PRCTICA No.

1: Desnaturalizacin y precipitacin de protenas

1.1 Marco terico

Se conoce como desnaturalizacin de protenas a todo proceso que, sin
ruptura o formacin de enlaces qumicos, determina una modificacin en las
propiedades de la protena nativa; es decir, en este proceso no se alteran los
enlaces peptdicos, mantenindose tambin la secuencia u orden en que estn
unidos los aminocidos. Se modifican nicamente el ordenamiento espacial.
Las protenas desnaturalizadas son qumicamente ms reactivas y ms
fcilmente hidrolizadas por enzimas. Para muchas protenas, el aspecto ms
visible de su desnaturalizacin es la disminucin de su solubilidad en agua.
La desnaturalizacin de protenas se puede realizar por

incremento de la

temperatura, por adicin de cidos o lcalis concentrados, tambin puede ser

producida por algunos solventes orgnicos como alcohol o cetona.

1.2 Competencias
Reconocer

la

modificacin

en

las

propiedades

de

protenas

por

desnaturalizacin.

1.3 Materiales y equipos

Reactivos

Albmina (coger un huevo y perforar en un extremo, luego extraer la

clara y agregar agua destilada hasta veces el volumen inicial, al final
filtrar)

Acido clorhdrico cc

Alcohol etlico

Hidrxido de sodio 10%

HNO3 cc

HCl cc

NaOH cc

Sulfato de cobre 10%

Solucin de ferrocianuro de potasio K3Fe(CN)6

Materiales

cocinilla elctrica

Pipeta 5 ml (3)

Pisceta

Termmetro

Tubos de ensayo (12)

Gradilla

Fiola 100ml

Probeta 100 ml

Bagueta

Embudo de vidrio

Beaker 250 ml (3)

Gotero (8)

1.4 Procedimiento

Desnaturalizacin de albmina

En cada uno de 5 tubos de ensayo colocar 20 gotas de solucin de

albmina

El primer tubo

se calienta poco a poco observando la temperatura

aproximada a la que tiene lugar la coagulacin.

Al segundo tubo se adiciona 30 gotas de alcohol etlico.

Al tercer tubo adicionar 5 gotas de cido clorhdrico concentrado.

Al cuarto tubo aadir 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Al quinto tubo, aadir 1 ml de solucin concentrada de NaOH.

Anotar en que casos se produce la coagulacin.

Precipitacin de protenas mediante cationes

A seis tubos adicionar las siguientes soluciones:

Al tubo A adicionar 20 gotas de agua

Al tubo B adicionar 20 gotas de solucin de albmina.

Al tubo C adicionar 20 gotas de agua ms 3 gotas de cido clorhdrico

al 10%.

Al tubo D adicionar 20 gotas de solucin de albmina ms 3 gotas de

HCl al 10%.

Al tubo E adicionar 20 gotas de agua ms 3 gotas de solucin de NaOH

al 10%.

Al tubo F adicionar 20 gotas de solucin de albmina ms 3 gotas de

solucin de NaOH al 10%.

A continuacin, adicione a cada tubo 2 ml de solucin de sulfato de

cobre al 10%, agitar los tubos y observe los resultados, haciendo las
comparaciones por pareja.

Precipitacin de protenas mediante aniones

Preparar 3 tubos idnticos a los tubos B, D y F del ensayo anterior. A

cada uno se adiciona 2 gotas de solucin de ferrocianuro de potasio.
Observe el tubo que presente precipitado de protena.

1.5 Resultados
TRATAMIENTO

DESNATURALIZACIN

DE

LA

DE

LA

PROTENA
Calentamiento
Etanol
Acido clorhdrico
Acido ntrico
Hidrxido de sodio

TRATAMIENTO

DESNATURALIZACIN
PROTENA

Cationes CuSO4 en medio cido

Cationes CuSO4 en medio bsico
Aniones

K3Fe(CN)6

en

medio

K3Fe(CN)6

en

medio

cido
Aniones
bsico

1.6 Conclusiones
Segn

los

resultados

obtenidos

desnaturalizacin de protenas.

