamente tolerantes al oxgeno, como
Bifidobacterium y Bacteroides spp., Y seguidas por las especies cada vez ms
sensibles al oxgeno hasta un complejo de tipo adulto microflora que se ha
construido despus de algunos aos. Con la disminucin de la tensin de oxgeno,
las bacterias facultativas disminuyen en nmero. Por lo tanto, el facultativo:
relacin anaerobio disminuye desde aproximadamente 1: 1,5 en recin nacidos a
1: 200 en adultos
La mayor parte del conocimiento bsico sobre la microbiota intestinal infantil se
deriva de los estudios basados en la cultura. En los ltimos aos, las tcnicas
moleculares han permitido que surja la identificacin de las bacterias que no
pueden ser cultivadas, principalmente anaerobios estrictos. La heterogeneidad de
la bacteriana 16S rRNA gen ubicuo, 1.500 pb de longitud, es ms comnmente
utilizado para la identificacin, por ejemplo, mediante clonacin y secuenciacin.
Una alternativa es para amplificar partes del gen 16S rRNA por PCR seguida de
secuenciacin multiparallel, es decir, "la secuenciacin de prxima generacin", en
la que un gran nmero de secuencias se pueden leer. Tcnicas moleculares
permiten la identificacin de anaerobios no cultivables presentes en un gran
nmero de la poblacin.
Sin embargo, las poblaciones bacterianas subdominantes pueden pasar por
desapercibidas incluyendo anaerobios facultativos que constituyen <1% de la
microbiota intestinal. Por ejemplo, para detectar una especie presente en
106 CFU / g entre 1011 bacterias / g requiere 100.000 secuencias analizadas. Un
enfoque alternativo es digerir PCR amplificado 16S rRNA genes de enzimas de
restriccin y separar los fragmentos de acuerdo con el tamao.

En la restriccin-terminal de los fragmentos de polimorfismo de longitud (T-RFLP),

el fragmento terminal est marcado con fluorescencia durante la reaccin de PCR
que permite su deteccin. Cada taxn bacteriano (gnero o especie) produce un
T-RF (fragmento terminal de restriccin) de un cierto peso y una comunidad
bacteriana complejo genera una serie de fragmentos de ADN que difieren en
tamao. Una desventaja es que la identidad de la T-RF no es inmediatamente
evidente; Se necesitan bases de datos para "traducir" el tamao del fragmento de
gnero / especie.
Pocos estudios han comparado directamente la sensibilidad de la cultura y los
mtodos basados en el ADN en relacin con la caracterizacin de la microbiota
intestinal. Hayashi et al (2002) compar la cultura estrictamente anaerbica y
bibliotecas de clones. La cultura fue capaz de identificar aproximadamente 30% de
las clulas bacterianas identificadas en el recuento de microscopio y 75% de los
clones secuenciados no se detectaron por cultivo. Por el contrario, Wilson y
Blitchington (1996) encontraron que el 16S rRNA clonacin slo se identific un
poco ms de grupos bacterianos de la cultura.
T-RFLP y la cultura se compararon respecto a la identificacin de comunidades
bacterianas de la carne podrida; bacterias del cido lctico presentes en 107 CFU
/ g en promedio se detectaron fcilmente, mientras que las enterobacterias
presentes en 103 CFU / g no se detectaron. Una comparacin entre la cultura y la
T-RFLP en la caracterizacin de las comunidades bacterianas en las hojas de
arroz mostr que ciertos gneros solamente fueron detectados por anlisis,
basados en el ADN la cultura independiente, mientras que otras bacterias slo se
encontraron con un enfoque basado en la cultura. Esta ltima inclua
principalmente Gammaproteobacterias tales como Pseudomonas, pero no hubo
informes sobre los respectivos niveles de poblacin de las bacterias que fueron
identificados, o se perdieron, por T-RFLP. A pesar del renovado inters en la
microbiota comensal, y a pesar de extensas bsquedas de la literatura, no hemos
encontrado ninguna comparacin sistemtica de las ventajas y limitaciones entre
T-RFLP y la cultura en la evaluacin de las comunidades bacterianas complejas,
como la microbiota intestinal.
El objetivo de este estudio fue comparar la T-RFLP con la cultura cuantitativa para
el anlisis de la microbiota intestinal en los lactantes. Anlisis paralelo de muestras
fecales por T-RFLP y cultivo aerbico y anaerbico cuantitativa utilizando una serie
de medios selectivos nos permiti calcular la sensibilidad de T-RFLP en relacin a
la cultura de los diferentes grupos de bacterias intestinales e investigar la utilidad
de T-RFLP para caracterizacin de la microbiota infantil. Un nmero limitado de
muestras tambin se analizaron por clonacin y secuenciacin. Adems, el trabajo
incluy el desarrollo de una base de datos que permite la rpida identificacin de
los fragmentos de restriccin terminal (T-FR) derivadas de las bacterias
intestinales infantiles a nivel de gnero o especie.

2.- MATERIALES Y MTODOS

2.1. Asignaturas
Se estudiaron seis recin nacidos por va vaginal (llamados AF) nacidos en 19982002 y seguido de un ao de edad. Ellos fueron seleccionados del nacimientocoherte sueco flora alrgica reclutado para examinar la relacin entre el patrn
de colonizacin intestinal temprana y el desarrollo de alergias ms tarde. Ninguno
de los nios estudiados haba recibido antibiticos durante el perodo de estudio.
Cinco fueron amamantados exclusivamente hasta los 4-6 meses de edad,
mientras que uno (infantil B) recibi frmula desde el nacimiento. Los alimentos
slidos se introdujeron a los 4-6 meses de edad. Se obtuvo el consentimiento
informado y el Comit de la Universidad de Gotemburgo la tica mdica "aprob
el estudio.
2.2. Recoleccin de muestras fecales y cultura.
Las heces fueron recogidas por los padres en seis ocasiones durante el primer
ao de vida (en el 1, 2 y 4 semanas y a los 2, 6 y 12 meses de edad; denominan
muestras 1-6). Las muestras fueron transportadas en un medio anaerbico en una
bolsita hermtica al gas y se cultivan aerbica y anaerbicamente en medios
selectivos y no selectivos dentro de las 24 h despus de la miccin como se
describi previamente. El lmite de deteccin fue de 300 (102.5) unidades
formadoras de colonias (UFC) / g de heces. En resumen, una cucharada calibrada
de heces se diluy en serie y se cultiva en medios no selectivos (agar de sangre
Columbia para cultivo aerbico y agar sangre Brucella para cultivo anaerbico) y 9
medios selectivos (Drigalski para Enterobacteriaceae, Staphylococcus agar para
Staphylococcus, Bacteroides bilis esculina agar para Bacteroides, agar Beerens
de Bifidobacterium, agar Enterococcosel de Enterococcus, agar Sabouraud para
levaduras, agar Rogosa para Lactobacillus y cicloserina cefoxitina fructosa agar
yema de huevo (CCFA) para Clostridium difficile. formadores de esporas
anaerobias ("clostridios") se cuantificaron por la cultura anaerobia de muestras de
alcohol tratados en agar de sangre Brucella. Las colonias bacterianas de
diferentes morfologas se enumeraron en un medio apropiado, subcultivaron para
la pureza y especificacin, utilizando una combinacin de pruebas bioqumicas y
gnero o especie especfica de PCRs tal como se describe anteriormente.
Aislamientos de cultura-pura se almacenaron congeladas a -80 C al igual que las
restantes heces.
2.3. Cultura- Pura y cepas de tipo
Para la construccin de una base de datos T-RF, se utilizaron cepas-cultivo puro
que se derivan de la cultura de la microbiota y colecciones de cultivos de cepas de
los bebs. En total, 42 cepas de bacterias intestinales se obtuvieron de la
Coleccin Cultura de la Universidad de Gotemburgo (CCUG), 36 de los cuales
eran cepas tipo de las respectivas especies (Suplemento Tabla B).

