Comparacin de bacterias cido lcticas

productoras de Nisina y Pediocina en

embutidos (salchicha)

NDICE

1. PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA 5
2. HIPTESIS
.. 5
3. JUSTIFICACIN
6
4. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS
ESPECFICOS.. 7
5. ANTECEDENTES
. 8
6. MARCO
TERICO
. 10
6.1.
BACTERIAS CIDO
LCTICAS.
10
6.2.
BACTERIOCINAS
. 11
6.2.1.PROPIEDADES BIOQUMICAS DE LAS
BACTERIOCINAS... 12
6.2.2.PRODUCCIN DE LAS
BACTERIOCINAS 13
6.2.3.BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS CIDO
LCTICAS 14
6.2.3.1. CLASIFICACIN DE LAS BACTERIOCINAS PRODUCIDAS
POR BAL..16
6.2.3.2. ESPECTRO DE
INHIBICIN 18
6.2.3.3. MODO DE
ACCIN
20
7. NISINA
.. 21
8. PEDIOCINA.

.. 22
9. APLICACIN DE BACTERIOCINAS EN
ALIMENTOS. 23
10. PROCUCTOS
CRNICOS
24
2

11. EMBUTIDOS ESCALDADOS: SALCHICHAS.

.. 26
12. EVALUACIN
SENSORIAL
... 27
13. MATERIALES Y
METODOS
.. 28
13.1.
ETAPA 1: AISLAMIENTO, PURIFICACIN, IDENTIFICACN Y
CONCERVACIN DE CEPAS DE BACTERIAS CIDO
LCTICAS. 28
13.2.
ETAPA 2: CONSERVACIN Y DETERMINACIN DE LA
TERMORESISTENCIA DE LAS ESPECIES PRODUCTORAS DE
PEDIOCINA Y NISINA. 29
13.3.
ETAPA 3: INOCULACIN Y ANLISIS EN LA VIDA DE ANAQUEL
DE LAS BACTERIAS
TERMORESISTENTES
. 30
13.4.
ETAPA 4: PRUEBA DE ACEPTACIN, DISEO EXPERIMENTAL Y
ANLISIS ESTADSTICO DEL EFECTO DE LA INOCULACIN DE
BACTERIAS PRODUCTORAS DE
BACTERIOCINAS..
31
14. RESULTADOS
. 32
15. CONCLUSIN
... 35
16. BIBLIOGRAFA
.. 36
17. ANEXO
A
.. 41
18. CRONOGRAMA
42

NDICE DE TABLAS
TABLA 1. EJEMPLO DE BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS
CIDO
LCTICAS
.. 16
3

TABLA 2: MICROORGANISMOS NO LCTICOS Y LA RESPECTIVA

BACTERIOCINA
DE BACTERIAS CIDO LCTICAS QUE LO
INHIBE.. 19
TABLA 3: PRUEBA DE ACEPTACIN DE LAS SALCHICHAS INOCULADAS
CON LAS BAL TERMORESISTENTES COMPARADAS CON UN CONTROL SIN
INOCULAR.. 33

NDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. FERMENTACIN LCTICA: A) HOMOFERMENTATIVA;
B)
HETEROFERMENTATIVA
. 10
FIGURA 2. MECANISMO DE ACCIN DE LA NISINA EN DOS
ETAPAS. 20
FIGURA 3. ESTRUCTURA QUMICA DE LA
NISINA 21
FIGURA 4. PASOS PARA EL AISLAMIENTO DE L. lactis Y P.
acidilactici. 28
FIGURA 5. TINCIN GRAM Y MORFOLGICA MICROSCOPICA DE LA
BACTERIAS
a) L.lactis Y b) P.
acidilactici
29
FIGURA 6. POBLACIN MICROBIOLGICA DE LAS MUESTRAS
INOCULADAS CON
L. lactis PARA ENTEROBACTERIAS EN LAS
MUESTRAS CONTROL 34

Comparacin de bacterias cido lcticas productoras de nisina y

pediocina en embutidos (salchicha).

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Diariamente la industria crnica se enfrenta a diferentes situaciones relativas a la
aparicin de peligros y/o riesgos para la salud de los consumidores. Muchos de
estos peligros se dan cuando la conservacin de estos mismos no es la adecuada,
o cuando los peligros microbiolgicos estn latentes, producindose el deterioro
de los productos en poco tiempo. Este problema es causa de elevadas prdidas
econmicas en las industrias por lo que, en la actualidad, se estn aumentando
los esfuerzos para minimizar o reducir los costes derivad<os de estas situaciones.
Los productos embutidos tienen una fecha de caducidad muy corta an en
condiciones de refrigeracin por lo que algunos productos elaborados como es la
salchicha requiere de la adicin de sustancias que ayuden a reducir la carga
microbiana hasta que el producto llegue al consumidor.
En los embutidos se utilizan para su conservacin la natalicia, un anti fngico
obtenido a partir de cultivos de Streptomyces natalensis que se adhiere a la pared
celular de algunos tipos de mohos y levaduras y las destruye. La aplicacin de
esta sustancia se realiza generalmente en forma lquida, mediante un spray. Sin
embargo, esta tcnica muestra un inconveniente; la baja viscosidad de la mezcla
lquida que contiene la natalicia no permite que sta quede adherida a toda la
superficie de algunos productos tales como la salchicha, dejando que algunas
partes de la carne queden expuestas a la proliferacin de microorganismos
deteriorantes.
Mediante la presente investigacin se evaluar dos alternativas de conservadores,
aplicando bacterias productoras de "nisina y pediocina" derivados de bacterias
cido lctico en salchichas, por lo que se comprobar su efecto en la duracin y
conservacin de este embutido, sin afectar sus caractersticas fsicas, qumicas y
sensoriales.

2. HIPTESIS

Las bacterias productoras de bacteriocina pediocina es el mejor conservador para

inhibir microorganismos no deseados que provocan la descomposicin de
alimentos fermentados (salchicha).

3. JUSTIFACIN
En la industria de alimentos se utiliza conservantes qumicos con capacidades
bactericidas como los sulfatos y los nitritos; sin embargo, estos bactericidas
presentan ciertos riesgos, ya que al estar presentes en la mayora de los alimentos
puede sobrepasar el lmite de ingesta diaria y entrar a ser txicos, ocasionando
enfermedades degenerativas en el sistema metablico como el cncer (Herrera,
2009).
Las personas estn siendo ms conscientes de la alimentacin y sus
implicaciones para la salud, de all que se haya asociado a los aditivos qumicos
como factores que pueden desencadenar problemas en el organismo del ser
humano (Casaus, 1998). Se calcula que ms del 20% de todos los alimentos
producidos en el mundo se pierden por accin de los microorganismos que los
estropean y los convierte en foco de enfermedades. Esto obliga a la bsqueda de
metodologas alternativas para conservar alimentos.
Actualmente hay una demanda creciente por los alimentos mnimamente
procesados y por reducir el uso de conservadores qumicos, esto ha llevado a la
industria alimentaria a reconsiderar el potencial antimicrobiano de las
bacteriocinas producidas por LAB ya que pueden ser consideradas como
conservadores naturales o bioconservadores (Alquicira Paez, 2006).
Las bacteriocinas poseen actividad antimicrobiana, letal o inhibidora, frente a
diferentes grupos bacterianos (Tecnologa y Alimentos, 2008). Aunque las
bacteriocinas se pueden sintetizar por levaduras, bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas, son las producidas por las bacterias cido lcticas las que han
recibido mayor atencin porque, adems de conservar alimentos, provienen de un
grupo bacteriano, por excelencia, saludable (Madrid, 1992). No slo interesa una
reducida carga microbiana, sino la ausencia de patgenos de importancia sanitaria
que constituyen un riesgo para los consumidores ya que su naturaleza peptdica
permite la degradacin por las enzimas digestivas, resultando as presuntivamente
inocuas para el consumidor (Dez Aldama, 2011).
La aceptacin del empleo de bacterias productoras de bacteriocinas como una
alternativa natural para la preservacin de alimentos ha despertado inters en
productores cuyos mercados les presentan exigencias estrictas de calidad
microbiana (Concha, Faras, Kmmerlin, & Sesma, 1999).
7

Las propiedades fisicoqumicas de las bacteriocinas las hacen resistentes a los

tratamientos trmicos y cambios de pH que sufren los productos carnicos
fermentados durante su fabricacin y almacenamiento y, adems, su pequeo
tamao permite la difusin en sistemas semislidos, propios de la mayora de los
productos alimentarios (Martnez Fernndez, 1996).
Uno de los factores ms importantes que repercute en la venta de productos
alimenticios, es el sabor en donde el uso de bacterias productoras de
bacteriocinas obtenidas de BAL han contribuido como potenciadores del sabor o
como precursores directos de otros compuestos de sabor durante la maduracin
de embutidos fermentados (Leroy et al. 2005). Por ello las bacteriocinas son
conservadores naturales aceptables en la fabricacin de productos crnicos
fermentados.

4. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la accin de las bacterias productoras de bacteriocina Nisina y Pediocina,
frente a diferentes bacterias patgenas en la conservacin de embutidos
fermentados.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Analizar los diferentes mecanismos de accin de las bacterias productoras

de bacteriocinas Nicina y Pediocina.
Estudiar las tcnicas de produccin de las bacterias productoras de
bacteriocinas Nisina y Pediocina.
Analizar las bacterias patgenas presentes en la salchicha que son
contrarrestadas por las bacterias productoras de bacteriocinas Nisina y
Pediocina.
Analizar el efecto en la vida de anaquel de la salchicha con bacterias
productoras de Nisina y Pediocina.

5. ANTECEDENTES
Debido a que las BAL son la microflora predominante de manera natural en la
carne y mataderos, algunas de estas bacterias pueden sobrevivir al tratamiento
trmico.
Franz y Holy (1996) aplicaron un doble tratamiento a BAL en medio lquido antes
de ser inoculadas en salchichas, encontrando que la supervivencia de estas
bacterias se increment probablemente debido a la exposicin prolongada al calor.
Las BAL tienen cierta capacidad de inhibicin para ciertos patgenos, como
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Salmonella sp (Hammes y
Tichackzek, 1994). La inhibicin de Listeria monocytogenes y Listeria innocua por
ciertas especies de BAL debido a la produccin de bacteriocinas ha sido tambin
reportada (Harris et al., 1992). La presencia y sobrevivencia de BAL no afecta las
caractersticas organolpticas y juegan un papel importante en la fermentacin de
productos crnicos.
Gonzlez y col (2003) , sealan que la accin antimicrobiana de las bacteriocinas,
representa un gran potencial para la industria alimentaria ya que se pueden utilizar
como conservadores biolgicos puros que en un momento dado podran
reemplazar a los conservadores qumicos ya que tienen la ventaja de ser
protenas que al biodegradarse no forman compuestos antimicrobianos. Por lo
tanto, las cepas productoras de bacteriocinas podran ser empleadas como
cultivos iniciadores activos frente a patgenos como Listeria monocytogenes
(Leroy et al., 2005; Aymerich et al., 2008).
Las bacteriocinas como la nisina, enterocinas o leucocinas mejor la reduccin de
L. monocytogenes y de S. aureus en productos fermentados (Glvez et al., 2008)
Diversas cepas de Lactobacillus productoras de bacteriocinas (principalmente Lb.
sakei y Lb. curvatus, Lb. rhamnosus y Lb. plantarum) han demostrado tener
efectos inhibidores frente a Listeria en fermentaciones de salchichas o salami,
dependiendo en gran medida de la cepa y el tipo de carne (Todorov et al., 2007).
La cepa Lb. sakei CTC 494 (productora de sakacina K) es un cultivo iniciador
interesante con actividad frente a Listeria, siendo capaz de inhibir con xito a L.
9

monocytogenes en embutidos fermentados al estilo espaol y alemn (Aymerich

et al., 2008) o reducir las poblaciones de Listeria en salchichas belgas, salami
italiano y salami Cacciatore (Ravyst et al., 2008).

Los pediococos productores de bacteriocina pueden reducir las poblaciones de L.

monocytogenes en productos crnicos fermentados (Amzquita y Brashears,
2002; Rodrguez et al., 2002; Aymerich et al., 2008). Los pediococcos son
preferidos como cultivos iniciadores (en lugar de los lactobacilos) en ciertos
productos, por ejemplo en embutidos al estilo americano fermentados a
temperaturas ms altas. Las cepas productoras de Pediocina PA-1 no inhiben a
bacterias que son importantes para la fermentacin de los embutidos como estafi
lococos y micrococos (Gonzlez y Kunka, 1987). Algunas cepas de lactococos
productoras de nisina aisladas de embutidos fermentados tambin se han
propuesto como cultivos adjuntos para mejorar la seguridad microbiolgica de los
productos crnicos fermentados elaborados en condiciones higinicas deficientes,
tales como en productos tradicionales caseros (Noonpakdee et al., 2003).
El empleo de bacterias productoras de bacteriocinas puede ser una barrera
interesante para la inactivacin de microorganismos en embutidos, en los que su
pH ms elevado y el mayor contenido en agua pueden facilitar la supervivencia y
proliferacin de ciertas bacterias patgenas.

10

6. MARCO TEORICO
6.1.

BACTERIAS CIDO LCTICAS

Las bacterias cido lcticas (BAL) son un grupo filogenticamente diverso de

bacterias Gram positivas caracterizado por algunos rasgos comunes, ya sean
morfolgicos, metablicos o fisiolgicos (Surez, 1997). Se caracterizan por la
produccin de cido lctico como producto metablico final de la fermentacin de
carbohidratos (Monroy Dosta, Castro Barrera, Frnandez Perrino, & Mayorga
Reyes, 2009). Tienen forma de cocos o bacilos, la mayora son aerotolerantes
anaerobios, catalasa y oxidasa negativas y sintetizan ATP en la fermentacin
lctica de los glcidos, carecen de citocromos y no forman esporas. Segn sus
caractersticas bioqumicas, estas bacterias se clasifican en homofermentativas;
cuyo nico producto final de fermentacin es el cido lctico y en
heterofermentativas, aquellas que producen adems del cido lctico, etanol,
acetato y CO2, como se muestra en la figura 1. El grupo de las BAL comprende
microorganismos de los gneros Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium,
Dolosigranulun,
Enterococcus,
Globicatella,
Lactobacillus,
Lactococcus,
Lactosphaera,
Leuconostoc,
Oenococcus,
Pediococcus,
Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella (Monroy et al., 2009).
a.-

b.
-

Figura 1. Fermentacin lctica; a) homofermentativa; b) heterofermentativa.

(Adaptada de Larpent, 1995)

Estos microorganismos producen diferentes sustancias con caractersticas

antimicrobianas. La capacidad de producir grandes cantidades de cido actico y
cido lctico por fermentacin de los carbohidratos presentes y la consecuente
cada del pH son los factores primarios en los que se basa la actividad
antimicrobiana de las BAL (Martnez Fernndez, 1996).
11

Asimismo, los productos del metabolismo de algunas BAL, como el perxido de

hidrgeno y el diacetilo producido por bacterias fermentadoras del citrato, pueden
contribuir tambin a la conservacin de los productos alimenticios. La accin
bactericida del perxido de hidrgeno se atribuye a su efecto altamente oxidante,
mediante peroxidacin de los lpidos de la membrana y la destruccin de la
estructura molecular bsica de protenas celulares. El diacetilo en cambio acta
desactivando enzimas microbianas por bloqueo o por modificacin de la zona
cataltica (Martin 16Katusic, 2002). Este efecto es muy importante ya que los
hbitats de estas bacterias, en especial los alimentos crudos, poseen alta
actividad de agua y son muy ricos en nutrientes, por lo que la proliferacin
bacteriana se ve muy favorecida (Martnez Fernndez, 1996).
Las BAL son microorganismos importantes, industrialmente reconocidas por su
capacidad de conservacin as como por sus beneficios de salud y nutricin, han
sido utilizadas hace ms de 4 mil aos en la elaboracin de una gran variedad de
alimentos fermentados y elaborados de forma artesanal. Inicialmente se utilizaron
para retardar el deterioro y preservar los alimentos a travs de fermentaciones
naturales, posteriormente se fueron encontrando aplicaciones comerciales como
cultivos iniciadores para la industria lechera, crnica, de elaborados vegetales y de
bebidas alcohlicas (Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn, 2010).
Uno de los rasgos fisiolgicos ms caractersticos de las bacterias lcticas es su
tolerancia al cido como consecuencia obligada de su metabolismo, lo cual les
ofrece una gran ventaja selectiva para desarrollarse en los hbitats donde se
encuentran (Martnez Fernndez, 1996). El grupo de las BAL es probablemente
sea el ms abundante y difundido en la naturaleza, debido a la capacidad que
poseen de crecer en una variedad de sustratos y en diversas condiciones
biolgicas. Dentro de las bacterias lcticas, el grupo Lactobacillus es el ms
importante y heterogneo, incluyendo especies con propiedades bioqumicas y
fisiolgicas muy diferentes (Vsquez et al., 2009).

6.2.

