LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

AGAR FC - M (Agar para coliformes fecales)

Uso
Para la cuenta y deteccin de organismos coliformes fecales en agua y bebidas
por la tcnica de filtracin en membrana.
Formula en gramos por litro de agua destilada
Acido rosolico
Agar
Anilina azul
Cloruro de sodio
Extracto de levadura

0.1
15.0
0.1
5.0
6.5

Lactosa
Peptona de casena
Polipeptona CAS
Sales biliares

12.5
6.5
5.0
1.5

pH = 7.4 0.2
Principio
Las peptonas y el extracto de levadura proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento de
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico. Las sales biliares inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas.
Los coliformes fecales tienen la capacidad de fermentar la lactosa del medio de cultivo a una temperatura
elevada (44C). La adicin del cido rosolico proporciona a las colonias de coliformes fecales color azul y los
otros microorganismos desarrollan colonias crema a grises.
El mtodo se basa en la filtracin por membrana de una muestra para concentrar clulas viables sobre la
superficie de una membrana y transferirlas al medio de cultivo.
Incubar 18-24 h a 44C y posteriormente contar el nmero de unidades formadoras de colonias.
Control microbiolgico
MICROORGANISMO
Escherichia coli
Enterobacter aerogenes

CEPA
ATCC 25922
ATCC 13048

CRECIMIENTO
Bueno, colonias azules
Bueno, colonias crema a grises

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AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA

Uso
Es un medio selectivo para deteccin y cuenta de organismos coliformes
totales en agua, leche, productos lcteos y otros materiales de importancia
sanitaria segn las recomendaciones de la APHA. Como medio preparado
(Catlogo 1005-P) para la cuenta total de coliformes en lquidos.
Formula en gramos por litro de agua destilada
Agar
Cloruro de sodio
Cristal violeta
Extracto de levadura

15.0
5.0
0.002
3.0

Lactosa
Mezcla de sales biliares
Peptona de gelatina
Rojo neutro

10.0
1.5
7.0
0.03

pH 7.4 0.2
Principio
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de microorganismos Gram positivos. La diferenciacin
de microorganismos entricos se basa en su habilidad para fermentar la lactosa, formando colonias incoloras,
rosas o rojas por el vire del indicador rojo neutro. Los organismos coliformes al fermentar la lactosa forman
colonias rojo prpura con halo de precipitacin de sales biliares.
El medio de cultivo se utiliza de acuerdo al procedimiento de Vaciado en Placa o de Cuenta en Superficie.
Incubar 24 h a 35C
Control microbiolgico
MICROORGANISMO

CEPA

RESULTADO

Escherichia coli

ATCC 25922

Crecimiento abundante, colonias rojo prpura con halo de

precipitacin

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Crecimiento inhibido o colonias puntiformes rosa

Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Crecimiento inhibido
2

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Salmonella

ATCC 14028

typhimurium

Crecimiento escaso a moderado, colonias incoloras, sin

halo de precipitacin

AGAR ENDO
Uso
Medio de cultivo ligeramente selectivo y diferencial utilizado para
identificacin de coliformes totales y otros microorganismos entricos a
partir de diversas muestras.
Formula en gramos por litro de agua destilada
Agar

15.0

Lactosa

10.0

Fucsina bsica

0.5

Peptona de carne

10.0

Fosfato dipotsico

3.5

Sulfito de sodio

2.5

pH = 7.4 0.2

Principio
La peptona proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos. La lactosa es el
carbohidrato fermentable. El fosfato dipotsico acta como regulador de pH del medio de cultivo.

La

selectividad del agar ENDO resulta de la combinacin del sulfito de sodio fucsina bsica que inhiben a las
bacterias Gram positivas. Los coliformes fermentan la lactosa, formando aldehdo y cido, desarrollando
colonias rojas con o sin brillo metlico, producido por la cristalizacin de la fucsina. Las bacterias que no
fermentan la lactosa forman colonias incoloras, quedando del color del medio de cultivo o rosa plido y
translcido.
Sembrar la muestra de ensayo en el medio de cultivo por estra cruzada. Incubar 24 h a 35C.
Control microbiolgico
MICROORGANISMO
Escherichia coli

CEPA
ATCC 25922

RESULTADO
Colonias rojo intenso con brillo metlico
3

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Enterobacter cloacae
Salmonella typhi
Shigella flexneri
Enterococcus faecalis

ATCC 13047
ATCC 19430
ATCC 12022
ATCC 29212

Colonias rojo intenso con o sin brillo metlico

Colonias translcidas, rosa plido o del color del medio
Colonias translcidas, rosa plido o del color del medio
Inhibicin parcial o colonias puntiformes