concluya

sobre

la

coagulacin

PRCTICA No. 2: Pardeamiento Enzimtico

1.1 Marco terico
Se denomina Pardeamiento enzimtico a la transformacin enzimtica en sus
primeras

etapas

de

compuestos

fenlicos

en

polmeros

coloreados,

frecuentemente pardos o negros. Es muy comn en frutas y vegetales

(manzana, pltano, palta, berenjena, championes, papas) que han sufrido
daos fsicos y/o exponen su tejido interno al aire y la luz. Frecuentemente es
considerado como perjudicial y debe tratar de prevenirse.
El enzima responsable del Pardeamiento enzimtico recibe el nombre de
polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente
cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal
sustrato.
A pesar del nombre genrico de Pardeamiento (browning en ingls), los
colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo
del alimento y de las condiciones del proceso. En algn caso, como en las
pasas, el t o el cacao el Pardeamiento enzimtico contribuye al desarrollo de
los colores caractersticos de estos productos, aunque como se ha indicado, en
otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin del color,
los

productos

formados

pueden

reaccionar

con

las

protenas,

insolubilizndolas.
Por otra parte, puede producirse tambin una perdida nutricional, ya que la
polifenoloxidasa no oxida directamente al acido ascrbico, esta vitamina puede
destruirse al reaccionar con intermedios de la reaccin.
Control de la reaccin de Pardeamiento
El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce
fundamentalmente mediante la compartimentalizacin de los sustratos. El
enzima se encuentra en los plstidos y cloroplastos (en los vegetales
superiores), y tambin en el citoplasma celular, mientras que los compuestos
fenlicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesculas. Cuando se
rompe la compartimentalizacin por dao mecnico, como el triturado, corte o

congelacin y descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir.

Tambin se produce la inhibicin del enzima por los productos de la reaccin.
Adems de mantener la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento se
puede frenar actuando sobre diferentes factores:

Inactivando la enzima (blanqueo, uso de inhibidores)

Minimizando el contacto con el oxgeno

Creando condiciones desfavorables para la actividad enzimtica

(descenso de pH, bajas temperaturas, reduccin de Aw)

Tratamiento con antioxidantes (ac. Ascrbico, dixido de azufre, etc.)

1.2 Competencias
Determinar el efecto del calor, pH, de la adicin de diferentes compuestos en la
reaccin de Pardeamiento.
1.3 Materiales y equipos

Muestras: manzana, papa, yacn

15 placas petri

Equipo de Bao mara

3 tubos de ensayo pyrex

1 pisceta

2 pipeta de 10 ml

3 lunas reloj

3 beaker de 250 ml

1 cocina elctrica

1 rejilla de asbesto

1 gradilla para tubos de ensayo

1 termmetros

2 fiolas de 100 ml

3 baguetas

1 embudo de vidrio

1 balanza

1 espatula

Licuadora o mortero (para extraer el jugo)

1 pinza de madera

Gasa

Cuchillo

Soluciones de acido ctrico al 0.1, 0.5 y 1 %

Solucin de bisulfito de sodio al 0.1, 0.5 y 1%

Zumo de limn

Agua destilada

1.4 Procedimiento
1.4.1. Formacin de Pardeamiento enzimtico

De forma rpida pelar 3 manzanas y extraer el zumo (diluido con 100 ml

de agua)

De forma rpida filtrar con gasa

Colocar 15 ml de zumo en un Beaker de 100 ml y otros 15 ml en una

placa petri

Dejar reposar por 15 minutos y observar cual de las 2 muestras se

encuentra con mayor grado de pardeamiento.

1.4.2. Efecto de la temperatura

Parte A

Colocar 5 ml de zumo de manzana en cada uno de los tubos de ensayo:

tubos A, B y C.

Tubo A: colocarlo a bao maria a 50 C por 15 minutos

Tubo A: colocarlo a bao maria a 100 C por 15 minutos

Tubo C: mantenerlo a temperatura ambiente

Comparar el grado de pardeamiento en los tubos de ensayo

Parte B

Colocar al mismo tiempo, 4 trozos de vegetal previamiente pelado

(manzana, papa o yacn) en agua hirviendo

Sacar los trozos despus de 30, 60, 90 y 120 seg.

Enfriarlos en agua y cortar cada trozo por la mitad

Observar cual es el menor tiempo necesario para inhibir el

pardeamiento enzimtico de la muestra.

1.4.3. Efecto del pH

Tomar 5 placas petri y rotule con las letras A,B,C,D y E.

Rpidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente

pelado en cada una de las placas petri

Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones:

A: solucin de cido ctrico al 1 %

B: solucin de cido ctrico al 0.5 %
C: solucin de cido ctrico al 0.1 %
D: zumo de limn
E: agua

Dejar durante una hora y comparar el Pardeamiento que haya tenido

lugar.

1.4.4. Efecto del bisulfito de sodio

Tomar 4 placas petri y rotule con las letras A, B, C y D.

Rpidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente

pelado en cada una de las placas petri

Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones:
A: solucin de bisulfito de sodio al 1 %
B: solucin de bisulfito de sodio al 0.5 %
C: solucin de bisulfito de sodio al 0.1 %
D: agua

Dejar durante una hora y comparar el pardeamiento que haya tenido

lugar.

1.4.5. Tratamiento de los tejidos y su efecto en la reaccin de Pardeamiento

Parte A

Cortar la muestra (manzana, papa o yacn) previamente pelado en 4

Dejar una parte en una placa petri

Una cuarta parte del vegetal cortarlas en trozos y colocarlo en una

placa petri

Otra cuarta parte desmenuzar y colocarlo en una placa petri

Comparar el Pardeamiento que se produce en las muestras

Parte B

La cuarta parte dividirla en 2

A una parte dividirla mediante rotura y a otra cortarla usando cuchillo.

Colocar sobre placas petri

Observar el color desarrollado y cual pardea ms rpidamente

1.5 Resultados
Compare el grado de Pardeamiento obtenido en la prctica con alguna fuente
bibliogrfica.

1.6 Conclusiones
Segn los resultados obtenidos concluya sobre el efecto de la temperatura, pH,
bisulfito y la influencia de los tejidos vegetales sobre el Pardeamiento
enzimtico en la muestra utilizada.

PRCTICA N 3: Determinacin cuantitativa de protenas

en harinas y en leche

1.1. Marco terico

El gluten es una protena de los cereales insolubles en agua, que se hidrata
dos veces su peso de agua, est compuesto de dos fracciones, una prolamina
llamada gliadina y una glutelina llamada glutenina que se separan por
precipitacin selectiva con etanol y cido. Las gluteninas son las responsables
de las propiedades elsticas y cohesivas de la harina de trigo en el proceso de
elaboracin del pan.
El trigo es el nico cereal cuya harina rinde cantidades considerables de gluten
y se utiliza esta determinacin como ndice de calidad de harinas. El gluten
hmedo en harinas normales de trigo debe ser igual o mayor a un 25 % y las
cifras normales de gluten seco son 9 a 12% en trigo blando y de 11 a 17% en el
trigo duro. El lmite mnimo admitido es de 5.5%.
Por otro lado, la casena es la principal protena de la leche, se encuentra
dispersa como un gran nmero de partculas slidas tan pequeas que no
sedimentan, y permanecen en suspensin. Estas partculas se llaman micelas
y la dispersin de las mismas en la leche se llama suspensin coloidal. En
estado puro la casena es de color blanco, sin olor e inspida; puede ser
extrada por filtracin usando un filtro de porcelana y las partculas de casena
tal como se presentan en la leche pueden ser observadas con un ultra
microscopio o por uso de un campo oscuro.
La casena se encuentra en la leche en combinacin con el calcio en forma de
caseinato de calcio. Este es precipitado por enzimas y alcoholes y por cidos a
un pH de 4.6. Los mtodos oficiales del AOAC para determinacin de casena
se basan en la precipitacin de la casena y determinacin de nitrgeno en el
precipitado lavado. La casena precipita a menor temperatura que otras
protenas.

Un mtodo sencillo y muy empleado en plantas de alimentos es el mtodo

Walker, el cual es utilizado para determinar protenas totales. Este mtodo se
basa en el hecho de que las protenas y sus productos derivados estn
relacionados con ciertos aminocidos. Estas sustancias poseen propiedades
bsicas debido al grupo amino (NH2) y cidas por el grupo carboxilo (COOH).
Las protenas reaccionan con el formaldehido para formar derivados los cuales
no poseen el grupo amino y por ende pierden sus propiedades bsicas. Las
protenas tienen reaccin neutra a la fenolftalena pero cuando son tratadas
con formaldehido tienen reaccin cida. La naturaleza general del cambio
puede ilustrarse de la siguiente manera:
La glicilglicina se deriva de dos molculas de glicina:
2 (NH2.CH2.COOH)

NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2

Glicina

Glicilglicina

NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2 + 2(HCHO)
Glicilglicina

2(CH2N.CH2.COOH) + H2O

formaldehido

cido

1.2. Competencias
Conocer los procedimientos a seguir para la determinacin cuantitativa de
protenas en leche (casena) y harina de trigo (gluten).

1.3. Materiales y equipos

1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos

1 equipo de titulacin

Erlenmeyer de 250 ml (1)

Pipeta de 10 ml (1)

Propipeta

Luna de reloj (2)

Beaker de 250 ml (2)

Bagueta

Estufa

Balanza

Esptula

Solucin de yodo en yoduro de potasio 0.001 N

Solucin de fenolftalena al 1%

Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N

Solucin de formaldehido neutro al 40%

Agua destilada

1.4. Procedimiento
1.4.1. Determinacin de gluten en harinas de trigo por mtodo de lavado

Pesar 100 g de harina. Anote el peso de la muestra (Pm),

mezclarla con 55 ml de agua potable en un beaker hasta obtener
una masa homognea, tape y deje reposar durante 20 minutos.