Cultivo-puro infantil aislado fue cultivado y subcultivado para la pureza y su gen

16S rRNA se secuenci (Seccin 2.6.2) para confirmar su identidad especie.
2.4. La extraccin de ADN y PCR de 16S rRNA genes
2.4.1. La extraccin de ADN de las heces
El ADN bacteriano fue extrado de 160 mg (peso hmedo) de las heces infantiles
congelados utilizando el Kit QIAamp DNA Mini heces. El rendimiento de ADN se
increment mediante la adicin de un paso adicional, en el que se aadieron 1012 perlas de vidrio (2 mm de dimetro) fue agregado al ASL fecal un buffer de
suspensin y se dieron 1200 rpm durante 30 min a 5 C. El ADN se cuantific por
espectrofotometra.
2.4.2. Extraccin de ADN de cultivo-puro y tipos de cepa
ADN de Enterobacteriaceae, Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. se extrajo
por incubacin en 50 l de buffer de lysis a 95 C durante 10 min, seguido por
centrifugacin durante 3 min a 12.000 x g. Otras bacterias se lisaron siguiendo el
protocolo Matrix InstaGene. Las concentraciones de ADN se midieron con el
espectrofotmetro NanoDrop.
2.4.3. Amplificacin PCR de 16S rRNA genes de bacterias.
Genes de bacterias 16S rRNA fueron amplificados utilizando los primeros ENV1
universales (5'-6-FAM-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG -3 ', Escherichia coli nr. 827) y ENV 2 (5'-CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT-3 ', E. coli nr. 1511 a 1.492)
(Gutell, 1994). Para T-RFLP, el cebador directo fue fluorescente marcada con 6FAM en 5 '. La mezcla de PCR contena 50 ng de DNA (25 y 75 ng tambin fueron
examinados; 25 ng de ADN generados picos T-RF ms pequeas), 25 l Hot Start
Taq Master Mix (Qiagen), 0,3 M de cebador, 1 mM MgCl2 y agua en un volumen
final de 50 l (muestras fecales) o 25 l (cepas de cultivo puro y los reactivos
fueron cortadas por la mitad). La reaccin PCR se realiz en un gradiente de
Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), utilizando el siguiente
programa: una activacin inicial de la polimerasa Taq a 95 C durante 15 min, 25
ciclos (28 y 32 tambin se sometieron a ensayo) de 94 C durante 1 min, 50 C
durante 45 s y 72 C durante 2 min, con una extensin final a 72 C durante 7
min. Los controles negativos que contienen todos los reactivos de extraccin de
ADN, pero sin las bacterias, se incluyeron durante todo el anlisis para detectar la
contaminacin de ADN a partir de reactivos o instrumentos.
2.5. Anlisis de T-RFLP
Los productos de PCR purificados a partir de muestras fecales (100 ng) fueron
digeridos con 16 U (4, 10, y 20 U tambin fueron probados) de la enzima de
restriccin de endonucleasa de MspI (New England Biolab, Ipswich, EE.UU.) a
37 C durante 5 h en un volumen final de 5 l. Para las bacterias en el cultivo

puro, 30 ng productos de PCR fueron digeridos con 16 U MspI en un volumen final

de 10 l. La reaccin se detuvo por calentamiento a 65 C durante 20 min.
2.5.2. Fragmento de anlisis
Etiquetas fluorescentes T-FR se detectaron utilizando un analizador gentico ABI
PRISM 310 con pop 4 gel. La resolucin (nmero y la calidad de los picos) fueron
comparados utilizando diferentes volmenes de amplicones digeridos de PCR
(0,5, 0,7, 1, 1,5, 2,5, 3,8 y 4,8 mu l), voltajes de funcionamiento (9.9, 12.2 kV y 15
kV) tiempos de inyeccin, (5 s y 10 s) y las normas de tamao (ROX 500,
ROX1000, combinan ROX 500 y ROX1000, LIZ 600 y LIZ 1200 Applied
Biosystems). La reproducibilidad se investig mediante la ejecucin de las
muestras por duplicado.
Las longitudes de los fragmentos se analizaron por GeneMapper, versin 4)
utilizando el Mtodo Sur Local. "True" picos fueron separados de "ruido" dentro de
un rango de longitud de fragmentos de entre 28 y 1.000 pb segn Abdo et al.
Brevemente, los datos fueron normalizados dividiendo el rea de cada pico por el
rea del pico total de la muestra particular. A continuacin, la desviacin estndar
(SD) del conjunto de datos se calcul suponiendo que la media real era cero.
Picos con una superficie de 3 SD por encima de la media fueron considerados
como seales verdaderas. Ellos se recogieron y se eliminan; de lo cual se reiter
el proceso hasta que no se identificaron ms picos "verdaderos". T-FR que difera
en no ms de 1 pb en diferentes anlisis fueron considerados como idnticos.
Se analizaron todas las muestras fecales en dos PCR independientes y anlisis
posterior T-RFLP. Slo los fragmentos representados en ambas carreras fueron
considerados y sus tamaos mximos y reas se promediaron.
2.5.3. Anlisis en computadora
Para obtener el tamao esperado de T-RF de diferentes especies bacterianas, en
la digestin hecho en computadora se realiz (RDP web: http:. //rdp8.cme.msu
Edu / html / TAP-trflp.html). Sitios para la enzima MspI de corte en sus genes 16S
rRNA fueron detectados y el tamao de los fragmentos terminales se calcularon y
compararon con el tamao observado T-RF obtenida a partir del anlisis T-RFLP
de las mismas cepas de tipo.
2.6. La clonacin y secuenciacin
Una biblioteca clon se construye a partir de nueve muestras fecales obtenidas de
cuatro bebs. Estas muestras fueron seleccionados en base a su alta abundancia
de T-RFs que no pudieron ser identificados a partir de bacterias cultivadas.

