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Facultad de Biologa
Grado en Biologa
1855: Regulacin Molecular de los procesos
Biolgicos.
3 Ribosomas ....................................................................................................... 17
4 Sntesis de protenas e inhibidores ..................................................................... 1
5 Chaperonas moleculares .................................................................................... 2
5.1 El descubrimiento de las Chaperonas ............................................................................. 3
5.2 El plegamiento de las protenas ...................................................................................... 4
5.3 Funciones de las chaperonas .......................................................................................... 5
5.4 Clasificacin de las HSP ................................................................................................... 6
5.5 Modo de accin de algunas chaperonas ......................................................................... 7
5.5.1 HSP70 y co-chaperonas (HSP20 y HSP40) ............................................................................... 7
5.5.2 HSP90 ..................................................................................................................................... 8
5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES) ........................................................................................................... 9
1.4. El transporte a travs del poro en funcin del tamao de la carga ............................. 34
1.5. Diversidad de carioferinas ............................................................................................ 34
1.6. Complejos proticos asociados a la distrofina ............................................................. 35
2.
2.2.
3.
5. El proteasoma ................................................................................................. 65
5.1 Relacin entre el Alzheimer y el proteosoma ............................................................... 66
5.2 Inhibidores del proteasoma en el tratamiento contra el cncer .................................. 68
3.7 Otras protenas que ayudan al plegamiento en el retculo endoplasmtico .............. 128
3.8 Ensamblado de las subunidades proteicas en el retculo endoplasmtico ................. 130
3.9 Modificaciones de la N-glicosilacin a nivel del aparato de Golgi .............................. 130
6
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11
12
El tipo celular pudiendo representar el 50% del volumen celular, pero gran parte de
este estar ocupado por vesculas del retculo endoplasmtico, del complejo de Golgi
lo que depende del tipo de clula.
El estado celular, ya que por ejemplo, una clula del sistema inmune no tiene el
mismo desarrollo de retculo endoplsmico cuando est estimulada para producir anticuerpos que cuando no est estimulada, por lo que tambin depende del estado celular.
Dnde hay ms volumen relativo de citosol, en un hepatocito o en miofibra muscular?
El volumen relativo de citosol es mayor en un hepatocito porque en la fibra muscular, aunque el volumen celular es mayor, este est ocupado por el retculo sarcoplsmico.
La concentracin de protena presente en el citosol es muy alta, del orden del 20% (P/v,
20mg/1ml o 20g/100ml). Debido a esa gran concentracin de protenas el citosol tiene un aspecto de gel estructurado.
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Tambin hay gotitas de grasa, que son TAGs. Las enzimas de sntesis (triglicridos sintetasa) y
degradacin (triglicridos lipasa) estn siempre cerca de los TAGs, para que la accin sea inmediata y no tengan que ir buscando esas enzimas por el citosol.
Por ejemplo, para que una protena incorpore un resto hidrofbico ha de ser sintetizada por
los ribosomas libres del citosol. Esto se debe a que la formacin de geranil-pirofosfato y farnesi-pirofosfato, a partir del isopentenil-pirofofasto y el dimetilalil-pirofosfato (que proceden
del cido mevalonico) se produce en el citosol. Por lo tanto la nica va de incorporacin de
poli-isoprenos o cidos grasos a las protenas va a ser mediante su sntesis citoslica.
Otro de los aspectos importantes del citosol es la presencia del citoesqueleto. En el citosol
tiene lugar la remodelacin del citoesqueleto que por una parte determina el movimiento de
algunos tipos celulares, y por otra determina la posicin relativa de los orgnulos subcelulares, lo que afecta a la eficiencia y rapidez de la respuesta a los estmulos.
La red del citoesqueleto proporciona las vas por las que van a circular los elementos del citosol gracias a los motores moleculares (dineinas y quinesinas). Este sistema de conduccin (actina, tubulina,) contribuye a la eficiencia en el acoplamiento de la vescula desde la membrana de salida hacia la membrana de llegada, garantizando, adems, la complementariedad
(las vesculas del retculo endoplasmtico van a ser conducidas a la cara proximal del retculo
de Golgi y no a la cara distal).
Puesto que la red del citoesqueleto regula la actividad celular normal, los fallos en la composicin, el funcionamiento o en la dinmica de los componentes pueden favorecer los problemas
de supervivencia celular o incluso la transformacin en clula neoplsica. El caso ms extremo
es la metstasis o posibilidad de que una clula migre de un tejido afectado mediante la separacin, entrada al sistema circulatorio y deposicin posterior en el tejido aceptor.
Otros de los aspectos por los que el citosol tiene una gran importancia en el metabolismo es
por la presencia de ribosomas. En eucariotas solo existe un tipo de ribosomas que en funcin
de la protena en sntesis se van a encontrar libres o acoplados al retculo endoplasmtico.
Al ser sintetizadas, las protenas pueden portar un pptido seal que provoca el acoplamiento al RE a travs de un receptor de la seal, que posibilita que el pptido sea introducido en el RE mediante un translocon.
El destino de una protena est determinado por la secuencia de aminocidos que contiene en
el extremo amino-terminal (N-terminal) donde puede situarse una seal de trnsito que la
dirigir:
-
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La albumina es una parte fundamental del plasma sanguneo que interviene en el transporte de
hormonas (Triyodotironina, tiroxina,) y que es una secrecin constitutiva en el hgado. Por el contrario, la secrecin de insulina desde las clulas islotes del pncreas es una secrecin regulada.
Tamao (pb)
3.274 millones
3.420 millones
2.385 millones
1.050 millones
1.563 millones
168 millones
487 millones
103 millones
12 millones
N de genes
~25.000
~25.000
~20.000
~18.000
~22.000
~13,000
~44.000
~19.000
~6.000
N cromosomas
46
40
78
66
48
8
24
12
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El conjunto de genes de un organismo seala la informacin que puede expresar la clula (la
capacidad que tiene), la variedad de protenas expresa la capacidad de la clula para hacer
frente a una situacin concreta, la variedad de protenas es altamente variable. Los genes son
los mismos en todas las clulas, pero la composicin de protenas (el proteoma de la clula)
vara y depende del tipo celular, del organismo, del momento del desarrollo del organismo, del
estado celular en ese momento, etc. El proteoma va cambiando para ir adaptndose a cada
situacin, pero los genes son siempre los mismos.
No se sabe cuntas protenas es capaz de fabricar el ser humano (100.000 protenas distintas),
pero esto tiene mucho inters, ya que comparando las protenas de una persona sana con otra
enferma, podramos ver qu protenas son causantes de esa enfermedad o qu protenas, en
su ausencia, causan esa enfermedad.
Se sospecha que la mayora de los 25.000 genes sufren splicing alternativo (90%). Se calcula
que debe de haber unas 100.000 protenas distintas, ya que por cada splicing suelen formarse
unas 4 variantes de la protena.
Hasta la fecha se han identificado 20.000 protenas distintas, que son las ms abundantes.
Como cada ao se van mejorando las tcnicas de identificacin y anlisis de protenas, por
tanto cada ao se irn descubierto cada vez ms protenas. Unas 1.000 protenas distintas se
han identificado en la mitocondria. En el suero sanguneo se han encontrado 3000 protenas y
en el lquido cefalorraqudeo unas 1000 protenas.
La diversidad de protenas aparece por resultado de Splicing alternativo (ensamblado alternativo de los exones y eliminacin de intrones) y transformaciones (o modificaciones) posttraduccionales.
La fosforilacin (Quinasas/Fosfatasas)
Acetilacin (acetilasas/desacetilasas o acetiltransferasas) como en el caso de las histonas y la expresin de genes.
Metilacin (metilasas/desmetilasas o metiltransferasas)
Oxidacin (oxidasas/reductasas)
Adicin de ubiquitina
Una protena que pierde los restos aadidos durante los cambios post-traduccionales irreversibles pierde su actividad biolgica al perder su estructura tridimensional. En ciertos
casos esta protena puede llegar a ser txica dando lugar a agregados como es el caso de
los priones.
3 Ribosomas
Uno de los compuestos ms abundantes en el citosol son los ribosomas que varan dependiendo de si la clula es eucariota o procariota.
-
Subunidad 60S
rRNAs 28S, 5.8S y 5S
45 protenas
Subunidad 40S
rRNA 18S
33 protenas
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Las protenas que se asocian con el ribosoma pueden llegar a tener unos 80 kD, lo que
supone un despilfarro energtico.
La sobreproduccin de cualquiera de ellas supone problemas, ya que a grandes concentraciones de una protena, esta puede desplazar a otras del lugar que le corresponde, a pesar de tener menos afinidad por el sitio de unin. Esto provoca ribosomas
no operativos o de baja eficiencia.
En el cuadro se representan las interacciones de las protenas relacionadas con el ARNr 16S de
la subunidad pequea del ribosoma procariota (S =
Small). Podemos clasificar estas protenas en funcin de
su relacin entre ellas y el ARN.
-
Por ello en estas condiciones, el desplazamiento que podra provocar una desregulacin de la
expresin de las protenas del ribosoma afectara gravemente a la funcionalidad ya que, si por
ejemplo la protena S20 desplazara a S7, ninguna de las que interaccionan con S7 podran unirse. Por ello en los procariotas, las protenas estn organizadas en operones.
Un opern es un conjunto de genes que se van a expresar de manera coordinada, es decir, que
la expresin del primer gen conlleva la expresin de los genes que le siguen. Todas las protenas que intervienen en la biosntesis de las subunidades del ribosoma estn agrupadas en operones de 2 o 3 protenas.
Adems la primera de las protenas expresadas por el opern tiene la facultad de unirse a su
lugar en el ARNr correspondiente y de actuar como un represor de su propio opern unindose al mensajero. Por ello, cuando todos los sitios correspondientes de los ARNr sean ocupados se inhibir la expresin de ms subunidades.
El ritmo de sntesis de protenas es de 15 aa/s, es decir, que el ribosoma se desplaza sobre la
cadena de mRNA a una velocidad de 45 b/s. Por ejemplo, una protena de 75.000 Da, considerando que la masa promedio de un aminocido es de 100 Da, contiene unos 750 aminocidos. Por lo tanto sern necesarios 50 segundos para sintetizar una protena. Pero puesto que
se forma un polisoma en el que varios ribosomas leen el mismo mensajero al mismo tiempo
con cierto desfase entre ellos, en 100 segundos no tendremos 2 copias, sino muchsimas ms.
El Cloranfenicol inhibe a la peptidiltransferasa, una ribozima (ARN con accin cataltica no proteica) que transfiere la cadena polipeptdica desde el sitio peptidil (P) al sitio
aminoacdico, para que se vaya formando la cadena.
La Puromicina es un anlogo estructural del Tyr-tRNA (aminoacil de tRNA), de manera
que se engaa al ribosoma, ya que incorpora a la puromicina creyendo que es la TyrtRNA y por tanto ya no puede continuar la elongacin de la cadena polipeptdica.
Tambin puede afectar a eucariotas.
La Tetraciclina y la Estreptomicina se unen a la Subunidad 30S y provoca la lectura
errnea del mRNA.
La Eritromicina se liga al rRNA 23S y detiene la translocacin del ribosoma a lo largo
del mRNA.
Puesto que las mitocondrias se ven afectadas por los inhibidores procariticos, los efectos del
consumo de estos compuestos sobre una persona dependern de la cantidad, del genoma y
el proteoma del individuo, as como de la naturaleza del antibitico y del tejido.
Cualquier agente antibacteriano que pueda afectar a nuestras mitocondrias afecta al resto de
la clula tambin. Dependiendo de la naturaleza qumica de estos compuestos, tendrn mayor
o menos dificultad para atravesar la membrana (cuanto ms polar sea, pasar con menos facilidad; cuanto menos polar sea, pasar con mayor facilidad). Tambin depende de la naturaleza
de la membrana mitocondrial externa e interna, que tienen distinta permeabilidad.
Se puede utilizar la Eritromicina, porque no puede cruzar (o casi no puede entrar) la
membrana mitocondrial interna.
Las clulas que se dividen muy activamente tienen muchas ms mitocondrias, por lo son mucho ms vulnerables a estos inhibidores. La vida media de una mitocondrial en una clula normal es de 5 o 6 das. Por eso, para que se afectaran de manera notable las clulas del organismo, tendra que someterse a un tratamiento con antibiticos durante unos 5, 6 o 7 das, para
afectar gravemente a las clulas. Si el tratamiento es de un par de das, por ejemplo, es posible
que solo el 20 o 30% de las mitocondrias de una clula se vean afectadas, pero aun as la clula
seguira funcionando ms o menos de forma aceptable (con el 80% de mitocondrias funcionando). Pero si por ejemplo se ven afectadas ms del 50-60% de las mitocondrias, pues la clula se ver gravemente afectada por esa disminucin de mitocondrias.
Los tratamientos con antibiticos bacterianos tienen que ser lo ms breves posible para que
no afecte mucho a las clulas y adems, que no se cree resistencia por parte de las bacterias.
Tetraciclinas: No pueden pasar a travs de la membrana plasmtica de las clulas de la
mdula sea, porque se crea el complejo tetraciclina-Ca, debido a que en el hueso hay una
gran concentracin de calcio (los huesos estn formados por fosfatoclcico).
Los tratamientos con antibiticos pueden causar trastornos en tejidos del epitelio intestinal,
apareciendo diarreas, se muere la flora intestinal, y algunos antibiticos pueden ocasionar
estado de anemia, porque se daan clulas sanguneas que sufren un recambio rpido y necesitan multiplicar sus mitocondrias.
Tambin hay que destacar que cuando estamos sometidos a un tratamiento con antibiticos,
nos sentimos dbiles y sin fuerzas, porque con el antibitico se ve reducido la sntesis de ATP
en las mitocondrias.
5 Chaperonas moleculares
En la construccin del ribosoma, intervena
los RNA ribosomales y adems un montn de
protenas, donde unas 55 para el ribosoma
bacteriano y en torno a 78 para el ribosoma
de eucariotas.
2
Estas protenas se sintetizan en ribosomas libres, y despus entran al ncleo (a travs de los
poros nucleares), llegando al nucleolo (que es la fbrica de ribosomas). A continuacin se forman las partculas pre-ribosomales (unindose al RNA ribosomal), que salen por los poros nucleares hacia el citosol. Una vez fuera, terminan la maduracin, unindose al RNA mensajero
ambas subunidades ribosomales (pequea y grande) y empieza la sntesis de protenas.
Para que todo esto ocurra de forma rpida y eficiente, hacen falta unas protenas de ayuda
que son las chaperonas.
La secuencia de aminocidos de una protena determina su estructura tridimensional, lo que
quiere decir, que al concluirse la sntesis de la cadena polipeptdica la protena debera estar
plegada. Pero lo que sucede en realidad es que los determinantes estructurales se pueden
situar en el extremo central o en el carboxilo, y por lo tanto, la protena no pueda plegarse
hasta que se haya completado la sntesis.
Cuando una protena presenta los determinantes estructurales en la secuencia N-terminal,
esta se ir plegando conforme sea sintetizada pero si se sitan ms adelante, la protena comenzar a plegarse de forma errnea formando un ovillo. Para evitar este fenmeno, las chaperonas van a mantener la estructura de la protena en sntesis desplegada hasta que los
determinantes estructurales permitan el plegamiento correcto.
El nombre de Heat shock protein (HSP) o protenas de choque trmico, que reciben las chaperonas, proviene de la observacin de su sntesis cuando se somete un cultivo celular a una
temperatura mayor a la que presenta un funcionamiento ptimo.
Si se introduce un cultivo de linfocitos en una cabina de flujo a 42 C durante 10 minutos,
aunque la clula sigue viviendo, muchas de sus protenas comienzan a desnaturalizarse, lo
que provoca las seales de estrs trmico que desembocan en la sobreexpresin de chaperonas para favorecer el replegamiento y la recuperacin de protenas.
En condiciones normales siempre existe una expresin basal de chaperonas, ya que, como
veremos ms adelante, estas van a tener muchas ms funciones. Para ejercer dichas funciones
precisan de un aporte de ATP, puesto que va a ser su hidrlisis la que produzca la variacin de
energa libre necesaria para dar lugar a procesos desfavorables termodinmicamente.
En general, las chaperonas van a ser inducibles por todos los factores que faciliten el unfolding1 como:
-
Variaciones de temperatura.
Disolventes orgnicos (etanol, propiodioxano,)
Elementos metlicos (Zn, Pb,)
hasta que la llegada del cortisol produce un cambio conformacional que libera el sitio y
permite su importacin al ncleo y la bsqueda de su elemento de respuesta (secuencia de nucletidos).
8) Transporte de protenas por translocones como en el caso de las chaperonas SecA en
procariotas y BiP en eucariotas. La protena de unin o Binding protein (BiP) facilita la
entrada de protenas al lumen del retculo endoplasmtico en el transporte posttraduccional (no confundir con la introduccin co-traduccional mencionada anteriormente). BiP es por tanto una chaperona que va a empujar protenas sintetizadas, mediante gasto de ATP, al interior del retculo.
9) Control de calidad (plegamiento correcto) a travs de los distintos pasos hasta el destino final de una protena. Las chaperonas son capaces de forzar a las protenas a conseguir su estructura nativa aunque sea necesaria la desnaturalizacin completa para
volver a realizar el plegamiento.
Adems, las chaperonas participan en la progresin del ciclo celular, mantenimiento de los
telmeros, apoptosis, transduccin de seales mitticas, transporte vesicular, inmunidad innata y degradacin proteica.
Conforme aumenta la edad, disminuye la capacidad de sntesis de chaperonas, lo que genera
problemas con la proteostasis (homesotasis del proteoma) dando lugar a neurodegeneracin,
demencias, diabetes tipo-2, patologas por depsitos de material en lisosomas, fibrosis qustica, patologas cardiovasculares y cncer.
HPS20
HSP40
HSP60
HSP70
HSP90
HSP100
Para establecer la identidad (parecido) entre las chaperonas de una misma familia se elige una
como prototipo o estndar y se calcula el parecido de secuencia con respecto a las dems.
Puesto que se encuentra en todos los orgnulos debieron aparecer en un momento temprano
de la evolucin, y puesto que estn representadas por muchas familias, su funcin es muy
importante ya que nos encontramos con un sistema de redundancia.
Esta diversidad tambin puede explicarse si se considera que la diana de accin son miles de
protenas con multitud de dominios estructurales diferentes. Cuando una chaperona detecta
6
una protena parcialmente desplegada que ha dejado expuesto un dominio hidrofbico, desarrolla su actividad cataltica golpeando a la protena hasta que recupera su forma nativa. De
esta manera se evita la formacin de agregados insolubles. Pero esto puede pasar con cualquier protena, por lo que es necesario que el centro activo sea flexible para abarcar una gran
cantidad de motivos. Adems, la combinacin de varias chaperonas aportar una cierta especificidad, pero relativa, para establecer una unin de baja afinidad que permitir la salida posterior de la protena.
protena diana que es golpeada una y otra vez hasta alcanzar su estado nativo. Por lo tanto
la HSP70-ADP presenta una alta afinidad por la protena diana.
Para que se pueda llevar a cabo cada ciclo la protena NEF (Nucleotide Exchange Factor) intercambia el ADP por ATP, haciendo que los dominios de unin a protenas de HSP70 cambien de
alta a baja afinidad. HSP70-ATP es el estado de baja afinidad por la protena diana.
Si la protena sigue presentando regiones hidrofbicas al medio, y por ende, est mal plegada,
entonces an presenta la afinidad suficiente por los dominios de unin a protenas y permanece en lugar activo para recibir un nuevo golpe. Pero si ha adquirido su estructura nativa entonces el cambio de HSP70 a un estado de baja afinidad le permite liberarse.
La HSP40 y HSP20 son co-chaperonas que median en el reconocimiento de protenas mal plegadas, caracterizadas por la exposicin de regiones de al menos 8-10 o 12 aminocidos hidrofbicos2, transportndolas hasta las proximidades de la HSP70 ejecutora y adems promueven
su actividad ATPasa.
Si observamos un ejemplo en el que interviene la protena J (co-chaperona), cuando esta interacciona con una protena
desplegada o mal plegada (1), se
une a ella y la traslada hasta la
HSP70, formndose un complejo
ternario (2) entre la protena J,
la protena diana y HSP70.
A continuacin se produce la
hidrolisis de ATP en HSP70 (3) lo
que provoca su aumento de
afinidad por la protena diana y
un descenso de afinidad por la
protena J.
Ahora NEF interviene y se une a HSP70 (4) provocando la salida del ADP (5) y la entrada de ATP
(6) con el consiguiente cambio conformacional, pasando a un estado de baja afinidad y favoreciendo adems la salida de NEF (7).
Este ciclo puede tener xito y conseguirse la estructura nativa de la protena o puede fracasar.
Cuando tras varios intentos no se consigue plegar correctamente a la protena esta es derivada hacia la degradacin a travs del sistema de ubiquitina-proteosoma o a travs de la autofagia.
5.5.2 HSP90
La HSP90 (Apo-HSP90) es un dmero que presenta tres dominios funcionales:
-
Dominio de unin C-terminal (CD) por donde los monmeros se unen a travs de sus
extremos C-terminales y en ocasiones es denominado pinza molecular.
Arginina y lisina
Esta chaperona presenta tres estados conformacionales diferentes en funcin de los ligandos a
los que se encuentre unida.
La primera conformacin o conformacin de alta afinidad es la
que se produce cuando la HSP90
no interacciona con sus ligandos
(ATP/ADP y una protena desplegada). Se encuentra en un estado
relajado con los monmeros
unidos a travs de CD separados
y exponiendo al medio algunos
residuos hidrofbicos con alta
afinidad por las protenas mal
plegadas.
La segunda conformacin o de baja afinidad se produce cuando HSP90 incorpora ATP en los
dominios ND y una protena desplegada en los dominios MD. La estructura se cierra y el sustrato queda secuestrado por interacciones no covalentes de baja afinidad.
La tercera conformacin o conformacin compacta se produce cuando otras protenas como
AHA1 interaccionan con HSP90 de baja afinidad, provocando la aproximacin de los dominios
ND con ATP unido, que dimerizan y aplastan a la protena que se encuentra unida en MD.
Finalmente se produce la hidrlisis del ATP a ADP +Pi que provoca la vuelta al estado de alta
afinidad inicial, la separacin de los dominios ND y la liberacin de la protena plegada. Posteriormente se libera el ADP + Pi y la chaperona vuelve al estado ms desplegado de alta afinidad.
Tal y como se puede observar en la imagen, el paso de un estado a otro est muy regulado
por protenas que comprueban que la protena unida a HSP90 necesita o no plegarse impidiendo o permitiendo el avance del proceso.
5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES)
La familia de chaperonas HSP60, a diferencia de las anteriores, forman estructuras polimricas
de oligmeros (Chaperoninas3) que en procariotas dan lugar a una estructura don forma de
barril compuesto por:
-
GroEL que es un cilindro con 14 subunidades proteicas (HSP60) cuyo interior da lugar a
dos cmaras, una superior y otra inferior separadas por una barrera.
GroES es una especie de tapadera con 7-8 subunidades de HSP60 que interacciona con
los huecos de las cmaras de GroEL.
Existe una tendencia a denominar Chaperonas a las monomricas y Chaperoninas a las polimricas.
Cuando una protena resulta resistente al plegamiento por HSP70, entonces esta se la cede a
GroEL, mediante un intercambio de ADP por ATP (cambio de alta afinidad a baja afinidad), que
la introduce en la cmara abierta (cis).
Puesto que cada complejo presenta dos cmaras estn actuaran de manera cclica y alternativa
por lo que mientras que una cmara puede presentar ATP unido, la otra podr presentar ADP
o el sitio vaco.
Al mismo tiempo que la protena va entrando en la cmara cis de GroEL, se promueve la salida
de 7 ADP en la cmara trans y la separacin de su unidad GroES, al mismo tiempo que 7 ATP se
unen a la cmara cis y promueve la unin de GroES.
Ahora la actividad ATPasa de las subunidades HSP60 se activa e hidroliza el ATP provocando un
cambio conformacional que presionan la protena dentro de la cmara cis hasta conseguir su
estructura nativa. En este estado con ADP, la cmara cis tiene una alta afinidad por la protena,
pero la unin del ATP a la cmara trans provoca la salida del ADP y de GroES de la cmara cis.
Puesto que la cmara presenta el interior tapizado por aminocidos hidrofbicos, en el caso de
que la protena est plegada, la salida de GroES provoca la expulsin inmediata de la protena.
Cabe destacar que la etapa ms larga del ciclo es el plegamiento de la protena.
10
5.6 Resumen
Hemos visto en los apartados anteriores como las chaperonas participan en el plegamiento de
las protenas, pero no hay que olvidar, que esta es solo una de sus acciones.