Coloque la masa en la palma de la mano izquierda y amasarla

bajo el goteo continuo del agua hasta que se arrastre todo el
almidn, evitando que el agua arrastre porciones de la masa.

Para comprobar la presencia de almidn, coloque en una luna

de reloj unas gotas de la solucin de yodo 0.001 N. La aparicin
del precipitado oscuro indica la presencia de almidn.

Al terminar los lavados prense la masa entre las manos bien

secas, repetidas veces hasta obtener un cuerpo muy adherente,
pese sobre una luna de reloj tarada para obtener el gluten
hmedo. Peso del gluten hmedo (P1).

Para obtener el gluten seco, coloque el gluten hmedo sobre un

vidrio de reloj tarado y lleve a la estufa a 105C por una hora.

Retire de la estufa y con una navaja o guillette bien afilado haga

unos cortes longitudinales y lleve nuevamente a la estufa a
140C de 1 a 2 horas hasta peso constante para obtener el peso
del gluten seco (P2).
Clculos:

1.4.2. Determinacin de casena en leche

Pipetear 9 ml de leche en un matraz de 250 ml y adicionar 1 ml

de solucin de fenolftalena al 1%.

Titular con la solucin de hidrxido de sodio hasta obtener un

color rosado profundo homogneo.

Adicionar 2 ml de formaldehido neutro al 40% al matraz y el

color se tornara blanco nuevamente.

Anotar la lectura de la bureta, adicione el lcali nuevamente

hasta obtener nuevamente un color rosado homogneo. Anotar
el volumen en ml de lcali requeridos para virar el color de la
muestra a rosado.
Clculo:

Cada mililitro de solucin de hidrxido de sodio 0.1 N es igual a

1.63 % de casena de leche, entonces el volumen gastado en la
titulacin despus de la adicin de formaldehido multiplicado por
1.63 nos reportara el porcentaje de casena en la leche.

1.5 Resultados
Compare los resultados obtenidos en el laboratorio con los datos tericos de
referencias bibliogrficas.

1.6 Conclusiones
Segn los resultados obtenidos concluya al respecto sobre el contenido de
gluten y de casena de cada de las muestras evaluadas.

PRCTICA N 4: Coagulacin enzimtica de la leche

1.1. Marco terico

Leche es la materia prima principal para la elaboracin de quesos es la leche.
Una leche de buena calidad asegura la obtencin de quesos de buena calidad.
Debe asegurarse que la misma cumpla con los siguientes requisitos:
Calidad fsico-qumica y microbiolgica: como se discutir ms adelante existen
factores que afectan la coagulacin de la leche que est ligado a

su

composicin (cantidad de protenas soluble, balance salino, pH, etc.) por otro
lado la carga microbiana por razones obvias afecta la calidad sanitaria, la
inocuidad del queso y la vida til del mismo. La leche debe estar libre de
inhibidores (residuos de detergentes, cloro, antibiticos, etc.) especialmente en
la elaboracin de quesos con la utilizacin de cultivos lcticos, lo cual no quiere
decir que en aquellos que no se utilicen cultivos iniciadores, pueda permitirse la
presencia de residuos qumicos. Debe recordarse la influencia sobre la salud
pblica de dichos residuos. No debe ser almacenada por largos periodos,
preferiblemente debe ser fresca. El almacenamiento prolongado de la leche a
temperaturas de refrigeracin por supuesto, produce cambios en el balance
salino y reduccin del tamao de la micela de casena por un aumento de la
cantidad de casena soluble (-caseina) y paralelamente aumenta el grado de
hidratacin de la micela, todo lo cual se traduce en problemas para la
coagulacin enzimtica de la leche. La mayora de estos efectos pueden
corregirse si la leche se mantiene por 30 minutos a una temperatura de 30-36
C antes de la coagulacin. Otro efecto y quizs ms perjudicial es el
crecimiento de bacterias psicrfilas a las cuales en su mayora tienen la
capacidad de producir enzimas lipoliticas y proteolticas capaces de soportar
temperaturas de pasteurizacin y que alteran los componentes de la leche
causando bajas en el rendimiento y alteracin de las caractersticas
organolpticas de los quesos.
Enzimas coagulantes: en los quesos elaborados mediante coagulacin
enzimtica o mixta, las enzimas coagulantes constituyen un elemento esencial.
Tradicionalmente se utiliza la quimosina o renina, extrada del cuarto estomago