BACTERIOCINAS

Las bacteriocinas son pptidos antimicrobianos producidos por un gran nmero de

bacterias, incluyendo bacterias cido lcticas. Normalmente actan contra
microorganismos no deseados o patgenos, estrechamente relacionados o
responsables del deterioro y causantes de enfermedades. Por esta razn, se
utilizan en varias aplicaciones, entre las que se encuentran la biopreservacin, la
extensin dela vida til, la accin antimicrobiana clnica y el control de la
fermentacin de la 17microflora (Marcos Balciunas, Castillo Martinez, Dimitrov,
Gombossy de Melo Franco, & De Souza Oliveira, 2013).
Las bacteriocinas comprenden un grupo grande y diverso de protenas o pptidos
antimicrobianos sintetizados ribosmicamente, algunos de los cuales se someten
12

a modificaciones post-traduccionales, que tienen un efecto bacteriocida o

bacteriosttico en otras bacterias ya sea de la misma especie (espectro estrecho)
o de otros gneros (Espectro amplio) (Marcos et al., 2013). La clula productora
sintetiza una molcula que la inmuniza contra la propia bacteriocina. La
produccin ocurre de forma natural durante la fase logartmica del desarrollo
bacteriano o al final de la misma, guardando relacin directa con la biomasa
producida (Vzquez et al., 2009).
Su sntesis se produce, generalmente, cuando las bacterias que las sintetizan se
encuentran en situaciones de estrs. Como es habitual en las rutas metablicas
de los microorganismos, la sntesis de las bacteriocinas tambin depende del
ecosistema, pH, potencial de xido-reduccin, cantidad de nutrientes, fase de
crecimiento, temperatura y oxgeno disponible (Tecnologa y Alimentos, 2008).
Las bacteriocinas son producidas por varias especies bacterianas, pero de
particular inters son aqullas producidas por bacterias cido lcticas.
Actualmente, la bioconservacin en la industria alimentaria se basa en las
bacteriocinas producidas especialmente por el gnero Lactobacillus. El potencial
de estos pptidos se basa en la adicin al alimento del microorganismo productor
de bacteriocina o una preparacin de sta, como una barrera adicional cuando se
pretende la preservacin por mtodos combinados (Hill, 1999).
Las bacteriocinas son inactivadas por enzimas tales como la tripsina y la pepsina,
las cuales se encuentran en el tracto gastrointestinal y por lo tanto, no alteran la
microbiota del tracto digestivo (Marcos et al., 2013).

6.2.1. PROPIEDADES BIOQUIMICAS DE LAS BACTERIOCINAS

Debido a su naturaleza proteica, todas las bacteriocinas se inactivan por una o
ms enzimas proteolticas, incluyendo aquellas de origen pancretico (tripsina y quimotripsina) y algunas de origen gstrico, como la pepsina. Esta caracterstica
permite la utilizacin de bacteriocinas en productos alimentarios, puesto que son
inactivadas durante su paso por el tracto gastrointestinal, sin ser absorbidos como
compuestos activos y sin causar los riesgos relacionados con el uso de
antibiticos (Martin Katusic, 2002) por lo tanto su ingesta resulta inocua para el
consumidor y no altera la microbiota intestinal normal (Suarez Gea, 1997).
Las bacteriocinas producidas por BAL son generalmente estables a pH cido o
neutro, lo que indica probablemente una adaptacin de estas sustancias al
entorno natural de las bacterias que las producen. La nisina y la lactoestreptocina
son, sin embargo la excepcin, ya que su actividad antimicrobiana es
extremadamente dependiente de este parmetro. La nisina tiene su mxima
solubilidad y estabilidad a pH 2,0, disminuyendo en la medida que aumenta el pH
siendo irreversiblemente inactiva a pH 7,0, mientras que las lactoestreptocinas son
estables y activas entre unrango de pH de 4,2 a 5,0 y reversiblemente inactivas
13

entre un de pH 7,0 y 8,0. Por el contrario, muchas de las bacteriocinas producidas

por BAL, resisten la exposicin a un amplio rango de pH entre 3,0 y 9,0. La
tolerancia a valores de pH extremos entre 1,0 a 2,0 y 10,0 a 11,0 han sido
reportadas para la acidocina B y bavaracina A (Martin Katusic, 2002).
En la mayora de las bacteriocinas producidas por BAL se ha demostrado cierta
resistencia al calentamiento, pudiendo resistir tratamientos equivalentes al de
pasteurizacin, pero la sensibilidad a la temperatura depende del estado de
purificacin de la bacteriocina, decreciendo en bacteriocinas purificadas y
parcialmente purificadas (Martin Katusic, 2002). Sin embargo, la nisina purificada
permanece activa despus de un calentamiento a 100C por 10 min a pH 2,0. La
caracterstica de termorresistencia que presentan algunas de las bacteriocinas
parece estar relacionada con su estructura molecular, normalmente compuesta por
pptidos pequeos que no presentan estructura terciaria (Martin Katusic, 2002).

6.2.2. PRODUCCIN DE LAS BACTERIOCINAS

La produccin de bacteriocinas depende del crecimiento y actividad fisiolgica de
la cepa productora. De hecho, la mayora de las bacteriocinas que se han
estudiado hasta el momento presentan una cintica de metabolito primario y, en
consecuencia, su produccin est correlacionada con el aumento de la biomasa.
Por otro lado, el control del pH a lo largo de la fermentacin puede resultar en
valores ms altos de actividad (Martnez Fernndez, 1996).
La produccin de bacteriocinas de BAL est usualmente asociada con la fase de
crecimiento de la cepa, y dicha produccin cesa al final de la fase exponencial
(algunas veces antes de que termine el crecimiento). Esto puede ser atribuido a la
adsorcin de la bacteriocina a las clulas productoras o a la degradacin de las
mismas por proteasas (Alquicira Paez, 2006).
En diferentes estudios se ha concluido que la glucosa es mejor fuente de carbono
que la sacarosa o la fructosa para la produccin de nisina y pediocina AcH (4000
UI/mL), disminuyendo hasta 2 veces con estas fuentes de carbono la produccin
de la misma bacteriocina. La adicin de fosfato de amonio y de potasio suprimi la
produccin de nisina en un medio sinttico. Tambin se observ que algunos
aniones como el fosfato y cationes como el magnesio y el calcio afectan la
produccin de bacteriocinas, aunque esto depende de la cepa (Alquicira Paez,
2006).
La produccin de algunas bacteriocinas puede ser favorecida bajo ciertas
condiciones de crecimiento. Por ejemplo las condiciones de incubacin, como son
la temperatura y el pH. Por lo que las condiciones de produccin deben ser
especficas para cada organismo productor (Rojas Muoz, 2010). En general los
medios complejos que contienen una fuente rica en nitrgeno son ptimos para el
aumento de produccin de bacteriocinas (Rojas Muoz, 2010). Es importante
14

elegir un medio de crecimiento correcto ya que este puede interferir o aumentar la

produccin y purificacin de bacteriocinas, por ejemplo, se ha reportado que el
Tween 80, interfiere en la purificacin de estas sustancias adems de que
disminuye la actividad antimicrobiana de pediodicina A y lactocina S (Monroy et al.,
2009).
El mtodo ms comn utilizado es la precipitacin con sulfato de amonio seguido
de una cromatografa HPLC (Rojas & Vargas, 2008). Consiste en que una vez
conseguida la produccin necesaria de la cepa de inters, se remueven las clulas
por centrifugacin y se precipita la protena con la adicin de sulfato de amonio,
seguido de varios pasos de cromatografa. Se han desarrollado otros mtodos con
separaciones por cromatografa y de acuerdo al pH del medio donde logran una
total liberacin o absorcin de las bacteriocinas dentro de la clula (Andrs Bello,
2012).
Para comprobar las caractersticas bioqumicas de la bacteriocina producida se
tratan las muestras obtenidas con diferentes proteasas (aquimiotripsina, tripsina,
proteinasa K, y pronasa E), o con otras enzimas (a-amilasa, lipasa A, lisozima,
aminopeptidasa, mutanolisina, DNAsa, y RNAsa); despus se determina el
tamao del compuesto producido mediante ultrafiltracin o se detecta la actividad
en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 15% (Tiwari & Srivastava, 2008).
Tambin se determina el campo de accin inhibitorio de la bacteriocina haciendo
diferentes pruebas de inhibicin in vitro, Mara Monroy et al., en 2009 describieron
dos tcnicas ampliamente utilizadas: antagonismo directo e indirecto. La primera
consiste en hacer crecer la cepa productora de la sustancia inhibidora junto a una
cepa indicadora o sensible y, observar, luego de la incubacin la formacin de
halos de inhibicin. El segundo tipo de antagonismo consiste en hacer crecer en
primer lugar la cepa productora de la sustancia inhibidora, de esta forma se
permite que libere la sustancia y solo entonces se siembra la cepa contra la cual
se desea observar el efecto antagnico (Monroy et al., 2009).