En la imagen se ha realizado una sntesis de
la importancia de las chaperonas en el plegamiento de protenas en procariotas.
Cuando la cadena polipeptdica comienza a
emerger del ribosoma esta se encuentra
con unas chaperonas unidas que mantienen
la estructura desplegada en el caso de que
se trate de una regin hidrofbica.
A partir de aqu se abren dos posibilidades.
Por un lado la protena puede sintetizarse
completamente y plegarse per se, como
ocurre en el 70% de los casos. Por otro lado
la protena necesitar de la participacin de
chaperonas que la mantengan desplegada
hasta encontrarse con HSP70 (20%) o que
adems necesiten de la participacin de los
complejos GroEL-GroES para finalizar el
plegamiento (10%).
Puesto que es ms rentable no utilizar chaperonas, la mayora de las protenas se pliegan a la
estructura nativa espontneamente, seleccionndose evolutivamente la presencia de los
determinantes estructurales en las regiones N-terminales de la secuencia de aminocidos.
Volviendo a las distintas posibilidades que tiene una protena para plegarse vamos a integrar lo
visto junto con las vas de degradacin. Una protena recin sintetizada pasa a un estado de
plegamiento parcial del que puede derivar en una protena con estructura nativa, paso facilitado por las chaperonas con una importancia relativa de 180, o puede formar estructuras mal
plegadas o misfolded y
agregados proticos.
Tal y como se muestra en
la imagen, la importancia
relativa de la degradacin de protenas va
ubiquitina-proteosoma
es de 600, unas 20 veces
mayor que la degradacin de agregados va
autofgia que tiene una
importancia relativa de
30.
11
Si una clula tiene problemas para conseguir ATP, se acorta la vida celular?
Puesto que la clula tiene daada la funcin mitocondrial y depende de un aporte continuo de ATP la clula va a sufrir, y uno de los problemas se localizar en la falta de chaperonas, lo que provocar un acortamiento de la vida.
Finalmente, en cuanto a la regulacin de la expresin de las chaperonas, tenemos que considerar que su actividad no siempre tiene por qu ser beneficiosa. Un ejemplo de ello es la
regulacin de HSP70 y HSP90 por parte del factor HSF-1 (Factor de transcripcin de chaperonas 1) en el estudio del Parkinson.
El Parkinson se caracteriza por la presencia de estructuras anmalas de -sinucleina que van
desde oligomeros solulbes hasta largos agregados denominados cuerpos de Lewy que aparecen por la polimerizacin de fibrillas insolubles.
Las chaperonas estn muy implicadas en el correcto plegamiento de estas protenas, pero
HSP90 parece promover la formacin y el crecimiento de las fibrillas y agregados, mientras que
HSP70 estabiliza las formas monomricas, inhibiendo la oligomerizacin.
Cuando la clula detecta un aumento en la cantidad de protenas mal plegadas o neurotoxinas
entonces se promueve la actividad de HSP70 y su sntesis a travs de la modulacin positiva de
HSF-1.
La rotenona y el amital son dos toxinas capaces de inhibir el transporte electrnico en la
cadena respiratoria mitocondrial provocando un descenso en la produccin de ATP que
afecta gravemente al sistema nervioso. Esto se debe a que la neurona necesita el ATP para
repolarizar la membrana a expensas de la bomba Na/K
12
Pero HSP90 acta como un secuestrador de HSF-1, evitando la produccin de HSP70, por lo
que parece que promueve la formacin de los cuerpos de Lewis.
Por casos como este, la relacin entre las distintas chaperonas est siendo objeto de profunda
investigacin ya que, por ejemplo, el mantenimiento de la vida til de p53, el guardin del
genoa, mediante una chaperona especfica alargara la vida.
Las Tirosin (Y) quinasas/fosfatasas que actan sobre residuos de tirosina como el receptor de insulina y Abl. Pueden ser solubles o estar asociadas a la membrana. Todos
los receptores de factores de crecimiento desarrollan esta actividad.
En cuanto a los sustratos de las PKs tenemos que considerar el ATP-Mg y las protenas sobre
las que actan.
El Mg es un catin divalente que interacciona con las cargas negativas de la molcula de
ATP dando lugar a una geometra que le permite acceder al sitio activo de la quinasa.
Quinasas y fosfatasas regulan casi todos (si no todos) los procesos celulares a travs de puntos clave en el metabolismo, la transcripcin, la traduccin, el ciclo celular, la estabilidad de
protenas, el movimiento celular, la apoptosis, exocitosis regulada, la dinmica del citoesqueleto, la contraccin muscular, la accin hormonal, la transduccin de seales, etc.
Patologas asociadas con la prdida o ganancia de funcin de quinasas/fosfatasas
Existen muchas patologas asociadas a los fallos relacionados con estas enzimas clave para las
clulas.
-
La quinasa Abl es una protena oncognica con actividad tirosina quinasa (Y-quinasa) que
presenta en su estructura 1 serina, 1 treonina y 9 tirosinas, capaces de ser fosforiladas dando
lugar a unas 2000 variantes. La hiperfosforilacin de la quinasa Abl provoca leucemia mieloide crnica cuyo tratamiento actual consiste en la utilizacin de inhibidores como el Imatinib.
-
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receptor-bound protein 2), que cambia de conformacin y se une a la protena Sos (Son of Sevenless).
La unin de la protena Sos a Grb2 la capacita para actuar como un intercambiador de GDP
por GTP en Ras unida a la membrana. La protena Ras-GTP es reconocida por el factor activado
por Ras 1 (Raf-1) y este fosforila a MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase) que pasa a
fosforilar a la quinasa regulada por seales externas (ERK).
La ERK fosforilada tiene la capacidad de trasladarse al ncleo porque su fosforilacin libera la
seal de localizacin nuclear que activa el sistema carioferinas (transportadores del poro nuclear), y all comienza la fosforilacin de los factores de transcripcin diana que se unirn a su
secuencia de reconocimiento activando o inhibiendo la expresin de un gen.
La importancia de las protenas G radica en su actividad como intercambiadoras de nucletidos de guanina. Estas son diferenciadas en dos clases:
-
Las mutaciones en protenas como Ras que provocan la prdida de su actividad GTPasa dan
lugar a una activacin constante que desregula completamente la expresin de protenas
desembocando en un cncer.
6.1.2 Modificacin de los dominios N-terminales de las histonas
Las histonas son unas protenas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol que entran al
ncleo para estabilizar a la fibra de DNA polimerizndose en octmeros. Estas protenas presentan a pH fisiolgico una gran abundancia de cargas positivas en sus extremos N-terminales,
situndose su punto isoelctrico a un pH superior a 10.
Aminocidos tales como la
lisina (K) o la arginina (R)
proporcionan estas cargas
que son idneas para estabilizar a la hebra de DNA, cargada negativamente por sus
enlaces fosfodister a pH
fisiolgico.
Uno de los puntos de regulacin de la compactacin de la cromatina van a ser las modificaciones covalentes reversibles sobre las colas N-terminales de las histonas, tales como la acetilacin, metilacin y fosforilacin.
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La acetilacin de histonas conlleva una neutralizacin de carga positiva mediante la adicin de un grupo acetilo (acetato), donado por el Acetil-CoA procedente de la mitocondria
a travs de la lanzadera de Citrato.
Cuando hay abundancia de Acetil-CoA la histona acetil transferasa (HAT) incorpora un resto de acetato al grupo -amino de la lisina y permitiendo la expresin de ciertos genes asociados a un estado de energa disponible.
Cuando los niveles de energa disminuyen, la histona desacetilasa (HDAC) puede realizar la
reaccin contraria liberando el resto acetilo y condensndose de nuevo la cromatina.
Incorporacin de cido adenlico (AMP) en glutamina sintetasa de E. coli por adenililtransferasa, una actividad regulada a su vez por uridil-transferasa.
Adicin de metilo (SAM) en restos de cido glutmico de receptores que regulan la
quimiotaxis bacteriana.
Adicin de ubiquitina a histonas y otras protenas de manera reversible (histonas) mediante unos pocos restos, o de manera irreversibles (degradacin proteica).
Incorporacin de ADP-ribosa en histonas, factor de elongacin EF2, subunidades s yi
de las protenas Gs y Gi del sistema adenilatociclasa (reversible o irreversible).
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Las protenas que incorporan el cido palmtico (16C) en una cistena (C) o serina (S),
siempre interna en la cadena de aminocidos.
Las protenas que incorporan el cido mirstico (14C) en una glicina (G) N-terminal.
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Las protenas que incorporan restos de poliisopreno como Farnesil (15C) o geranilgeranilo (20C) en cistenas (C) C-terminales que posteriormente pueden incorporar un
resto metilo.
La adicin de los restos hidrofbicos aporta un carcter anficlico a la protena que la desplaza
hasta la membrana ms cercana desde donde se desplazar hasta su localizacin definitiva.
La adicin de restos hidrofgicos como cambio post-traduccional irreversible es un proceso
que en humanos afecta a ms de 700 protenas entre las que 500 incorporan poliisoprenos,
100 incorporan cido palmtico y otras 100 cido mirstico. En el gnero Tripanosoma se han
identificado ms de 100 protenas unas a la membrana a travs de puentes GPI.
3-Isopentenil pirofosfato y la sntesis de poliisoprenos
El 3-Isopentenil pirofosfato (5C) es la molcula precursora de toda la familia de los isoprenos
presentes en gran cantidad de protenas celulares. Adems es el precursor de muchas molculas como el dolicol (relacionado con la N-glicosilacin) que acepta los azcares que sern transferidos a las protenas.
El dolicol es una molcula anfiptica con un resto alcohol que puede mirar hacia el interior
o el exterior del retculo endoplasmtico gracias a los movimientos de flip-flop. Cuando el
dolicol es cargado en la cara citoslica con la N-acetil-glucosamina y la manosa, se internaliza para glicosolar protenas.
En el citosol encontramos un equilibrio entre los ismeros de dimetilalil pirofosfato y 3Isopentenil pirofosfato, condensados por la preniltransferasa (cabeza-cola) para dar lugar al
geranil pirofosfato (10C).
La condensacin del geranil pirofosfato con una
nueva molcula de 3Isopentenil pirofosfato
da lugar al farnesil pirofosfato (15C) o la condensacin de dos molculas de geranil pirofosfato (cabeza-cabeza) da
lugar al geranil-geranilo.
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Si la protena de partida era de la familia Rho, la adicin del poliisopreno le impide salir al citosol libremente, por lo que la chaperona GDI (GDP-dissociation inhibitor) la
carga (4a) y la desplaza hasta la cara citoslica de la membrana plasmtica donde participara en la reorganizacin del citoesqueleto.
Si la protena de partida era de la familia Ras, se abren dos posibilidad en funcin de la
variante.
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Las protenas K-Ras4A, N-Ras y K-Ras5 viajan en vesculas al Golgi (4b) donde
la palmitoiltransferasa aade un residuo de palmtico (5, palmitolacin) y va en
vesculas a la cara citoslica de la membrana plasmtica. Pero aqu se establece una dinmica donde la prdida del residuo de palmtico (6, despalmitolacin) la devuelve al Golgi para ser palmitolada nuevamente.
Las protenas K-Ras4B se desplazan directamente del retculo endoplasmtico
hasta la cara citoslica de la membrana plasmtica gracias a interacciones inicas de sus cargas positivas con las cabezas polares de los fosfolpidos, cargados negativamente.
Raft lipdico
A diferencia de lo que se pensaba aos atrs, la membrana plasmtica no presenta una composicin homognea de lpidos y protenas. En ella encontramos los raft lipdicos o balsas lipdicas que son dominios de membrana muy estructurados.
Los raft lipdicos son dominios muy ricos en colesterol y esfigolpidos, es decir, molculas anfipticas que se organizan
de manera muy compacta
gracias a que no presentan insaturaciones. Estos
dominios son pobres en
fosfolpidos. En funcin de
la presencia o no de caveolina, se van a diferenciar dos tipos de raft:
-
Las variantes K-Ras presentan cuatro residuos de lisina (K) en el extremo C-terminal cargados positivamente a pH fisiolgico.
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Los raft lipdicos son dominios dinmicos que se unen y separan constantemente por lo que
solo cuando interaccionen un dominio con, por ejemplo, el receptor de adrenalina y otro con
la protena G, se producir la seal.
6.2.2 Glicosilacin
La glicosilacin de protenas como cambios post-traduccionales irreversibles son la Nglicosilacin y la O-glicosilacin.
La N-glicosilacin se produce en el retculo endoplasmtico donde los restos son incorporados
a asparaginas (N) o glutaminas (Q) internas en un nico oligosacrido.
La O-glicosilacin puede tener lugar tanto en el retculo como en el citosol y consiste en la
introduccin de monosacridos en los restos de serina (S) y/o treonina (T), uno por uno a travs de interacciones con los grupos hidroxilos.
6.2.3 Cambios por protelisis limitada
Los cambios post-traduccionales asociados a la protelisis hacen referencia a la degradacin
selectiva de parte de la cadena de aminocidos con el fin de permitir que esta adquiera su
estructura tridimensional final o pueda desarrollar su actividad cataltica.
El gran ejemplo es la activacin de zimgenos, como el pepsinogeno a pepsina, los factores de
coagulacin de la sangre, del complemento, apoptosis (Caspasas), proinsulina y otras hormonas polipeptdicas, como las del hipotlamo e hipfisis, encefalinas, endorfinas, neuropptidos,
etc.
Tambin se incluyen aqu los cortes de pptidos de destino a orgnulos como aquellas que
entran al retculo y cuya secuencia hidrofbica inicial es cortada, o las seales de trnsito a los
orgnulos energticos y el peroxisoma.
6.2.4 Otros cambios post-traduccionales irreversibles
Otros cambios irreversibles que afectan a las pueden ser:
-
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1. Trfico citosol-ncleo
El ncleo es el destino de numerosas protenas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol,
como es el caso de las protenas histnicas, no histnicas, los componentes de la cromatina,
enzimas como las RNA-polimerasas y DNA-polimerasas, factores de transcripcin Todas ellas
presentan en comn un dominio de aminocidos conocido como secuencia de localizacin
nuclear (NLS, Nuclear localization sequence). La NLS es una secuencia de pequeo tamao
(20 aminocidos) que puede presentar dos tipos de eptopo reconocido por las protenas de
transporte:
-
Un eptopo secuencial es aquel reconocido como secuencia de aminocidos lineal. Este tipo de secuencias son reconocidas por los anticuerpos cuando la protena est desnaturalizada o plegada de manera que se muestre completamente.
Un eptopo conformacional es aquel que puede ser reconocido al plegarse la secuencia y por lo tanto no tiene porqu ser lineal, los diferentes aminocidos pueden estar
repartidos por el pptido y reunirse con el plegamiento para permitir el reconocimiento. Este tipo de eptopos no puede ser reconocido por los anticuerpos cuando la protena est desnaturalizada, ya que est es reconocido como un motivo tridimensional.
Estas secuencias son muy ricas en ciertos aminocidos como la lisina (K) y arginina (R), que
segn el tipo de eptopo se presentaran continuas o discontinuas, y en muchas ocasiones estarn ocultas hasta la llegada de una seal extracelular que modifique el factor de transcripcin
para que muestre la NLS.
Podemos ver varios ejemplos de secuencias NLS clsicas, no clsicas e incluso algunas especiales de eptopo conformacional. Tal y como se observa en la secuencia M9, no siempre es tan
fcil distinguir la seal de localizacin nuclear. Las seales se pueden localizar en cualquier
punto de la protena excepto en los extremos, ya que, la importina precisa de un cierto apoyo
para transportar a la protena, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuencia de aminocidos.
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La existencia de estos dos tipos de NLS nos permite inferir que no es una condicin estricta
que la protena se encuentre desplegada para ingresar al ncleo, como ocurre en la mitocondria. Adems, como veremos posteriormente, esta secuencia se puede situar en cualquier
punto de la cadena de aminocidos, ya que no ser cortada al llegar a su lugar de accin por la
dinmica nuclear durante la mitosis celular.
Hoy sabemos que el trnsito de protenas entre el citosol y el ncleo es bidireccional, es decir, ciertas protenas ingresan y salen del ncleo en respuesta a factores hormonales gracias a
la presencia de otra seal denominada seal de exportacin nuclear (NES, Nuclear export signal) que las protenas pueden mostrar alternativamente segn las condiciones celulares.
Para poder realizar este transporte la clula cuenta con una compleja batera de protenas
denominadas genricamente como carioferinas (importinas, exportinas, Ran) capaces de
realizar el transporte a travs del poro nuclear.
Las complejas interacciones que se producen entre las carioferinas, as como la gran cantidad
de interrogantes planteados sobre el proceso ha llevado al desarrollo de hasta 6 hiptesis sobre el transporte de protenas entre el citosol y el ncleo.
Un hecho muy importante es que las protenas de localizacin nuclear siempre van a mantener su secuencia de importacin/exportacin, a diferencia de lo que ocurre para las protenas
de localizacin mitocondrial o del retculo endoplasmtico. Esto se debe a que durante la mitosis se produce la desorganizacin de la membrana nuclear, liberndose todo el contenido al
citosol. La conservacin de la secuencia, permite el posterior regreso de las protenas al ncleo
tras la reorganizacin en las clulas hijas.
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1500 protenas por segundo y poro. Todo gracias a la presencia de NLS/NES y la ayuda de ms
de 20 carioferinas (importinas, exportinas y transportinas) con sitios de unin a dominios FG.
El nmero de poros nucleares en las clulas eucariotas ronda las 3.000 unidades, y hasta donde se sabe hoy en da, todos estn formados por las mismas protenas. En el poro nuclear es
un octmero de nucleoporinas (protenas que componen el poro) en el que se pueden distinguir tres partes:
-
Las medidas de este poro son de unos 200-250 nm de dimetro por unos 80 nm de alto. Pero
la luz til para el paso de protenas ronda los 20-25 nm considerando que la subunidad mayor
del ribosoma tiene unos 18-20 nm.
Una de las caractersticas a destacar del poro nuclear es que las nucleoporinas que las componen presentan agrupaciones peridicas de fenilalanina (F) y glicina (G), conocidas como dominios FG. Estos dominios actan como carriles de entrada que permiten que las carioferinas
salten de uno a otro mediante cambios de
afinidad secuenciales. En la imagen de la
izquierda podemos observar la nomenclatura de las nucleoporinas de un octmero y el
nmero de dominios FG que presentan cada
una. Es importante considerar que el canal
del poro es una va aromtica que proyecta
sus aminocidos hacia la luz, tapizando el
poro, y por lo tanto el dimetro es inferior al
que se observa y depende de la conformacin de los aminocidos para permitir el
paso o no de protenas en funcin de la disponibilidad y las condiciones.
La unidad recurrente del octmero del poro parece estar formada por unas 30 nucleoporinas
diferentes y que adems pueden estar repetidas por lo que la geometra octadrica nos permite considerar que pueden estar repetidas 8, 12, 24 o 32 veces (siempre mltiplos de 8) dando
lugar a unas 500-1000 protenas por poro, que da lugar a un tamao de unos 112 MDa en vertebrados con alrededor de 200 dominios FG.
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Como veremos posteriormente, se necesita Ran (GTPasa), porque la direccin del transporte
va a depender de Ran-GTP, cuya concentracin es muy alta en el ncleo. Tambin participar
Ran-GEF como intercambiadora de GDP por GTP en la cromatina y Ran-GAP como activadora
de la actividad GTPasa de Ran en el citoplasma.
En esta imagen, por ejemplo, podemos observar como las nucleoporinas penden hacia el citosol, y en una ampliacin las asociaciones entre las carioferinas, Ran y sus protenas asociadas.
Tambin se pueden observar los dominios FG discontinuos en azul.
En la membrana nuclear podemos observar la continuidad del lumen con el retculo endoplasmtico, en el que muchas protenas estarn siendo sintetizadas. Adems en l se dispone,
insertas en las membranas, las protenas que anclan la lmina nuclear con el citoesqueleto,
formando un continuo, como es el caso de la nesprina asociada a la actina. Esto supone que el
ncleo se encuentra en una posicin especfica en la clula.
Las protenas LAP son protenas asociadas a la lmina nuclear y a ellas se asocian modificadores de la cromatina (acetilasas, desacetilasas,). Tambin podemos observar emerina y algunos receptores de membrana.
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Si analizamos el gen de la lamina, vemos que por splicing alternativo se da lugar a dos mensajeros (prelamina A y lamina C) que presentan una secuencias de localizacin nuclear y que por
lo tanto es traducido por ribosomas libres en el citosol, y posteriormente entra en el ncleo.
Todo esto da lugar a la existencia de mltiples hiptesis para el transporte de protenas a travs del poro nuclear.
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Pero adems tenemos que considerar las deficiencias en todo el espectro, ya que una mala
glicosilacin de las protenas implicadas tambin dar lugar a un estado patolgico.
El fallo de las protenas provoca un aumento de la permeabilidad del sarcolema que permite la
salida de los componentes al plasma sanguneo, as como la entrada. Uno de los indicadores de
lesin muscular ms utilizados es la identificacin de una alta concentracin de creatinina en
plasma.
Pero lo ms preocupante desde el punto de vista de la clula muscular es la entrada de calcio,
ya que los cambios en la concentracin de calcio son un mensaje que va a activar a las calpainas, las proteasas de la actina y la miosina, destruyendo la masa muscular.
Hoy da se sabe que las mutaciones en la lamina A de la lmina nuclear tambin dan lugar a
una distrofia muscular debido a que el citoesqueleto como conjunto falla, provocando la ruptura del sarcolema. Por lo que, la deficiencia de cualquier protena estructural del citoesqueleto puede afectar a la integridad del sarcolema.
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En cualquier caso el mitDNA representa el 0,5% del DNA total de una clula y el nmero de
copias vara mucho en funcin del nmero de mitocondrias. Si cada mitocondria tiene 2 o 3
copias estaramos hablando de unas 80-100 copias del genoma mitocondrial.
La teora endosimbitica apoya que el genoma mitocondrial sea DNA circular de doble cadena
desprovisto de histonas, que yace en la matriz mitocondrial y que est controlado por una
herencia maternal.
La importancia de la mitocondria radica en su papel para la supervivencia de la clula participando en el transporte de electrnico, la fosforilacin oxidativa y la respiracin celular. Tambin est muy relacionado con el metabolismo como en el caso del ciclo de los cidos tricarboxilicos, el ciclo de la urea y en la liberacin de citocromo C para determinar los procesos apoptticos durante la morfognesis.
El hecho de que dos genomas codifiquen distintas subunidades de un complejo proteico obliga
a la existencia de una comunicacin fluida entre la mitocondria y el ncleo, establecindose
lo que se conocen como seales retrgradas, de la mitocondria al ncleo, y las seales antergradas, del ncleo a la mitocondria.
El intercambio de seales decrece con la edad produciendo un deterioro de la funcin
mitocondrial que va a favorecer trastornos neurodegenerativos ya que el sistema nervioso central consume mucho ATP.
En el momento en el que la mitocondria lanza una seal S.O.S al ncleo, como el aumento de
los niveles de ROS, este responde mediante un aumento en la produccin de SOD, peroxidasas, glutatin reducido y afines.
Uno de los factores que ms destacan es el hecho de que solo se sintetizan 22 tRNA para 21
aminocidos existentes (solo l triplete de la serina est degenerado y puede ser codificado
por dos tRNA). Esto se debe a que la sntesis de protenas en la mitocondria se va a producir
mediante apareamientos no cannicos en los que el reconocimiento del codn se realizar
sobre dos bases, balancendose la tercera.
En el citosol son necesarios al menos 30 tRNA para sintetizar una protena ya que hay
una preferencia por ciertos tripletes.
Esta traduccin tan laxa aporta un menor grado de fidelidad que facilita las mutaciones durante la sntesis de protenas y adems obliga a cambiar el significado de algunos tripletes de
bases, existiendo una divergencia desde el endosimbionte.
En cuanto a los rRNA se codifica uno de 16 S y otro de 12 S que se modifican y ensamblan en
la propia mitocondria, pero todas las
protenas accesorias son codificadas
por el genoma nuclear, lo que obliga a
la existencia de dos series de protenas
ribosomales, una de las cuales porta la
secuencia de localizacin mitocondrial.
La RNA-pol y la DNA-pol tambin son
importadas.
Existen muchas enfermedades asociadas a mutaciones en los genes mitocondriales que codifican para las
subunidades de los complejos respiratorios ya que por ejemplo, cuando el
complejo 1 no es funcional solo se producen 2 molculas de ATP a travs del
complejo II, en vez de 3.
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Seis localizaciones mitocondriales diferentes entre las que se deben repartir ms de 1000
protenas que se amplan a nueve en el cloroplasto por la presencia de la membrana tilacoidal
y el lumen dentro del estroma.