2.6.1. La ligacin y transformacin

Productos de PCR (70 ng de ADN) se ligaron en pGEM-T Easy Vector Systems de
acuerdo con el protocolo del fabricante. Solucin de ligacin (2 l) se transform
en clulas JM109 de alta eficiencia competentes (Promega) o clulas
qumicamente competentes Bioblue (BIOLINE, UK). Las clulas transformadas se
cultivaron en triplicado Luria-Bertani placas de agar que contenan ampicilina,
IPTG y X-Gal (Promega) incubaron durante la noche a 37 C. Se analizaron un
total de 927 colonias blancas (51-292 colonias / muestra).
2.6.2. La secuenciacin del gen clonado rRNA 16S
Inserciones de Clon fueron amplificados con primers vector M13: M13 adelante 5'CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC y M13 inverso 5'-TCA CAC AGG AAA
CAG CTA TGA C (TAG Copenhagen A / S, Dinamarca) con el siguiente programa
de PCR : 95 C durante 15 min, 30 ciclos de 94 C durante 30 s, 55 C durante
30 s y 72 C durante 90 s, con una etapa de extensin final a 72 C durante 10
min. Productos de PCR (4 l) se verificaron mediante electroforesis en gel de
agarosa, insertos con aproximadamente 1,750 nt se pasaron a una segunda PCR
usando cebadores universales 16S como se describe para el anlisis de los
aislados fecales. Productos de PCR (4 l) se verificaron de nuevo por
electroforesis en gel de agarosa. Se digirieron los clones de alrededor de 1.500 nt
tamao usando 0,2 l de la amplificacin por PCR 16S, 8 unidades de MspI y se
analizaron su tamao del fragmento. Dentro de una especie, hay varios sitios de
restriccin enzimtica a lo largo del gen 16S.En la digestin completa se obtiene
una nica T-RF (el sitio ms prximo a la digestin cebador directo). Cuando se
utiliza la concentracin de la enzima otros sitios de digestin inadecuada puede
detectarse. Tal digestin parcial se utiliz en el anlisis de clones con el fin de
obtener un patrn ms complejo. Los clones con el mismo perfil de digestin
parcial T-RF se consideran idnticos y por lo menos dos clones representativos de
cada perfil nico T-RF se seleccionaron para la secuenciacin.
La secuenciacin de PCR se realiz utilizando BigDye Terminator v3.1 los kits de
secuenciacin de ciclo (Applied Biosystems) y se purific el producto M13 PCR se
utiliz como molde. La mezcla de reaccin de 20 l contena 2,5 l de producto de
PCR M13, 2 l BigDye Terminator, buffer 2 l y 20 M de cebador M13 adelante,
M13 inversa o 907r cebador universal (5'-CCG TCA TCA CCT TTA AGT TT-3 ' E.
coli nr. 907 a 926). La amplificacin se realiz con el siguiente programa: 25 ciclos
de 96 C durante 30 s, 55C durante 15 s y 60 C durante 4 min. Los amplicones
fueron precipitados en 50 l de etanol 95% y 2 l del buffer de acetato de sodio (3
M) durante 20 min a temperatura ambiente. Despus de la centrifugacin (14.000
xg, 20 min) el sedimento se lav con etanol al 250 l 70% y se centrifug de nuevo
(14.000 g, 5 min). El sobrenadante se elimin y el fluido restante se evapora
(temperatura ambiente, 1 h). El sedimento se disolvi en 15 l de formamida. ADN
fue secuenciado en un ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied

Biosystems) y el resultado se analiz usando el programa de anlisis de

secuenciacin de ADN, v5.2 (Applied Biosystems) y alineados utilizando FASTA en
http base de datos pblica del Instituto Europeo Bioinformacin: // www .ebi.ac.uk /
Herramientas / sss / fasta /.
2.7. El anlisis estadstico
El anlisis de componentes principales (PCA) y ortogonal anlisis parcialmente
menos 2 plazas-discriminante (O2PLS-DA) se utilizaron para obtener un patrn
general del intestino microbiota infantil (SIMCA P + versin 12, Umetrics AB,
Ume, Suecia). PCA representa la estructura inherente de datos multivariados y
las principales correlaciones entre observaciones y variables. O2PLS-DA es una
variante de regresin de PCA por el cual correlacin entre un conjunto de datos
multivariante y una variable Y se puede probar. Wilcoxon utiliz pares T-test para
comparar la diversidad de los T-FR obtenidos a diferentes edades.
3.- RESULTADOS
3.1. Metodologa de T-RFLP
3.1.1. Optimizacin de T-RFLP
En T-RFLP, la identificacin de un taxn bacteriana se basa en el tamao del
fragmento terminal obtenida despus de la digestin del gen 16S rRNA.
Es de vital importancia que un solo fragmento marcado (T-RF) se produce
despus de la PCR y digestin del gen 16S rRNA de un solo taxn. Si se genera
ms de un fragmento, cada una de ellas se puede interpretar como una especie
bacteriana nicos, es decir, un "pseudo" -T-RF. En primer lugar la reaccin de PCR
se optimiz utilizando cepas de cultivo puro. Hasta 25 ciclos, slo 1.500 nt
amplicones, en representacin de toda la longitud del gen 16S rRNA, se
produjeron, mientras que despus de >25 ciclos, fragmentos de otros tamaos
pareca que podra interpretarse como T-FR. Adems, usando <16 U de la enzima
de restriccin MspI por 100 ng de amplicn PCR condujo a la aparicin de pseudoT-RFs como resultado de una digestin incompleta.
Se encontr que las condiciones ptimas para T-RFLP son: una mezcla de 1 l de
digerido 16S amplicn, 9 l de formamida y 0,5 l de LIZ 1200 se desnaturaliz a
95 C durante 3 min y despus se coloc inmediatamente en hielo, un 5 s tiempo
de inyeccin y la separacin de 80 min a 15 kV. Una tensin de funcionamiento de
15 kV dio tamao de los fragmentos ms precisa y en menor tiempo de 12 kV.
Despus de la optimizacin, la reproducibilidad T-RFLP fue investigada por
anlisis repetidos de las mismas muestras. Entre los anlisis realizados en el
mismo da, T-RFs diferan en 0.2 nucletidos, esto aument a 1 nucletidos
cuando la misma muestra se llev a cabo en das diferentes. Decidimos analizar
todas las muestras fecales en dos PCR independientes y anlisis posterior
T-RFLP y para incluir slo T-FR apareciendo en ambos anlisis. T-FR diferentes

no ms de 1 nucletidos fueron considerados como un solo taxn; sus tamaos

y reas de pico de los duplicados se promediaron.
3.1.2. La identificacin y la exclusin de la pseudo-T FR
Una observacin preocupante fue que se observ en repetidas ocasiones picos
bastante grandes T-RF que representan nucletidos de longitud 210 ( 1) y 540 (
1) (que se encuentran 24 y 29 veces, respectivamente, en las 36 muestras fecales
analizadas).Estos fragmentos nunca se generaron al analizar islotes de cultivo
puro ni clonados de ADN a partir de muestras fecales, sugiriendo que eran
pseudo-T-FR. Hemos encontrado que estos dos picos aparecieron slo en
muestras en las que el T-RF (tamao ~ 90) especfica Bacteroides representado
>25% del rea total del pico, es decir, muestras en las que Bacteroides spp. eran
cuantitativamente dominante. En el anlisis hecho en compu la digestin del gen
16S rRNA de las cepas de tipo Bacteroides revel tres sitios de restriccin enzima
MspI (CCGG) situadas en torno a 90, 210 y 540 nucletidos de B. y B. fragilis
vulgatus. B. ovatus y B. thetaiotaomicron slo tienen dos sitios (90 y 540) en. La
digestin completa por MspI deben generar un fragmento de 90 nt etiquetados
terminal individual. Si la digestin en este sitio no estara completa, la digestin en
uno de los otros sitios MspI podra generar fragmentos de 210 o 540 nt,
respectivamente. En las muestras con grandes cantidades de ADN Bacteroides,
tales digestiones incompletas podran ser numerosas suficiente para pasar el
umbral y generar visibles T-FR. Esta hiptesis fue apoyada por la falta del
fragmento de 210 nt de las tres muestras de heces que, de acuerdo a la cultura,
contena B. ovatus o B. thetaiotaomicron pero no hay otras especies de
Bacteroides. Otra fuente de variacin que puede explicar la ocurrencia de ms de
un pico por genoma es que los 16S rrn operones pueden aparecer en varias
copias en el genoma bacteriano y que estas copias pueden diferir ligeramente en
la secuencia. Si tales polimorfismos de nucletido afectar a los sitios de enzimas
de restriccin, T-RFs de diferente longitud puede aparecer. Como se considerar
que el T-FR de 210 y 540 nt para representar pseudo-T-FR, fragmentos de estos
tamaos fueron excluidos de los anlisis
3.1.3. Las discrepancias entre el falso y verdadero tamao de T-RF .
Comparamos observando tamaos T-RF a partir del anlisis T-RFLP de tipos de
cepa bacteriana con el tamao terico T-RF obtenido por la digestin in silico de la
secuencia de la misma cepa. Se observaron discrepancias significativas, es decir,
se subestimaron las longitudes de fragmentos largos como tiempo de migracin
aument de forma no lineal con el tamao (Suplemento Tabla S1). El anlisis de
los marcadores de tamao estndar MW confirm que un incremento en el tamao
dio un incremento en el tiempo de migracin que disminuye gradualmente con el
aumento MW.
Una complicacin adicional en la traduccin de tiempo de migracin de tamao
era que los compendios de PCR se marcaron con la FAM fluorforo que tiene un