6.2.3. BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS ACIDO

LACTICAS.
Las bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas son las que encierran un
mayor inters ya que tienen el estatus de QPS (qualified presumption of safety), es
decir, son consideradas como microorganismos seguros para la salud, ya que
tanto ellas como sus metabolitos han sido consumidos en alimentos fermentados
por innumerables generaciones sin que hubiera efectos adversos en la poblacin
(Joerger, 2003).
Existen numerosas bacteriocinas producidas por las bacterias cido lcticas y
cada una tiene espectros de inhibicin particulares, esta caracterstica es
aprovechada en la industria de los alimentos para utilizarlas de diversas formas.
15

Algunas bacteriocinas se utilizan en procesos que requieren la inhibicin del

crecimiento de bacterias indeseables especficas estrechamente relacionadas al
productor de la bacteriocina, y en otros casos se aplican para inhibir el crecimiento
de microorganismos degradadores de alimentos o de patgenos como
estalilococos y listerias, respectivamente (Gonzlez Martinez, Gmez Trevio, &
Jimnez Salas, 2003).
Las bacteriocinas de bacterias cido lcticas son un grupo heterogneo de
sustancias antimicrobianas de origen peptdico, la mayora no han sido bien
caracterizadas an. Por tanto, no se puede establecer propiedades en comn, sin
embargo, las propiedades que principalmente se tienen en cuenta son las
siguientes: naturaleza, tamao molecular, composicin aminoacdica y estructura
qumica, termorresistencia y estabilidad frente a pH (Cristbal Delgado, 2008). Son
generalmente estables a pH cido o neutro, indicando un entorno natural de las
bacterias que las producen. Adems algunos extractos de lactobacillus plantarum
y lactobacillus brevis presentan estabilidad al calentamiento a 50 y 80C,
propiedad que es importante para asegurar el control de microorganismos en
algunos procesos de la industria alimentaria (Vzquez et al., 2009).
Las bacteriocinas producidas por BAL ejercen un efecto inhibitorio
especialmentesobre microorganismos Gram positivos, existen pocos reportes de
bacteriocinas que inhiban el crecimiento de microorganismos Gram negativos,
aunque se han encontrado algunas cepas como el L. curvatis y el L. casei que
inhiben el crecimiento de cepas patgenas de E. coli y Salmonella enerica sin
necesidad de tratamiento previo. Por lo general las bacterias Gram negativas se
tratan inicialmente con agentes quelantes como el EDTA, alta presin hidrosttica
o alguna otra lesin que destruya la pared celular para permitir la entrada de las
bacteriocinas y obtener un efecto antibacterial satisfactorio (Rodriguez Pea &
Torres Lozano, 2006).

16

Tabla
1.
Ejemplos de bacteriocinas producidas por bacterias acido lcticas. (Monroy et al.,
2009).

6.2.3.1.

CLASIFICACION DE LAS BACTERIOCINAS PRODUCIDAS

POR BAL.

Diversos investigadores han buscado clasificar a las bacteriocinas de acuerdo con

sus caractersticas bioqumicas y genticas. A continuacin se presenta la
clasificacin de estos compuestos propuesta por Kemperman en 2003 (Monroy et
al., 2009).

Clase I: Lantibiticos. Son pptidos pequeos (< 5 KDa), policclicos,

estables al calor, activos a nivel de membrana, contienen algunos
aminocidos poco comunes en su composicin como lantionina, b-metillantionina y dihidroalanina que se forman postraduccionalmente (Monroy et
17

al., 2009). La formacin de aminocidos no comunes se explica por la

deshidratacin de los aminocidos serina y treonina, lo que da lugar a la
formacin de dehidroalanina (Dha) y dehidrobutirina (Dhb) (Lpez, Ochoa
Z., Anaya L., Martinez T., & Medina M., 2008). Aunque estos precursores
puedan formar parte de la estructura final del lantibitico, en muchas
ocasiones sufren una condensacin con el grupo sulfhidrilo de las cistenas
presentes en la molcula, formndose puentes alanina-S-alanina
(lantionina) o cido aminobutrico-S-alanina (-metil lantionina) (Martnez
Fernndez, 1996). Un ejemplo bien conocido de estas bacteriocinas es la
nisina producida por L. lactis, es la bacteriocina mejor caracterizada, y se
comercializa para uso como aditivo alimentario. A su vez, en funcin de su
estructura y modo de accin, los lantibiticos se subdividen en 2 grupos:
Clase I A: Pptidos de 2.1 a 3.4 KDa, elongados y catinicos (2 a 7 cargas
positivas) Actan a nivel de membrana y engloban a los lantibiticos de un
slo pptido y a aquellos que requieren la presencia de dos pptidos para
ejercer su actividad antimicrobiana total (Monroy et al., 2009).
Clase I B: Pptidos globulares e hidrfobos que actan como inhibidores
enzimticos. Tiene un tamao comprendido entre 1.9 y 2.0 KDa sin carga o
cargados negativamente (Martnez Fernndez, 1996).
Clase II: No lantibiticos. Bacteriocinas lineales y no modificadas
postraduccionalmente en su estructura primaria. Son pptidos pequeos (<
10KDa) y termoestables, que actan a nivel de la membrana plasmtica
(Monroy et al., 2009). El representante ms caracterstico de este grupo es
la pediocina PA-1, la bacteriocina ms estudiada despus de la nisina
(Martnez Fernndez, 1996). En este grupo se pueden identificar tres
subclases:
Clase II a: Tienen la secuencia consenso en la regin N-terminal
TGNGVXC (T: tirosina, G: glicina, N: asparagina y V: Valina), muestran una
potente actividad inhibitoria frente a la Listeria spp. y sus representantes
caractersticos son la 28 pediocina PA-1 producida por la P. acidilactici y la
sakacina A y P producidas por Lb. Sake (Monroy et al., 2009).
Clase II b: Formadores de complejos para la formacin de poros que
consisten de dos pptidos diferentes. Ambos pptidos son necesarios para
una mejor actividad antimicrobiana, y actan mediante un mecanismo de
formacin de poros en la membrana plasmtica. En este grupo se
encuentran la lactococcina M y Gproducidas por cepas de L. lactis, la
lactacina F producida por Lb. Johnsonii y lasplantaricinas E/F, J/K y S
sintetizadas por Lb. Plantarum, (Martnez Fernndez, 1996).
Clase II c: Pptidos pequeos, termoestables, no modificados y que se
transportan mediante pptidos lder. En esta subclase solamente se
reportan las bacteriocinas divergicina A, lactococcina B y acidocina B
(Monroy et al., 2009).

18

Clase III: Bacteriocinas de elevado tamao molecular (>30 kDa) y

termolbiles. Las bacteriocinas ms conocidas de esta clase son helveticina
J, acidofilicina A, lactacinas A y B y la caseicina 80. Todas ellas producidas
por cepas de Lactobacillus spp (Martnez Fernndez, 1996).
Clase IV: Bacteriocinas complejas. Son pptidos con una parte proteica y
una o ms fracciones lipdicas o glucdicas necesarias para su actividad
biolgica. Por tanto, esta clase incluye bacteriocinas que se consideran
como glicoprotenas (lactocina S) o como lipoprotenas (mesenterocina 52).
Clase V: Bacteriocinas de estructura circular y no modificadas
postraduccionalmente. A esta clase pertenecen la enterocina AS-48 y la
gasericina A.
6.2.3.2.

ESPECTRO DE INHIBICIN

El espectro de inhibicin muestra que tipo de microorganismos son sensibles a ser

inhibidos por las bacteriocinas. El espectro de inhibicin es reducido para las
bacterias cido lcticas, generalmente es sobre microorganismos relacionados
taxonmicamente, de forma que presentan actividad bactericida solamente frente
a cepas sensibles. La susceptibilidad de las bacterias Gram negativas a las
bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas es mucho ms limitada y hasta
hace poco no se conocan bacteriocinas producidas por bacterias lcticas de
origen alimentario activas naturalmente frente a bacterias Gram negativas
(Vzquez et al., 2009), pero recientemente se han encontrado algunas cepas
como el L. curvatus y el L. casei que inhiben el crecimiento de cepas patgenas de
E. coli y Salmonella enerica sin necesidad de tratamiento previo y se han
desarrollado tambin bacteriocinas que inhiben bacterias Gram negativas a partir
de los gneros Lactobacillus, Streptococcus y Staphylococcus (Rodriguez Pea &
Torres Lozano, 2006).
El espectro de inhibicin de las bacteriocinas o sus extractos puede verse
afectado segn el tratamiento al que son sometidos, como liofilizacin,
concentracin del sobrenadante, purificacin y neutralizacin, entre otros. En el
caso particular de los extractos de bacteriocinas, la actividad es mayor cuando son
concentrados, pero es necesario tener en cuenta la termoresistencia para evitar la
alteracin de la funcionalidad de la bacteriocina. Adems, la accin combinada de
dos o ms bacteriocinas puede reforzar considerablemente la accin inhibitoria
(Lpez et al., 2008).

19

Tabla 2. Microorganismos no lcticos y la respectiva bacteriocina de bacterias

cido lcticas que lo inhibe.

20

6.2.3.3.