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El mecanismo bsico es sencillo y pueden participar chaperonas. Por ejemplo, una protena
sintetizada en ribosomas libres va a ser mantenida desplegada por las chaperonas HSP70 y
HSP90 que van a ser reconocidas por una de las receptoras en TOM. A continuacin la protena
va a pasar de una protena a otra del complejo hasta introducirse por el canal del poro.
una hlice en la que todas las cargas positivas quedan a un lado generando una parte polar y
otra no polar. Pero no todas las protenas van a portar esta hlice, solo las que van o tienen
que pasar por la matriz mitocondrial.
Para poner de manifiesto esta secuencia se gener una protena DHFR (tpica del citosol) quimrica que contena una secuencia de localizacin mitocondrial de 61 aminocidos procedente
del citocromo B, cuya localizacin es el espacio intermembrana de la mitocondria.
El experimento revel que la protena DHFR quimrica era transportada hasta el espacio intermembrana,
pero si se eliminaba una parte de la secuencia, dejando solo 35 aminocidos la protena era transportada a
la matriz mitocondrial.
Esto supone la existencia de dos seales en la secuencia de localizacin del citocromo b, una de ellas
(1-35 aa) es la seal de importacin a la matriz mitocondrial, y la otra (36-61 aa) es la seal de localizacin
en el espacio intermembrana, a donde se dirige tras
pasar por la matriz.
Una vez que la protena entra en la matriz la secuencia de localizacin es cortada por proteasas y se produce el plegamiento adecuado de la protena, que ha tenido que permanecer desplegada para poder atravesar el translocon TOM y el translocon TIM (Translocase of the inner
membrane).
En la actualidad hay dos teoras sobre el motivo por el que las protenas pasan por la matriz
mitocondrial para alcanzar su destino final en otra localizacin:
-
La teora conservativa defiende que para que se produzcan los plegamientos definitivos y las modificaciones adecuadas, todas las protenas tienen que pasar por la matriz
mitocondrial ya que ah es donde se sita la maquinaria especfica de modificacin.
La teora no conservativa defiende que este paso no es necesario.
La realidad es que unas 100 protenas siguen el modelo conservativo y las otras no. Un ejemplo son las protenas que, una vez
dentro de TIM, son incorporadas a la membrana mitocondrial
interna sin tener que pasar por la matriz mitocondrial.
Otra de las conclusiones que se obtuvieron del experimento anterior era la necesidad de que la protena estuviera desplegada
(parcial o completamente) para atravesar los translocones. Si se
adiciona metotrexato, un potente inhibidor de DHFR por su gran
afinidad, esta se pliega y no entra en la mitocondria a pesar de
portar la secuencia de localizacin mitocondrial.
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Finalmente una protena en la que se alternan regiones hidrofbicas e hidroflicas, que no porta una secuencia de localizacin mitocondrial tambin puede introducirse en la mitocondria mediante el reconocimiento por Tom70, que la introduce
en el poro de Tom40.
Ahora Tim9/10, unas chaperonas del espacio intermembrana
guan la protena hasta un complejo de Tim22 y Tim54 que
permiten la internalizacin de las regiones hidrofbicas en la
membrana mitocondrial interna sin pasar por la matriz mitocondrial.
Protenas accesorias aparte, solo se ha identificado un complejo
de poro de Tom (Tom40). En cambio s que se conocen varios
tipos de Tim que dan lugar a diferentes tipos de incorporaciones
proteicas en la mitocondria.
2.3.5. Modelo general de transporte al espacio intermembrana
El trnsito de protenas hacia el espacio intermembrana de la mitocondria se puede realizar de
dos formas, pasando por la matriz mitocondrial o no.
Una protena precursora con una secuencia de localizacin mitocondrial y una secuencia de localizacin en el espacio intermembrana puede ser reconocida por
las protena accesorias de Tom e introducirse hasta Tim23/17 donde la secuencia
de localizacin en el espacio intermenbrana impedir que cruce.
Ahora al igual que en los casos anteriores,
sufrir un desplazamiento lateral en la
membrana mitocondrial interna, y la secuencia de localizacin en la matriz ser
cortada. Finalmente una proteasa de la
membrana mitocondrial interna cortar la
protena definitiva que quedar libre al
espacio intermembrana donde adquirir
su conformacin y se le aadirn diferentes grupos prostticos hasta alcanzar el
estado nativo.
La conformacin final de una protena no solo queda definida por su secuencia, sino por
esta y el conjunto de modificaciones y de grupos prostticos que se la aadan.
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H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Ser-Asn-Ser-Phe-Leu-Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu-Gln-Gly---
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La -sinuclena (ASN) es una protena de 140 aminocidos, muy importante en la sntesis de dopamina que acta como inhibidor de la tyr-hidroxilasas clave en la sntesis
de catecolaminas convirtiendo la tirosina en DOPA y sta a dopamina que puede convertirse en noradrenalina para posteriormente pasar a adrenalina. Tambin interviene
en la transduccin de seales, en la dinmica del citoesqueleto, en la plasticidad neuronal, en el aprendizaje, en la memoria, Las mutaciones en el gen ASN provocan la
formacin de fibras y agregados fribrilares (efecto potenciado por ROS) que dan lugar
a la formacin de placas que en personas jvenes y sanas son elminadas por el sistema
ubiquitina-proteosoma (UPS). Pero con el paso del tiempo el sistema comienza a fallar
dando lugar a la aparicin de PD, demencia, o el exceso de ROS y neurotoxinas naturales provocan la prdida de las neuronas DA.
La parkina es una E3-ligasa del sistema UPS encargada de la degradacin de ASN, por
lo que mutaciones en este gen (hasta 57 en casos de PD temprano en menores de 45
aos) derivan en la aparicin de PD.
El oncogen DJ1 es una chaperona de la matriz mitocondrial inducido por estrs oxidativo y que previene la produccin de ROS. Mutaciones en este gen provocan el aumento de ROS que desencadena la agregacin de ASN derivando en PD.
La quinasa PINK1 o quinasa 1 inducida por PTEN, es otra protena de accin protectora
frente al estrs oxidativo cuya mutacin ha sido relacionada con la aparicin de PD.
dos hebras. Otro de los efectos negativos es la oxidacin de protenas en restos de cistena,
arginina y lisina, que provoca un cambio en la estructura tridimensional.
A medida que envejecemos, la capacidad de la clula para manejar los niveles de ROS disminuye, bien por la sobreproduccin o porque la comunicacin ncleo-mitocondria ya no es eficiente, y con esa premisa se est estudiando la relacin de ROS con PD, transtornos cardacos,
cncer,
La degeneracin mitocondrial y la sobreproduccin de ROS conducen en ltima instancia a la
neurodegenracin causante del PD, ya que el sistema nervioso (SN) precisa de grandes aportes
de ATP.
Por ello tanto la mutacin de los complejos respiratorios de la cadena de transporte de electrones como su inhibicin mediante qumicos (MPTP, Rotenona o Paraquat) conducen a una
bajada en la produccin de los niveles de ATP, que puede ser atajada mediante inhibidores o
secuestradores de estas sustancias como los triterpenos, creatinina, coenzima Q10 y nicotinamida. En caso contrario se genera una disfuncin mitocondrial.
Por otro lado, la produccin de ROS va a suponer una sobreproduccin de ciertos factores que
afectan a la proliferacin mitocondrial, impidiendo la transmisin del dao e induciendo la
mitofagia. Si no fuese suficiente el ltimo paso es la apoptosis celular.
Adems una sobreproduccin de ROS induce a factores de transcripcin nucleares que van a
promover la expresin de catalasa, superxido dismutasa, glutatin reducido, que disminuyen la cantidad y suprimen la neurodegeneracin si se alcanza un estado de neuroproteccin.
Pero cuando la cantidad de ROS aumenta demasiado se produce la activacin de BAX junto a la
liberacin de citocromo C que conduce a la apoptosis y por ende a la prdida de neuronas.
Esta sobreproduccin tambin produce la formacin de agregados de ASN, la parkina, el oncogen DJ1 y la quinasa PINK1.
En condiciones normales, la parkina se encuentra se encuentra inhibida, pero su unin con
PINK1 la activa y le permite comenzar la degradacin de ASN en el citosol. El acoplamiento
con DJ1 permite al conjunto ligarse a la membrana mitocondrial y actuar como un activo protector frente a la acumulacin de ASN. Pero las mutaciones de PINK1 o Parkina provocan neurodegenracin al no poder interactuar entre ellas. Adems el exceso de ROS tambin perjudica
la accin del proteosoma, por lo que puede interferir con la degradacin de ASN.
Otras protenas como miro/milton participan en el transporte de mitocondrias a travs de los
microtbulos antergrado y retrgrado, en los que intervienen como adaptadores de dineina y
quinesina situados en la membrana mitocondrial externa. La mutacin de estos genes dan
lugar a mitocondrias defectuosas en relacin a la fusin o fisin que conducen a la neurodegeneracin.
Tambin hay que destacar el papel del activador de sirtuina 1 (SIRT1 activator) y el revaratrol,
una agente antioxidante (reductor) de los frutos rojos a base de fenoles que dan lugar a quinonas relativamente inocuas. Las sirtuinas son desacetliasas de lisina dependientes de NAD+
50
51
52
53
Aldolasa
GAPDH
Citocromo b
LDH
Citocromo c
Histonas
Receptores nicotnicos y muscarnicos (otra cosa es que suban o bajen).
Presentan tiempos de vida media que oscilan entre las 118 h e incluso cuatro meses como es
el caso de la hemoglobina.
En definitiva el proteoma va a estar representado por el balance entre la sntesis y degradacin de protenas. Los fallos en cualquiera de los dos extremos van a desencadenar estados
patolgicos ya que no se va alcanzar la homeostasis del proteoma.
La vida media de una protena mutada ser ms corta porque en el momento en el que el plegamiento cambie, ser identificada como aberrante por los sistemas de chaperonas que las
pondrn en marcha hacia la degradacin.
El anlisis bioinformtico de la secuencia de aminocidos de las protenas revel que aquellas
que presentan una vida media larga presentan en sus extremos aminoterminales restos de
metionina, glicina, alanina, serina, treonina o valina, lo que sugiere que estos estabilizan a la
protena, evitando su degradacin a corto plazo
evitando el reconocimiento sencillo por parte del
sistema UPS (ubiquitina-proteasoma). En cambio las
protenas de vida media corta presentaban isoleucina, glutamina, tirosina, glutamato, prolina, leucina, fenilalanina, asparragina, lisina o arginina.
3. Protelisis intracelular
3.1 Protelisis intracelular en procariotas
La protelisis intracelular en procariotas es muy activa debido a la limitacin en la cantidad de
aminocidos a la que estn sometidos. Una vez que una protena cumple su funcin es rpidamente degradada para fabricar otra, ya que no disponen de reservas.
Se han identificado en este sentido, muchas proteasas que actan por defecto degradando
protenas de manera continua a menos que se active algn mecanismo para detenerlas. Por lo
tanto en procariotas la va normal es la sntesis y degradacin continua de protenas, a diferencia de los eucariotas.
Para esta protelisis se han identificado varias proteasas como Lon y ClP que detectan las protenas que no son necesarias o las desplegadas y las degradan mediante cortes proteolticps.
Estas protenas tienen en muchos casos una doble funcin, por un lado son chaperonas y por
otro proteasas, en dos dominios diferentes o mediante dos subunidades.
55
Estas proteasas detectan, como chaperonas, una estructura tridimensional aberrante y la encaminan hacia la degradacin realizando cortes proteolticos cada 60-70 aminocidos. Ambas
actividades son ATP dependientes, es decir, se precisa una molcula de ATP para el reconocimiento y otra molcula para la protelisis.
A continuacin los fragmentos pequeos son degradados por otros mecanismos que no cuestan tanta energa.
Estructuralmente esta protena, que se est convirtiendo en la gran estrella del cncer, presenta una gran parte de hoja y una hlice . Es muy importante recalcar la importancia de la
situacin del grupo amino en las lisinas (K) que recordemos, son -amino.
Cuando la ubiquitina se empieza polimerizar sobre la protena diana va a formar un polmero
en el que la ubiquitina entrante se va a enlazar siempre con la misma lisina de la molcula de
ubiquitina precedente. Por lo tanto, el extremo C-terminal de la primera ubiquitina se enlaza
con una de las lisinas expuestas de la protena a degradar, y
a continuacin el extremo C-terminal de otra ubiquitina se
enlaza con la K48 de la primera, y as sucesivamente hasta
formar un polmero de ubiquitina enlazado por K48.
Si observamos el punto de enlace entre las lisinas y la ubiquitina vemos que esta ltima porta una glicina en su extremo C-terminal que da lugar a un enlace isopeptdico (amino + carboxilo), que no debe confundirse con un enlace
peptdico (-amino + carboxilo). El enlace isopeptdico es
una enlace covalente y fuerte que requerir de enzimas
hidrolizantes para su ruptura.
57
Una protena cuya conformacin est alterada o se haya solucionado tendr lisinas expuestas
a las que se unirn las unidades de ubiqutina conducindola hacia la degradacin. Pero no
todo est determinado, en funcin de las circunstancias la protena podr ser degradada por el
proteasoma, o seguir otros caminos.
En el genoma se han detectado 2 genes para E1, 40 genes para E2 y 600 genes para E3, lo que
ofrece una extraordinaria cantidad de combinaciones E2-E3 que permite actuar sobre miles de
protenas.
4.2.1 Variabilidad en la actuacin del complejo E2-E3
Si observamos detalladamente el mecanismo de adicin de ubiquitina podemos encontrar tres
rutas diferentes en las que la participacin de los componentes E2-E3
vara.
En muchos casos la protena E2ubiquitina es reconocida por la
protena E3, que presenta sitios de
reconocimiento para E2-ubiquitina
y la protena diana, funcionando
como un adaptador.
En otros casos la protena E3 interviene en la adicin de ubiquitina funcionando como un aceptor
de la protena que a continuacin
se la transfiere a la protena dina.
Adems la protena E3 puede ser
un complejo proteico, cuya formacin estar regulada por la intervencin de otras protenas como
es el caso de la familia RING o
puede ser una nica protena como es el caso de la familia HECT.
Las combinaciones de las protenas de conjugacin E2 y unin E3 de ubiquitina explican la
enorme diversidad de protenas diana sobre las que actan. Estas combinaciones se pueden
activar por diversos motivos como:
-
Fosforilacin
Unin de un ligando especfico
Asociacin a una protena
Por otro lado, una protena normal se puede convertir en objetivo da degradar por:
-
Fosforilacin
Disociacin de una protena
Creacin de un extremo N-terminal inestable
59
60
Pero la adicin de un polmero lineal unido a travs de K63 se ha relacionado como una seal
de dao en el DNA, el trfico vesicular y la activacin de quinasas.
Tambin se ha encontrado la unin del polmero a travs de K6, pero presenta una funcin
desconocida.
Por lo tanto, en funcin de la conformacin que adquiere el polmero de ubiquitina, va a poder
ser reconocido por una u otra protena que encaminar a la protena marcada hacia una ruta u
otra.
La ubiquitina no es la nica protena pequea que sirve para este tipo de regulacin. Otras
del mismo tipo como SUMO y NEDD, a travs de mecanismos similares a los de E1-E2-E3 con
su propio juego de adaptadores, realizan las mismas funciones aadiendo un nivel ms de
complejidad al proceso.
Bloqueo de la accin de
Mdm2/MdmX
Favorecer la accin de USP7
Evitar el reconocimiento de p53
por el sistema UPS.
62
Pero la protena p53 es muy inestable y presenta una vida media corta, por lo que su cantidad
depende de su sntesis y degradacin. Como ya hemos mencionado, uno de los genes expresados es el de la protena MDM2, una E3-ligasa (p53 est controlada por al menos 5 de estas
ligasas) que desva a p53 a su degradacin y por lo tanto es un oncogen. Pero tambin entra en
juego ARF, un inhibidor de MDM2, y por tanto es un anti-oncogen.
MDM2 puede formar complejos con p300 e incorporar polmero de ubiquitina a p53, pero
tambin puede introducir una sola unidad de ubiquitina, desplazando a p53 al citosol, sin degradarla.
En el retculo endoplasmtico no hay proteosoma, pero la ruta de ERAD asocia una serie de
chaperonas que van a acerar la protena mal plegada hasta un translocon que la sacar al citosol donde ser degradada por el proteosoma.
Otro caso es en el que se produce como resultado de mutaciones o de condiciones en el que
una gran cantidad de protenas en el retculo estn mal plegadas. En ese momento el retculo
63
nota la falta de chaperonas y se activa la ruta UPR (Unfolding protease response) que manda
seales al ncleo para aumentar la produccin de chaperonas.
En cualquier caso, las protenas mal plegadas del retculo que son translocadas hacia el exterior sufren la adicin de ubiquitina y son conducidas al proteasoma.
La fibrosis qustica es una enfermedad incurable de origen gentico debido a la mutacin
del gen CFTR (27 Exones) que codifica la protena reguladora de la conductancia tranmembrana de la fibrosis qustica (1480 aminocidos). La protena es una ATPasa de tipo ABC (ATP
binding cassette) que acta como un canal de cloruro situado en la membrana plasmtica.
En situaciones normales la protena se sintetiza en ribosomas asociados al retculo desde
donde se desplaza al Golgi para glicosilarse y posteriormente es incorporada a la membrana
plasmtica. Pero sus mutaciones, entre ellas el frecuente cambio de la fenilalanina 508,
modifica el plegamiento de la protena y esta es incapaz de superar el control de calidad de
la va ERAD.
Aunque la protena no es completamente funcional con esta mutacin, se est investigando
la induccin de chaperonas o la utilizacin de qumicos que fuercen el plegamiento en el
retculo de manera que aunque no se pliegue correctamente supere el control de calidad
La progresin del ciclo celular est determinada por el balance entre reguladores positivos (CDKs)
y reguladores negativos (inhibidores de ciclinas dependientes de quinasas, CKIs). Las ciclinas del
tipo D (D1, D2 y D3) son las primeras expresadas durante el ciclo celular. De estas 3, la ciclina D1
es la que ms frecuentemente se sobreexpresa en los casos de cncer humano. El mecanismo de
sobreexpresin de la ciclina D1 puede deberse a la duplicacin gnica, la activacin transcripcional
y la alteracin del sistema de degradacin. De estos posibles mecanismos, la inhibicin de la degradacin va UPS parece ser la causa primaria de la sobreexpresin en tumores humanos.
5. El proteasoma
El proteasoma es una estructura supramolecular cilndrica con un coeficiente de sedimentacin de 26S, formada por un ncleo degradativo de 20S y complejos en los extremos de 19S.
La localizacin del proteasoma es en el citosol (no parece que haya en el retculo, el lisosoma o
el Golgi) y en la mitocondria, donde se produce la sntesis de protenas. Tambin hay proteasomas en el ncleo ya que muchos de los factores de transcripcin van a ser degradados
ah.
En cuanto a sus variantes tenemos tres, el inmunoproteasoma, relacionado con el corte de
fragmentos antgenicos para las clulas Th, el timoproteasoma, relacionado con la diferenciacin de los linfocitos T en el timo, y el proteasoma clsico,
65
Estructuralmente el proteasoma est formado en 4 capas de 7 subunidades (28 en total) presentado dos capas de subunidades
internas que son las que presentan
la actividad proteoltica, y dos capas
de subunidades externas que presentan una treonina (T) nucleoflica
en el extremo N-terminal. Este ncleo central es el que presenta un
coeficiente de sedimentacin de 20S
y est presente, con cierta variacin
en eucariotas, procariotas y arqueas.
En las tapas de 19S, hay protenas que reconocen las colas de poliubiquitina, por lo que una
protena que est marcada por poliubiquitina se tendr que pegar ah. Luego habr protenas
que quitan ubiquitina (USP, proteasas especficas de ubiquitina), otras que despliegan la protena si es que est plegada denominadas ATPasas de clase AAA (ATPasa con varias actividades
biolgicas), y luego otras que la van introduciendo tirando de ella. En total hablamos de unas
25 protenas distintas por lo que en conjunto tendremos 50-55 protenas.
Una vez que estn en el ncleo
proteoltico (zona central de las
subunidades beta), hay subunidades que desarrollan actividad
como la tripsina, otras como la
quimotripsina, etc. Entonces, un
polipptido ms o menos grande lo cortan en varios trozos, y
stos se irn degradando. El
conjunto tendr unos 40-50nm.
66
De manera que una neurona es absolutamente dependiente del trfico vesicular y trfico mitocondrial retrgrado y antergrado. En el soma est el Retculo Endoplsmico y el Golgi, y hay
mitocondrias que se estn sintetizando en el soma pero que tienen que transportarse hasta el
axn. Cuando se interrumpe dicho transporte tenemos un problema. Una de las protenas que
regula esa polimerizacin y formacin de los microtbulos es TAU.
Los nudos son ricos en actividad acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa.
Aqu tenemos el otro rasgo histopatolgico de los pacientes de Alzheimer, las placas seniles.
Estn en los espacios intercelulares, compuestas por el pptido -amiloide, que se genera
por la protelisis de una protena de membrana llamada protena precursora de -amiloide.
Las placas seniles contienen actividad acetil/butirilcolinesterasa, y la gravedad de la
demencia se relaciona con la cantidad de placas seniles en el encfalo.
Algunos investigadores piensan que las placas seniles son neuroprotectoras, como mecanismo
de defensa, y que la enfermedad de Alzheimer deriva ms de los nudos neurofibrilares que de
las placas seniles.
Las placas seniles se generan porque el -amiloide, que se
tiene que degradar por el sistema del proteasoma, no se
degrada y empieza a acumularse. Un conjunto de amiloide da lugar a la formacin de fibrillas, formando
finalmente agregados de -amiloide. Igual que la protena
-sinuclena.
El plano de la bicapa lipdica, la protena se proyecta hacia
el exterior. La inmensa mayora del polipptido est
orientado hacia el exterior, ms del 80%. Aqu es donde
actan las protenas denominadas secretasas (alfa, beta y
gamma secretasas).
El corte secuencial en alfa y beta, de ese trozo se obtienen pptidos no patognicos. En cambio si el corte se
produce entre beta y gamma (no en alfa) encontramos pptidos patognicos: pptido amiloide. No se conoce con exactitud la funcin de la protena precursora de amiloide (APP).
67
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nas que sirven para alimentar a las clulas en momento de ayuno, siendo protenas que llevan
la secuencia KFERQ.
Si tenemos un cultivo de clulas de fibroblastos y lo ponemos en ayuno, sin suministro de suero, las clulas sobreviven cierto tiempo degradando protenas que son prescindibles. Las protenas que se degradan son KFERQ, son reconocidas por chaperonas de la familia HSP70, que
ve esa secuencia o agrupaciones KFERQ y la lleva a las proximidades del lisosoma. All se encuentra la protena de reconocimiento LAMP-2 (protena de membrana asociada al lisosoma).
La protena llega con la chaperona, llega al receptor que est en la membrana del lisosoma,
siendo capturada e introducida en el interior del lisosoma.
En ratas en ayunas, las protenas que se degradan son tambin las mismas, con esta secuencia.
Por ello, parece que estas secuencias KFERQ sirven para marcar protenas prescindibles. Esta
degradacin selectiva de protenas ocurre en todos los tejidos, excepto en cerebro y testculo.
Una clula tumoral tiene unas caractersticas muy particulares: es absolutamente dependiente
del suministro de sangre, puesto que necesita un aporte continuo de nutrientes debido a que
tiene un metabolismo muy activo, hasta el punto que hacen uso de estas protenas prescindibles. De esta manera, podemos atacar a la clula tumoral ponindole cloroquina?, agentes
lisomotrpicos para que no pueda degradar protenas con el lisosoma, y stas terminan muriendo, entrando en autofagia.
A travs de los antgenos de histocompatibilidad y las diferencias de los receptores que tengan
las clulas normales y las tumorales, seremos capaces de distinguirlas, evitando as atacar a las
clulas sanas, centrndonos solamente en las tumorales.
70
71
Una de estas protenas que se van a fosforilar son FOS y JUN que dimerizan y entran al ncleo
para unirse a los elementos de respuesta que van a dar lugar a la expresin de los genes de las
ciclinas de la fase G1 (Ciclina D, CDK6 y CDK4), adems del factor E2F.
Para que se produzca toda la cascada el impulso debe de ser lo suficientemente duradero y
por ello cada protena implicada presentar un tiempo de actuacin, permitiendo que los niveles de expresin superen el umbral que permite la progresin del ciclo celular.