peso molecular de 376, mientras que el estndar se marc con LIZ cuya MW no
se revela por el fabricante. Sin embargo, desde que se subestiman los verdaderos
tamaos T-RF ya en cortocircuito la camiseta de los FR, el fluorforo LIZ debera
tener mucho ms alto MW de FAM. El estndar LIZ MW fue elegido en base a su
gran nmero de marcadores y su distribucin uniforme en una amplia gama.
3.1.4. Construccin de una base de datos T-RF
Desde el tiempo de migracin observada de T-RFS no poda traducirse en un
taxn bacteriana particular usando en la digestin en el anlisis e computadora,
decidimos desarrollar nuestra propia base de datos para la identificacin T-FR. TFR de 96 especies bacterianas se pudo identificar a travs del anlisis T-RFLP de
cultivo puro de bacterias aisladas de heces de nios y cepas Type Culture
Collection. La clonacin y secuenciacin del ADN bacteriano a partir de nueve
muestras de heces infantiles aadieron otros 34 especies, produciendo una base
de datos que consiste en los tamaos observados T-RF de 130 especies
bacterianas. Todas las secuencias de 16S rRNA de los aislados y clones en la
base de datos se presentaron al Archivo Europeo de nucletidos y los nmeros de
acceso asignadas eran HE974918-HE974988.
3.1.5. Capacidad de discriminacin taxonmica de T-RFLP
Una preocupacin en la metodologa microbiolgica es el nivel de discriminacin
taxonmica que se puede lograr. Cultura permite la tipificacin de un nivel de
especies bajo, mientras que la base tcnica del gen 16S rRNA no poda, debido a
que era inadecuado en muchos propsitos
La Tabla 1 muestra, para algunos gneros, el nmero de especies nicas, o nico
T-FR, que se identificaron utilizando la base de datos. Por ejemplo, nuestra base
de datos contena diez especies de Bacteroides diferentes que se encuentran en
la microbiota intestinal humana.
Estas diez especies colectivamente generan siete nicas T-FR, lo que sugiere
que T-RFLP fue capaz de diferenciar taxonmicamente grupos de especies
Bacteroides relacionados o incluso individuales. Como se observa en la Tabla 1, la
mayora de los gneros estaban representados por varios T-FR, lo que indica que
el nivel de discriminacin taxonmica para T-RFLP en nuestras manos estaba en,
o por debajo, el nivel de gnero. Una notable excepcin fue Enterobacteriaceae,
que produjo una nica T-RF en casi todas las muestras, y un segundo T-RF
apareci en algunas muestras de las que se realiz cultivo de Enterobacter. Los
estafilococos tambin generaron una nica T-RF, por lo que es imposible distinguir
entre S. aureus y estafilococos coagulasa negativos (Tabla 1). Esto puede
explicarse por la proximidad taxonmica de muchas especies dentro de los
gneros clnicamente relevante, que han sido separados sobre la base de
importancia clnica y no relacin taxonmica. Curiosamente, T-RFLP fue capaz de

diferenciar varios grupos dentro del gnero estreptococo, una tarea que es muy
difcil, incluso mediante la secuenciacin de todo el gen 16S rRNA.
No de taxones nicos

Gnero
Facultative bacteria
Enterobacteriaceae
Enterococcus
Staphylococcus
Streptococcus
Obligate
anaerobes
Bacteroides
Bifdobacterium
Clostridium
Lactobacillus

Base de datos

)
especies

7
3
2a
9
10
9
13
9

T-RFLP
T-RFs) *

2
2
1
6
7
3
1
1
8

*Basado en digestin de enzimas usando MspI.

estafilococos solamente fueron identificados como cualquiera de S. aureus, o estafilococos coagulasa
negativos, sobre la base de la prueba de coagulasa.
a

3.2. Anlisis del desarrollo de la microbiota intestinal infantil por T-RFLP y la

cultura
3.2.1. Anlisis de la microbiota del infante F por T-RFLP
La composicin de la microbiota se examin por anlisis de T-RFLP de ADN fecal
a partir de seis lactantes (A-F) muestreados en seis ocasiones (1, 2 y 4 semanas
de edad, y 2, 6 y 12 meses de edad). Fig. La figura 1 muestra el patrn de T-RFLP
de la microbiota de heces del beb F. Cada pico (T-RF) representa un taxn
bacteriana (gnero o especie). Como se desprende de la figura, cierta T-FR (por
ejemplo, 30, 31 y 149) estuvieron presentes en las primeras muestras, pero luego
desapareci. Usando la base de datos, stas fueron identificadas como
Lactobacillus mucosae (30 nt), L. vaginalis (31) y Staphylococcus (149). Como se
ha sealado anteriormente, S. aureus y estafilococos coagulasa negativos
generan la misma T-RF y no pueden ser distinguidos por T-RFLP (Tabla 1). Otros
T-FR, e. g. 129 y 130, lo que representa Bifidobacterium spp., Estuvieron
presentes en la microbiota intestinal infantil de F a lo largo de los 12 meses. Una
gran 486 nt T-RF estuvo presente de 1 semana a 6 meses; que se identific como
Enterobacteriaceae. Este pico ya no era detectable por T-RFLP a los 12 meses de
edad. Las diferentes especies de Enterobacteriaceae no podan resolverse por TRFLP (Tabla 1).
Cultura revel que infante F fue colonizada por E. coli de 1 semana a 12 meses de
edad (datos no mostrados). Durante este perodo, el tamao de la poblacin
disminuy desde 109.4 hasta 107.9 UFC / g de heces, lo que refleja la creciente
competencia de los anaerobios. As, la "desaparicin" del pico de enterobacterias
a los 12 meses de edad se debi a su abundancia relativamente baja en esta

muestra. Del mismo modo, el pico Staphylococcus (149) tambin "desapareci"