(cuajar) de los becerros lactantes. Pero debido al aumento en la demanda de

cuajos se han desarrollado tcnicas para la utilizacin de enzimas provenientes
de microorganismos y vegetales.
Los cuajos microbianos son elaborados principalmente a partir de cultivos de
mohos de la especie rhizomucor. Actualmente se elabora quimosina producida
por fermentacin con microorganismos modificados genticamente, con lo cual
se obtiene una enzima bastante similar a la quimosina de origen animal; el
extracto comercial contiene quimosina 100% a diferencia del producido por
maceracin del estomago el cual puede contener 90-95% de quimosina y 1015% de pepsina.
Fuerza del cuajo: antes de utilizar cualquier enzima coagulante debe
conocerse su fuerza lo cual permite utilizar las dosis necesarias sin caer en los
errores que conlleva emplear dosis bajas o muy altas a las necesarias. La
fuerza del cuajo se define como la cantidad de leche en mililitros, que cuaja a
35C en 40 minutos, cuando se le adiciona un gramo o mililitro de cuajo.
El cloruro de calcio se utiliza para corregir problemas de coagulacin que se
presenta en la leche almacenada por largo tiempo en refrigeracin y en leche
pasteurizada. Su uso permite disminuir las prdidas de rendimiento en estos
casos y permite obtener una cuajada ms firme a la vez que permite acortar el
tiempo de coagulacin.
La dosis mxima a utilizar e del 0.02% (1 g por cada 5 litros de leche). Una
dosis excesiva conduce a una cuajada dura y quebradiza y con sabor amargo.
La sal se adiciona con el objetivo principal de darle sabor al queso, aunque
adems sirve para alargar la vida til de los mismos al frenar el crecimiento
microbiano al disminuir la actividad de agua. El porcentaje ideal depende del
tipo de queso y del gusto del consumidor aunque se puede decir que puede
estar entre el 2 3%.

1.2. Competencias
Evaluar la coagulacin enzimtica de la leche fresca y determinar la fuerza del
cuajo.

1.3. Materiales y equipos

1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos

4 Beaker (250 y 500 ml)

1 Probeta de 100 ml

1 Bagueta

1 Balanza

1 equipo de bao mara

1 pastilla de cuajo Marshall

Cocinilla elctrica

Sal yodada

Tubos de ensayo (9)

2 pipetas (5 y 10 ml)

2 propipetas

1 cucharita esptula

1 luna reloj

1 fiola de 100 ml

1.4. Procedimiento
1.4.1

Efecto de la temperatura sobre una reaccin catalizada por una enzima

a) Poner 10 ml de leche cruda o pasteurizada dentro de una serie de 6
tubos de ensayo grandes. Etiquetarlos del 1 al 6. Colocar el tubo 1
en bao mara a 30 C x 5 minutos hasta que alcance los 30C,

aadir 0.5 ml de cuajo y homogenizar. Determinar el tiempo que se

necesita para la coagulacin.
b) Repetir el mismo procedimiento a 40, 50, 60, 70 y 80C.

1.4.2

Efecto en la reaccin del tratamiento previo de la leche por el calor

a) Etiquetar 3 tubos de ensayo del 1 al 3 de llenarlos de la siguiente
forma:
1

10 ml de leche cruda

10 ml de leche pasteurizada

10 ml de leche hervida y enfriada

b) Poner los 3 tubos en bao mara a 35C hasta que la leche alcance
esta temperatura, agregar 0.5 ml de cuajo y anotar el tiempo de
coagulacin.

1.4.3

Produccin de queso
a)

Preparar una solucin de cuajo a partir del cuajo en pastilla y

llevarlo a una fiola de 100 ml y adicionarle 0.1 g de sal.

b)

En un Beaker Calentar 100 ml de leche fresca en bao mara a

37C, agregar 5 ml de cuajo

c)

Repetir la misma operacin anterior en leche pasteurizada o

esterilizada.

d)

Esperar unos 10 minutos y evaluar la cuajada formada mediante un

corte cruz.

e)

Corte en cubito y agregar agua caliente para optimizar la cuajada

f)

Evaluar la firmeza de la cuajada en las muestras.

1.5 Resultados
Compare los resultados obtenidos, y elabore un cuadro con ellos.

1.6 Conclusiones
Segn los resultados obtenidos concluya al respecto sobre la fuerza del cuajo y
la importancia del tipo de leche en la coagulacin enzimtica.