Pero hay que tener en cuenta que la sobreproduccin tambin es peligrosa. Las cantidades de
cada protena tienen que producirse en un momento dado, ser suficientes y a continuacin
decaer para progresar de fase. Esto establece varios niveles que pueden llevar a la produccin
de cncer:
-
La sobreproduccin del factor de crecimiento conduce a una sobreestimulacin de toda la cascada que puede inducir al cncer.
Mutaciones en un receptor de factores de crecimiento son oncognicas porque hay
variantes truncadas que expresan actividad de manera constitutiva y por lo tanto se
considera al receptor como un pro-oncogn.
Mutaciones en RAS que aumentan el tiempo de actividad son oncognicas.
Mutaciones en cualquiera de las protein kinasas que intervienen (RAF, MEK o ERK)
producen cncer.
La sobre expresin de los oncogenes FOS y JUN deriva en cncer, as como su transformacin a V-FOS y V-JUN (viral mutada) que impide su degradacin.
Las mutaciones que provocan una sobreproduccin de las quinasas o una atenuacin
de las fosfatasa que inhiben la ruta, tambin es un factor desencadenante de cncer.
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Como ya vimos en el tema anterior, el MPF presenta una actividad quinasa y su degradacin
est regulada por APC activo, una E3 ligasa, que determina la adicin de ubiquitina a la ciclina
del complejo y su consiguiente degradacin por la va UPS.
El complejo APC est activo siempre y cuando su subunidad Cdh1 no presente fosfato, ya que
cuando es fosforilado por el complejo Ciclina-CDK de G1 queda inactivo. La actuacin de Cdc14,
una fosfatasa, retira el fosfato de Cdh1, activado a APC y degradando la ciclina.
Cuando los niveles de ciclina mittica aumentan, estas forman los MPF inactivos que van a ser
fosforilados por la quinasa Wee1 en la posicin Y15 (inhibidora). A continuacin el complejo
MPF va a ser fosforilado en la posicin T161 (activadora) por la quinasa CAK, pero permanecer inactivo por la inhibicin de Y15.
El estado activo del complejo MPF, que permite fosforilar a sus sustratos, solo se alcanza por la
accin de la fosfatasa Cdc25, que retira el fosfato de la posicin Y15 dejando libre el sitio cataltico.
73
Esto deja libre al complejo Ciclina-CDK de la fase S que comienza a fosforilar a las protenas de
la maquinaria de replicacin activndolas.
74
Ya en fase G2/M la accin del MPF (Ciclina-CDK) desencadena la mitosis mediante la fosforilacin de los tetrmeros de lamina. Finalmente la reactivacin de APC por la fosfatasa Cdc14
produce la degradacin de MPF y la vuelta a interfase.
En este cuadro podemos ver la actuacin secuencial de las quinasas y fosfatasas que intervienen a lo largo del ciclo celular, as como las fases mitticas.
75
La falta o deficiencia de RB provoca una estimulacin continua de las ciclinas-E y CDK2 que
conlleva un exceso de divisin celular.
ATM y ATR son dos quinasas que se activan ante un dao en el DNA, la primera cuando se rompen ambas hebras y la segunda cuando se rompe una o hay DNA no replicado.
p53 es un factor de transcripcin que induce la expresin de muchsimas protenas
como p21CIP.
p21CIP es la protena inhibidora del ciclo celular que realiza su accin sobre los complejos Ciclina-CDK.
Chk1 y Chk2 son dos quinasas que frenan la accin de la fosfatasa Cdc25.
Cdc25 es la fosfatasa que activa a MPF.
APC es una E3-ligasa de ubiquitina.
En el ciclo celular podemos encontrad cuatro puntos de control para el dao del DNA o que
no est replicado, que van a estar mediados por la actuacin, en primer lugar de los sensores
ATM/ATR.
76
Centrados en la fase G1, cuando se detecta la rotura de una o dos de las hebras del DNA (4a) se
produce la activacin de ATM/ATR que van a fosforilar a p53, estabilizndola, lo que provoca
la expresin de las protenas p21CIP que van a inhibir al complejo Ciclina D-CDK4/6.
En el inicio de la fase S y durante esta hay otro control del DNA (4b y 4c) donde en su caso se
vuelven a activar ATM/ATR pero que adems de fosforilar a p53 e inhibir al complejo Ciclina
E/ACDK2, van a activar a las quinasas Chk1/2. Estas quinasas fosforilan a la fosfatasa Cdc25
impidiendo que realice su actividad cataltica y por lo tanto que se retire el fosfato inhibidor
del centro activo de los complejos de ciclina de esta fase.
En la entrada a la fase M (1 y 4d) vamos a encontrar un sistema anlogo a lo ya explicado que
va a consistir en un control de daos del DNA a travs de p53 y un control de DNA no replicado
a travs de la inhibicin de Cdc25, que van a actuar sobre los complejos de las ciclinas A/BCDK1.
Finalmente en anafase y telofase (fase M) respectivamente tenemos la inhibicin por Mad2
de la APC-Cdc20, una E3 ligasa de ubiquitina que permite la degradacin de la securina (cemento entre las cromtidas) en el caso de que no se hayan alineado las cromtidas. Y a continuacin el control de la segregacin de cromtidas que cuyos efectores inhiben a la fosfatasa
Cdc14 y por lo tanto impide la degradacin de las ciclinas B por el complejo APC-Cdh1, hasta
que no se ha finalizado.
77
En la siguiente imagen
podemos ver estas interacciones entre las protenas implicadas y como
afectan concretamente a
los complejos de ciclina
de cada fase, indicndose el punto de control en
el ciclo celular. Ntese
como cada Cdc25 puede
frenar en distintas etapas. La protena p38 es
facilita la respuesta a
estmulos de estrs como las citoquinas
78
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81
Obsrvese como los puntos de insaturacin se localizan en la posicin 2 del glicerol fosfato.
Recordatorio: La ceramida puede dar lugar a esfingosina (Sph) y esta a esfingosina-1fosfato (S1P). Tambin es el precursor para la sntesis de esfingomielina (SM), ceramida-1fosfato (C1P) y Glucosil ceramida (GlcCer).
Todos estos elementos son fuertemente hidrofbicos y presentan una distribucin diferente
entre las distintas membranas celulares.
82
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salvo que una protena con huecos hidrofgicos y mediante el gasto de ATP, pase los lpidos de
un lado a otro. Este movimiento est facilitado por las flipasas y flopasas.
Adems, las scramblasas facilitan el intercambio de fosfolpidos a favor de gradiente, sin gasto
de ATP.
poner lo de abajo
poner lo de abajo
85
Otra anotacin importante es que aunque se sabe de la existencia de lanzaderas que toman
los lpidos de una membrana y los llevan a otra, se sabe de la existencia de puntos de contacto
como los que se encuentran entre la mitocondria y el retculo, que permiten un cierto transito
de lpidos.
1.3.1 Topologa de la sntesis de glicoesfingolpidos de mamferos
La ceramida (Cer) es sintetizada en el retculo endoplasmtico, donde la base esfingonoide
puede ser desaturada o hidroxilada. En clulas especializadas, la ceramida puede ser convertida en galactosilceramida en el lumen del retculo endoplasmtico, por la galactosil transferasa
(CGalT), tambin denominada GalT-1. Las dems transferasas de galactosa se localizan exclusivamente en el aparato de Golgi, esta es solo para lpidos.
A continuacin la ceramida y la galactosilceramida viajan al aparato de Golgi, donde la glucosiltransferasa (CGlcT), activa en el lado citoslico, sintetiza la glucosilceramida (GlcCer) que debe
ser translocada al lumen para poder ser convertida en otros compuestos. Existe un amplio
repertorio de transferasas que introducen restos glucosdicos en diversas posiciones.
1.3.2 Sntesis de fosfolpidos
La sntesis de fosfolpidos se realiza a partir del glicerol-3-fosfato (G3P) al que se le aade un
primer cido graso para formar el liso-cido fosfatdico (Lyso-PA), y un segundo cido graso
para formar el cido fosfatdico (PA).
El cido fosfatdico puede seguir dos vas, la normal y la especfica del hgado para formar los
diferentes fosfolpidos.
En la va normal se aade citidina difosfato (CDP) al cido fosfatdico (PA) quedando CDP-DAG
y liberndose un fosfato. La ruptura de este enlace pirofosfato aporta la energa necesaria para
catalizar el reemplazo del grupo CMP por inositol, G3P, o serina para formar fosfoinositol (PI),
PGP (precursor de cardiolipina), o fosfatidilserina (PS) respectivamente.
86
Topol
glycos
Ceram
where
desatu
specia
conve
by the
called
CGlcT
the Go
GlcCe
the Go
LacCe
transfe
La fosfatidilserina (PS) puede ser descarboxilada para dar fosfatidiletanolamida (PE), que a su
vez puede ser metilada para producir fosfatidilcolina (PC).
Synthesis of
ph
choline; Etn, et
monolyso-CL;
P-ethanolamine
pyrophosphate
Synthesis
ofen
p
provides
the
choline;CMP
Etn, w
et
replace
monolyso-CL;
or
PS, respectiv
P-ethanolamine
dephosphorylat
pyrophosphate
from
PG and
Synthesis
of C
p
provides
the
en
the
pyrophosph
choline;
Etn, et
replace
CMP
w
the
chemical en
monolyso-CL;
Centrados a nivel de la mitocondria y el transporte lipdico hacia el orgnulo, podemos ver que
or PS, respectiv
vacant
primary
hay zonas en las que el retculo y la membrana mitocondrial externa se aproximan y contactan.
P-ethanolamine
dephosphoryla
La sntesis de cardiolipina comienza con la conversin del cido fosfatidico en CDP-DAG, padecarboxylated
pyrophosphate
from
PGPC.
and C
sando ambos hasta la membrana mitocondrial interna. A continuacin el CDP-DAG sufre una
to
yield
provides
theAl
en
serie de reaccin por enzimas mitocondriales que dan lugar a la cardiolipina.
the
pyrophosph
synthesized
replace CMPvia
w
the
chemical
en
Kennedy
pathw
or PS, respectiv
vacant
primary
transport
event
dephosphoryla
decarboxylated
aminoglycerop
from PG and C
to yieldsynthesiz
PC. Al
C)
thePA
pyrophosph
synthesized via
biosynthetic
the chemicalrea
en
Kennedy
pathw
ER/MAM
or be
vacant primary
transport
event
the
action of Cd
decarboxylated
aminoglycerop
OM,
mitochond
to yield
PC. Al
C)
PA
synthesi
Cds1,
CDP-DA
synthesized
via
Para la fosfatidiletanolamida y la fosfatidilcolina, el cido fosfatidico es activado mediante CDP
biosynthetic
re
Crd1,
CL pathw
synth
Kennedy
a CDP-DAG en la propia membrana del retculo, donde es condensado con una molcula de
ER/MAM or b
phosphatidylgl
transport event
serina y viaja a la membrana mintocondrial interna. Una vez all, se cataliza la descarboxilacin
the
action
of m
C
P-Etn
a fosfatidiletanolamida y vuelve hasta la membrana del retculo donde se le aade la colinaPem2,
y
aminoglycerop
OM, mitochon
es exportado de nuevo a la mitocondria.
phosphatidylgl
C) PA synthesi
Cds1, CDP-DA
decarboxylase;
biosynthetic re
Crd1, CL synth
ER/MAM or b
phosphatidylgl
the action of C
Pem2, P-Etn m
OM, mitochon
phosphatidylgl
Cds1,
CDP-DA
decarboxylase;
Crd1, CL synth
phosphatidylgl
Pem2, P-Etn m
phosphatidylgl
decarboxylase;
87
88
Por ejemplo, el benceno y sus derivados que al ser metabolizados se convierten en fenoles y
difenoles, mucho ms hidrosolubles que pueden ser conjugados con cido clico en el rin,
para formar colatos o con el cido hiprico, y ser eliminados con la orina.
89
En el retculo, los electrones pasan del NADPH hasta la protena NCR (NADPH Citocromo p450 Reductasa, que es una flavoprotena porque tiene como grupos prostticos FADH2 y FMNH2, que son estables cuando reciben los dos electrones, pero pueden
soltarlos o los dos a la vez o de uno en uno). Esos electrones son cedidos al citocromo
p450, que cuando toma los electrones y pasa al estado reducido. En estado reducido
puede pasar a estado oxidado a travs de la reduccin del sustrato. La NCR es una de
las pocas protenas que tiene dos grupos prostticos, ya que la mayora de las protenas tienen uno de estos dos grupos, pero no los dos al mismo tiempo).
nes al propio citocromo p450, que luego lo pierde ya al sustrato para pasar del estado
reducido al oxidado (igual que en retculo). La adrenodoxina es un transportador que
tiene cluster de grupos Fe-S asemejndose en cuanto a estructura a la ferredoxina.
91
Los electrones van a pasar desde el NADPH hasta el FADH2 y luego al FMN, que se los cede al
citocromo P450, reducindolo. Estos electrones pueden llegar de dos en dos o de uno en uno,
ya que el citocromo va a poder recibir un electrn del NADPH, pero adems otro del citocromo
B5 (adosado a la membrana). El donador de electrones para el citocromo B5 (desde la citocromo B5 reductasa) es el NADH, por lo que en funcin del balance de poder reductor, los
electrones procedern en principio del NADPH o del NADH.
2.1.2 Modo de accin de la adrenoxina reductasa
Existen tres modelos tericos para explicar el trasiego de electrones desde la adrenosina reductasa por la adrenoxina, hasta el citocromo P450:
-
92
En la biosntesis de hormonas derivadas del colesterol el citocromo P45017 tiene una actividad 17-hidroxilasa en varios puntos de la ruta, como por ejemplo en la conversin de la pregnenolona a hidrixipregnenolona.
93
El hecho de que P450 actu sobre un metabolito no significa que el producto sea ms inofensivo que el sustrato, en algunas ocasiones, como el caso de los epoxiderivados del antraceno o
el naftaleno, estos son ms perjudiciales y cancergenos que los compuestos de los que proceden.
La siguiente tabla muestra variantes de citocromos que metabolizan medicamentos que se
utilizan para la depresin, psicosis, lcera, cncer, problemas de corazn, etc. Hay frmacos
contra distintas enfermedades, que se metabolizan a travs de cit. p450.
94
UMs = metabolizadores ultrarpidos (un metabolizador ultrarpido es aquel que tiene copias
mltiples o superenzimas, con el centro activo idneo para metabolizar determinados frmacos. A lo mejor a ese individuo le tienen que administrar 200 veces la dosis normal.
PMs = metabolizadores pobres (un metabolizador pobre a lo mejor con el 40% de la dosis
normal tiene ya suficiente).
Si hay 57 tipos de cit. p450 y uno de ellos est suprimido, apenas se notar el efecto, ya que,
otro puede desempear su funcin en cierta medida.
95
Una vez separadas las diferentes fracciones subcelulares, tendremos que asegurarnos de que
son aquello que deberan, y para ello se emplean miden concentraciones de enzimas o protenas que marcan exclusivamente una fraccin u orgnulo determinado.
96
Orgnulo
Retculo endoplasmtico
Aparato de Golgi
Matriz mitocondrial
Lisosoma
Citosol
Membrana plasmtica
Retculo sarcoplasmtico
Peroxisoma
Balsa lipdica
Marcador
Aril sulfatasa, BiP
Galactosil transferasa, COP-I
Succinato deshidrogenasa
-hexosaminidasa, -glucuronidasa
Lactato deshidrogenasa
Na/K-ATPasa (sensible a ouabana)
Ca-ATPasa
Catalasa
5-nucleotidasa, Fosfatasa alcalina
Para determinar la riqueza del orgnulo cuyo marcador se est analizando existen tablas que
establecen las unidades de actividad por miligramo de protena (U/mg) del marcador para una
fraccin pura. Por lo que si estoy analizando la succinato deshidrogenasa de la matriz mitocondrial (100% = 5,000 U/mg) y obtengo un valor de 4,000 U/mg, tendr una preparacin de
matriz mitocondrial al 80%.
Obtenidas las vesculas de la fraccin microsomal podemos analizar sus propiedades bioqumicas en el musculo normal (VMN) y distrfico (VMD), midiendo el rendimiento de protenas Tal
y como se observa en la tabla el msculo distrfico presenta un mayor rendimiento de protenas.
A continuacin se analiza la actividad de varias protenas diferentes que se presentan en las
membranas. Tal y como se puede observar en la tabla, se ha detectado un fuerte descenso de
la actividad calcio-ATPasa en el msculo distrfico, adems de un aumento de las actividades
de las magnesio-ATPasa y Sodio/potasio-ATPasa.
Las primeras son canales o bombas de calcio
que estn presentes
en la membrana muscular, pero no en las
dems. Las segundas
son canales o bombas
que generalmente se
presentan en mayor
medida en la membrana plasmtica.
Por lo tanto, podemos concluir que las membranas derivadas del msculo distrfico contienen
ms membrana plasmtica que el msculo normal, lo que se correlaciona con el mayor contenido de colesterol.
Pero tenemos que considerar que esta medicin se est realizando sobre el conjunto de membranas de la clula por lo que es necesario realizar un fraccionamiento de los microsomas con
el fin de separarlas. Este fraccionamiento se realiza sometiendo la muestra de microsomas a
un gradiente continuo de sacarosa (25%-50%) durante toda la noche.
98
Este tratamiento supone la separacin de 4 fracciones de con membrana, una superior con
muy poca densidad que se corresponde con la membrana plasmtica, y tres fracciones de
retculo sarcoplasmtico de densidad baja, media y alta.
Cuando comparamos las actividades de las distintas protenas analizadas en cada fraccin,
podemos observar un alto contenido en sodio-ATPasa y acetilcolinesterasa (AChE) entre otras
tpicas de la membrana.
En cambio las fracciones de retculo sarcoplasmtico presentan una mayor actividad de CalcioATPasa, adems de actividad AChE.
Las diferencias entre las membranas del retculo sarcoplasmtico se deben a que este est
formado por cisternas y elementos longitudinales capaces de formar tradas (vesculas muy
pesadas cargadas de calcio). La distribucin de protenas y las cantidades varan a lo largo de
estas, produciendo retculo con diferentes densidades.
Una vez caracterizado el tipo de microsomas se realiz un anlisis de la composicin de protenas de las vesculas microsomales mediante un ensayo electroforesis con el fin de observar
diferencias entre los patrones proteicos del msculo normal y distrfico.
El anlisis del patrn muestra dos
bandas mayoritarias que se corresponden con los tamaos de CalcioATPasa y Calsecurina (CSQ). Estas
bandas son mucho ms intensas en
el patrn del musculo normal por lo
que no solo hay menos actividad de
estas protenas en el msculo distrfico, como se ha determinado
anteriormente, sino que adems
hay menos protena.
Para confirmar estos resultados se realiz un ensayo de Western Blot con anticuerpos especficos para Calcio-ATPasa y Calsecurina que mostraa idnticos resultados.
99
Las balsas lipdicas son elementos de membrana ricos en colesterol y esfingolpidos, que son
en detergentes.
Por ello, si
homogeneizamos
la membrana
muscular
en un medio
Iinsolubles
SOLATI ON
OF LI PI D RAFTS,
AS
TRI TON X-100-RESI
STANT
M EM BRANES,
con tritn-X100
y se centrifuga
enAL
un AND
gradiente
de sacarosa,Clas
balsas lipdicas
FROM
M USCLES
OF NORM
DYSTROPHI
Lama2dy
M I CEquedan sobre
el gradiente, viajando a travs de todo este.
Caveolin 3
Tube Top
Normal M uscle
Dystrophic M uscle
La membrana
deldystrophin,
msculo normal
muestra unofsolo
tipo de in
balsas
lipdicas,
mientras que en
As for
the deficiency
laminin-2
Lama2dy
mice
produces
an
increase
in
caveolin-3
and,
therefore,
of
caveolae
in the
msculo distrfico encontramos dos. Si ahora analizamos las diferentes fracciones
del gradiensarcolemma
te, concretamente la presencia de caveolina (protena estructural de rafts), podemos observar
como en el msculo distrfico hay muchas ms poblaciones de rafts.
C.J. Vidal: Targeting of AChE to lipid rafts
Por lo tanto, la patologa distrfica no solo afecta a los perfiles proteicos, sino tambin a la
composicin lipdica de las membranas en relacin a la mayor necesidad de reparaciones que
precisa.
100
101
Al mismo tiempo, en otro tubo de ensayo se situaron los mismos componentes, pero aadiendo la fraccin microsomal desde el principio, y se midi el tamao de la protena.
Los resultados indicaron que la protena del primer ensayo era ms grande que la del segundo,
esto se debe a que al no ingresar la protena en el retculo, no se corta el pptido seal. En el
segundo caso se produjo la entrada de la protena al retculo donde inmediatamente se le corto el pptido.
La caracterizacin del pptido lder que dirige a las protenas al lumen del retculo endoplasmtico determin que se trataba de una secuencia N-terminal con un tamao de 25-35 aminocidos, cuya naturaleza se corresponda con la organizacin de un ncleo hidrofbico que
ocupa entre 10-15 aminocidos. Esta secuencia es retirada de la protena al entrar al lumen.
En la actualidad conocemos dos tipos de seales que mandan una protena al retculo; Por un
lado est la secuencia de importacin el retculo, que es el pptido lder mencionado cuya secuencia puede ser:
+
H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Gly-Val-Phe-Gln-----
Pero tambin podemos encontrar una secuencia especial de retorno al retculo para aquellas
protenas que son transportadas en las cisternas hacia el Golgi y tienen que regresar, ya que el
transporte es bidireccional. La secuencia se denomina KDEL y se sita en el extremo C-terminal
de todas las protenas solubles del retculo, para que regresen a este si van al Golgi o si han
escapado al citosol. Cuando las protenas son de membrana la secuencia es KKXX.
----Lys-Asp-Glu-Leu-COO- (--KDEL)
102
Aunque las dimensiones del pptido lder son muy variables a lo largo de la escala evolutiva,
presenta siempre una divisin en tres secciones y una serie de caractersticas en comn:
-
103
Ahora la SRP unida al pptido lder es reconocida por el receptor de la partcula de reconocimiento de la seal (SRPR), que se encuentra adosada a un translocon cerrado en la membrana
del retculo, lo que provoca la induccin de la actividad GTPasa que ambos tienen produciendo
la hidrlisis del GTP unido y cambiando de conformacin. La SRP es liberada y el translocon se
abre para permitir la entrada del polipptido que reanuda su traduccin.
Inmediatamente despus de entrar el extremo N-terminal del polipptido, una peptidasa de la
seal corta el extremo con el pptido lder y el polipptido va entrando conforme se sintetiza,
al mismo tiempo que la oligosacaril transferasa va N-glicosilando las asparraginas (N) cada vez
que reconoce una secuencia NXS/T.
Finalmente, las chaperonas ayudan al plegamiento de la protena y al terminarse la traduccin
el ribosoma se disocia y el translocon se cierra.
1.2.1 Partcula de reconocimiento de la seal (SRP)
La partcula de reconocimiento de la seal (SRP) es una riboprotena (ARN + protenas) formada por una molcula de ARN y 6 protenas diferentes:
-
Esta estructura en horquilla le permite unirse al ncleo hidrofbico e introducirse en el ribosoma. Si observamos su geometra y orientacin espacial por difraccin de rayos X podemos
observar el hueco hidrofbico que sirve para la unin de la riboprotena con el ncleo hidrofbico.
Adems, el pptido lder presenta un resto con carga positiva en su primera seccin (R/K) que
se ha relacionado con la correcta fijacin del motivo a la SRP. Si este aminocido es retirado, el
reconocimiento ya no es bueno.
104
La SRP es una riboprotena con actividad GTPasa que tiene un punto isoelctrico muy alto
(carga positiva a pH fisiolgico), esto se debe a que precisa interaccionar con polinucletidos
(que tienen carga negativa a pH fisiolgico), al igual que las histonas.
1.2.2 Componentes de los translocones y protenas asociadas
Aunque todo parece indicar que existe ms de una clase de translocn en el retculo, se ha
confirmado que el translocn Sec 61 participa en el transporte co-traduccional. Esta relacin
se estableci a partir de la utilizacin de agentes que causaban crosslinking qumico entre el
mensajero y el translocon, dando lugar a enlaces covalentes que paralizaban el proceso, lo que
permita su observacin.
Si observamos su tamao relativo con respecto al ribosoma podemos hacernos una idea de lo
grande que es el ribosoma. Estas protenas del translocon Sec 61 presentan una gran homologa a lo largo de la escala evolutiva.
El translocn Sec61, al menos a nivel del retculo endoplasmtico, est formado por 4 unidades
formadas por tres pptidos denominados Sec61, Sec61 y Sec61, por tanto doce pptidos
en total que se organizan para formar un barril que permite la existencia del canal.