despus de 2 meses de edad, aunque infantil F fue colonizada por Staphylococcus
durante todo el perodo, pero en la disminucin de los niveles de poblacin.
Interesantemente, varios T-FR estuvieron presentes en las muestras de uno y de
dos semanas, ausentes en un mes de edad, y luego reapareci en el 2, 6 y 12
meses de muestras. Estos T-FR incluidos identificados como Parabacteroides
(86), Bifidobacterium (126), catenaformis Coprobacillus (532) y varios no
identificados T-SSR (53, 69 y 422).
Como era de esperar, los 6 y 12 meses muestras fueron dominados por bacterias
obligatoriamente anaerobias tales como; Bacteroides spp. (90, 93), Clostridium
indolis (213), C. ramosum (287), Akkermansia muciniphila (265), Lactobacillus
casei / paracasei (562), L. fermentum (571) y las especies no identificadas
representadas por T-FR 136, 282 , 516 y 535.
3.2.2. El anlisis multivariado de patrn de la colonizacin de la microbiota
analizada por T-RFLP
Una visin de conjunto de la composicin de la microbiota analizada por T-RFLP
se obtuvo mediante anlisis de componentes principales (Fig. 2). Aqu, cada
observacin (muestra) se coloca sobre la base de los T-RFs se encuentran en esa
muestra. En general, las muestras obtenidas entre 1 semana y 6 meses de edad
(muestras 1-5), agrupados por nio, lo que sugiere que cada beb tena una parte
nica de microbiota. En contraste, todas las muestras de 12 meses (A6-F6) y las
muestras de 6 meses a partir de dos nios (A5 y F5) aparecieron en las
proximidades uno de otro, pero lejos de las primeras muestras. Por lo tanto, los
finales de las muestras eran ms similares entre s que a los primeros muestras de
los respectivos lactantes.Para identificar T-RFs que produjo la diferencia entre
principios y finales de las muestras, se emple O2PLS-DA, una variedad de
regresin de anlisis de componentes principales. Las muestras finales (A6, B6,
C6, E6, F6, A5, y F5) se compararon con el resto de las muestras (valor atpico
D6, cuya microbiota era claramente diferente de todas las dems muestras, fue
excluido). O2PLS-DA mostr que las primeras muestras se distinguen de los
finales de los aos por la presencia de los siguientes T-FR: 486 (enterobacterias),
161 (Propionbacterium acnes), 148 (Staphylococcus), 181 (Lactobacillus gasseri),
130 (Bifidobacterium infantis / breve ), 547 (Streptococcus sanguinis / salivarius),
129 (Bifidobacterium spp) y 30 (Lactobacillus mucosae), as como no identificado
T-RFs 158 y 702.Las muestras finales fueron distinguidas de las primeras por la
presencia de T-RFs como de 218(Eubacterium rectale / eligens), 215
(Ruminococcus gnavus), 77 (Bacteroides spp), 188 (Clostridium bartlettii /
lituseburense / bifermentans), 514 (Clostridium perfringens), 216 (Ruminococcus
obeum), todos los que representan a los anaerobios estrictos, as como el no
identificado T-FR 136, 201, 215, 277 y 516.

La muestra de 12 meses a partir de nio D (D6) no hizo grupo con cualquiera de

las otras muestras (Fig. 2). O2PLS-DA analiz D6 en relacin a las otras 35
muestras revel que contena varias D6 T-RFs que eran nicas para este ejemplo:
es decir, 220, 273, 279, 447 y 491. Adems, esta muestra contena T-RFs que slo
eran que se encuentra en dos muestras derivadas de otros bebs, es decir, 176
(L. acidophilus) y el no identificado T-FR 206, 297, 311 y 529.
T-RFno.(id)a

(19)
30
19 (12)

1mo
w
2

25 (14)

2mo

21 (11)

w
6mo

33 (19)

12mo
1

38 (21)

53 86
69 126

422

532

Fluorescence intensity (0-500 unit)

90, 93 136

213

265, 282,
287

516, 535,562,571

Longitud de nucletidos (de 0-600)

Fig. 1. Anlisis de T-RFLP de la composicin de la microbiota fecal en un nio sigui durante el primer ao de vida. El ADN
bacteriano fue extrado de muestras fecales obtenidas a 1 y 2 semanas de edad y a las 1, 2, 6 y 12 meses de edad y se
analiz por T-RFLP. Cada pico representa un fragmento de restriccin terminal de una longitud especfica que corresponde

a un filotipo bacteriana, por lo general un gnero. Una base de datos se construy a partir del anlisis T-RFLP de especies
bacterianas conocidas o clonado y secuenciado bacterianas 16 S rRNA genes, y esta base de datos se utiliz para
identificar individuales T-RFs en muestras fecales. T-RF no. denota el nmero de T-RFs identificados en la muestra
- el nmero de T-RF que podran identificarse utilizando la base de datos. El infante representado corresponde al infante F
en las figuras. 2 y 3.
a

F6/E6
R2X[1] = 0.120029 R2X[2] = 0.0880433

g
Ellipse:Hotellin

T2(0.95)

Fig. 2. Desarrollo microbiota durante el primer ao en seis bebs. Las muestras de heces de seis nios (A-F) obtenidos en
seis ocasiones durante el primer ao de vida fueron analizados por T-RFLP y el patrn de T-RF se analiz mediante anlisis
de componentes principales. (1 = 1 semana, 2 = 2 semanas, 3 = 1 mes, 4 = 2 meses, 5 = 6 meses y 6 = 12 muestras
meses). La posicin de la muestra se genera por la totalidad de T-RFs presentado en la muestra.

3.3.1. Los lmites de deteccin de T-RFLP y la cultura

Como todas las muestras haban sido analizados por cultivo cuantitativo en
medios selectivos y no selectivos, podramos investigar la capacidad de que un
grupo bacteriano particular, se detect por cultivo o T-RFLP, respectivamente.
Como se muestra en la Fig. 3, ciertas bacterias facultativas fueron ms
frecuentemente detectados por la cultura que por T-RFLP. Este fue el caso de los
estafilococos y enterococos (Fig. 3). Enterobacteriaceae, fueron, sin embargo, casi
tan a menudo detectada por T-RFLP como por la cultura. Estreptococos aerobios
fueron detectados fcilmente por T-RFLP, pero rara vez por la cultura, lo que
podra explicarse por el hecho de que no hemos incluido cualquier medio de
cultivo selectivo para los estreptococos; estas bacterias solamente se detectaron
en los medios de comunicacin no selectiva cuando est presente en altos
recuentos. La Identificacin de T-RFLP de varias bacterias obligatorias anaerobias
frecuentemente faltantes en la cultura, incluida Veillonella, Coprobacillus y
Ruminoccous, as como un nmero de T-FR que no pudo ser resuelto.

Number of samples
Fig. 3. Frecuencia de las muestras que produce un taxn bacteriana por la cultura o T-RFLP. En
total, 36 muestras de heces (6 muestras de cada uno de los 6 nios) se cultivaron
cuantitativamente y analizados por T-RFLP. Las barras indican el nmero de muestras en las que
un determinado taxn fue detectado por T-RFLP (barras rellenas) o de cultivo (barras rayadas),
respectivamente. Taxa bacteriana Facultativa se indican en negrita.

Fig. La figura 4 muestra los niveles de poblacin fecales, determinados por la

cultura, en muestras que fueron positivas o negativas para un grupo de bacterias
por T-RFLP. En cuanto a los enterococos, solamente una muestra con recuentos
de poblacin muy altas (109 CFU / g) fue positivo, mientras que los estafilococos
pudieron ser detectados en ejemplos donde tuvieron presente 106,9 1,2 CFU /
g. Bacteroides spp. fueron detectados por T-RFLP en todas las muestras que
fueron positivas por la cultura. Esto podra explicarse por los altos niveles de
poblacin de esta especie (> 108 UFC / g en todas las muestras, Fig. 4). Sin
embargo, con la excepcin de los enterococos, T-RFLP era bastante sensibilidad;
81% de las bacterias que estaban presentes en > 106 CFU / g en las muestras
fecales (a juzgar por cultivo), fueron detectados por T-RFLP.

Fig. 4. Los niveles de poblacin fecales de bacterias cultivables detectados y no detectados por TRFLP. Niveles de poblacin de diferentes gneros bacterianos en 36 muestras fecales fueron
determinadas por cultivo cuantitativo. Los niveles de poblacin de un gnero particular, se
compararon entre muestras en las que este gnero tambin se detect por T-RFLP (smbolos
rellenos) y las muestras que fueron negativas para el gnero en cuestin por T-RFLP (smbolos
abiertos). Las barras indican las medianas.