MODO DE ACCIN

El modo de accin de las bacteriocinas est determinado por la composicin de la

membrana citoplasmtica, la estructura y la expresin de una protena en funcin
de la inmunidad, adems de la composicin qumica del medio ambiente (Monroy
et al., 2009).
La formacin de poros en la membrana citoplsmica de clulas sensibles es un
mecanismo de accin comn, presentado por las bacteriocinas producidas por
bacterias lcticas (Gonzlez et al., 2003). En este proceso las bacteriocinas
actan destruyendo la integridad de la membrana citoplasmtica del
microorganismos sensible a travs de la formacin de poros, lo que provoca la
salida de compuestos pequeos, prdida de iones K, ATP o la alteracin de la
fuerza motriz de protones (fuente de energa celular) necesaria para la produccin
de energa y sntesis de protenas o cidos nucleicos (Gonzlez et al., 2003). La
prdida de estas sustancias origina a su vez una prdida potencial de membrana,
consumo de las reservas energticas celulares, descenso en la sntesis de ADN,
ARN y protenas originando finalmente la inhibicin o muerte celular (Vzquez et
al., 2009).

Figura 2. Modelo sobre el mecanismo de accin de la nisina.

21

En la figura 2 se observa un modelo que muestra el mecanismo de accin dual de

la nisina. En la etapa 1 la nisina posee una carga neta positiva que incrementa su
interaccin con las cargas negativas de los componentes de la pared celular.
Posteriormente en la etapa 2, la nisina se une al lpido II, principal transportador de
las subunidades de peptidoglucano del citoplasma a la pared celular interfiriendo
con su sntesis, lo que lleva a la bacteria a muerte celular. Finalmente en la etapa
3, adicionalmente, varias molculas de nisina utilizan al lpido II para anclarse e
insertarse en la membrana celular y comenzar con la formacin de los poros, lo
que lleva a la bacteria a una rpida muerte celular.

7. NISINA
Desde su descubrimiento (Rogers, 1928) y sus primeras aplicaciones como
agente inhibidor del desarrollo de microorganismos alterantes en la fabricacin de
quesos (Hirsch et al., 1951), la nisina ha sido objeto de continuos y extensos
estudios, tanto moleculares como tecnolgicos, y se ha convertido en el
lantibitico por excelencia. Adems, a pesar de los numerosos ensayos que
ponen de manifiesto el potencial biotecnolgico de otras bacteriocinas, la nisina
es la nica admitida como conservante (aditivo) de grado alimentario y se
produce a escala industrial para su comercializacin.
La produccin de nisina es un fenotipo muy extendido dentro de la especie L.
lactis. Se han aislado lactococos productores de nisina de ambientes muy
variados como leche y productos lcteos, vegetales fermentados, productos
crnicos con orgenes geogrficos muy diversos y leche humana (Martnez et al.,
1995; Rodrguez et al., 1995a; Olasupo et al., 1999; Ayad et al., 2002; Beasley
et al., 2004). Se ha estimado que aproximadamente un tercio de los lactococos
bacteriocinognicos aislados producen nisina, lo que se puede considerar como
un claro reflejo de la ventaja selectiva que les confiere.

Figura 3. Estructura qumica de la nisina.

La estabilidad, solubilidad y actividad biolgica de la nisina depende del pH. La
22

nisina es ms soluble y estable a pH cidos por lo que su aplicacin como

conservante se ve favorecida en alimentos cidos o fermentados. A pH 2 la
solubilidad es de 56 mg/ml mientras que a pH 7 disminuye a 1 mg/ml. La
estructura relativamente sencilla de la nisina le confiere una alta resistencia al
tratamiento trmico. La nisina soporta el autoclavado (121 C, 15 min.) a pH 2. Del
mismo modo que ocurre con la solubilidad, la termorresistencia disminuye al
aumentar el pH.
La nisina ejerce un efecto bactericida sobre un amplio rango de microorganismos
Gram positivos entre los que se incluyen bacterias lcticas (Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc), patgenos (Listeria, Staphylococcus) y formadores
de endoesporas (Bacillus, Clostridium). Los microorganismos Gram negativos son
sensibles siempre que se destruya la membrana externa que acta como escudo
protector. La nisina inhibe tambin la germinacin de las esporas. Este efecto
parece ser, en principio, diferente a la inhibicin de las clulas vegetativas ya que
en mutantes con la sustitucin Dha5Ala pierden su actividad biolgica frente a las
esporas pero no as sobre las clulas vegetativas (Chan et al., 1996).

8. PEDIOCINA
Las primeras referencias de la pediocina PA-1 se remontan a los aos 80 cuando
el grupo de Gonzlez y Kunka en 1987 la aislaron de una cepa de origen crnico:
P. acidilactici PAC1.0 (PA-1).
La pediocina es la bacteriocina mas caracterizada despus de la nisina, es una
bacteriocina producida por cepas de las especies Pediococcus acidilactici de
origen crnico, Pediococcus parvulus de origen vegetal y una cepa de L.
plantarum aislada de queso. La pediocina PA- 1 es un pptido de 44 aminocidos
que no se modifican postraducionalmente. Tiene carga neta positiva a pH 6,0 y pH
bsico entre 8,6 y 10. La secuencia primaria conocida es suficiente para inducir
un efecto txico en las clulas sensibles (Dez Aldama, 2011). La pediocina es
activa frente a un gran nmero de bacterias Gram positivas relacionadas, tales
como algunas especies de los gneros Lactococcus, Lactobacillus y
Enterococcus. Tambin posee actividad frente a otras bacterias Gram positivas
ms lejanas filogenticamente, entre las que se encuentran las responsables de
algunas toxinfecciones alimentarias como el Bacillus, la Brochotrix, la Listeria y el
Staphylococus. Con respecto a las bacterias Gram negativas, sus cubiertas
celulares impiden el acceso de las bacteriocinas a la membrana plasmtica. Sin
embargo, tal como ocurre con la Nisina, es suficiente alterar la permeabilidad de
sus membranas externas para permitir la accin antimicrobiana de las
bacteriocinas (Dez Aldama, 2011).
Es utilizada como conservador en productos vegetales y crnicos y por su
elevada actividad contra especies de Listeria tiene un alto potencial para ser
utilizada como conservante en alimentos lcteos (Gonzlez et al., 2003). La
pediocina PA-1 aadida al agua que se emplea para higienizar hortalizas crudas
(repollo, coliflor, entre otras) como alternativa al tratamiento con hipoclorito o junto
23

con las clulas lisadas productoras de la bacteriocina en carne de pollo cruda

sometida a radiacin. Esta comercializada bajo el nombre de Alta 2341 y consiste
en un fermentado de un cultivo iniciadorde P. acidilactici productor de pediocina,
recomendado especialmente para productos crnicos y lcteos (Dez Aldama,
2011).

9. APLICACIN DE BACTERIOCINAS EN ALIMENTOS

La biopreservacin puede ser aplicada en alimentos y especficamente en
crnicos por mtodos bsicos (Hugas M., 1998; Chen H. y Hower D., 2003), en
los que se aplica bacteriocinas o sus bacterias productoras.
1. Aadiendo un cultivo puro BAL viables productoras de bacteriocina. De
esta manera ofrece una forma directa de incorporar bacteriocinas en el
alimento, dependiendo su xito de la habilidad del cultivo para crecer y
producir bacteriocina en el alimento bajo condiciones ambientales y
tecnolgicas (temperatura, pH, aditivos, entre otros). En el caso de la
carne, (que es un alimento que no puede ser sometido a pasterizacin
antes de la adicin de las cepas iniciadoras), los cultivos biopreservadores
o fermentadores deben ser capaces de competir con la microflora natural,
no debe tener impacto en las propiedades fisicoqumicas y organolpticas
del alimento, no debe producir gas ni exopolisacaridos para evitar el
inflamiento en el empaque debido a la acumulacin de gases y la
formacin de viscosidades en las superficies de la carne (Castellano P., et
al, 2000).
2. Aadiendo preparaciones de bacteriocina cruda (extracto crudo), licor
fermentado o concentrados obtenidos por el crecimiento de BAL
productoras de bacteriocina en sustrato complejo. Este mtodo evita el uso
de compuestos purificados que pueden tener regulacin legal y ahorra
costos en la purificacin de cada compuesto.
3. Adicionando sustancias antagnicas puras o semipuras como las
bacteriocinas producidas por BAL. Al usar este mtodo la dosis de
bacteriocina es ms precisa y por ende ms predecible. Sin embargo la
aplicacin se limita de acuerdo a la regulacin de cada pais concerniente a
aditivos en alimentos (Hugas M., 1998).
La primera metodologa podra denominarse mtodo in situ de biopreservacin
(por inoculacin del sistema alimenticio con la cepa productora de bacteriocina en
condiciones que favorezcan su produccin); mientras las dos ltimas seran
metodologas ex situ (donde la bacteriocina es producida por fuera del alimento
en condiciones controladas y luego aplicada al alimento). En el caso de usar
sustancias antagnicas puras o semipuras, es necesario utilizar tcnicas de
precipitacin de la protena adaptadas a las condiciones de cada laboratorio, debe
inicialmente estandarizarse la produccin y precipitacin de la bacteriocina, hasta
garantizar su reproducibilidad antes de la aplicacin en alimentos para asegurar
24

una cantidad adecuada con suficiente poder inhibitorio.