Otro conjunto de protenas que pueden formar el translocn, esta vez implicadas en el transporte post-traduccional son la Sec 62, 63, 71, 72 y Ssh1. Estas protenas mantienen una gran
homologa entre ellas.
Cuando una cadena polipeptdica presenta en su extremo N-terminal un pptido lder, este es
reconocido por el complejo del translocn (doble sentido) y es introducido al lumen del retculo donde se le retira la seal, a menos de que esta se encuentre interna en la secuencia.
Hasta ahora se pensaba que aquello que
entraba en el retculo ya no poda abandonarlo, pero esto se ha desmentido ya
que depende del translocn que participa, por ejemplo en el caso de ERAD. En
cualquier caso, para que una protena
entre en el retculo mediante transporte
post-traducional es necesario que algo
tire de ella. Las chaperonas BiP son protenas que, mediante el gasto de ATP, van
105
a pivotar entre conformacin de alta y baja afinidad para tirar de la protena e introducirla en
el lumen del retculo.
Asociado a cualquiera de los dos translocones se encuentran tambin las siguientes
protenas:
-
106
ribosome
station fu
proteins p
TM segm
the transl
EM imag
complex
ribosoma
respectiv
by LD. Im
TRAP (i.
Note the
which ha
channel t
passes. M
only a de
dimers . I
include th
assembly
Este control de calidad va a depender en gran medida de los niveles de calcio, ya que el retculo es uno de los de los depsitos ms importantes para la homeostasis del calcio.
El retculo es un lugar donde hay una gran concentracin de chaperonas, ya que es el lugar donde se produce el plegamiento de la protena, y en muchos casos las chaperonas
que deciden si una protena puede o no partir al Golgi van a ser ligantes de calcio. Dos
chaperonas que van a ser muy importantes para el correcto plegado de las protenas son:
-
Disulfuro ismeras (DSI) cuya funcin consiste en establecer los enlaces disulfuro
correctos entre las cistenas (C) para que una protena adquiera su conformacin
final. Este proceso sucede mediante prueba y error hasta que la protena alcanza
el punto de energa interna mnima o mxima estabilidad.
Cis-Trans prolil isomerasa es una enzima cuya funcin es la de romper la prolina
(P) y voltearla. La prolina (P) es un aminocido con un gran anillo pentagonal rgido
que puede plantear problemas estricos a la hora de que una protena adquiera
conformaciones helicoidales, por ello en muchas ocasiones se hace necesaria la
isomerizacin de Cis a Tans mediante la ruptura del enlace.
La respuesta a protenas mal plegadas (UPR, Unfolded protein response) es el sistema que
tiene la clula a modo de alarma ante una aumento de protenas mal plegadas en el retculo
endoplasmtico.
El estudio profundo de este tipo de alarmas ha revelado la existencia de tres vas de sealizacin ante el aumento de protenas mal plegadas en el lumen del retculo endoplasmtico:
-
En la membrana del retculo hay unos receptores Ire con un extremo citoslico y un
extremo mirando al lumen que en condiciones normales (bajo nmero de protenas
mal plegadas) se encuentran unidos a la chaperona BiP.
Cuando la cantidad de protenas mal plegadas aumenta, las cantidad de chaperonas
BiP unidas al receptor disminuye, porque estas son necesarias para colaborar con el
plegamiento, y esto provoca la dimerizacin de los receptores que sufren
una fosforilacin cruzada por su actividad quinasas en el lumen, y comienzan a desarrollar una actividad nucleasa en el dominio citoslico.
En el citosol hay un mRNA inmaduro
(no competente para la traduccin)
que gracias a la accin nucleasa de los
receptores es cortado y empalmado
(Splicing) comenzando la traduccin
de factores de transcripcin de la expresin de chaperonas que van al ncleo.
107
La activacin de otros tipos de receptores llevan a un aumento de factores de trascripcin asociados a la expresin de las protenas del ERAD que dirige a los pptidos
mal plegados al citosol donde son degradados por el proteasoma.
Otros receptores sensibles a la cantidad de protenas mal plegadas producen la fosforilacin de factores de traduccin que detienen o ralentizan la sntesis de protenas. En
funcin del nivel de fosforilacin se ralentizar ms la traduccin.
108
La seal de cargas positivas que impide la entrada de parte de la protena debe situarse antes de la seal de
detencin de la transferencia para
producir la inversin, en caso contrario el curso del polipptido ser el
normal ya que se le impedir la entrada a la secuencia que venga detrs de
la secuencia hidrofbica (extremo Cterminal).
109
110
Tema 7: Glicosilacion de protenas en el retclo endoplasma tico y en las cisternas del Golgi
La Glicosilacin es el proceso de adicin de restos de azcar a las protenas, pasando a denominarse glicoprotenas. Se trata de un proceso que se produce en el retculo endoplasmtico,
en el Golgi y en el citosol.
1 Las glicoprotenas
Las glicoprotenas son protenas que tienen unidos, de modo covalente, uno o varios hidratos
de carbono (oligosacridos generalmente). A diferencia de los proteoglicanos, la proporcin de
azcares es mucho menor.
Existen muchos tipos de glicoprotenas
que pueden ser de membrana o de
secrecin:
-
Proteger de la protelisis, ya que los hidratos de carbono no son sustrato de la proteasa. Por ejemplo, la fibronectina glicosilada de la lmina basal es ms resistente a la
accin de proteasas.
Ayudar al plegamiento correcto como funcin estructural ya que los hidratos de carbono N-unidos son aadidos durante la sntesis de la cadena polipeptdica determi111
nando en gran medida el modo de plegamiento de la protena. Los oligosacridos Ounidos pueden estabilizar la conformacin plegada de una protena disminuyendo su
libertad conformacional o reduciendo su flexibilidad. Los oligosacridos tambin son
marcadores del mecanismo de plegamiento en el retculo, asegurando que las
protenas no abandonen el retculo
hasta que estn plegadas correctamente
(Ciclo
calsecuestrina/calreticulina).
Direccionamiento a su destino,
por ejemplo, los restos de manosa-6-fosfato dirigen a la protena
a los lisosomas.
Determinar la estabilidad en la
clula (p53)
Determinar la permanencia en la
sangre (Ceruloplasmina)
Reconocimiento en superficie celular (Leucocitos, espermatozoides, bacterias, virus, toxinas).
2 La glicosilacin de protenas
2.1 Introduccin a los glcidos
Antes de comenzar con el proceso de glicosilacin realicemos un repaso observando la tabla
Glicosilacin de protenas
en la que se muestran sus nombres y la representacin utilizada.
Se ha creado una simbologa estndar para la representacin de azcares:
-
El color determina de que azcar han derivado, por ejemplo, la glucosa se representa con color
azul, por lo que sus derivados tendrn color azul. Adems tambin encontramos los cidos
silicos como el cido N-acetilneuramnico.
Recordemos tambin que las aldohexosas son azcares de seis carbonos epmeros de la glucosa, como la manosa y la galactosa. Las aldopentosas como la xilosa son azcares de cinco carbonos epmeros de la ribosa.
112
El cido N-acetilneuramnico (cido silico) es un azcar cido que tiene un grupo carboxilato
(carboxilo, procedente de la oxidacin del ltimo carbono) y por tanto carga negativa que preGlicosilacin
deelprotenas
senta
glicerol como uno de sus sustituyentes.
UDP
o
o
o
o
o
GDP
o
o
Glucosa (UDP-Glc)
Galactosa (UDP-Gal)
N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc)
N-acetilgalactosamina (UDP-GalNAc)
Xilosa (UDP-Xyl)
Manosa (GDP-Man)
Fucosa (GDP-Fuc)
113
Estos nucletidos-azcar se sintetizan en el citosol mediante una reaccin general de condensacin entre un azcar fosfato y generalmente un nucletido trifosfato (NTP) catalizada una
NDP-azcar pirofosforilasa dando lugar a un nucletido-azcar y PPi (hidrolizado por una pirofosfatasa para que la reaccin sea exergnica e irreversible).
El enlace N es aquel que se produce por la unin al grupo amida de una asparagina
(N). Se habla de N-glicosilacin y azcares N-unidos que suelen ser grandes, complejos
y ramificados.
El enlace O es aquel que se produce por la unin al oxgeno del grupo hidroxilo de la
cadena lateral de una serina (S) o treonina (T). Se habla de O-glicosilacin y azcares
O-unidos que suelen tener entre 1-4 restos de oligosacrido.
114
Esto diferencia a las glicoprotenas de los proteoglicanos que presentan largas cadenas de polisacrido O-unidas.
Vemos el ejemplo de la glicoforina glicosilada (N y O-glicosilada) que presenta todos los restos
de glicosilacin en el dominio externo de membrana.
115
Los oligosacridos N-unidos solo se pueden incorporar a restos de asparagina (N) que estn
localizados en la secuencia consenso:
-Asn-X6-Ser/Thr- (-NXS/T-)
Por lo tanto podemos identificar cuales son los sitios de posible N-glicosilacin con un vistazo a
la secuencia de la protena, pero la utilizacin de estos sitios depender entre otras cosas de
la estructura de la protena y del tipo celular en que se exprese.
Todos los oligosacridos N-unidos
tienen en comn un pentasacrido
central o pentasacrido nuclear
formado por 5 restos monosacardicos que constan de dos restos de Nacetilglucosamina (GlcNAc) y tres
restos de manosa (Man). Estos
restos se encuentran unidos a otros
dando lugar a la gran diversidad de
oligosacridos N-unidos que podemos encontrar de manera natural.
116
Los enlaces entre las manosas no ramificadas son 1,2, las primeras dos glucosas de la rama A
estn unidas por enlace 1,3 (sensibles a glucosidasa II) y la ltima a travs de enlace 1,2
(sensibles a glucosidasa I).
El dolicol fosfato sobre el que se sintetiza el oligosacrido precursor es un lpido especializado
de la membrana del retculo endoplasmtico de carcter isoprenoide
formado por un nmero variable de
unidades de isopreno (11-24 unidades
en funcin de la especie). Este lpido
acta como transportador y el azcar
va a quedar unido al grupo fosfato.
Aunque la ruta de sntesis del oligosacrido precursor comienza con el dolicol fosfato, este
quedar unido a travs de un puente pirofosfato (grupo pirofosforilo) por lo que en muchos
casos se hablar del dolicol pirofosfato.
117
El oligosacrido precursor de 14 restos se sintetiza en la membrana del retculo endoplasmtico por la adicin sucesiva (1 by 1) de los restos de monosacridos, gracias a enzimas de membrana.
El proceso comienza en la cara citoslica del retculo y termina en la luz, siendo los dadores
monosacardicos activos en la cara citoslica UDP-GlcNAc y GDP-Man, mientras que los de la
cara luminal sern los dolicoles fosfato-azcar (derivados del dolicol fosfato y un azcarnucletido activado), capaces de cambiar su orientacin en la membrana.
1) Partiendo desde el dolicol fosfato en la cara citoslica del retculo, la primera reaccin
que sucede en la sntesis del oligosacrido precursor es caracterstica y consiste en la
transferencia de la fosfo-N-acetilglucosamina sobre el dolicol fosfato desde la UDPGlcNAc, con la liberacinn de UMP. Esta reaccin es caracterstica porque a diferencia
de las restantes se transfiere al monosacrido y el grupo fosfato, establecindose el
puente pirofosfato sobre el dolicol.
2) La segunda reaccin consiste en la adicin de la segunda unidad de GlcNAc utilizando
como donador la UDP-GlcNAc y liberando UDP.
3) En tercer lugar, mediante 5 reacciones consecutivas se aaden 5 restos de manosa a
partir de GDP-Man.
4) Una vez aadidas las manosas se produce un cambio de orientacin del dolicol fosfato
en la bicapa que transloca el oligosacrido en sntesis a la cara luminal del retculo mediante la participacin de una enzima tipo translocn.
5) Una vez en el lumen se aaden los 4 restos de manosa restantes, pero en este caso el
donador es el dolicol fosfato-manosa, que en la cara citoslica recibi el azcar a partir de su nucletido-azcar.
6) Finalmente se aaden las 3 glucosas a partir de dolicol fosfato-glucosa, tambin procedente de su nucletido-azcar.
118
Ahora este dolicol pirofosfato se vuelve a translocar a la cara citoslica del lumen donde una
fosfatasa hidroliza el enlace difosfato, reciclando el dolicol fosfato para volver a aceptar una
unidad de fosfo-N-acetilglucosamina.
En la imagen se han resaltado 5 de los restos del oligosacrido que forman el pentasacrido
nuclear. El posterior tratamiento de los oligosacridos N-unidos (todos empiezan as) en el
retculo y en el Golgi dar lugar a los distintos oligosacridos unidos, pero siempre conservando el pentasacrido.
119
Es muy importante remarcar que la adicin de este oligosacrido precursor de 14 restos durante la sntesis proteica va a afectar en gran medida al plegamiento del polipptido.
El estudio de este proceso se ha venido realizando mediante un antibitico denominado tunicamicina que bloquea la primera etapa de la sntesis del oligosacrido precursor, es decir, la
adicin de fosfo-N-acetilglucosamina y por lo tanto afecta a la sntesis de todos los oligosacridos N-unidos. Se trata de una anlogo estructural del azcar-nucletido UDP-Nacetilglucosamina necesario.
120
La adicin de las glucosas al oligosacrido precursor supone la seal de que este est listo
para ser transferido, por lo que le primer paso tras la transferencia ser su retirada. Adems
la glucosa proximal a la protena va a poder ser retirada y aadida cclicamente, ya que como
veremos va a estar implicada en el plegamiento de la protena.
Si analizamos el procesamiento del oligosacrido asociado al plegamiento de la protena en el
retculo endoplasmtico, debemos recordar que las protenas sintetizadas en este espacio
celular van a sufrir procesos de plegamiento, ensamblado de subunidades y formacin de
puentes disulfuro.
Este procesamiento debe ofrecer la estructura correcta de la protena y por ello, asociado a las
modificaciones del oligosacrido precursor se encuentra el sistema de control de calidad del
plegamiento que nos va a asegurar que las protenas estn correctamente plegadas y ensambladas para partir del retculo al Golgi.
Para que estos procesos de plegamiento se produzcan de manera adecuada destacan tres grupos de protenas chaperonas como la calnexina, calreticulina y BiP, que se van a unir a las protenas segn se sintetizan, evitando la agregacin.
El sistema mejor caracterizado de control de calidad en el retculo va a implicar a calnexina
(CNX), calreticulina (CRT) y la glicosilacin de las protenas.
121
oxidoreductasa o disulfuro isomerasa), aadiendo o quitando los puentes disulfuro hasta que
se alcance el estado de menor energa interna y mxima estabilidad.
A continuacin la glucosa restante es eliminada por la glucosidada II dando lugar a la forma M9
que puede seguir tres caminos distintos:
-
122
La porcin luminal de la calnexina (CNX), anloga a la calreticulina, presenta un dominio de unin a carbohidratos
(domino lectina) que estructuralmente es una sndwich (dos hojas en paralelo), y un brazo largo denominado
brazo P, rico en prolina capaz de interaccionar con la disulfuro isomerasa (ERp57).
Esta disulfuro isomerasa presenta dos centros activos con dos cistenas (-CXXC-)capaces de catalizar el intercambio de puentes disulfuro.
Un hecho a tener en cuenta sobre este sistema de control de calidad es que no solo se va a
poder reglucosilar la forma 9M del pptido precursor, sino tambin formas con menos manosas, siempre y cuando mantengan la manosa aceptora de glucosa en la rama A.
Continuando con el procesamiento del oligosacrido precursor tras el ciclo calnexina/calreticulina, pasado un cierto tiempo, la manosidasa I del retculo endoplasmtico (ER
ManI) va a eliminar la manosa terminal de la rama B dando lugar al oligosacrido M8B.
Esta nomenclatura indica el nmero de manosas y aquella rama que es diferente a las restantes por lo que la siguiente forma en la que se pierde la manosa terminal de la rama C sera la
M7A, ya que la rama A es ms larga que las dos restantes.
123
La presencia del M8B en una protena determina en este caso dos posibles vas para la protena:
-
Si la protena est bien plegada es reconocida por los receptores de carga hacia el Golgi (ERGIC-53, VIPL o VIP36).
Si la protena est mal plegada el oligosacrido es reconocido por las protenas EDEM
que la destina a hacia el ERAD.
Las protenas con M8B puede continuar sufriendo ms prdidas de manosas dando lugar a
otras formas como M7A, M6 y M5, que van a ser reconocidas por la protena OS-9 y destinadas
al ERAD.
Esto se debe a la afinidad que tienen las lectinas por cada oligosacrido. Hay lectinas que solo
unen un oligosacrido concreto, siendo muy selectivas. Pero otras pueden unirse a varios diferentes siendo selectivas, pero admitiendo una cierta variabilidad.
124
La extensa desmanosilacin que tiene lugar en el retculo endoplasmtico da lugar a dos seales o propiedades del oligosacrido que dirigen
a la protena marcada a la degradacin:
-
Lectinas OS-9 y EDEM, que dirigen a las protenas mal plegadas al complejo ERAD.
SEL1L, Derlina-2/3 y BiP, que participan en la interaccin entre las lectinas y el translocon.
HRD1, una ligasa de ubiquitina que aade los restos al polipptido que la va
atravesando.
p97 es una ATPasa que impulsa la retrotranslocacin.
El proteasoma que digiera
a la protena una vez que
se encuentra en el citosol.
Tambin participa en este proceso la protena ERdj5, una disulfuro isomerasa que elimina los
puentes disulfuro para favorecer la salida al citosol.
125
126
La UPR consta de tres procesos o tipos de respuesta que son la adaptacin, alarma y apoptosis:
-
Protein kinasa activada por ARN de doble cadena (PKR, double-stranded RNA-activated protein kinase)
127
la unin oxidativa de dos grupos tiol y por ello para generarlos ser necesario otro puente disulfuro. Los puentes disulfuro son imprescindibles para el establecimiento de la estructura
terciaria y cuaternaria (anticuerpos) de las protenas. Pero como normal general, estos solo se
puede realizar en el lumen del retculo endoplasmtico por lo que solo se van a localizar en
protenas de secrecin y en la porciones exoplsmicas (no citoslica) de las protenas de membrana.
En funcin del estado de la protena disulfuro isomerasa hablaremos de la creacin o disociacin de un enlace disulfuro:
-
Las PDIs pueden ser oxidadas desde su forma ditiol gracias a la accin de otras protenas como
ERO1. Estas protenas no saben si un puente disulfuro es correcto o no, simplemente los van
intercambiando hasta que la estabilidad conformacional de la protena es tal, que ya no pueden actuar.
129
Las PDIs son una familia de protenas muy diversas que presentan esta funcin de intercambio
de puentes disulfuro y que pueden presentar uno o varios centros activos, con normalmente,
dos cistenas (C) separados por dos aminocidos cuales quiera.
-CxxCOtra de las protenas necesarias para el plegamiento de las protenas son las peptidil-prolil
isomerasas encargadas de acelerar la isomerizacin Cis-Trans o Trans-Cis de los enlaces peptdicos donde el segundo aminocido es una prolina (P) en regiones no plegadas de las protenas. Esta reaccin de isomerizacin suele ser la etapa limitante en el plegamiento de las protenas.
Los enlaces peptdicos, en general siempre estn en configuracin Trans, pero
algunos donde el segundo aminocido es
una prolina (P) cuyo nitrgeno forma
parte de un anillo ser necesaria la isomerizacin para el correcto plegamiento
de la protena.
130
Durante su paso por el Golgi los oligosacridos N-unidos a las protenas van a ser procesados
en una serie de reacciones ordenadas catalizadas por glicosilasas y transferasas que se van a
distribuir conforme al orden de estas
reacciones por las cisternas del aparato:
-
La primera etapa (2) que se produce en la cara cis del Golgi consiste en la retirada de
tres manosas por la accin de la manosidasa I del Golgi que da lugar a la forma M5.
La segunda etapa (4) que se puede llevar a cabo al mismo tiempo que la siguiente,
consiste en la retirada de dos manosas ms por la manosidasa II del Golgi dando lugar
a un oligosacrido con tres manosas que constituye el pentasacarido nuclear comn a
todos las protenas N-glicosiladas.
Las tercera etapa (3), que se puede llevar a cabo al mismo tiempo que la anterior consiste en la adicin de N-acetilglucosamina por la N-acetilglucosamina transferasa I del
golgi en la rama A del pptido precursor.
131
A continuacin se pueden aadir galactosa y cido silico para dar lugar a los oligosacridos
complejos. Los donadores monosacardicos del proceso son los nucletidos azcar estudiados
anteriormente que entran al lumen del aparato de Golgi mediante antiporter nucletidoazcar/nucletido.
La retirada de la primera de estas manosas por la manosidasa II del retculo convierte a la protena en
resistente a la accin de la endoglicosidasa H, por lo que podemos detectar las protenas que han
pasado por el Golgi medio, ya que sus oligosacridos no sern degradados.
Conocer el estado de glicosilacin de una protena supone conocer cmo avanza sta en la va
secretora:
-
El procedimiento consiste en realizar una electroforesis de la protena con SDS despus del tratamiento con la endoglicosilasa adecuada. La protena desglicosilada tendr un tamao ligeramente menor y por lo tanto avanzar ms rpidamente.
Otro procedimiento consiste en la utilizacin de lectinas para un determinado azcar
que se incorpore en una regin concreta del Golgi. Por ejemplo, la aglutinina del germen de trigo reconoce a la N-acetilglucosamina aadida en el Golgi medio. La fitohemaglutina (lectina de cacahuete) reconoce a los azcares con galactosa y por lo tanto a
los que pasan a travs del Golgi Trans.
Pero esto son solo clases fundamentales ya que los oligosacridos N-unidos pueden ser muy
variados apareciendo los bicatenarios, trecatenarios, tetracaternario y muchas modificaciones
como la adicin de fucosa en el ncleo pentasacridico o incluso N-acetilglucosamina entre las
ramas (bisectriz).
132
El proceso de transferencia de fosfato a la manosa es el que falla en la denominada enfermedad celular I (I de inclusin). Los lisosomas son orgnulos que degradan materiales celulares y
de endocitosis, por lo que si las enzimas encargadas no son capaces de alcanzar su destino,
estos materiales (glicolipidos y glicosaminoglicanos) se acumulan en el lisosoma. Las enzimas
hidrolasas son secretadas al torrente sanguneo y en la orina.
La glicosilacin es por tanto muy importante para:
-
Los restos de manosa-6-fosfato sern ms adelante reconocidos por el receptor (lectina) que
provocar la formacin de vesculas destinas a los lisosomas.
133
Receptor de manosa-6-fosfato
dependiente de cationes (CDMPR).
Receptor de manosa-6-fosfato
no dependiente de cationes
(CI-MPR).
Este receptor es un buen ejemplo de interaccin entre una lectina y su ligando. Si analizamos
cuales son los aminocidos que intervienen en el reconocimiento vemos como la manosa-6fosfato se une, a travs de sus grupos hidroxilo, por puentes de hidrgeno. Adems de esto:
-
La histidina 105 (H105) del receptor y a veces otros aminocido se unen por puentes
de hidrgeno a los oxgenos del grupo fosfato, lo que es la base de la especificidad de
la interaccin.
El aspartato 103 (D103) y el grupo fosfato interacionan a travs del magnesio (catin
divalente) en el receptor dependiente de cationes.
134
El glutamato 133 (E133) es imprescindible para la unin de la manosa, pero al descender el pH al llevar al lisosoma (endosoma) se protona, provocando la prdida de afinidad del receptor por la carga y la consiguiente liberacin.
Una de las diferencias fundamentales es que en bacterias, el aceptor del olicosacrido precursor no es el dolicol fosfato, sino el undecaprenol fosfato.
La N-glicosilacin es frecuente en eucariotas y arqueas, no tanto, pero tambin existe en bacterias. La O-glicosilacin es ms frecuente en eucariotas y bacterias que en arqueas.
135
4 El proceso de O-glicosilacin
El enlace O es aquel que se produce por la unin al oxgeno del grupo hidroxilo de la cadena
lateral de una serina (S) o treonina (T). Se habla de O-glicosilacin y azcares O-unidos que
suelen tener entre 1-4 restos de oligosacrido.
La idea que vamos a tratar es la de la adicin de un nico resto de azcar, directamente sobre
la protena al que posteriormente podrn unirse otros.
El proceso de O-glicosilacin se puede dar en tres lugares diferentes en mamferos:
-
Cabe aclarar que a pesar de que la adicin de N-acetilglucosamina O-unida se produzca tanto
en el citosol como en el Golgi, se trata de procesos totalmente diferentes y permiten la aparicin de estos azcares en protenas de secrecin o de superficie.