3.3.2. La taxa bacteriana predominante segn la cultura y el anlisis de T-RFLP

Se compar cual gneros / especies bacterianas eran ms prevalente en los
lactantes examinados, dependiendo de si las muestras se analizaron por cultivo o
por T-RFLP. La Tabla 2 muestra los gneros / especies identificadas en al menos
cuatro nios de cada seis en diferentes ocasiones. Tanto T-RFLP y la cultura
identificaron Bifidobacterium, Clostridium y Bacteroides spp colonizadores tan
comunes de la microbiota infantil durante todo el primer ao de vida. El uso de la
cultura, la E. coli y estafilococos se encontraron en todos los lactantes y los
enterococos en 5/6. El uso de T-RFLP, enterobacterias fue identificado en todos
los recin nacidos de hasta 6 meses de edad, mientras que los estafilococos slo
eran frecuentes en la muestra de 1 semana y enterococos no fueron identificados
como un colonizador importante. Por el contrario, Streptococcus spp, Veillonella y
varios anaerobios, que estaban entre los colonizadores ms frecuentes de
acuerdo con T-RFLP, no resultaron ser igualmente frecuente, uso de la cultura
para la deteccin. Curiosamente, las primeras muestras (1- 2 semanas)
produjeron varios fragmentos de T-RFLP no identificados que claramente difieren
de los no identificados T-FR que prevalecan en la dcada de muestras (6 y 12
meses). No identificado T-FR eran menos comunes en los 1 y 2 meses de las
muestras.
3.3.3. Complejidad microbiota analizada por T-RFLP y la cultura
T-RFLP es ideal para determinar la complejidad microbiota; como cada taxn est
representado por un pico; el nmero de picos se puede calcular y se utiliza como
una medida de la complejidad. Como se observa en el anlisis de beb F
( Figs 1, 5A), haba ms T-RFs en las muestras 1 y 2 semanas (25 y 30,
respectivamente) que en las muestras 1 y 2 meses (19 y 21 , respectivamente).

Examinamos complejidad microbiota en los seis bebs como una funcin del
tiempo, es decir, el nmero de taxones (especies o gneros) identificados en cada
ocasin de muestreo. Fig. 5A muestra el nmero total de T-FR distinguido por TRFLP en cada muestra fecal recolectada de los seis nios estudiados (A-F).
Curiosamente, con la excepcin de infantil B, se detect un mayor nmero de
taxones bacterianos en las muestras de la semana 1-2 que en las muestras 1-2
meses, produciendo una curva de complejidad "forma de V" (Fig. 5A). En
promedio, el nmero de T-RFS detectados por T-RFLP fueron 22 (1 semana), 21
(2 semanas), 17 (1 mes), 19 (2 meses), 26 (6 meses) y 36 (1 ao) . Por lo tanto, el
nmero de T-RFs tendi a disminuir entre 1 semana y 1 mes de edad (p = 0,09),
mientras que un claro incremento en el nmero de picos se observ entre 1 y 12
meses de edad (p = 0,03). Aproximadamente la mitad de los picos que estaban
presentes en las muestras iniciales (1 y 2 semanas) haba desaparecido en
alrededor de 1 mes y no fueron vistos de nuevo en el mismo nio, mientras que la
otra mitad apareci de nuevo una o varias veces en las siguientes muestras. La
identidad de la T-FR que desapareci despus de las primeras semanas fueron
diferentes entre los nios, y hay un patrn no general podra ser discernido.
En total, se identificaron 845 T-FR en las 36 muestras examinadas por T-RFLP, en
representacin de 146 nicas T-FR (filotipos bacterianas). Utilizando la base de
datos de T-RF (datos del Suplemento) que comprende T-FR de 130 especies
diferentes, hemos sido capaces de identificar 553/845 (65%) del total de T-FR o
72/146 (49%) del T- nica FR. En promedio, la cultura identific alrededor de la
mitad de muchos taxa bacteriana nica al igual que T-RFLP (promedio de 41%,
rango: 25 a 63% en los lactantes individuales, la figura 5B.). No hubo una
tendencia hacia una mayor complejidad en la dcada de muestras usando la
cultura (Fig. 5B), lo que indica que las especies anaerobias adquiridos despus de
6 meses de edad fueron, en gran medida, se perdidas. Curiosamente, el mismo
puede decirse de las primeras muestras, que no aparecieron ms compleja que la
muestra 1-2 meses mediante la cultura. Por lo tanto, un nmero de bacterias
presentes en las primeras muestras tambin se perdieron por la cultura.
3.3.4. Anlisis por clonacin y secuenciacin del gen 16S rRNA
Con el fin de ampliar nuestra base de datos de T-RF con bacterias no cultivables,
clonado y secuenciado amplificado por PCR 16S rRNA genes de nueve muestras
fecales que contenan muchos T-FR que no pudieron ser identificados a partir del
anlisis de las cepas cultivadas. Se obtuvieron un total de 927 clones y despus
de la deteccin en gel de agarosa de los productos, 834 clones se analizaron con
xito utilizando T-RFLP (Tabla 3). Los clones con el mismo perfil de digestin
parcial T-RFLP se agruparon y al menos dos representantes de cada clon se
seleccionaron para la secuenciacin. La longitud promedio de las secuencias fue
de 500 nt y las secuencias mostraban <98% de similitud con secuencias
previamente publicadas, se llev a cabo cerca de la secuenciacin de longitud
completa del gen 16S rRNA. Clasificacin taxonmica revel que el 64% de los

clones pertenecan al phylum Bacteroidetes, representada principalmente por los

gneros Bacteroides, Parabacteroides, Barnesiella y Prevotella. El segundo
phylum ms prevalente fue la Firmicutes (25%), que fue representado por tres
clases, entre las cuales la clase clostridios era ms prevalente con gneros como
Ruminococcus, Clostridium, Eubacterium, Faecalibacterium y Lachnospira.
Negativicutes (familia inusual de bacterias) estuvieron representados por
Veillonella y Dialister y la clase Bacilos por Streptococcus y Lactobacillus.
Proteobacteria (principalmente Enterobacteriaceae) se detecta fcilmente,
mientras que el gnero Bifidobacterium slo se detect en una sola muestra (Tabla
3).
TABLA 2
La mayora de los grupos de bacterias prevalentes en la microbiota fecal infantil segn lo determinado por la cultura y la
T-RFLP.
Nmero

de

lactantes

(n)

1 week

2 weeks

Cultur
e E.
coli
Bifdobacterium

6
6

E. coli

Bacteroides
Enterococcus
Clostridium
S. aureus

produciendo

un

grupo

de

bacterias

especifcas

en

las

heces.