La aplicacin de bacteriocinas depende de las variables tecnolgicas a las que

sean sometidas los cultivos, en los casos ex situ, la produccin de bacteriocina
puede llegar a ser una metodologa ms costosa ya que no solo requiere de las
cepas iniciadoras (microorganismos completamente aislados), sino de medios de
cultivo y equipos para el desarrollo de las cepas y para la produccin de la
bacteriocina. Adicionalmente se debe garantizar la actividad de cada extracto o de
la bacteriocina e incluso puede llegar a ser necesario determinar la concentracin
mnima inhibitoria contra patgenos. La utilizacin de estos sistemas de
biopreservacin requiere en cualquier caso estudios preliminares para determinar
el comportamiento de las bacterias en el medio de cultivo en que se desarrolla
(curvas de crecimiento), y la estandarizacin de las tcnicas para lograr
producirlas en cantidades suficientes.
Glvez y colaboradores (Galvez A. et al, 2007) mencionan que la aplicacin de
cultivos productores de bacteriocinas, ofrece varias ventajas por ser una
produccin in situ comparada a la produccin ex situ, concerniente al aspecto
legal y de costos. Disminuir los costos en los procesos biopreservativos puede ser
altamente atractivo, especialmente para economas pequeas y pases en
desarrollo, donde la seguridad alimenticia puede estar altamente comprometida.

10. PRODUCTOS CRNICOS

El conocimiento de un material crnico como materia prima, tanto desde el punto
de vista de su funcionalidad, la de sus componentes y de la manera como stos
interactan con los dems materiales que hacen parte de una formulacin
determinada, lleva a la calidad industrial, la cual est ntimamente ligada a la
funcionalidad, y puede definirse como aquellas caractersticas de la carne que la
habilitan para ser usada industrialmente como materia prima en la elaboracin de
productos crnicos (Goll et al., 1977).
La calidad de los productos elaborados, depender de la correcta utilizacin y de
la calidad de las materias primas.
Las materias primas ms importantes son:

La carne: es el tejido muscular de los animales. Para elegir la carne debe

tomarse en cuenta su color y su estado (que no haya descomposicin); la
carne debe provenir de animales sanos, y tratados higinicamente durante
su matanza. La carne de puerco es la que ms se usa para estos fines,
aunque se puede utilizar todo tipo de animal. La grasa de los animales
contiene grasa orgnica y grasa de tejidos.

La grasa orgnica: como la del rin, vsceras y corazn, es una grasa

blanda que normalmente se funde para la obtencin de manteca. La grasa
25

de los tejidos, como es una grasa resistente al corte y se destina a la

elaboracin de los productos crnicos.

Sales curantes: ellos constituyen un ingrediente primordial en el proceso de

conservacin de las carnes. Se dividen en dos:

Nitritos y nitratos: ayudan al curado de las carnes, mejoran el poder de

conservacin, el aroma, el color, el sabor y la consistencia. Adems sirven
para obtener un mayor rendimiento en peso, porque tienen una capacidad
fijadora de agua. Lo ms importante, es que protege a las carnes del
Botulismo, una de las peores formas de envenenamiento que conoce el
hombre. Se usan en cantidades muy pequeas para no afectar al producto.

Sal comn: prolonga el poder de conservacin, mejora el sabor de la carne,

aumenta el poder de fijacin de agua y favorece la penetracin de otras
sustancias curantes.

Especias y condimentos: son sustancias aromticas de origen vegetal que

se agregan a los productos crnicos para conferirles sabores y olores
peculiares.

Segn el mtodo, el sabor de la carne, el modo de presentacin, el grado de

salazn, curacin, desecacin y ahumado, los productos crnicos se clasifican en:
Embutidos crudos: chorizos y longanizas.
Embutidos escaldados: salchichas.
Embutidos cocidos: queso de puerco y morcilla o rellena.
Carnes curadas: jamn, tocino y chuleta. .
Los diferentes productos son simplemente carne de cerdo, res, ternera, pollo, pavo
o conejo, junto con grasa de cerdo, sazonada con sal, cebolla, ajos, chiles y otros
condimentos, todo eso metido en una tripa de cerdo o simplemente procesado.
La carne tiene un nmero de propiedades intrnsecas las cuales hacen que el uso
de bacteriocinas sea ms problemtico que en alimentos lquidos. En particular es
difcil alcanzar una distribucin homognea, puede haber problemas de
solubilidad, las bacteriocinas pueden separar la fase grasa, o simplemente ligarse
a las protenas crnicas (Hill, 1999).
Para alimentos crnicos, las bacteriocinas pueden llegar a sustituir el uso de
nitritos, sin embargo es necesario determinar la bacteriocina adecuada que no
requiera de una elevada concentracin de aplicacin (Rojas & Vargas, 2008). Se
han realizado estudios con nisina con el objetivo de reducir el nivel de nitritos en
carnes, los resultados muestran que se requieren altos niveles de nisina para
alcanzar un buen control de Clostridium botulinum debido a la unin de la nisina
26

con partculas crnicas, distribucin no homognea, pobre solubilidad en sistemas

crnicos o a la posible interferencia en la actividad de fosfolpidos crnicos (Abee,
2005).
Luckansky et al. (1992) inocularon una cepa productora de pediocina y otra no
productora de pediocina en pasta de salchicha tipo vienesa la cual fue
subsecuentemente inoculada con 4 cepas de Listeria monocytogenes. El nmero
de listerias permanecieron altos (10 5/g) en las vienesas que contenan la cepa no
productora de pediocina, mientras que en la que contena la cepa productora de
pediocina el nmero de listerias descendi a menos de 10 2/g. Adems, la
pediocina producida sobrevivi al proceso de coccin al final de la fermentacin y
fue detectable a lo largo de los 60 das de almacenamiento a 4C. Estos mismos
investigadores desarrollaron una forma de gelatina de pediocina, producida por
una bacteria cido lctica, que protege a los embutidos de la contaminacin con
Listeria (Hill, 1999).
11. EMBUTIDOS ESCALDADOS: SALCHICHA
Se conoce con el nombre genrico de embutido a los productos crnicos que se
han producido mezclando las carnes con otros ingredientes, tales como agua,
grasa, sal, especias y aditivos, y donde la mezcla ha sido introducido en fundas,
tripas o tubulares, que pueden ser naturales o artificiales, mediante el uso de una
embutidora.
Los productos escaldados son sometidos a un proceso de escaldado que equivale
a una pasterizacin, es decir, llevando el ncleo del producto hasta una
temperatura de 68 a 72 grados Centgrados.
Existe una variedad de productos escaldados, un ejemplo de ello es la salchicha,
uno de los productos con mayor demanda en el mercado.
La salchicha es un producto crnico cuya elaboracin pasa por varias etapas:
desde el picado de los ingredientes hasta la obtencin de una masa a la cual se
aade agua o hielo y aditivos (como los fosfatos y nitritos para favorecer la fijacin
del agua y dar estabilidad a la masa), hasta ser embutido en tripa natural o
sinttica (como el celofn). Su composicin vara de marca a marca: mientras
unas contienen carne de cerdo, otras llevan res, pavo, pollo o alguna mezcla de
stos. Con respecto a sus ingredientes, el principal es el agua (que vara del 46%
al 70% entre las diferentes marcas del mercado), adems de la carne y los
aditivos, a los que pueden adicionarse otros ingredientes como protena no crnica
(soya o protena de leche), almidones y grasas (casi siempre de cerdo). Pero la
incorporacin de estos ingredientes se hace a costa del contenido de carne, con lo
cual se abarata el producto. Las salchichas aportan protenas y grasas;
dependiendo de la marca, estos contenidos tienen variaciones que van del 7% al
19%, y del 5% al 36%, respectivamente. El tipo de grasa tambin vara, ya que las
salchichas elaboradas a base de pavo tienen menos grasas saturadas (las que
aumentan los niveles de colesterol en sangre) que las elaboradas a base de res o
27