Otro cosa importante es que la adicin de N-acetilgalactosamina se va a diferenciar de los
dems procesos de O-glicosilacin en que en este caso van a existir muchas enziamas (20)
que intervendrn en el proceso denominadas N-acetilgalactosamina transferasas, mientras
que en los dems procesos de O-glicosilacin participaran como mucho un par de enzimas.
Los dos tipos ms frecuentes de O-glicosilacin con mucha diferencia son:
-
136
Los fallos asociados a la O-glicosilacin son causantes de muchas enfermedades, pero muchas
de ellas provocan la muerte del animal antes de nacer por su letalidad. Un ejemplo es la deficiencia de las enzimas responsables de la manosilacin que provocan la aparicin de distrofia
muscular. Esta enfermedad se produce porque el -distroglicano tiene azcares O-unidos que
comienzan por manosa, y estos son necesarios para la unin con la lmina basal.
137
Los sindecanos son protenas que presentan una porcin transmembrana y portan de
3-5 cadenas de GAGs de heparan sulfato, adems de condroitin sulfato. Puede ser liberado de la membrana por accin de proteasas.
Los glipicanos son protenas unidas a la membrana por un enlace de glicosil fosfatidiliO-Glicosilacin:
Proteoglicanos
nosiltol
(GPI). Puede
ser liberado de la membrana por la accin de fosfolipasas.
Las cadenas de heparan sulfato que presentan estos dos presentan una serie de dominios Nsulfatados (NS, sulfatados en el grupo amino) con abundantes grupos sulfato, y dominios Nacetilados (NA, acetilados en el grupo amino) sin sulfato. Por ejemplo, podemos ver uno de
estos dominios NS donde el cido idurnico (IdoA) que sera N-acetilglucosamina es Nsulfoglucosamina,
conProteoglicanos
ms cargas negativas.
O-Glicosilacin:
138
O-Glicosilacin
140
La activacin de OGT supone la O-glicosilacin de protenas que puede afectar a varios procesos:
-
Un ejemplo de este tipo es el factor CRTC2 (coactivador de CREB en hepatocitos) que permanece en el
citosol cuando S70 y S171 se encuentran fosforiladas, pero la adicin de N-acetilglucosamina en estos
restos permiten su migracin al ncleo donde se expresan los genes de la gluconeognesis.
O-Glicosilacin:
El O-GlcNAc
caso ms simple es aquel en el que el resto de serina o treonina es el mismo que se
fosforila o se le aade N-aceltilglucosamina
como sucede en C-myc y ER-.
Pero tambin existen casos en los que la presencia de dos residuos susceptibles alternativamente de estos cambios estn muy prximos en la secuencia, por lo que si uno
de ellos es glucosilado o fosforilado, el
otro no podr ser modificado, lo que establece una regulacin reciproca como
sucede en el caso de p53 y de la RNA polimerasa II.
Esta proximidad entre dos residuos susceptibles tambin se puede dar como resultado de la conformacin
proteica y por lo tanto no tienen porque estar prximos
Hu FEBS L 2010
en la secuencia. Es el caso de la CaMKIV.
Finalmente tenemos la posibilidad de que la actividad
de la protena sea regulada por el estado de modifica141
cin de sus residuos de manera independiente, por lo que para dos sitios de modificacin
puedan darse las tres posibilidades de que uno sea susceptible de la glicosilacin y el otro de
fosforilacin.
142
Ozcan BBA 2010
La relacin de las deficiencias de la OGT con la diabetes radica en que varias de las protenas
que participan en la cascada de transduccin de la seal de insulina son su sustrato. Entre estas protenas se encuentra IRS-1, PI3K, PKB (=AKT) y la propia glucgeno sintasa.
Por ejemplo, la PKB es una protena cuyo estado activo es el fosforilado, inhibiendo a GSK3 y
permitiendo la sntesis de glucgeno. Cuando OGT se transloca a la membrana por el aumento
de PIP3 glicosila a PKB poniendo fin a la cascada de sealizacin.
143
GPI
144
Uno de los cambios importantes que va a sufrir el GPI en el Golgi va a ser la sustitucin del
enlace ester del cido graso
en Estr.
posicin
1 del glicerol por un enlace alkilo (ter, alcoholGPI:
y sntesis
alcohol).
Adems, cabe mencionar que en algunas ocasiones el grupo acilo del inositol se mantiene en el
puente GPI maduro.
Otro de los cambios ms usuales es la sustitucin del cido graso en posicin 2 del glicerol,
que suele ser poliinsaturado originalmente, por uno saturado como el cido esterico
(=estearato).
Las protenas que quedan unidas a GPI son las protenas transmembrana de tipo I con una
hlice transmembrana y el extremo N-terminal mirando hacia el lumen del retculo. Estas protenas presentan una seal de 15-25 restos hidrofbicos que queda atrancada en el translocn
y dan lugar a la hlice transmembrana. Antes de esta secuencia presentan otra en la parte
luminal, pero muy cercana a la membrana que es reconocida por la GPI transaminidasa que
va a cortar a la protena en
ese punto y la transferir al
GPI preformado.
-G/A-D/N-S/CEl proceso supone la eliminacin de la zona Cterminal de la protena
original y la protena queda
anclada siempre a la cara
luminal del retculo endoplasmtico.
145
Adems el enlace por puente de GPI permite una difusin ms libre en la bicapa, ya que una
protena anclada por GPI est relacionada con la monocapa externa, mientras que las protenas transmembrana presentan interacciones con el citoesqueleto, dificultando su difusin.
El anclaje por GPI generalmente dirige a las protenas a los dominios apicales de la membrana
de las clulas polarizadas (epiteliales) y en muchos casos se concentran en los rafts lipdicos.
Los glcidos son molculas muy ricas en informacin ya que las lectinas son protenas
que reconocen especficamente azcares en todos lo reinos, incluidos los virus.
o El ejemplo clave es del las selectinas (lecinas que intervienen en el proceso de
reconocimiento y adhesin celular) que van a participar en la extravasacin de
leucocitos (selectina-P, Selectina-E y selectina-L) en la implantacin del embrin en el endometrio (selectina-L) y en la fertilizacin de vulos.
o Tambin es muy importante en el reconocimiento intercelular por parte de las
bacterias (Helicobacteri pylori y las lceras de estmago).
o Tambin hay lectinas virales como la hemaglutinina del virus de la gripe, necesaria para la infeccin.
Dada la gran cantidad de lectinas y su importancia para las interacciones entre clulas y patgenos, estas son la diana farmacolgica de numerosos tratamiento que van a competir por los
receptores de los oligosacridos con el fin de impedir que el virus reconozca los oligosacridos,
como en el caso del tamiflu y la relenza, dos medicamentos anlogos de los azcares que
reconocen los virus e impiden la infeccin.
Los glcidos tambin regulan la permanencia de una glicoprotena en el plasma sanguneo. La mayora de las protenas plasmticas estn glicosiladas con cido silico
(cido N-acetilneuramnico) y conforme envejecen, van perdiendo estos restos glicosdicos por lo que son captadas por el receptor de axialoglicoprotenas del hepatocito
que reconoce las galactosas expuestas en los oligosacridos produciendo la endocitosis y degradacin de la protena.
146
147
148
Algunas de estas vesculas de transporte presentan cubiertas proteicas bien caracterizadas por
lo que se conocen como vesculas recubiertas (Coated vesicles), diferencindose en funcin de
la protena estructural de la cubierta en:
-
COP I (CGN RE y entre las cisternas del Golgi, pero siempre transporte retrgrado)
COP II (RE CGN, transporte antergrado)
Clatrina (TGN MP/END, transporte antergrado)
Proceso general
Proceso general
Estas seales de clasificacin casi siempre son secuencias de aminocidos muy cortas. En el
caso de protenas solubles es por ejemplo la manosa-6-fosfato cuyo receptor de carga va a ser
el receptor
de manosa-6-fosfato.
Proceso
general
El ensamblado y desensamblado de la cubierta est regulado por la presencia en los tres tipos
de vesculas recubiertas por la presencia de protenas pequeas de unin a GTP con actividad
GTPasa que son protenas monomricas similares a Ras y forman parte de la superfamilia de
151
las GTPasas de protenas interruptoras (Switch) que se presentan activas unidas a GTP e inactivas unidas a GDP. Hay dos tipos de estas:
-
Sar1-GDP es una protena inactiva y soluble en el citosol que cuando interacciona con un factor
intercambiador de nucletidos de guanina Sar1-GEF (= Sec12 de la membrana del retculo endoplasmtico) intercambia GDP por GTP.
Sar1-GTP presenta una conformacin abierta que expone su extremo N-terminal hidrofbico,
el cual se inserta en la bicapa
lipdica citoslica del retculo. Se
forma as el cimiento que promueve la polimerizacin de la
cubierta de COPII sobre la membrana del retculo que fuerza la
gemacin.
Pasado cierto tiempo la actividad
GTPasa de Sar1-GTP hidroliza el
GTP a GDP provocando la disociacin de la cubierta sobre la vescula ya formada.
152
Una vez que la vescula ya est en las proximidades de la membrana, gracias a la accin de Rab
y su efector, para que se produzca la fusin van a intervenir dos tipos de protenas SNARE:
-
153
Tras la fusin de las membranas los complejos SNARE tienen que disociarse mediante la participacin de un hexmero de NSF (NEM9-Sensitive Factor) y SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) que hidrolizando ATP, desacoplarn la cremallera de SNARE.
Las protenas de membrana presentan una seal di-acdica con dos aminocidos cidos que va a ser reconocida por Sec24 de la cubierta de COPII.
Asp-X-Glu
Las protenas de membrana residentes en el retculo que son transportadas al Golgi por error o por intervenir
en el trfico vesicular, pero que deben volver al retculo, presentan en
su extremo citoslico una secuencia
KKXX reconocida por las protenas
COPI y COPI de la cubierta de COPI.
Lys-Lys-X-X
154
155
156
La comunicacin dependiente de contacto es aquella que se produce mediante el contacto directo de dos clulas a travs de protenas de la membrana que actan como
seales. Cuando una de estas protenas de membrana colisiona con el receptor adecuado se produce la transduccin de la seal que puede ser transmitida a ambas clulas.
La comunicacin paracrina es aquella que se produce a travs de un mediador qumico liberado por una clula y detectado a nivel local de donde se produce la liberacin.
Un ejemplo concreto sera la sealizacin autocrina en la que la propia clula capta el
estmulo emitido por ella como es el caso de los receptores -adrenrgicos que son
autoreguladores. Entran en este grupo las prostaglandinas, prostacilcinas, linfoquinas y
citoquinas.
La comunicacin sinptica se caracteriza porque la distancia que recorre el neurotransmisor es muy pequea y los mediadores son liberados al espacio sinptico.
La comunicacin endocrina es aquella en la que el mediado qumico viaja largas distancias a travs del torrente sanguneo.
157
1 Accin hormonal
Las hormonas se han clasificado generalmente segn su naturaleza qumica en funcin del
compuesto del que derivan. Podemos establecer por tanto cuatro clases fundamentales:
-
Las hormonas eicosanoides derivadas del cido araquidnico como las protaglandinas,
prostaciclinas y tromoboxanos (derivado del cido araquidnico) son hormona liposolubles que van a unirse a receptores de membrana desencadenando la liberacin de
segundos mensajeros.
158
carrier, como la albmina u otras ms especficas. La regulacin de los niveles de este tipo de
protenas va a afectar a la cantidad de hormona disponible (libre).
La albmina es una protena carrier del torrente circulatorio que tiene la capacidad de unir
compuestos tan diversos como la bilirrubina o los derivados del cido glucurnico gracias a
una estructura con huecos de regiones hidrofbicas. La unin de hormonas liposolubles a la
albmina siempre ser con una unin o afinidad muy baja, con respecto a protenas carrier
ms especficas.
La globulina ligante de corticoesteroides (CBG, Corticosteroid
binding globulin) es una protena carrier especfica que une al
80% de los 17-hidroxiesteroides. Por ejemplo, el cortisol en
el torrente circulatorio se presenta en un 70% unido a CBG,
un 22% unido a albmina y un 8% libre que puede formar
agregados y es la que entra en la clula.
La globulina ligante de hormonas sexuales (SHBG, Sexual
hormone-binding globulin) liga especficamente andrgenos y
estradiol, pero con menos afinidad que la albmina. La cantidad de SHBG se reduce durante la pubertad, por lo que el
nivel de testosterona libre (89-87% con albmina, 10% con
SHBG y 1-3% libre) aumenta provocando la aparicin de los
caracteres sexuales secundarios.
La globulina ligante de andrgenos (ABG, Androgen-binding
globulin) suministra la testosterona para la sntesis de protenas
en espermatozoides, y la globulina ligante de tiroides (TBG,
Thyroid-binding globlulin) transporta las hormonas tiroideas.
La fraccin de hormona liposoluble libre en el torrente circulatorio es la que es capaz de entrar en la clula y unirse a sus
receptores, de manera que, por una parte nos encontramos las hormonas formando un complejo con las protenas carrier (CH) y la hormona libre (H) que oscila entre el 3-10% del total.
Estas concentraciones se encuentran en realidad en un equilibrio en el que tambin van a participar los receptores (R), ya que sern los que formen complejos con las hormonas (HR), retirando hormona libre del equilibrio y desplazndolo hacia la disociacin de la protena carrier,
de acuerdo con la ley de accin de masas.
Posteriormente la liberacin de la hormona por parte del receptor puede invertir el desplazamiento para recuperar el equilibrio.
En trminos de constante de afinidad y de disociacin, la afinidad del receptor por la hormona
es altsima, es decir, su constante de afinidad oscila entre 109-1012 M-1, por lo que el equilibrio
est muy desplazado hacia la formacin de complejos hormona-receptor. Por ende, la constante de disociacin es muy baja, del mismo orden pero en negativo, lo que significa que la
159
Los esteroides anabolizantes inducen la secrecin de testosterona en hombres, que da lugar a la atrofia del testculo y al
aumento de las mamas. En las mujeres, el efecto conlleva una
disminucin de la ovulacin y de la secrecin de estrgenos,
adems de una regresin de la mama.
160
161
Los antagonistas del receptor de estrgenos, como el tamoxifeno, provocan un cambio de conformacin parcial que impide que el receptor sea reconocido por los moduladores.
Tambin el receptor de estrgenos al que la unin del estradiol provoca la conformacin compacta con capacidad de unin al DNA y los co-activadores.
162
Pero como ya hemos mencionado, el tamoxifeno se une con ms afinidad al receptor provocando una conformacin plegada, pero diferente, que no es competente para el reclutamiento
de co-activadores.
3.1.1 Co-activadores
Una de estas familias de co-activadores son los de la familia p160 que presentan varios dominios importantes en su secuencia:
-
10
CBP = CREB binding proten, CREB = CRE-binding protein y CRE = cAMP response element.
163
cuidado, como hemos mencionado antes, algunos de ellos puede dimerizar con otros receptores y dar lugar a heterodmeros.
Esto establece dos puntos de colisin (unin) con el DNA para los receptores dimerizados, que
en el caso de interactuar con otros co-activadores o co-represores presentarn 4 puntos colisin con el DNA [2x(1 del receptor + 1 por cada co-activador)]. Si no hay dimerizacin adecuada no se produce una fijacin adecuada al DNA.
Los experimentos que implican el estudio de receptores y el modo de accin de estos son
complicados porque la cantidad de estos que presenta una clula es muy pequea. Para identificarlos hay que llevar a cabo un seguimiento que permita su purificacin, requirindose en
muchos casos ligandos radiactivos.
Adems, es necesario utilizar tejidos con un alto contenido de receptores de esta clase, como
son el tejido mamario, el ovrico o los testculos.
3.1.3 Localizacin de receptores de hormonas liposolubles
Los receptores de hormonas liposolubles ejercen su accin en el ncleo, pero se van a distribuir entre el citosol y el ncleo, segn el tipo.
-
Los receptores de glucocorticoides se localizan en el citosol y no entran al ncleo hasta que unen el ligando.
Los receptores de andrgenos y estrgenos se sitan en el ncleo, pero en un estado
no competente, como unidades independientes que precisan del ligando para dimerizar y formar los homodmeros.
Los receptores heterodimricos como los de las hormonas tiroideas, los de cidos retinoicos, el de la vitamina D2 o D3, se sitan siempre unidos a su elementos de respuesta pero asociados a co-represores en ausencia del ligando. Esto se debe a que el
sitio de interaccin con el modulador es excluyente, es decir, o tiene unido un corepresor o tiene unido un co-activador.
164
Adems, esta estructura alberga el loop que permite la dimerizacin de los receptores (negrita) cuya deteccin se realiz porque la mutacin de la alanina (A458) a treonina (T) impide la
dimerizacin o la hace defectiva.
Si no se produce esta dimerizacin no hay un posicionamiento correcto y fijo sobre el DNA lo
que impide la expresin adecuada de los genes.
En funcin del proceso de maduracin del mensajero podremos encontrar dos variantes (isoformas) resultado del empalme alternativo del exn 9 (hGR) o 9 (hGR), que presentan
diferente nmero de aminocidos.
Dentro de estos dominios estructurales se han caracterizado varios dominios funcionales que
determinan el modo de actuacin de los receptores de glucocorticoides. Estos receptores se
encuentran solubles en el citosol interaccionando con chaperonas en ausencia del ligando.
Cuando la hormona liposoluble difunde al citosol e impacta con el receptor este
muestra sus secuencias de
localizan nuclear (dominio
funcional) y es importado al
ncleo.
165
11
Las mutaciones en las regiones de dimerizacin afectan negativamente a la funcionalidad del receptor.
166
Concretamente podemos observar la estructura del hGR cuando presenta unido un agonistas
(hlice plegada) y cuando presenta un antagonista (hlice extendida). Esta hlice 12 es crtica
para construccin de la maquinaria de transcripcin.
Cuando el receptor de glucocorticoides (GR) une a su ligando forma dmeros que se unen a sus
elementos de respuesta (GREs)
y son reconocidos por coactivadores como p160, CAF y
p300/CBP, formando conjuntos
de hasta 30-40 protenas que
representan la maquinaria de
transcripcin en la que se introducen las RNA polimerasas.
Como podemos ver, la regulacin de los niveles de GR se
produce a travs de la va UPS.
tiltransferasas (HATs) en muchos casos dependientes del gaso de ATP y que en funcin de la
situacin van a actuar como co-activadores o co-represores activando o silenciando la expresin gnica.
Por ejemplo la hipoacetilacin y la metilacin de la histona H3 en la lisina9 (H3K9) se relaciona
con una represin por condensacin de la cromatina, mientras que la hiperacetilacin o la
metilacin en la histona H3 en la lisina 4 (H3K4) se relaciona con expresin por cromatina descondensada.
Algunos factores de crecimiento tambin van a colaborar con esta remodilacin mediante la
fosforilacin de protenas que va a llevar a la activacin de los receptores.
Por lo tanto, los complejos correguladores pueden estar bajo el control de rutas de sealizacin extra- e intracelulares que perciben los cambios en el entorno y el estado nutricional de
la clula y desencadenan cambios epigenticos apropiados.
En algunos casos, como en los receptores de hormonas liposolubles heterodimricos que se
presentan unidos a sus elementos de respuesta pero de forma no competente (las hormonas
tiroideas, los de cidos retinoicos, el de la vitamina D2 o D3), cuando no presentan ligando, la
hlice 12 acta como lugar de unin reconocido por los complejos de co-represores que mantienen el promotor silenciado.
Cuando llega el ligando, la hlice 12 se pliega, como si de un interruptor se tratase, y los complejos de co-activadores entran unindose a las secuencias LXXLL y provocando la remodelacin de la cromatina que permite la transcripcin.
168
Cuando el cido retinoico se une a RAR las protenas del complejo N-CoR se disocian de los
heterodmeros y reclutan co-activadores como N-CoA, SRCs, P300/CBP, y el complejo PCAF
(HATs) relacionado con la acetilacin de histonas. La consecuente remodelacin de la cromatina que se produce permite la entrada de la polimerasa y de los factores generales de transcripcin.
169
Adems SRC interacciona a travs de un dominio rico en glutamina (Q) con CBP, p300, CAF,
CARM1 y PRMT1 que son co-activadores comunes dando lugar a la remodelacin de la cromatina mediante las actividades acetiltransferasa y metiltransferasa que permite el ensamblado
de los factores generales de transcripcin y de la RNA polimerasa II.
Las regiones de activacin son las que tambin estn comprometidas con la dimerizacin que
se va a llevar a cabo para formar heterodmeros con los receptores de otras proteinas (RX).
Estos heterodmeros se unen a los elementos de respuesta y reclutan a co-activadores como
CBP, p300, remodeladores de la cromatina, proteinas activadoras de la familia p160 hasta
formar un holoenzima de 30-40 protenas que da lugar al complejo de transcripcin al que se
acopla la RNA polimerasa.
La importancia de la vitamina D radica en que su falta provoca raquitismo ya que es muy importante para la formacin del hueso. Su efecto permite retener el fosfato y el calcio necesarios para dar lugar al hidroxiapatito que lo forma.
Adems la vitamina D o la 1,25-dihidroxi-vitamina D como hormona est relacionada con la
regulacin de la proliferacin celular y la apoptosis, ya que es capaz de inducir la expresin de
50-60 genes en distintos tipos celulares.
Esta hormona detiene la progresin del ciclo celular en el paso de G1 a S, bien directamente o
mediante la induccin de factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante
(TGF, factor de no crecimiento).
La detencin es producida porque se va a promover la expresin de los inhibidores de los
complejos Ciclina/CDK, como p21 y p27, que contribuyen a la cada de la actividad quinasa y
conducen a la recuperacin de la protena retinoblastoma (RB) formada por p107 y p130, que
se une a E2F. Impidiendo la expresin de ciclinas.
170
171
mar complejos con PI3K, las quinasas de Src (SrcK), Ras y protenas G, que van a disparar la
cascada de transduccin que lleva a la fosforilacin.
En general hasta hace poco se consideraba que todas las acciones de los receptores se producan exclusivamente en el ncleo mediando como activadores o represores, pero ahora se
ha descubierto que estos tambin pueden promover acciones en el citosol que afectan a esta
regulacin a travs de otras protenas.
172
1 Transmisin de seales
La transduccin de la seal producida por la colisin entre un ligando y el receptor es la
transmisin de un estmulo que informa a todos los componentes implicados en la respuesta.
Las clulas responden a gran variedad de estmulos como antgenos, glicoprotenas, seales de
desarrollo, componentes de la matriz extracelular, factores de crecimiento, hormonas, luz,
toque mecnico, neurotransmisores, nutrientes, olores, feromonas y sabores.
Pero en muchos casos, el fin de todas estas seales ser la produccin de segundos mensajeros que provocarn un cambio en el potencial de membrana que va a llegar hasta regiones
particulares del cerebro para integrar e interpretar las seales.
Se trata de una interaccin especfica ya que para cada receptor hay un ligando preferente, es decir, un ligando que presenta alta afinidad por un receptor concreto, aunque este puede ser estimulado por una gran cantidad de molculas similares como los
receptores y adrenrgicos que responden ante adrenalina.
Es un proceso de amplificacin ya que la interaccin que provoca la seal presenta
una estequiometria 1:1 pero la activacin del receptor produce cambios en ms de
una protena o da lugar a ms de un segundo mensajero por lo que la seal se amplifica. Por ejemplo, la activacin de adenilato ciclasa (AC) a travs de protenas G da lugar
a la produccin de gran cantidad de AMPc que a su vez activa a muchas molculas de
protein quinasa A (PKA) y esta fosforila a muchas protenas.
Se trata de un proceso sujeto a la desensibilizacin de receptores, es decir, que se
produce una atenuacin de la respuesta cuando la seal permanece en el tiempo o es
excesivamente intensa. En muchos casos la propia activacin del receptor desencade-
173
Los eventos que se pueden producir a lo largo de la transduccin de la seal quedan reflejados
a continuacin. En muchas ocasiones al principio de la seal suele generarse un conjunto de
protenas asociadas que se denominan generalmente como rel (Scaffold) que van a actuar
una a continuacin de la otra de forma concatenada. Estas protenas pueden estar reunidas
gracias a la participacin de una protena estructural que las aproxime para aumentar la eficiencia del mecanismo.
A continuacin se produce la amplificacin de la seal mediada por la produccin del segundo
mensajero que va a activar a
numerosas protenas que a su
vez actuaran sobre otras que
van a estar moduladas por
otros procesos y por lo tanto,
en este punto se produce la
integracin de seales positivas y negativas.
Finalmente llegamos a la modulacin de la seal donde se
va a producir un aumento de
protenas activadoras y un
descenso de las inhibidoras
para que los factores de
transcripcin queden libres o
activados y eventualmente
ingresen al ncleo para unirse
a sus elementos de respuesta
en el DNA y se produzca la
transcripcin gnica.