1 month

2 months

6 months

12 months

6
6

E. coli
Bifdobacterium

6
6

E. coli
Bifdobacterium

6
6

E. coli
Bifdobacterium

6
6

E. coli
Co-neg

6
6

Bifdobacterium

S. aureus

5
4

S. aureus
Bacteroides

5
4

Lactobacillus

4
4

Enterococcus
Clostridium

4
4

T-RFLP
Enterobacteriaceae
Bacteroides

6
5b

Enterobacteriace
ae
Bacteroides

6
5b

Bifdobacterium

Streptococcus

Clostridium
Staphylococcus

5
4

Veillonella

Co-neg Staph

Co-neg Staph

Co-neg Staph
Bacteroides
Enterococcus

Co-neg Staph

Co-neg Staph

Staph
Bifdobacteriu
m
Bacteroides
Enterococcus

6
5

S. aureus
Bacteroides

5
4

Bacteroides
Enterococcus

5
5

5
5

4
4

Enterococcus

Clostridium
S. aureus

4
4

Clostridium

5
5

Enterobacteriace
ae
Bifdobacterium

5
5

Enterobacteriace
ae
Bacteroides

6
6b

Veillonella
Clostridium

6
6

Bifdobacterium
Enterobacteriace
ae
Bacteroides

4b

Bacteroides

5b

Bacteroides

5a

Bacteroides

Bifdobacterium
Barnesiella

5
4

Veillonella
Lactobacillus

4
4

4a
4

Veillonella
Bifdobacterium

5
5

Clostridium

Streptococcus

Clostridium

Streptococcus

595

Streptococcus

Coprobacillus

277
Bifdobacteriu
m
Ruminococcu
s
Lactobacillus

6
5

Bacteroides
Propionbacteriu
m
Clostridium

595#

876#

Lactobacillus

Coprobacillus

702#

495#

Enterobacter

876#

Selenomonas

136

495#

516#

a
b

Las muestras de heces de seis nios a los seis puntos de tiempo fueron analizadas por la cultura y la T-RFLP. Taxa bacteriana
identifcada en al menos 4/6 infantes por la cultura o la T-RFLP, respectivamente, se indican y (n) se refere al nmero de
recin nacidos en los que se encontr el respectivo taxn. Cursiva = bacterias anaerobias, * Staphylococcus. #Unidentifed TFR son presentados por sus respectivos tamaos de los fragmentos. ab = diferentes Bacteroides con tamao T-RF en torno al
80 y 90, respectivamente.

5
5

A
14
3
6
9

B
9
1
7
3

C
D
E
F
13 14 16 162Total
6
4
9
59 Id.(%)
6
6
7
3
3
6

A
68

B
5
8

C
41

D
6
8

E
55

F Inf
an
4 t
0 To
tal

Fig. 5. LA compleja Microbiota como una funcin en seis nios de la edad. Las muestras de heces de los bebs A-F se recogieron en seis
ocasiones durante el primer ao de vida (1 y 2 semanas de edad y de 1, 2, 6 y 12 meses de edad), analizados por T-RFLP e identificados
(cuando sea posible) utilizando una base de datos. (A) El nmero de T-RFS detectados en cada muestra se representa por una barra de
color negro, de ah que cada beb es representado por seis barras, una para cada cultura. A continuacin, el nmero total de T-RFs
identificados en ese beb est indicado, as como la proporcin de T-RFs que podran ser identificados mediante el uso de la base de datos
(Id%). La mayora de los lactantes demostraron una alta complejidad en las primeras muestras, seguido por una disminucin en la
complejidad alrededor de 1-2 meses de edad (tercera-cuarta barras), y el aumento de la complejidad de nuevo en las ltimas muestras (6 y
12 meses de edad). (B) Anlisis de las mismas muestras mediante cultivo aerobio y anaerobio cuantitativo revel menos taxones bacterianos
y no revel el patrn de complejidad bifsica visto con T-RFLP.

4. Discusin
En el presente estudio, hemos optimizado T-RFLP para el anlisis de la microbiota
de los lactantes y examinamos su funcionamiento el uso de muestras fecales de
seis nios que fueron seguidos desde 1 semana hasta 1 ao de edad.
En teora, el tamao T-RF puede calcularse a partir de conocimiento de los sitios
especficos de escisin de la enzima ("en la digestin silico"). En la prctica, esto
era imposible, ya que el tiempo de migracin no estaba linealmente relacionada
con el tamao T-RF a travs del ciclo tamao, de acuerdo con informes anteriores.
Por lo tanto, se utiliz el anlisis de T-RFLP de aislamientos bacterianos de
especies conocidas para la construccin de una base de datos para permitir la
identificacin de los T-FR en una muestra. La clonacin y secuenciacin, seguido
de T-RFLP, proporcionaron datos adicionales con respecto a la identidad de T-FR
en representacin de las bacterias no cultivables. Con este enfoque, se obtuvieron
conocimientos sobre el T-FR que corresponde a ms de un centenar de especies
de bacterias comunes en la microbiota intestinal infantil. Esta base de datos nos
permiti directamente identificar aproximadamente el 60% de los picos
encontrados en muestras fecales de seis bebs desde el nacimiento hasta los 12
meses de edad. Por lo tanto, a pesar de los grandes esfuerzos, una proporcin
sustancial de la microbiota intestinal infantil todava consista en bacterias no
identificadas, lo cual es una clara limitacin del mtodo T-RFLP cuando se emplea
en muestras de la microbiota intestinal.

T-RFLP en la mayora de los casos permite la identificacin a nivel de gnero y, en

muchos casos, varios T-RFs representaron un cierto gnero. De acuerdo,
Nieminen et al concluyeron que el nivel taxonmico resolucin del mtodo de TRFLP fue entre gnero y especie. La baja resolucin taxonmica es un problema
significativo cuando se utiliza la secuenciacin masiva en paralelo, "la
secuenciacin de prxima generacin", ya que se basa en el anlisis de slo
partes del gen 16S rRNA. Por ejemplo, la secuenciacin basado en 400 bases del
gen 16S rRNA slo da una probabilidad de 89% para llevar a cabo la identificacin
a nivel de gnero, por 50 bases que se utilizan comnmente en muchos estudios
de pirosecuenciacin temprana, esto se reduce a 52%. Un problema significativo
fue, sin embargo, planteado por Enterobacteriaceae, que estaban presentes en
todas las muestras y se detect fcilmente, pero que no se pudo resolver an ms
por T-RFLP, excepto por una clara T-RF producida por algunas especies dentro del
gnero Enterobacter.
Tambin esto est de acuerdo con informes anteriores. El gen 16S rRNA
heterogeneidad vara entre los taxones bacterianos y muchas especies de la
familia Enterobacteriaceae son 96% idnticos en el gen rRNA 16S, que hace que
sea prcticamente imposible de diferenciar, por ejemplo, E. coli, Klebsiella y
Proteus, por 16 S rRNA- mtodos basados. En contraste diferentes Bacteroides
spp. comparten slo el 47% -96% de identidad de secuencia, explicando por qu
Bacteroides podra escribirse casi hasta el nivel de especie; diez especies
diferentes Bacteroides produjeron nicamente siete T-FR. Es posible que la
resolucin taxonmica se podra aumentar mediante el uso de ms de una enzima
para la escisin del gen 16S rRNA amplificado. Al principio habamos probado las
enzimas de restriccin MspI y AluI pero posteriormente utiliza slo Mspl como la
construccin de bases de datos sera una labor muy intensa usando dos enzimas.
Mspl ha demostrado tener la ms confiable resolucin entre 18 enzimas y produce
el ms alto nmero de patrones nicos de T-RF cuando se analiza la flora del
colon humano. Nuestro anlisis PCA de los datos de T-RFLP mostr que MspI
podra separar y agrupar las diferentes muestras fecales de acuerdo con otros
estudios publicados.
La comparacin entre T-RFLP y la cultura anaerbica y aerbica utilizando medios
selectivos y no selectivos, revel que T-RFLP identific 2,5 veces ms diferentes
taxones que hizo el anlisis basado en la cultura. Esto se debi principalmente a la
identificacin de varias bacterias anaerobias obligadas por T-RFLP que fueron
muy a menudo se perdi por la cultura, incluyendo Veillonella, Coprobacillus y
Ruminoccous, as como un nmero de T-FR que no pudo ser resuelto.
Ruminococcus es muy sensible a la exposicin al oxgeno y por lo tanto es difcil
de cultivar a menos que todo el manejo de las muestras se lleven a cabo bajo
estrictas condiciones anaerbicas. Bacteroides se detect con mayor frecuencia
por T-RFLP que por la cultura, que est de acuerdo con observaciones anteriores.