cerdo. Es conveniente sealar que existen salchichas de pavo adicionadas de

grasa de cerdo, con lo que aumentan el contenido de grasas saturadas.
Los avances en la elaboracin de salchicha, constituyen ahora uno de los rubros
ms dinmicos en la industria crnica y es de complejidad si se tiene en cuenta
que en la actualidad se elaboran ms de 1500 tipos de salchichas para el mercado
mundial (Llamas, 2007).
12. EVALUACIN SENSORIAL
La Evaluacin Sensorial es una disciplina desarrollada desde hace algunos aos;
naci durante la segunda guerra mundial, ante la necesidad de establecer las
razones que hacan que las tropas rechazaran en gran volumen las raciones de
campaa. El hecho apareca inslito e inesperado: las dietas estaban
perfectamente balanceadas y cumplan los requerimientos nutritivos de los
usuarios; pero stos las rechazaban.
Luego de reunir abundante informacin a travs de entrevistas y encuestas, y
analizar cuidadosamente la situacin, se concluy que la causa del rechazo era el
deterioro en mayor o menor grado de algunos o todos los parmetros de calidad
organolptica de los alimentos que conformaban la dieta.
Se postularon diferentes hiptesis con el fin de determinar las causas que
producan el deterioro, sealndose que ste podra provenir de la materia prima,
o del proceso de elaboracin, o del envasado, o del almacenamiento. Una
herramienta muy valiosa para investigar estas causas ha sido la Evaluacin
Sensorial.
La Evaluacin Sensorial trabaja en base a paneles de degustadores, denominados
jueces, que hacen uso de sus sentidos como herramienta de trabajo. Los jueces
se seleccionan y entrenan con el fin de lograr la mxima veracidad, sensibilidad y
reproducibilidad en los juicios que emitan, ya que de ello depende en gran medida
el xito y confiabilidad de los resultados. Mediante un entrenamiento adecuado es
posible obtener el mismo grado de seguridad que en un mtodo instrumental,
teniendo la ventaja que la sensibilidad del test sensorial es mayor, esto es, los
sentidos son capaces de pesquisar concentraciones menores. As por ejemplo,
cuando los mtodos instrumentales se aplican a anlisis de trazas, en que se
alcanza el lmite de deteccin del mtodo, cuando en el anlisis cromatogrfico ya
no aparecen ms "peaks", es posible la mayora de las veces percibir claramente
"algo" en el sabor y aroma. Se evidencia lo que Jellinek llama el "detector
biolgico". (Jellinek, 1973).
Los mtodos de Evaluacin Sensorial tienen tambin limitaciones puesto que se
trabaja con paneles de laboratorio, formados por seres humanos, sujetos tambin
a ciertas limitaciones que han sido descritas en estudios biolgicos. Los jueces
estn sujetos a variaciones en las respuestas debido a un gran nmero de
factores, que al ser conocidos pueden evitarse o minimizarse. Adems los
resultados se expresan en trminos relativos y no en trminos absolutos. Para
llegar a resultados vlidos se requiere de mucho tiempo y material. De ah la
importancia de contar con un panel bien entrenado que entregue resultados
confiables y reproducibles.
28

La realidad demuestra que la Evaluacin Sensorial proporciona informacin

integral de la calidad, junto con proporcionar una informacin de las expectativas
de aceptabilidad por parte del consumidor.
13. MATERIALES Y MTODOS
La presente investigacin se llev acabo en el laboratorio del departamento de
microbiologa del instituto tecnolgico de Tuxtla Gutirrez, ubicado en la carretera
panamericana Km. 1080, en la ciudad de Tuxtla Gutirrez, Chiapas.

13.1. ETAPA 1. Aislamiento, purificacin, identificacin y

conservacin de cepas de bacterias lcticas.
Obtencin de cepas de bacterias lcticas
Se seleccionaron cepas de bacterias lcticas, Lactococcus lactis y Pediococcus
acidilactici de la Coleccin Mexicana de Cultivos Microbianos del Centro de
Investigacin y de Estudios Avanzados del I.P.N. (CINVESTAV), Mxico, D.F.

Aislamiento

El aislamiento de L. lactis y P. acidilactici se realiz en placas con 20 mililitro de

agar MRS con un pH de 4.5, inoculando colonias seleccionadas por el mtodo de
estra abierta cruzada, para la obtencin de colonias aisladas (Ver figura 4).

Figura 4.- pasos para el aislamiento de L. lactis y P.acidilactici

Las placas inoculadas llevaron a incubacin se realiz a una temperatura de 37C,

por un tiempo de 24 horas.

Purificacin e identificacin microscpica y morfolgica

De cada cepa aislada se tomaron tres colonias aisladas, cada colonia se inocul
por estra abierta cruzada en caja Petri conteniendo agar MRS con un pH de 4.5,
de tal manera que se obtendran cepas puras. Seguido de su incubacin en
anaerobiosis, se realiz la identificacin microscpica (por triplicado) por el mtodo
de Tincin Gram. Observando en un microscopio ptico su morfologa y
clasificacin (Ver figura 5).

29

a)

b)

Figura 5.- Tincin de gram y morfologa microscpica de las bacterias a) L. lactis

y b) L. acidilactici

13.2. ETAPA 2. Conservacin y determinacin de la termoresistencia

de las especies productoras de pediocina y nisina

Conservacin de bacterias lcticas

Las cepas ya purificadas e identificadas como Lactococcus y Pediococcus, se

cultivaron 15 ml de caldo MRS a pH de 4.5, inoculados con una colonia individual
de cada cepa, incubados a 37C por 24 horas.
Se conservaron por congelacin a una temperatura de -22C en tubos eppendorf
conteniendo 500l de conservador (composicin: leche descremada 10% y glicerol
10%) y 500l de cultivo.

Determinacin de termorresistencia

La termorresistencia de cada cepa fue determinada adaptando la metodologa de

Anderson et al. (1991) y Ptaja (1991). Se colocaron 10 mL de cada cepa
resuspendida en tubos con tapa verticalmente posicionados en baos de agua a
diferentes temperaturas (50, 60 y 70 C), y se mantuvieron para cada temperatura
durante 30, 45 y 60 min. Despus del tratamiento trmico, 1 mL de caldo de cada
tubo calentado a las diferentes temperaturas y tiempos fue sembrado en cajas
petri con agar con medio MRS e incubados a 352 C durante 24 horas,
reportando el nmero de colonias supervivientes. Las cepas con un crecimiento
abundante (>300 UFC/mL) fueron consideradas como termorresistentes.

30

Preparacin de las cepas resuspendidas

Se realiz una cintica para observar el comportamiento de las cepas

termorresistentes, cultivando una pequea cantidad en caldo MRS, con una
agitacin de 120 rpm, la evaluacin del crecimiento se realiz mediante densidad
ptica (D.O.) a una = 620 nm y siembra en placa. Una vez obtenido los datos de
la evaluacin de crecimiento, se realiz de igual forma el procedimiento anterior
pero esta vez solo hasta obtener 1x10 -2 UFC/g, porque es una cantidad menor de
microorganismos mesofilos aerobios (1x10 -6 UFC/g) permitidos por la NORMA
Oficial Mexicana NOM-122-SSA1-1994 (Secretaria de salud, 1994).

13.3. ETAPA 3: Inoculacin y anlisis en la vida de anaquel de las

bacterias termo resistentes

Elaboracin e inoculacin salchichas

Se utiliz una formulacin tpica para salchicha tipo Viena (Guerrero et al., 2002),
con ciertas modificaciones. La formulacin bsica consisti en carne de res (39%),
carne de cerdo (19%), lardo o grasa dorsal de cerdo (15%), sal, mezcla de
fosfatos comerciales Hamine (McCormickPESA, Ciudad de Mxico) y sal pura
(6,5% p/p de nitrato de sodio). La carne de res y cerdo fueron adquiridas en
carniceras locales; se limpi tejido conectivo visible y grasa, moliendo con un
cedazo de 0.42 cm en un molino para carne. La carne molida, sal, fosfatos y la
mitad de hielo fueron mezclados en una cutter de 5 L Hobart modelo 84145
(Hobart Corp., Troy, Ohio) durante 2-3 minutos hasta la completa incorporacin de
los ingredientes. Se aadi entonces el lardo congelado y el resto de hielo,
incorporando todos los ingredientes por 5 minutos ms, cuidando que la
temperatura del batido permaneciera entre 122 C. Se aadieron la cepas
termorresistentes resuspendidas (5% v/p), se dej en reposo 15 min y despus de
este tiempo se embuti manualmente en tripas de celulosa de 20 mm de dimetro
y se cocinaron a 70 C durante 20 min.
Las salchichas fueron enfriadas, empacadas al vaco y almacenadas a 42 C
durante 12 das. Se elaboraron dos lotes de 1 kg, para la cepa termorresistente y
un control sin inocular.

Anlisis en la vida de anaquel

31

Se tomaron muestras a los 0, 3, 6, 9 y 12 das de tres salchichas tomadas al azar

de cada lote de produccin; salchichas sin inocular para el control y salchichas
inoculadas con nuestras bacterias lacticas, para llevar a cabo recuentos de
enterobacterias en agar de eosina y azul de metileno (Murthy, 1984) y de bacterias
lcticas en agar MRS (De Man et al., 1960) con la tcnica de UFC, las placas se
incubaron a 37C por 24 horas y los resultados se leyeron como UFC totales por
fraccin de tiempo, de cada prueba.