174
En 10 tubos de ensayo se introducen las mismas cantidades de protena (que sabemos que
presentan receptores), como por ejemplo 1 mg, se deja un tubo sin ligando (blanco) y a los
dems se les aaden concentraciones crecientes de ligando.
Se incuban los tubos durante un determinado tiempo y a continuacin se pasa el contenido
por un filtro que solo va a dejar pasar las molculas de bajo peso molecular, es decir, el ligando
no unido.
A continuacin pasas los filtros por un contador de centelleo (mide radiactividad)
empezando por el blanco, que nos va a
ofrecer el background inespecfico que
restaremos a las mediciones de receptor
con concentraciones de hormona crecientes, obtenindose la cantidad de ligando
por miligramo de protena. Esta curva es la
que se representa como unin total.
Esta unin es saturable, por lo que si se va aumentando la concentracin de ligando, llegar un
momento en el que no se ligue ms, pero las clulas o las membranas utilizadas presentan
muchas ms protenas de las que nos interesan y a las que tambin se puede pegar el ligando.
Por ello se repite el experimento con un antagonista del receptor concreto obtenindose solo
la seal del ligando que se ha unido inespecficamente porque los huecos en los receptores van
a estar ocupados por el antagonista.
Se resta este valor a la curva de unin y obtenemos los datos de unin especfica.
A partir de estos datos podemos hacer una representacin de la hormona ligada al receptor y
la relacin entre ligando unido y ligando libre. Esto simplifica el proceso porque cuando tu
realizas un experimento lo que puedes medir es la cantidad de ligando que se ha unido a una
protena y el resto que ha quedado libre. Por lo que si situamos en ordenadas la cantidad de
ligando (unido y libre), y en abscisas la cantidad de ligando unido, obtendremos una recta de
pendiente 1/Kd, es decir, la constante de disociacin, que cuanto menor sea, ms afinidad
tendr el receptor por la hormona.
175
176
177
Los receptores 7tm presentan el extremo N-terminal en el exterior y el C-terminal en el interior relacionado con la protena G.
Cuando la protena G est en reposo presenta una molcula de GDP, pero cuando el receptor
se une al ligando provoca el intercambio de GDP por GTP que provoca la disociacin de la
subunidad Gs (activadora) hasta que la propia actividad GTPasa de la subunidad lo hidroliza y
desconecta el sistema.
Pero no tenemos que olvidar que las subunidades G/ tambin tienen actividad biolgica, como en el caso de la motilidad cardiaca donde la adrenalina estimula y la acetilcolina inhibe la
velocidad del ritmo cardaco. Esto se debe a que los receptores muscarnicos de acetilcolina
estn acoplados protenas Gi que disminuyen la actividad de adenilato cilcasa, pero adems las
subunidades y abren canales de potasio que favorecen la hiperpolarizacin de la membrana, atenuando la motilidad cardaca desde dos puntos.
Para saber si un proceso est mediado por una protena G se utilizan homlogos no hidrolizables de GTP que se unen a las subunidades G que van a impedir que el proceso que estamos
estudiando pare, por lo que si medimos el aumento del proceso en s, como la liberacin de
un compuesto, y vemos que tras aadir el homlogo este se vuelve constitutivo, podremos
determinar que hay protenas G implicadas.
Si la estructura del GTP sera GDP-O-P, homlogos no hidrolizables pueden ser GDP-S-P o
GDP-NH-P, que presentan un tamao parecido pero no pueden ser hidrolizados por la clula
por presentar nitrgeno o azufre, en vez de oxgeno.
179
En el caso de la motilidad cardaca vamos a encontrar implicadas a las protenas G. Por un lado
la acetilcolina frena el ritmo cardaco, por otro la adrenalina lo acelera.
Existen dos tipos de receptores de acetilcolina:
-
Los receptores muscarnicos (M1-5) actan asociados a protenas G donde podemos diferenciar entre:
o M1, M3 y M5 que estn acoplados a la produccin de IP3 mediante aumentos
de calcio.
o M2 y M4 acoplados a protenas Gi que bajan la actividad de adenilato ciclasa.
Existen multitud de estos sistemas enzimticos y cada uno de ellos especializado en diferentes
actividades, tal y como se muestra en la tabla donde se indica el tipo de protena G trimrica y
las subunidades que median en la funcin.
ciado a PKA mediante protenas de anclaje como AKAP79 (protena estructural de anclaje de
PKA a adenilato ciclasa) o la gravina (ADAP250) que se asocia a la membrana.
PKA consta de dos subunidades catalticas (azul) y dos subunidades reguladoras (rojo) que
presentan menor afinidad por las primeras que el AMPc, por ello cuando la concentracin aumenta desde 1 M a 5 M, la subunidad cataltica es desplazada por el AMPc, liberndose.
Cada una de las subunidades reguladoras presenta dos sitios de unin para AMPc por lo que
sern necesarias 4 molculas de
AMPc para provocar el cambio conformacional que disminuye la afinidad por la subunidad cataltica hasta
en 10.000 veces.
Las subunidades catalticas de PKA
son activas en el momento en el que
son liberadas, debido a que las
subunidades catalticas funcionan
como un dominio pseudosustrato
que impedan la actividad enzimtica
de PKA.
La PKA regula a un gran nmero de protenas a travs de su actividad S/T quinasa cuyo sitio de
fosforilacin se caracteriza por presentar arginina (R) o lisina (K) en posicin -1/-2. Para hacernos una idea de las seales reguladas a travs de AMPc como segundo mensajero tenemos la
tabla de la derecha.
El modelo de actuacin del sistema comienza con la unin del ligando al receptor que activa a
una protena G que va a interaccionar con adenilato ciclasa. El aumento en la concentracin de
AMPc provoca la liberacin de PKA que va a fosforilar a protenas como CREB, que se nir a su
elemento de respuesta (CRE) al dimerizar y reclutar co-activadores como CBP y P300.
Como podemos ver a propsito del receptor de glucocorticoides, este es un punto en el que
ambas vas van a desencadenar el mismo efecto.
181
El IP3 que se va a desplazar hasta los receptores de IP3 en el retculo endoplasmtico, que son canales inicos de calcio que responden a ligando. Cuando se
produce el impacto, los canales se
abren durante un corto periodo de
tiempo provocando una salida masiva
de calcio que va a ser receptado inmediatamente por los sistemas pertinentes.
El diacilglicerol (DAG) que va a difundir
por la cara citoslica de la membrana
plasmtica para activar a la proteinquinasa C (PKC) junto con el calcio liberado. La vida media del DAG es corta ya
que va a ser rpidamente eliminado por
las fosfolipasas A1 y A2.
Se ha comprobado que la activacin de PKC est medida por el calcio gracias a que la adicin
de EDTA (acomplejante de cationes divalentes) impide su activacin.
En cuanto a las concentraciones de cada uno de estos segundos mensajeros en el caso del IP3 puede variar desde 109
hasta 10-8 mientras que el calcio oscila entre 10-7 (0,1 M)
hasta 10-6 (1 M), pudiendo alcanzar en algunas ocasiones 5
M.
La PKC est implicada en la proliferacin celular por lo que la utilizacin de esteres de forbol,
que mimetizan las acciones del DAG van a provocar una activacin muy poderosa del sistema
que inducir la formacin de tumores.
183
Pero estos steres presentan una vida media muy larga y por ello sobreactivan a la PKC, como
es el caso de acetato de miristoilforbol. Aunque la naturaleza de sus colas hidrofbicas y del
propio ncleo es distinta, tiene una gran afinidad por PKC y provoca una proliferacin celular
excesiva, lo que demuestra la relacin de la quinasa con la iniciacin del ciclo celular.
A groso modo, PKC activa a numerosos factores de transcripcin como AP1 (Fos y Jun), muy
importantes en el paso de G0 a G1. En la tabla podemos ver algunas de las seales que actan
a travs de la fosfolipasa C, el IP3 y las variaciones en la concentracin de calcio.
184
El motivo por el que esta PLC puede interaccionar con el receptor se debe a que presenta
dominios SH2 y SH3 que le va a permitir unirse a los restos de Y-fosfato.
Las c-PKCs se caracterizan por la necesidad de unir calcio, son las clsicas ya estudiadas y van a presentar una regin exclusiva de unin a calcio. Dentro de estas encontramos las , I, II y .
Las n-PKCs no precisa de calcio y se van a diferenciar entre ellas por la regin bisagra.
Dentro de estas encontramos las , , y .
Las a-PKCs tampoco precisa de calcio para su activacin y dentro de ellas encontramos
las y las isoformas / .
Todas ellas presentan un dominio pseudosustrato, el sitio de unin para DAG y esteres de forbol, dedos de cinc con restos de cistena, la regin de unin a ATP y la regin cataltica.
185
El propio retculo endoplasmtico presenta bombas de calcio que introducen constantemente el catin en contra de gradiente de concentracin.
La mitocondria tambin es capaz de acumular calcio a expensas de la fuerza protnmotriz.
En el citosol podemos encontrar protenas ligantes de calcio que captan el calcio libre,
reduciendo sus niveles como es el caso de la calmodulina.
En la membrana plasmtica tambin vamos a encontrar una bomba de calcio y un antiporter con sodio, que permite mantener la concentracin citoslica baja.
El retculo plasmtico es
el principal almacn de
calcio, pero su salida y
retirada por otros sistemas pueden provocar
que se vace. Para impedirlo existen puntos
de contacto entre el
retculo y la membrana
plasmtica a travs del
acoplamiento de protenas que van a introducir calcio directamente al retculo endoplasmtico a favor de
gradiente de concentracin.
186
Cuando la concentracin de calcio pasa del estado basal (0,1 M) al entorno de 0,5 M, la
calmodulina liga clcio y sufre un cambio conformacional que expone regiones hidrofbicas
que le van a permitir interaccionar con gran variedad de protenas como la calcio-calmodulina
quinasa que es una S/T quinasa.
Un ejemplo de acontecimientos relacionados con la calmodulina es la exocitosis de las vesculas sinpticas que depende de la concentracin de calcio en la terminal. La concentracin de
canales de calcio dependientes de voltaje es muy alta en la terminal sinptica y cuando llega
un potencial de accin estos se abren, aumentando la concentracin de calcio. El aumento de
la concentracin de calcio es detectado por la calmodulina, que activa a la calcio-calmodulina
quinasa 2 que comienza a fosforilar a las protenas del citoesqueleto, liberando las vesculas
que se fusionan con la membrana para verter su contenido al espacio sinptico.
Procesos como la secrecin de saliva, insulina y otras hormonas como la histamina son tambin dependientes de calcio.
La calcio calmodulina quinasa es una protena oligomrica con un dominio cataltico y un
dominio inhibitorio que va a presentar memoria.
Cuando la calmodulina con calcio se une a la quinasa, esta sufre un cambio conformacional
que mediante el uso de ATP realiza una primera autofosforilacin alcanzando el estado de
activacin completa.
Al bajar la concentracin de calcio, la calmodulina se disocia, pero la quinasa sigue parcialmente activa (50%) debido a la autofosforilacin hasta que las fosfatasas correspondientes
retiren el resto de fosfato.
Por lo tanto, la actividad de calcio-calmodulina quinasa va a depender de la concentracin de
calcio, la disponibilidad de calmodulina y fosfatasas.
5.4.2 Protenas reguladas por calcio y calmodulina
Entre las protenas reguladas por los niveles de calcio a travs de la calmodulina podemos citar:
-
PI3K (oncogn) que fosforila a los fosfolpidos de inositol en posicin 3 (anclaje a quinasas dependientes de fosfoinostidos relacionadas con la supervivencia celular). Por
lo que la fosfatasa correspondiente sera un anti-oncogen.
Bomba de calcio de la membrana plasmtica que va a funcionar o no dependiendo de
la concentracin de calcio y por ende de calmodulina.
Una vez hecho esto, se puede evaluar el funcionamiento de los canales de calcio mediante la
adicin de IP3 o una pequea cantidad de detergente que libera todo el
calcio que haya en el retculo.
Otro sistema que nos permite evaluar los niveles de calcio son los indicadores metalocrmicos, molculas
que cambian de color en funcin de
la concentracin de un determinado
in, en este caso el calcio, cuyo indicador ms utilizado es Fura-2.
Fura-2 es una molcula permeable y
penetra en el interior de la clula y
permite un seguimiento in vivo de
las variaciones en la concentracin
de calcio, lo que permite el estudio
de receptores como los muscarnicos
(M1, M3 y M5).
El xido ntrico es una molcula fabricada por la xido ntrico sintasa que presenta una gran
variedad en cuanto a formas y distribucin (inducible, endotelia, neural,). La reaccin de
sntesis comienza con la arginina (R), y mediante la adicin de oxgeno y la utilizacin de poder
reductor (NADPH) se produce citrulina, y una molcula de xido ntrico.
189
Pero este tiempo es suficiente para activar a la guanilato ciclasa y aumentar al concentracin
de GMPc, que posteriormente ser degradado por la fosfodiesterasa de GMPc.
Uno de los efectos del GMPc es provocar la relajacin de la musculatura lisa (vasodilatador)
por ello a las personas con una angina de pecho se les administra una pastilla de nitroglicerina
(libera NO) bajo la lengua.
Por ejemplificar esta relajacin
muscular de manera natural, la
acetilcolina se une a los receptores de las clulas de los endotelios que presentan receptores mucarnicos (M1, M3 o
M5) dando lugar a la activacin
de la PLC que conlleva un aumento en la concentracin de
IP3 y de calcio-calmodulina, que
como vimos anteriormente es
un activador de la xido ntrico
sintasa.
La produccin de xido ntrico y su difusin a travs del tejido estimula a los receptores de NO,
en la musculatura lisa que producen la activacin de guanilato ciclasa y dan lugar a la formacin de GMPc que activa a la proteinquinasa G (PKG S/T quinasa) que va a fosforilar a las protenas que conducen a la relajacin muscular.
En la medida en la que se active a guanilato ciclasa o se bloquee la accin de las fosfodiesterasas de GMPc esta enzima permanecer ms tiempo activada.
La viagra (Sildenafil) es un compuesto que bloquea la
accin de la fosfodiesterasa de GMPc 5, y por ello
mantiene elevados niveles de GMPc y acta como un
vasodilatador.
190
En estos receptores podemos establecer tres niveles de actividad, por un lado la actividad
basal propia, por otro la actividad que presentan cuando se unen al ligando y finalmente el
nivel de actividad mximo tras producirse la autofosforilacin cruzada.
La mayora de las clulas se encuentran quiescentes hasta que reciben en sus receptores el
impacto de un factor de crecimiento que desencadena un aumento en la cantidad de ciclinas
mitticas que permiten el paso de G0 a G1.
191
La mayora de estos receptores desarrollan actividad Y-quinasa, pero tambin podemos encontrar algunos ejemplos de receptores con actividad S/T-quinasa, e incluso algunos con actividad
Y-fosfatasa, ya que muchas protenas van a ser activas en su forma desfosforilada.
Los receptores que no presentan actividad Y-quinasa intrnseca, como el receptor de citoquinas, presentan asociadas protenas Y-quinasas como JAK (Janus kinase) o SrC, cuya actividad es
exaltada al dimerizar el receptor, provocando la fosforilacin cruzada de los labios inhibitorios
que presentan y a continuacin del resto del dominio citoslico.
192
En esta tabla podemos ver algunas de las protenas sealizadoras que actan a travs de RTKs.
Protena sealizadora
Factor de crecimiento epidermal (EGF)
Insulina
Factores de crecimiento tipo
insulina (IGF1 e IGF2)
Factor de crecimiento neural (NGF)
Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
Factor estimulador colonial
del macrfagos (MCSF)
Receptor
EGFR
Estimulacin de la supervivencia celular, crecimiento y proliferacin, o diferenciacin de algunos tipos celulares. Acta como una
seal inductiva en el desarrollo.
Receptor de
insulina
IGF receptor 1
Trk A
PDGFR
MCSFR
Factor de crecimiento de
fibroblastos
FGFR
VEGFR
En este caso sin la presencia de estos azcares ambos receptores no podran interaccionar, ya
que se sitan entre ambos impidiendo la repulsin.
de homologa 2 con Src). Los dominios SH2 son dominios estructurales que permiten la interaccin con restos de Y-fosfato y aminocidos adyacentes.
La unin a travs de los dominios SH2 no provoca un cambio conformacional en la protena,
pero su aproximacin a la actividad Y-quinasa del receptor promueve la fosforilacin de la
protena que interacciona y el consiguiente cambio que la capacita para realizar una funcin.
Las protenas que encontramos con este tipo de dominios y que van a interaccionar con estos
receptores son la fosfolipasa C- (PLC), que va a generar DAG e IP3, PI3K, que desencadenaba
la ruta de activacin de PKB, y otras protenas reguladoras como GAP (GTPase-activating protein).
La Src o protena del sarcoma de Rous es una protena oncognica que presenta un estado inactivo autoinhibido cuando
uno de sus restos de tirosina se encuentra fosforilado y es
reconocido por su dominio SH2. Adems presenta un dominio SH3 que se une a restos de prolina (P) de la propia protena.
Cuando acta una fosfatasa sobre Src o por una mutacin
pierde el dominio que porta la tirosina da lugar a una protena mutante que se encuentra activa constitutivamente,
algo que ocurre habitualmente en versin viral del gen (VSrc).
Cuando esto ocurre, la protena desarrolla actividad Yquinasa reconociendo a otras a travs del dominio SH2 y
SH3 fosforilandolas.
195
La protena estructural Shc presenta dominios SH2 y PTB, y como hemos visto Src presenta
dominios SH2, SH3 y un dominio Y-quinasa.
La protina Shp2 es una Y-fosfatasa que presenta dominios SH2, adems del propio de la actividad cataltica. Por lo que cuando este interacciona con el receptor fosforilado produce una
interrupcin de la activacin.
196
La protena STAT es un factor de transcripcin que presenta un dominio SH2, junto con un
dominio de unin al DNA y uno de activacin de la transcripcin (TA).
La protena SOCS es una reguladora de la seal que presenta SH2 y un dominio que facilita la
actividad de una E3-ligasa de ubiquitina que se relaciona con la degradacin de receptores a
travs del sistema UPS.
Finalmente la protena PLC- que produce el IP3 y el DAG como segundos mensajeros est
formada por una gran multitud de dominios como PH, SH2, SH3, C2,
Debemos entender que la interaccin de estos dominios con sus secuencias sustrato o sus
ligandos produce en mayor o menor medida la activacin de la enzima y por lo tanto segn las
teclas que toquemos tendremos unos efectos u otros.
La activacin permanente de la fosfolipasa C por parte de los steres de forbol desencadenan
cncer. Pero si en cualquiera de los estmulos que es capaz de percibir PLC- se produce un
exceso de activacin, tambin ha a desencadenar el cncer.
197
198
Pero es que la va de PKB comentada en el apartado anterior tambin est implicada en la internalizacin del GPCR. Cuando PKB fosforila en serinas (S) al receptor este es reconocido por
la -arrestina e internalizado.
Esto permite a Sos posicionarse para producir el intercambio de GDP por GTP en Ras, que pasa
a un estado activo.
199
Mientras Ras no hidroliza el GTP est activo, favoreciendo la activacin de Raf-1. La protena
Raf presenta un dominio regulador, y un centro cataltico amordazado por la protena 14-3-3
(Truco: suma 20). Cuando ambos dominios presentan fosfato el complejo de Raf est inactivado por la protena 14-3-3, pero la interaccin con Ras provoca la desfosforilacin del dominio
regulador y la liberacin de Raf.
Esta activacin de Raf es un punto crtico de la cascada. Inicialmente el conjunto est amordazado presentando Raf fosfato en las serinas 259 y 621. La activacin conlleva una serie de
cambios y la actuacin de la proteinfosfatasa 2A, la quinasa Src y otras dos de naturaleza desconocida que van a fosforilar el dominio cataltico en serinas, tirosinas y treoninas, permitiendo la separacin de 14-3-3.
200
otros asociados a los restantes restos de Y-fosfato, como es el caso de PI3K que se fosforila y
genera zonas PH en la membrana todo para desencadenar la activacin de PKB.
Pero la activacin del receptor debe de ser lo ms breve posible y para ello tenemos dos mecanismos de desactivacin de la seal.
-
Por un lado la SHP1 es una Y-fosfatasa que se encuentra inactiva hasta que el receptor
se fosforila y se une a JAK a travs de sus dominios SH2, desfosforilando al receptor.
Por otro lado tenemos las protenas SOCS que son E3-ligasas de ubiquitina que van a
comenzar a pegarse a travs de sus dominios SH2 al receptor para encaminarlo a su
degradacin va UPS. Estas protenas tambin actan estableciendo una competitividad por el receptor en funcin de su concentracin, ya que van a impedir que los dominios SH2 de otras protenas reconozcan los restos si estn en mayor concentracin.
Puesto que no es lo mismo desconectar que eliminar un proceso, ambos mecanismos van a
estar fuertemente regulados y la actuacin de uno u otro depender del estado de la clula.
Vemos todo el abanico de posibilidades que se abren desde la activacin del receptor de EPO
como ejemplo de un receptor de citoquinas tpico.
El anclaje de PKB a la membrana no supone una activacin total, ser necesario que otra quinasa denominada PDK1 (quinasa dependiente de fosfoinostidos) que tambin se activa por la
unin al inositol-3,4-bifosfato fosforile a PKB en el labio de activacin.
Por lo tanto PKB solo muestra un 100% de actividad cuando est unida a la membrana y fosforilada. PKB y PDK1 son S/T quinasas.
1.4.6 AKT1 (=PKB) y PTEN
Existen dos protenas que son muy importantes para la regulacin de las cascadas de transduccin porque van a actuar alternativamente activando y desactivando seales.
La protena AKT1 (=PKB) es una quinasa que presenta un dominio PH de reconocimiento de
fosfolpidos de inositol que le permite anclarse a la membrana como ya hemos visto. Existe
una versin viral activada constitutivamente que produce el desarrollo de cncer por lo que es
un oncogen.
203
En esta imagen podemos ver cmo afectan una serie de situaciones de estrs como la inflamacin o el estado de hipoxia a las rutas activadas por citoquinas y factores de crecimiento.
Cuando el receptor manda las seales se activa PI3K que va permitir la activacin de PKB (AKT)
y que adems estimula a la xido ntrico sintasa que va a favorecer al factor de crecimiento de
los endotelios vasculares, y por otra parte va a fosforilar a IKK activandola. Esto provoca la
fosforilacin del factor NFB, separndolo de su inhibidor y favoreciendo la expresin de genes. Tambin se inhibe a GSK3 que inhiba a la -catenina, permitiendo la transcripcin de
muchos otros genes.
Pero todo este proceso est inhibido por PTEN ya que va a impedir la activacin de PKB (AKT)
en caso de hipoxia o inflamacin.
La enfermedad del hgado graso es una patologa que puede evolucionar hacia una cirrosis y
eventualmente hasta un cncer heptico. En el desarrollo de esta enfermedad estn implicadas las vas en las que intervienen PI3K/AKT (PKB) y GSK3.
En muchas ocasiones los tumores se desarrollan a bajas concentraciones de oxgeno por un
abastecimiento insuficiente que acomoda a las clulas a vivir en condiciones de hipoxia. Estas
condiciones estimulan la formacin del factor de hipoxia (HIF-2) que impide la oxidacin de
compuestos grasos desencadenando el hgado graso.
Como podemos ver, los cidos grasos libres (FFA) activan la ruta de PI3K/AKT (PKB) que inhibe
a GSK3. Por otro lado, se produce la activacin de mTOR (diana de rapamicina en clulas de
204
mamfero) que induce la activacin de NFB lo que provoca la inactivacin de PTEN y por tanto
cesa la inhibicin del propio sistema.
Como vemos se trata de una ruta muy bien regulada que donde fallos en PTEN o PI3K pueden
desencadenar la aparicin de cncer.
2 Vas de sealizacin
A modo de resumen vamos a realizar una visin global de las vas de sealizacin estudiadas,
as como un estudio pormenorizado de algunas no tratadas hasta ahora.
Los receptores acoplados a protenas G que estimulan a adenilato ciclasa y la activacin de la
PKA con dos subunidades catalticas y dos reguladas por AMPc, producen la fosforilacin de
factores de transcripcin como Fos, Jun, Myc y CREB.
Los receptores de citoquinas como
el de EPO estn asociados a quinasas
como JAK que permiten la fosforilacin de otras en restos de tirosina,
como es el caso de STAT que muestra sus NLS al dimerizar y va al ncleo.
Los receptores con actividad Yquinasa directa en su dominio citoslico desencadenan cascadas
como la de Ras y las MAPKs que se
translocan al ncleo para fosforilar
factores de transcripcin.