Lo contrario era cierto para las bifidobacterias, mientras que los lactobacilos y
Clostridium difficile fueron igual de fcilmente detectados por ambos mtodos. Por
lo tanto, varias de las bacterias anaerobias que colonizan el recin nacido puede
ser detectada por la cultura, con la condicin de que los medios selectivos estn
disponibles y la especie no es exclusivamente sensible al oxgeno.
La clonacin y secuenciacin identific principalmente Bacteroides, algunos
clostridios, Veillonella y enterobacterias en las muestras fecales analizadas. Dado
que slo aproximadamente 100 clones se examinaron a partir de cada muestra,
109 CFU/g de heces se puede esperar slo las bacterias presentes en los niveles
de poblacin muy por encima de 109 CFU para ser detectados por este mtodo.
Sin embargo, esto no explica la incapacidad de identificar Bifidobacterium spp, que
eran, de acuerdo a la cultura, presente en niveles iguales o mayores de poblacin
como Bacteroides. Para los anlisis basados en el gen 16S rRNA, varios factores
pueden influir en el lmite de deteccin:
1) El grado de ajuste de los cebadores de PCR universales. Bifidobacterias
pertenecen al filo Actinobacteria se caracteriza por un alto contenido de GC
y varios cebadores universales no pueden ser ideal para detectar estas
bacterias.
2) El nmero de copias del opern 16S que vara de 1 a 15 entre las especies
bacterianas (Acinas et al., 2004). Por ejemplo, Bifidobacterium tiene 3,6
copias en promedio, en comparacin con 6 en Bacteroides (de acuerdo con
el ARN ribosomal opern).
3) La eficacia por la que el ADN bacteriano se puede extraer de la muestra.
ADN podra ms fcilmente obtenerse de bacterias Gram-negativas tales
como Bacteroides y Enterobacteriaceae, mientras que algunas bacterias
Gram-positivas tienen una pared celular muy gruesa y resistente. Creemos
que esto puede ser la razn principal de la poca deteccin de enterococci a
pesar de que la mayora de las muestras tenan >106 UFC / g de
enterococos. Se utiliz el kit de extraccin de Qiagen identificado por
McOrist et al. (2002) como el ms eficaz entre cuatro kits de extraccin de
ADN fecal comerciales y complementado con golpes de perlas de vidrio de
la muestra para mejorar an ms la posibilidad de romper la pared celular.
Esto todava podra ser inadecuada para la extraccin de ADN a partir de
bacterias Gram-positivas.

En contraste con la clonacin y secuenciacin, T-RFLP era, en la mayora de

los casos, capaces de detectar las bacterias que estaban presentes en una
muestra fecal por encima de una poblacin de 106 CFU / g. Esto hace que el
mtodo ms adecuado que la secuencia para el anlisis de la microbiota
complejo con grandes variaciones en la densidad de poblacin entre diferentes
taxones - tericamente al menos 10.000 secuencias deben ser analizados para
obtener una sla lectura de una bacteria presente en un nivel de 106 UFC / g

dentro de una poblacin total de 1011 UFC / g. La ventaja de T-RFLP es que

los fragmentos se separan por tamao antes de ser detectado. Por lo tanto, la
presencia de 100 a 1.000 veces el exceso de ADN Bacteroides no impide
necesariamente la deteccin de una especie subdominante, siempre que no
tenga un T-RF que difiere claramente en tamao de estas bacterias
dominantes.
El anlisis basado en la cultura mostr una sensibilidad superior para las
bacterias facultativas, sobre todo porque a menudo estaban presentes en
niveles relativamente bajos de poblacin. Aunque (obligatoriamente)
anaerobios
son cuantitativamente dominante en la microbiota fecal,
especialmente en los adultos, las bacterias facultativas pueden tener especial
relevancia en trminos de estimulacin inmune y conformacin del sistema
inmune del lactante, por ejemplo por ser capaz de trasladar, es decir, pasar
intacto y viable a travs de la mucosa , una propiedad no es compartida por la
mayora de los anaerobios estrictos.
El anlisis de los patrones de T-RFLP de las muestras de heces infantiles
produjo una imagen interesante que, dentro de nuestro mejor conocimiento, no
se ha informado antes. Parece que en la mayora de los nios, una alta
diversidad bacteriana caracteriza las muestras fecales de una y de dos
semanas, pero la complejidad microbiota disminuy despus de llegar
alrededor de 1 mes de edad. A partir de entonces, la complejidad aumenta
notablemente, siendo ms alta en la ltima muestra recogida a los 12 meses
de edad. Es bien sabido que la complejidad de la microbiota aumenta durante
el primer ao de vida, ms y ms bacterias anaerbicas se depositan en el
intestino.
Sin embargo, la alta complejidad bacteriana de las muestras obtenidas de 1 y 2
semanas de edad fue un hallazgo inesperado. Varias especies bacterianas que
se encontraron en las muestras fecales desaparecieron de la microbiota
despus de las primeras semanas y no vuelven a aparecer. Algunas de ellas
pueden derivarse del canal del parto, ya que todos los nios examinados aqu
fueron entregados por va vaginal.
Muchos colonizadores del intestino no profesionales probablemente tuvieron
la oportunidad de expandirse en las primeras semanas, pero no sern capaces
de soportar la competencia ms profesional que adquieren algunas bacterias
intestinales. Adems, pueden ser ms sensibles a pptidos antibacterianos
producidos en la mucosa en respuesta a la colonizacin. Informes anteriores
han demostrado que las bacterias procedentes de la flora vaginal de la madre
pueden ser cultivadas a partir de contenido gstrico del beb inmediatamente
despus del nacimiento,pero que muchas de estas bacterias no pueden
colonizar el intestino del lactante.

Utilizando el componente principal del anlisis, encontramos que las primeras

muestras tenan una microbiota relativamente nico en cada nio, pero que la
microbiota de los lactantes de ms edad era ms similares entre s.
Esta convergencia est de acuerdo con los resultados anteriores (Kurokawa et
al., 2007).
Hacia el final del primer ao de vida, una microbiota ms compleja es
desarrollada, probablemente como resultado de la exposicin a una mayor
variedad de bacterias despus del destete, y quizs tambin debido a cambios
en el medio intestinal despus de la terminacin de la lactancia materna. La
leche materna crea un entorno en el intestino infantil que suprime el
crecimiento de muchas especies bacterianas. Nuestros resultados sugieren
que T-RFLP es bastante sensible y adecuado para una rpida caracterizacin
de la microbiota intestinal infantil. Sin embargo, las bacterias facultativas en los
niveles de poblacin moderados slo se detectaron utilizando cultivo en medios
selectivos. Por otra parte, varios T-FR permanecieron sin identificar, no existe
un mtodo simple de saber de qu bacteria se derivan, sobre todo si no estn
presentes en muy altas poblaciones y por lo tanto pueden escapar a la
deteccin mediante clonacin y secuenciacin o la secuenciacin de prxima
generacin. Por lo tanto, una caracterizacin completa de la microbiota
intestinal infantil requiere una combinacin de mtodos.

TRADUCIDO POR DIANA PAULINA PADILLA ANTON.