13.4. ETAPA 4: Prueba de aceptacin, diseo experimental y anlisis

estadstico del efecto de la inoculacin de bacterias productoras
de bacteriocinas.

Anlisis sensorial

Para determinar el efecto de la inoculacin de BAL sobre las salchichas, se llev a

cabo una prueba de aceptacin con un panel no entrenado. La prueba de
aceptacin se llev a cabo a los 1 y 12 das de almacenamiento. Un total de 25
jueces reclutados entre personal acadmico y alumnos evaluaron cada una de las
salchichas elaboradas con las 2 cepas termorresistentes, comparndolas contra
un control sin inocular. En una sesin previa, se definieron a los jueces los
atributos a evaluar: color, sabor, textura y aceptacin general. Cada cepa fue
evaluada en una sesin diferente. Cada muestra y el control (2 g de cada una) se
presentaron codificadas a temperatura ambiente, evaluando los cuatro atributos en
la misma sesin, utilizando una escala no estructurada (10 cm de largo), con la
calificacin ms baja del lado izquierdo y la ms alta del lado derecho (Pedrero y
Pangborn, 1989). Se midi la distancia marcada como la calificacin
correspondiente para cada atributo (Ver evaluacin sensorial en el Anexo A).

Diseo experimental y anlisis estadstico

Se utiliz un diseo completamente al azar en la distribucin de las muestras

entre los diferentes tratamientos para la prueba de aceptacin, determinando el
efecto de la inoculacin de las cepas de bacterias lcticas termorresistentes sobre
los atributos de las salchichas mediante un anlisis de varianza en el paquete
estadstico SAS versin 8,0 (SAS Institute, Cary, North Carolina). La diferencia
entre medias se determin mediante la prueba de Duncan en el mismo paquete
estadstico (P < 0,05)

14. RESULTADOS
32

Termorresistencia de las cepas seleccionadas

De las cepas seleccionadas, solo una de ellas present una supervivencia
adecuada a los tratamientos trmicos. L. lactis tuvo conteos mayores a 300 UFC
despus de ser sometidas a 50, 60 y 70 C durante 30, 45 y 60 min. Segn W.
Dos Santos (1993) la especie Pediococcus sp. no sobrevivi al tratamiento
trmico a 45C durante 30min, ni a mayores temperaturas y/o tiempos ya que las
temperaturas mesfilas les son favorables
Otra diferencia importante es la velocidad de calentamiento aplicada hasta
alcanzar la mxima temperatura en los baos de agua. En los baos de agua las
temperaturas fueron menores pero el tiempo de exposicin fue mayor (de 15 a 60
min). El tiempo que permanecieron las bacterias en los baos de agua a la
temperatura mxima de 70 C permiti a las BAL algn tipo de adaptacin al calor
aplicado. Esta adaptacin se vio reflejada en la supervivencia de las BAL en los
batidos crnicos antes y durante el cocimiento. Milbourne (1983) report que las
BAL tienen una mejor sobrevivencia en productos crnicos debido a la accin
protectora de los ingredientes del producto.

Prueba de Aceptacin
La Tabla 3 presenta los resultados de la prueba de aceptacin llevada a cabo a
las muestras inoculadas con las cepas termorresistente y el control sin inocular, la
evaluacin sensorial se realiz con un universo de 25 jueces reclutados entre
personal acadmico y estudiantes.
Al segundo da, los valores ms altos para color, sabor, suavidad y apariencia
general, comparados con la muestra control, fueron atribuidos a las muestras
inoculadas con L. lactis, con calificacin significativamente (P < 0.05) ms alta.
A los 12 das de almacenamiento, los atributos evaluados presentaron cierto
detrimento en comparacin con las notas evaluadas en el segundo da. El color y
la apariencia general fueron mejor aceptados por parte de los catadores en la
muestras control. El color disminuy en aceptacin para las salchichas inoculadas
con L. lactis. De manera interesante, el atributo de sabor tuvo las calificaciones
ms altas al da 2 y al da 12 del inoculo L. lactis, por lo que la inoculacin de
estas BAL no alter el sabor detectado al transcurrir el tiempo de
almacenamiento.

Tabla 3. Prueba de aceptacin de las salchichas inoculadas con las BAL termoresistentes
comparadas con un control sin inocular. Medias con la misma letra en la misma fila no son
significativamente diferentes (P < 0,05).
33

Control

L. Lactis

Da 2

Color

4.71

1.2c

5.24

1.1b

Sabor

3.08

1.2b

4.46

0.5a

Suavidad

5.05

0.8

6.02

1.0

Apariencia
general

4.51

0.7d

5.28

0.6a

4.99

0.7

4.50

0.9

2.96

0.4 b

3.42

0.5a

Suavidad

2.09

0.8

2.20

1.1

Apariencia
general

4.74

0.8a

4.55

0.5b

Da 12

Color
Sabor

La suavidad de las muestras disminuyo considerablemente en las salchichas

inoculadas con L. lactis pasando del da 2 con una aceptacin de 6.02 1.0 al
da 12 con 2.20 1.1.
Garriga et al. (1998a) reportaron que al inocular BAL en productos cocidos en
general los atributos mejoraron por la adicin del inculo, excepto por un sabor
cido que no fue aceptado por los jueces. Sin embargo, y con excepcin del
sabor, los valores asignados a las muestras inoculadas no cayeron en el extremo
de inaceptabilidad.
Estos resultados concuerdan con los de Bredholt et al. (1999), que encontraron
que los productos crnicos cocidos inoculados con bacterias lcticas pueden
presentar propiedades sensoriales aceptables, adems de que se reduce el
crecimiento de L. monocytogenes y Escherichia coli (Fries et al. 2000).
Anlisis microbiolgicos
La poblacin microbiolgica en las salchichas, tanto para enterobacterias como
para BAL, presentaron una tendencia similar aun en las muestras inoculadas con
las BAL termorresistentes. La poblacin de BAL se increment respecto al tiempo
de almacenamiento, mientras que los conteos de enterobacterias tambin
presentaron cierta tendencia a aumentar con respecto al tiempo de
almacenamiento, mantenindose por abajo del conteo de BAL.

34

Figura 6.- Poblacion microbiolgica de las muestras inoculadas con L. lactis para
enterobacterias en las muestras control ( ) e inoculadas ( ) y bacterias acido
lcticas en las muestras control ( ) e inoculadas ( )

La Figura 6 muestra el comportamiento de los anlisis microbiolgicos realizados

para las muestras inoculadas con L. lactis. La poblacin de enterobacterias se
increment durante el almacenamiento tanto en el control como en las muestras
inoculadas. La poblacin de estos patgenos fue ligeramente mayor para las
muestras sin inocular que en las inoculadas despus del da 4 de
almacenamiento. Los conteos de BAL tuvieron un comportamiento similar, es
decir, la poblacin de estos microorganismos se increment durante el
almacenamiento.

35

15. CONCLUSION
Como conclusin, podemos decir que la produccin de bacteriocinas puede ser
una excelente opcin para utilizarlas como conservadores, ya que al ser protenas
son asimiladas por nuestro organismo y aparentemente no causan ningn efecto
secundario.
Las bacterias productoras de nisina en comparacin con las de pedocina, tuvieron
una mejor respuesta en la determinacin de termorresistencia debido a que las
bacterias productoras de pediocina no resisten las altas temperaturas de la
elaboracin de las salchichas cocidas. La termorresistencia de algunas cepas de
bacterias lcticas es importante, ya que estas pueden ser utilizadas como cultivos
inhibidores de microorganismos patgenos.
La inoculacin de bacterias L. lactis pueden ser una alternativa viable para
mejorar la vida de anaquel de la salchicha, de acuerdo a los resultados no
modific las caractersticas sensoriales de las salchicha.
Las bacteriocinas o sus bacterias productoras ofrecen buenas oportunidades para
la conservacin de productos crnicos, adicionadas de forma individual o
empleadas junto con otras barreras o tratamientos por lo que constituye un campo
interesante de investigacin para el desarrollo de productos ms seguros,
enriquecidos en sabor de forma ms natural, o con propiedades funcionales.

36

16. BIBLIOGRAFA
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41

17. ANEXO A

42

18. CRONOGRAMA
Semana
Actividad
1

10

11

12

Obtencin de cepas de
bacterias lcticas
Aislamiento

Purificacin e
identificacin
microscpica y
morfolgica
Conservacin de
bacterias lcticas
Determinacin de termo
resistencia
Preparacin
de
la
suspensin de cepas
termo resistentes
Elaboracin e
inoculacin de
salchichas
Anlisis en la vida de
anaquel
Anlisis sensorial
Diseo experimental y
anlisis estadstico

43

13