AGAR DE DEXTROSA Y PAPA

Uso
Para cultivo y recuento de hongos y levaduras en productos lcteos, bebidas
embotelladas y alimentos. Como medio preparado (Catlogo 1059-P) para la
cuenta de hongos y levaduras en lquidos.
Formula en gramos por litro de agua destilada
Agar
Dextrosa
Infusin de papa

15.0
20.0
4.0

pH 5.6 0.2
Principio
La infusin de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y
levaduras. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos
y levaduras, agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45C, 14 ml de una
solucin estril de cido tartrico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. Sembrar el medio de cultivo
por estra en la superficie o adicionar la muestra para la tcnica de vaciado en placa. Incubar hasta 7 das a
temperatura ambiente.
Control microbiolgico
MICROORGANISMO
Candida albicans
Saccharomyces cerevisiae
Trichophyton mentagrophytes

CEPA
ATCC 10231
ATCC 9763
ATCC 9533

Aspergillus niger

ATCC 16404

RESULTADO
Colonias crema, lisas
Colonias crema, lisas
Colonias blancas, reverso blanco a marrn,
4
algodonosas
Colonias de apariencia lanosa de blanco a negro,
reverso amarillo

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AGAR MALTOSA SABOURAUD

Uso
Se utiliza para el cultivo de hongos y levaduras y para la numeracin

de

estos microorganismos en alimentos y otros materiales. Los agares

Sabouraud con maltosa estn especialmente indicados para favorecer

el

crecimiento de los hongos filamentosos.

Formula en gramos por litro de agua destilada
Agar
Peptona
D(+)-Maltosa

40,0
10,0
15,0

pH final: 5,6 0,2

Principio
En estos medios la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de los hongos y levaduras, el
carbohidrato (maltosa) es la fuente energtica. La maltosa, cumple con los requisitos nutritivos, de forma
general, de hongos y levaduras patgenas y no patgenas.
El crecimiento selectivo que se da en los medios Sabouraud que no contienen antibiticos, depende por completo
del pH cido de estos medios. Sembrar la muestra segn fines previstos e incubar entre 20C y 30C de 3 a 7
das. Tiene un aspecto de polvo fino, de coloracin beige claro.
Control microbiolgico
MICROORGANISMO
Aspergillus niger

CEPA
ATCC 16404

RESULTADO
Satisfactorio, coloracin beige claro

Candida albicans

ATCC 26790

Satisfactorio

Escherichia coli
Lactobacillus casei

ATCC 25922
ATCC 9595

Parcialmente Inhibido
Satisfactorio
5

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Saccharomyces cerevisiae

ATCC 9763

Satisfactorio

DETECCIN DE ESCHERICHIA COLI EN ALIMENTOS

Medios de cultivo, materiales, reactivos y equipos
Agar cromognico selectivo para el aislamiento de E.coli O157. Ejemplo Rainbow agar O157 o
equivalente. Para muestras con un alto contenido de flora acompaante, agregar 10 mg / l de

novobiocina ms 0.8 mg / l de telurito de potasio.

Agar tripticasa soja con extracto de levadura (TSAYE)
Reactivo de Kovacs para indol
Reactivo ltex Anti O157 y anti H7. (Remel, Lenexa, KS, o equivalente) 74
Balanza de 1 g - 500 g, sensibilidad 0.1 g
Homogeneizador automtico tipo Stomacher
Bolsas para Stomacher con filtro de capacidad adecuada.
Estufa de incubacin a 36C 1C
Estufa de incubacin a 42C 1C
Peachmetro: capaz de medir 0.01 unidad de pH, calibrado con exactitud de 0.1 unidad de pH a 25C.
Tubos y frascos de capacidad adecuada para esterilizacin y almacenamiento de medios de cultivo e

incubacin de medios lquidos.

Pipetas graduadas o automticas de 10 ml y 1 ml de capacidad nominal, graduadas en 0.5 ml y 0.1 ml

respectivamente.
Ansa de platino o nquel.
Micropipetas: de 0.5 l 20 l, 20 l 200 l, 200 l 1000 l
Mezclador rotativo capaz de rotar a 15 a 20 r/min.
Placas de Petri de 150 mm
Vrtex
Placas de vidrio para reaccin de aglutinacin
Papel de filtro

PRINCIPIO:
Enriquecimiento de la muestra en caldo mBPWp
Siembra de diluciones del caldo mBPWp en agar SMAC-CT y agar cromognico
Confirmacin de colonias sospechosas por propiedades bioqumicas y serologa

PROCEDIMIENTO:
6

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1.- Enriquecimiento
Vegetales de hoja: Agregar igual cantidad de Buffer fosfato de Butterfields a 200 g de muestra (como mnimo)
en una bolsa o recipiente estril, agitar con la mano por 5 minutos. Pesar 125 g del lquido de enjuague y agregar
125 ml del caldo mBPWp doble concentracin. 75
Jugos, leche y otras bebidas turbias: centrifugar aspticamente 200 ml de la muestra a 10000 x g durante 10
minutos. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 225 ml de mBPWp.
Agua embotellada y otras bebidas no turbias: pesar 125 ml de la muestra en 125 ml de caldo mBPWp doble
concentracin. Utilizar este procedimiento para los lquidos en los cuales no queda precipitado despus de la
centrifugacin.
Otros Alimentos: Pesar 25 g de la muestra en 225 ml de mBPWp y agitar o llevar a Stomacher. Incubar las
muestras a 37C 1C durante 5 horas, luego agregar 1 ml del suplemento ACV e incubar a 42C 1C toda la
noche (18 h a 24 h).
2.- Siembra en agares selectivos
Sembrar las muestras en los medios selectivos para el aislamiento de colonias. La siembra se realiza a partir del
caldo de enriquecimiento mBPWp incubado toda la noche.
A partir del caldo de enriquecimiento mBPWp incubado toda la noche realizar diluciones decimales con buffer
fosfato de Butterfields, sembrar 50 l en los agares selectivos y esparcir con esptula de Drigalsky.
Generalmente, sembrando 50 l de las diluciones 10-2 y 10-4 se obtiene un recuento de 100 a 300 colonias.
Sembrar por duplicado en agar SMAC-CT y en agar cromognico para E.coli.
Incubar las placas a 37C 1C, durante 1 8 h 24 h.
Observar las placas para seleccionar colonias sospechosas.
Se hace una Prueba de aglutinacin con ltex anti O157 a partir de los agares de aislamiento
picando una porcin de cada una de las colonias sospechosas aisladas. Picar todas las colonias tpicas que dieron
una reaccin positiva para la prueba de aglutinacin con ltex anti O157 (3.3.7) (hasta 10 colonias si hay ms de
10 colonias presentes) y estriar en agar TSAYE para chequear la pureza.

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Se hace una Prueba de la mancha de indol a partir de las colonias aisladas en el agar TSAYE (3.3.8.) tomando
una porcin de crecimiento y depositndola sobre un papel de filtro humedecido con reactivo de Kovac. E coli O
157 da una reaccin positiva COLOR ROJO. Si es negativa dara COLORACION AMARILLO/MARRON

IDENTIFICACION DE E.COLI EN AGAR CROMOGENICO

INDOL (R. DE KOVACS)

IDENTIFICACION CON
(COLONIAS COLOR MALVA)

COLOR ROJO REACCION POSITIVA

DETECCIN DE ENTEROCOCCUS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
MATERIALES Y MEDIOS:

Caldo glucosa azida

Caldo EVA (medio de deteccin)
Agar BARNES (medio de aislamiento)
Tubos de dilucin
Placas Petri
Pipetas de 5y 10 ml
Mechero bunsen
Asas microbiolgicas
Frascos esteriles

PROCEDIMIENTO:
Tomar la muestra del alimento y agregar el caldo EVA, si se presenta una turbidez y sedimento color
rojizo, llevar a aislamiento
El aislamiento se hace con el agar Barnes (solo para los tubos que dieron positivo con caldo EVA)

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Luego, realizar la identificacin de las colonias con la coloracin de Gram y otras como catalasa,
crecimiento a 45C, crecimiento en NaCl al 6.5%, crecimiento a pH 9.6 y otros de ser necesarios.

Pasado el tiempo de incubacin se leen las placas y se observaran las sgtes coloraciones:
Colonias con el centro rojo: E. faecalis
Colonias blancas: E. faecium
Colonias rojo intenso: Lactococcus Lactis

Identificacin de enterococcus con caldo EVA

Identificacin de E. faecalis

AGAR SULFITO DE BISMUTO

Uso:
Medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin de Salmonella typhi
y otras Salmonellas a partir de diversas muestra
Principio:
La peptona, el extracto de carne y la dextrosa proporcionan los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos. El sulfato ferroso acta como indicador en la produccin
de sulfuro de hidrgeno que se manifiesta en el centro de la colonia por un precipitado negro y un halo negro
grisceo con brillo metlico por la reduccin de los iones bismuto en presencia del sulfuro de hidrgeno.
El sulfito de bismuto y el verde brillante inhiben considerablemente el crecimiento de bacterias contaminantes.
Sembrar la superficie del medio de cultivo con el material de ensayo por estra cruzada. Incubar 24 - 48 h a 35C
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

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Agar

20.0

Dextrosa
Extracto de carne
Fosfato disodico

5.0
5.0
4.0

Indicador de sulfito de
bismuto
Peptona especila
Sulfato ferroso
Verde brillante

8.0
10.0
0.3
0.025

Preparacin:
Rehidratar 52 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo. NO calentarse por
tiempo prolongado y evitar as que pierda su selectividad. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar
aproximadamente a 45C. El precipitado caracterstico del medio se debe dispersar uniformemente durante el
vaciado en las cajas de Petri estriles. Una vez solidificado presenta un aspecto crema uniforme y gradualmente
un color verde plido. ES IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA LUZ y conservarlo en refrigeracin de 2 a
8C. De lo contrario, el medio de cultivo que est en forma reducida se va oxidando hasta adquirir un color
francamente verde, cuando esto ocurre se descarta el medio
CONTROL DE ACTIVIDAD
MICROORGANISMO
Salmonella typhi

CEPA
ATCC 19430

Salmonella typhimurium
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Staphylococcus aureus

ATCC
ATCC
ATCC
ATCC

14028
25922
12453
25923

RESULTADO
Colonias con centro negro, bordes claros, a las 48 h con halo negro grisceo
y brillo metlico
Colonias negras a verdes
Crecimiento inhibido o colonias verdes
Colonias pequeas verde plido a veces mucoides, sin swarming
Crecimiento inhibido

MEDIO SLIDO SELECTIVO BAIRD PARKER (B P)

(Staphylococcus)
Composicin:

Triptona 10 gc
Extracto de carne 5 g
Extracto de levadura 1 g
Piruvato sdico 10 g
Glicina 12 g
Cloruro de litio 5 g
Agar 20 g
Agua destilada 1.000 mL
10

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Disolver por calentamiento y agitacin. Ajustar el pH a 6,9 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 20
minutos. Enfriar a 50 C y aadir 50 de emulsin estril yema de huevo-telurito. Mezclar uniformemente y
preparar placas de Petri.

Emulsin de yema de huevo-telurito

Composicin:

Emulsin de yema de huevo 50 g

Telurito potsico 3,5 por 100
Sulfametazina 0,2 por 100
Agua destilada 1.000 mL

La yema de huevo se prepara partiendo de huevos frescos de gallina, bien lavados y que hayan permanecido en
alcohol al 70 por 100, entre 2-3 horas. Se ex-trae el huevo aspticamente, y, de la misma forma, se separan las
claras de las yemas. La emulsin se obtiene mezclando 50 mL de yema de huevo con la misma cantidad de
solucin salina estril. La mezcla se homogeneiza en homogeneizador estril.
La solucin de telurito potsico al 3,5 por 100 se esteriliza por filtracin. Para preparar la solucin de
sulfametazina, se disuelven 0,5 g del producto puro en 25 mL de hidrxido sdico, completando hasta 250 ml
con agua destilada.
Anlisis:
Pesar en condiciones aspticas 10 gramos de muestra.
Aadir 90 ml de agua de triptona al 0,1%.
Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos, el tiempo vara segn el tipo de
alimento. (Si no se dispone de stomacher puede homogenizarse en una trituradora de cuchillas -tipo
batidora- a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos)
Revivificacin; dejar reposar 1 hora a 20C.
A partir de esta, se preparan diluciones decimales sucesivas, tomando 1 mL de la primera dilucin y
descargndolo en un tubo que contenga 9 mL de diluyente (agua de triptona al 0,1%) y as
sucesivamente con las siguientes diluciones.
11

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y
descendentes formando un ngulo de abertura aproximado de 60 entre brazo y antebrazo.
mezclar mecnicamente utilizando un agitador Vortex.
Partiendo de las diluciones decimales, sembrar, por diplicado, en placas Baird Parker, mediante
extensin en superficie.
ncubar a 37C durante 48 2 horas.

(clostridium perfringens)
El medio contiene sulfitos y sales de Fe, dado que el
Clostridium perfringens es capaz de reducir los sulfitos a

sulfuro

en presencia de Fe se forma Sulfuro ferroso y por tanto las

colonias las

veremos de color negro, adems precipita la lecitina de la

yema

huevo, por lo que se observa un halo de precipitacin

alrededor

de la colonia.
La determinacin de Clostridium pefringens como indicador, se hace por cuenta en placas vertidas de agar
triptosa-sulfito-cicloserina (TSC) con yema de huevo, incubadas en anaerobiosis (Gas-Pack o similar).

12

y
de