205
Los receptores como los del factor de crecimiento transformante (TGF) son muy especiales
porque van a desarrollar, a diferencia de los anteriores, actividad S/T-quinasa activando a
factores de transcripcin como Smad que en funcin del caso van a reclutar co-activadores o
co-represores.
Estos cuatro tipos de receptores estn relacionados con la fosforilacin de protenas que lleva
a una modulacin de la expresin gnica, pero adems podemos encontrar otros tres tipos de
receptores que van a realizar esta modulacin a travs de la degradacin de complejos o protelisis de protenas.
Los receptores del tipo Hedgehog (Hh, erizo) son un complejo de dos protenas que se disponen en la membrana plasmtica, donde una acta como receptor del ligando y la otra como
colaboradora amordazada por la primera. Cuando el ligando impacta con la protena receptora, esta se disocia y la colaboradora comienza a
mandar seales que provocan la disociacin de
complejos proteicos cuyas unidades entran al
ncleo como factores de transcripcin.
Los receptores Wnt son receptores del tipo
7tm que al unirse al ligando actan sobre una
protena que impeda la liberacin de factores
de transcripcin acoplados a complejos multiproteicos. Precisan de una protena similar a
LDLR para unir el ligando.
Los receptores Notch (muesca) son receptores
que interaccionan con protenas delta de otras
clulas favorecindose la protelisis del dominio citoslico mediante presenilinas y convertasas, que marcha al ncleo donde acta como
un factor de transcripcin.
Tienen como ligandos la superfamilia de TGF y BMPs, activinas e inhibinas (mamferos) y Dpp (Drosophila).
Presentan actividad S/T-quinasa intrnseca en el dominio citoslico.
Estn implicados en la activacin de los factores de transcripcin Smad.
Tienen como ligando los interferones, eritropoyetina, hormona de crecimiento, algunas interleucinas (IL-2 e IL-4) y otras citoquinas.
206
Tienen como ligando el factor natriurtico atrial y las hormonas peptdicas relacionadas.
Estructuralmente es una hlice transmembrana con actividad guanilato ciclasa intrnseca en el dominio citoslico.
Estn implicados en la generacin de GMPc.
Tienen como ligandos las pleiotropinas y otras hormonas proticas que van a actuar
como seales no negativas (positivas para la divisin) inhibiendo al receptor.
Presentan actividad fosfotirosina fosfatasa en el dominio citoslico inhibida por la
unin de ligandos. Por lo tanto tienen actividad fosfatasa constitutiva garantizando
que no se producir divisin celular en ausencia de estmulos.
Participan en la hidrolisis de los residuos de Y-fosfato que activan varias rutas iniciadas
por Y-quinasas.
Tienen como ligandos pequeos pptidos asociados a los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en la membrana plasmtica de macrfagos y otras clulas presentadoras de antgenos.
Se trata de hlices transmembrana con un gran nmero de qunasas asociadas al
dominio citoslico y que solo se han localizado en linfocitos T.
Estn implicados en la activacin de Y-quinasas citoslicas y las rutas de PI3K, IP3/DAG
y Ras-MAPK.
A continuacin el heteroligmero fosforila a las protenas Smad3 que van a formar un complejo trimrico compuesto de dos subunidades de Smad3 y una subunidad de Smad4 que al
interaccionar van a mostrar sus NLS para ser importadas al ncleo como factores de transcripcin.
Si a estos complejos se les unen co-activadores pues se producir la expresin de genes, pero
si se les unen co-represores como Ski, N-CoR y las histonas desacetilasas se producir el silenciamiento gnico.
12
APC= adenomatosis polyposis coli proten que es un importante represor de tumores en humanos
208
La interaccin de Wnt con Fz provoca que el complejo receptor inhiba la protelisis de la catenina activando a la protena Dishevelle que va a actuar como inhibidora del complejo de
GSK3.
La -catenina es una protena que al no ser degradada, entra al ncleo e interacciona con TCF,
pasando ahora a actuar como co-activador de la expresin gnica.
2.3.2 Ruta de Hh
Los receptores Hedgehog (Ptc) presentan 12 hlices transmembranales que va a regular la
presencia en la membrana de otra protena denominada Smo del tipo 7tm.
En ausencia de hedgehog los receptores Ptc impiden la externalizacin Smo mediante la actuacin
de otras protenas que las mantienen en vesculas intracelulares.
Esto impide la asociacin del complejo Ci155/Fu/Cos2 cuya fosforilacin produce la liberacin proteltica de Ci155 que va al ncleo y
acta como un represor (estado
off). Adems las vesculas con Smo
van a estar siendo degradadas de
manera constitutiva va lisosomal.
209
La unin de Hh a Ptc produce la inactivacin del receptor y permite la salida de los receptores
a la membrana abriendo tres vas de transduccin:
-
210
Pero cuando el primer corte est mediado por la -secretasa y el segundo es con presenilina se
da lugar a un pptido de 42 aminocidos que es patognico. La terapia para combatir el Alzheimer se centra actualmente en la bsqueda de inhibidores selectivos contra la -secretasa
que no afecten a otras convertasas como la presenilina.
211
212
La llegada del glutamato activa los receptores GPRC y GluR metabotrpicos que estn acoplados por protenas G al sistema adenilato clicasa que aumenta la concentracin de AMPc desencadenando la activacin de PKA.
La activacin de PKA tiene varios efectos, por un lado fosforila a los receptores ionotrpicos de
glutamato (iGluR), provocando un aumento de la concentracin de calcio induciendo la activacin de CamK-II (calcio-calmodulina quinasa II), y por otro lado las dos quinasas (PKA y CamK-II)
fosforilan al factor de transcripcin CREB en la S133 permitiendo la unin al elemento de respuesta CRE. Esto permite el reclutamiento de co-activadores (CBP, p300) y de la mquina de
transcripcin (TBP, TFIIB,) sobre la caja TATA.
Por otro lado, la llegada del glutamato a los GluR metabotrpicos del grupo D provoca la activacin de la PLC a travs de protenas G que desencadenan la produccin de DAG e IP 3 activando a PKC y abriendo los canales de calcio del retculo endoplasmtico. Esto activa ms cal213
modulina y por ende a calcio-calmodulina quinasas (II y IV) que van a tener el citado efecto
sobre CREB.
No podemos olvidar a los receptores de los factores de crecimiento que van a activar a PI3K
reclutado a GRB2, Sos, que va a facilitar la activacin de Ras, que fosforila a Raf, luego a las
MEKs y finalmente ERK que actuara como factor de transcripcin directo o fosforilado a otros
factores como p90RSK.
214
215
216
Ligandos canal Na: tetrodotoxina, batracotoxina, veratridina, toxinas de escorpin and anmonas
K 1; Rb 0.9,
NH4
0.1, Li<0.01,homogeneizado
Na<0.01
La purificacin de canales se puede realizar a partir del cerebro
de
cordero
en
Na -RVVRVFRI GRI LRLI KAAKGI R--Hlice de respuesta al voltaje
una solucin con tritn X-100 (detergente) que seCa
centrifuga
para obtenerNRAKGLK--Hlice
una S1 en la que
-KI LRVLRVLRPLRAI
de ya
respuesta al voltaje
Ligandoscanal K: tetraetilamonio (TEA), dendrotoxina de serpiente mamba
tendremos toda la poblacin de canales.
Ligandoscanal Ca,:dantroleno, nifedipina, nitrendipina
La tetrodotoxina es una neurotoxina derivada de la guanidoina extraordinariamente potente extrada del pez globo que tiene gran
217
afinidad por los canales de sodio. Se trata de una molcula hidrosoluble que bloquea
los canales de sodio evitando la despolarizacin de la membrana.
La batracotoxina (sapo) y veratridina (planta) son toxinas liposolubles que se unen al
canal de sodio pero por sus dominios intermembrana, alterando el tiempo de transicin entre los estados del canal. No es lo mismo que un canal cambie en 1 s que tarde 10-20 min.
Toxinas de escorpin y anmona.
Tetraetilamonio (TEA)
Dendrotoxina de serpiente mamba
Dantroleno
Nifedipina
Nitredipina
Como ya hemos mencionado en el extracto S1 tendremos toda la poblacin de canales de sodio, calcio y potasio. En primer lugar, antes de realizar una purificacin especfica de los canales de sodio vamos a separar los canales en general del resto de protenas que producirn
unin inespecfica.
Puesto que los canales de sodio son glicoprotenas, porque estn en la membrana plasmtica y
podemos presumir que tienen estructura oligomrica, tal vez sean reconocidos por alguna
lectina como LCA (aglutinina de la lenteja). Por lo tanto mediante una matriz de sefarosa-LCA
que reconoce manosas separamos todas las glicoprotenas con manosa terminal y lavamos el
resto. Para liberar las glicoprotenas de la matriz realizamos un lavado con una disolucin de
manosa (1M) y se dializa lo obtenido para retirar el exceso de manosa.
A continuacin, para realizar un seguimiento a la capacidad de unin de la toxina se aade
tetrodotoxina radiactiva a la disolucin, se lava la no unida y se mide con un contador de centelleo la radiactividad total.
En una segunda fase se utiliza una placa de sefarosa-tetrodotoxina para que los canales de
sodio queden especficamente unidos. Finalmente lavamos la sefarosa con una disolucin de
tetrodotoxina, obtenindose una purificacin rica en protenas que ligan esta toxina.
Para comprobar la pureza podemos realizar una electroforesis o para posteriores experimentos inyectarla a un conejo con el fin de generar un antisuero que nos permitir realizar experimentos como el Western blot.
La purificacin de los canales permite la realizacin de estudios funcionales a travs de liposomas a los que se adicionan los canales purificados. Posteriormente mediante la adiccin de
sodio radiactivo en este caso, y de toxinas que provocan la despolarizacin de la membrana
(veratridina) porque pasan los canales del estado cerrado al abierto, pues tendremos que detectar seal en el interior de los liposomas.
218
Por el contrario, la adicin de tetrodotoxina retiene los canales de sodio en estado cerrado, lo
que nos permite establecer la cantidad de sodio presente en el liposoma que se considerar
como background inespecfico.
Trnsito de iones
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Canal de Na
Canal de K
Na
Li
NH3OH
NH4
0,9
0,9
0,1
0,01
0,01
0,1
NH2NH3 CH3NH3
0,6
0,01
Rb
0,1
0,01
0,9
219
A travs de los canales de sodio entra por tanto el sodio con un 100% de facilidad, pero tambin:
-
El sodio (100%) presenta un dimetro de 5 , pero que aumenta ya que pasa a travs
del canal solvatado.
El litio (90%) porque presenta un radio inico similar en solvatacin.
El hidrxilamonio (NH3OH, 90%) es capaz de atravesar el canal gracias a su capacidad
para formar puentes de hidrgeno con los aminocidos del canal, mientras que el
amonio NH4 (10%) no presenta electrones desapareados para formar estas interacciones y no pasa a pesar de presentar menor tamao.
La hidracina (NH2NH3, 60%) y el metilamonio (CH3NH3, <1%) a pesar del tener el
mismo tamao presentan esa gran diferencia de facilidad de paso debido a que la primera puede establecer puentes de hidrgeno.
El potasio (10%) y el rubidio (<1%) entran muy mal a travs del canal ya que presentan
mayor radio inico.
A travs de los canales de potasio pasa el potasio con un 100% de facilidad en solvatacin:
-
En los axones no mielinizados podemos encontrar una densidad de 100 canales de sodio/2,
mientras que en los axones mielinizados podemos encontrar hasta 20.000 canales/2.
220
Para los canales de potasio tetramricos tendremos por tanto 4 hlices sensoras de voltaje y 8
hlices formando parte del ionforo, junto con las 12 hlices restantes haciendo un total de 24
hlices, unindose los monmeros mediante interacciones no covalentes pero muy fuertes.
Cada monmero presenta un tamao de unos 70 kD (7000 aminocidos).
En este canal encontramos adems una bola en los extremos N-terminales de las cadenas polipeptdicas que se denomina bola de presidiario y que va a obturar el ionforo para impedir el
trnsito de iones en el estado inactivo.
Los canales de sodio y calcio son monomricos, es decir, las 24 hlices van a formar parte de
una misma cadena polipeptdica que presenta un tamao de unos 280 kD (2800 aminocidos),
y carece de bola de presidiario.
Presentan una zona hidrofbica (H) interna que se denomina unidad de inactivacin. Este
segmento, en funcin de su conformacin interfiere con el paso de iones pasando el canal al
estado inactivo.
Tal y como vemos en las secuencias de las hlices 4 para los canales de sodio y calcio, se trata
de una secuencia en la que se van alternando cada dos o tres posiciones aminocidos cargados
221
Ligandos canal Na: tetrodotoxina, batracotoxina, veratridina, toxinas de escorpin and anmonas
positivamente
a pH
fisiolgico.20,000
Esta hlices
son axones
anfipticas,
ya que presentan todas las cargas
100 canales/2
axones no
mielinizados;
canales/2
mielinizados
Selectividad:
Na
1;
NH3OH
0.9;
Li
0.9;
NH2NH3
0.6;
NH4
0.1;
K
0.1;
Rb<0.01;
CH3NH3< 0.01
en un lado actuando como sensor de los cambios de potencial
en la membrana.
K 1; Rb 0.9, NH4 0.1, Li<0.01, Na<0.01
En el caso de procariotas, los canales e potasio solo estn formados por las dos ltimas hlices
y el asa, por lo que es lo mnimo que se necesita para establecerlo y adems resulta muy til
para los estudios funcionales.
Podemos ver el funcionamiento de las hlices sensoras de voltaje representadas en el modelo
de bola de presidiario (aunque se ndice canal de sodio, no es correcto). La despolarizacin de
la membrana provoca el cambio de posicin relativa de las hlices en la protena lo que provoca la transicin desde unos estados a otros.
222
atravesar el canal de potasio, ya que desolvatado no se acomoda adecuadamente a los restos de oxgeno expuestos y por lo tanto no gana estabilidad y el proceso no es favorable.
El canal de potasio tiene una longitud de poro de 34 presentando una salida de 12 de largo
con una luz til de 3 , por lo que el radio inico del potasio (1,33 ) junto con el de los oxgenos (1,4 ) hacen un total de 2,73 ,
suficiente para pasar por el poro estableciendo los puentes de hidrogeno.
Pero dado que el sodio tiene un radio
inico menor (0,95 ), no puede establecer los puentes necesarios para
ser estable.
El canal de potasio se ensancha en el
vestbulo del lado citoslico que tiene
un dimetro de 10 donde la molcula est a solvatada-
224
Los aminocidos con los que el potasio establece puentes de hidrgeno a travs del ionforo
son treonina, valina, glicina, tirosina y glicina (TVGYG, televisin gallega y gallega) a travs de
sus grupos carbonilo.
En un canal de potasio vamos a poder encontrar dos iones pasando a la misma vez. El potasio
tiene una elevada densidad de carga positiva cuando est desolvatado, por lo que al entrar en
el canal, va a generar una fuerte repulsin electrosttica sobre los iones que puedan estar ya
dentro, empujndolos hacia el exterior a favor de concentracin de los propios iones en el
canal.
Este es el funcionamiento base de todos los canales dependientes de voltaje, es la unidad bsica sobre la que vamos a encontrar toda una variedad de protenas accesorias y otros procesos
como el modelo de la bola de presidiario.
225
226
Los transportadores de colina de baja afinidad se distribuyen en todos los tejidos perifricos.
Los transportadores de colina de alta afinidad se distribuyen a nivel del SNC junco con
los anteriores y se inhiben por hemicholinio-3
y van a depender de sodio para su funcionamiento ya que se trata de un co-transporte
tipo simporte, es decir, sodio y colina entran
al mismo tiempo. Estos transportadores pertenecen a la familia de transportadores de catecolaminas, siendo todos muy parecidos.
La colina que se encuentra en el torrente sanguneo, a una concentracin 10 mM, va a proceder de la dieta (1/2) y de la recaptacin que se produce tras la hidrolisis de acetilcolina (1/2).
La presencia de los transportadores de alta afinidad en el SNC asegura el suministro de colina
en momentos de ayuno.
Dado que la recaptacin de colina en el espacio sinptico depende de sodio, la inhibicin de las
bombas de sodio/potasio de la membrana plasmtica mediante ouabana impedir el proceso.
El gen que codifica la colina acetiltransferasa est compuesto por 18 exones y en uno de sus
intrones se encuentra el transportador vesicular de acetilcolina, por lo que la sntesis de ambas protenas va a estar completamente coordinada. La enzima colina acetiltransferasa es el
marcador de las rutas colinrgicas.
El acetato activo (Acetil-CoA) que proporciona la energa necesaria para garantizar que la reaccin sea termodinmicamente favorable, procede del ciclo de los cidos tricarboxlicos, concretamente del citrato mitocondrial que sale al citosol a travs de la lanzadera de citrato/aspartato.
La acetilcolina es una molcula con carga positiva que va a ser acumulada inmediatamente en
las vesculas sinpticas gracias a la accin de los transportadores vesiculares de acetilcolina
(VAChT) que van a realizar un antiporter con dos protones. Estos transportadores son inhibidos por el vesamicol (Bsame) y se parecen mucho a los transportadores vesiculares de dopamina, noradrenalina Las vesculas van a albergar hasta 10.000 molculas de acetilcolina
junto con protenas que van a equilibrar la osmolaridad.
El pH de estas vesculas es de en torno a 5-5.5 gracias a la accin de bombas proteicas que
funcionan a expensas de ATP, sin esta acidificacin el transporte no funcionara, por ello las
sustancias lisosomotrpicas (neutralizan el pH cido) afectan negativamente al acmulo de
catecolaminas en general (dopamina, AChe, noradrenalina, adrenaina,).
El transportador vesicular de acetilcolina est formado por 12 estructuras helicoidales, al igual
que los transportadores vesiculares de catecolaminas en genera, pero no los de membrana.
228
En primer lugar una vescula vaca sufre la acidificacin de su interior mediante la aportacin
de los protones a travs de una ATPasa que va a permitir la captacin de acetilcolina por el
transportador vesicular de acetilcolina. Una vez llena la vescula se desplaza hacia el entorno
de la membrana donde se produce el atraque mediado por las SNAPs.
Pero no va a ser hasta que se produzca una entrada de calcio medidada por los canales dependientes de voltaje hasta cuando se produzca la fusin de membranas y exocitosis de acetilcolina.
A continuacin se produce la recaptacin mediada por los canales de alta afinidad simportadores de colina/sodio, y las vesculas vuelven al interior celular gracias a la formacin de la cubierta de clatrina.
229
Cuando llega un potencial de accin a la terminal sinptica se abren los canales de calcio dependientes de voltaje que provocan la liberacin de acetilcolina al espacio sinptico donde los
receptores nicotnicos (ionotrpicos, canales) de acetilcolina que son pentmeros 2 (SNC
embrionario) o 2 (musculo embrionario y zonas no sinpticas).
Existen del orden de 11 genes para la subunidad , 3-4 genes para la subunidad y un gen
para las restantes. En funcin de la zona los receptores nicotnicos sern pentmeros homomricos o heteromricos presentando diferentes afinidades por agonistas y antagonistas.
La subunidad de estos canales es la
que liga agonistas como la acetilcolina
provocando un cambio conformacional
que pasa el canal al estado abierto presentando un dimetro de poro de 10
(es menos selectivo y tambin puede
pasar el calcio).
La entrada de sodio a travs de los receptores ionotrpicos desencadena la
despolarizacin local de la membrana
que genera un potencial de accin capaz de abrir los canales de sodio dependientes de voltaje y finalmente los tubulotransversos, donde los canales de sodio se acoplan a los receptores de rianodina de las cisternas terminales del retculo sarcoplasmtico y
provocan la liberacin de calcio y la contraccin del msculo.
230
La AChE hidroliza especficamente acetilcolina liberando colina y acetato. Es fuertemente inhibida por BW284c51 y poco inhibida por Iso-OMPA.
La BuChE presenta un centro activo de mayor tamao que le permite hidrolizar otras
molculas y puede suplir la accin de AChE, pero su substrato ptimo es la butirilcolina. Es fuertemente inhibida por Iso-OMPA pero poco inhibida por BW284c51.
La e-serina es un inhibidor especfico de colinesterasas que permite diferenciar entre colinesterasas y esterasas cualesquiera.
Propiedades cinticas.
-
231
Las acciones colinrgicas de las colinesterasas son aquellas implicadas con la neurotransmisin y la sinapsis colinrgica.
Las acciones no colinrgicas son la hidrlisis de neuropeptidos como la sustancia P, encefalinas y endorfinas. Control de la actividad motora por secrecin desde varias regiones cerebrales. Estn implicadas en la formacin de nudos neurofibrilares y placas
amilodes en los cerebros con Alzheimer. Diferenciacin y proliferacin en tejidos neuronales y no neuronales. Detoxifificacin (BuChE).
Existen tres formas hidroflicas que son el monmero (3-4 S), el dmero (5-6 S) y el tetrmero
(10-11 S) globular, y dos formas anfiflicas, el monmero (3-4 S) y el dmero (5-6 S).
Si el gen prima que codifica la protena que produce la unin entre las formas globulares y la
membrana no es operativo, por mucho que se exprese el mensajero T para las formas globulares anfiflicas todas sern hidroflicas.
Por otro lado, el mensajero que empalma el exn 6 da lugar a las formas asimtricas de AChe
que forman protenas heteromricas en las que varias unidades se van a aunir a travs de de
una triple hlice de colgeno a la membrana. Esta hlice est codificada por el gen ColQ.
233
234
Los canales inicos dependientes de voltaje son los canales ya estudiados de sodio,
potasio y calcio que pasan al estado abierto mediante una despolarizacin de la membrana.
Los canales inicos dependientes de transmisores son los clsicos excitatorios de acetilcolina, glutamato y serotonina, o los inhibidores de GABA y glicina que aumentan la
carga negativa en el interior de la clula (hiperpolarizacin).
Dado que las neuronas presentan toda una poblacin de estos canales, en funcin de los estmulos que reciba se producir una hiperpolarizacin de la membrana o una despolarizacin,
aumento de calcio
1 Sistema glutamatrgico
El glutamato es un aminocido que puede actuar como neurotransmisor, pero no puede atravesar la barrera hematoenceflica por lo que debe ser sintetizado en las neuronas a partir de
precursores locales:
-
La fuente de glutamato en las neuronas es la glutamina procedente de las clulas gliales, convertida en glutamato por la glutaminasa.
Tambin puede ser sintetizado por transaminacin del 2-oxoglutarato, un intermediario del ciclo de los cidos tricarboxlicos que se transforma en -cetoglutarato. A continuacin el -cetoglutarato es descarboxilado por la glutamato descarboxilasa dando
lugar al glutamato. En este caso el glutamato se produce a partir de la glucosa metabolizada en las neuronas y representa uno de los motivos del consumo de este glcido
por el cerebro.
Receptor NMDA (N-metil-D-aspartato) cinco clases R1, R2A, R2B, R2C, R2D.
Receptor AMPA (-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato) cuatro clases R1-R4.
Receptor de kainato cinco clases GluR5-7 y KA1-2
236
2 Sistema GABArgico
El GABA es un metabolito que se puede obtener a partir de diferentes rutas tal y como se
muestra en la imagen, donde destaca la descarboxilacin del glutamato.
Los receptores de GABA y glicina, a diferencia de los de glutamato y AChE, son inhibitodios. El
receptor GABA-A est compuestos por 19 subunidades (1-6, 1-3, 1-3, , , , y 1-3)
cuya diversidad sigue aumentando por las variantes de Splicing alternativo que van apareciendo y que se localizan a nivel del SNC.
Esto da lugar a una variedad de receptores altsima, al menos 30, cada uno de ellos con propiedades farmacolgicas y fisiolgicas distintas, adems de un modelo caracterstico de expresin. Pero dado que todos favorecen la hiperpolarizacin de membranas se considera que son
inhibitorios y se han venido empleando agonistas para el tratamiento de crisis convulsivas.
Uno de los agonistas ms conocido es
el diazepan, una benzodiacepina. Tambin liga etanol y tiopental, un componente relacionado con el suero de la
verdad para provocar hipnosis. Dado
que este receptor tambin puede ligar
hormonas esteroideas, se considera
que est relacionado con los cambios
de humor femeninos.
237
3 Receptor de glicina
Los receptores de glicina abundan en la medula espinal y el antagonista ms conocido es la
estricnina (cicuta). Estos receptores que tambin presentan varias clases son todos pentamricos entre los que pueden encontrarse homoligomeros y heteroligmeros.
Se trata de canales de cloruro que provocan la hiperpolarizacin de membranas y por lo tanto son inhibitorios.
Tienen sitios de unin diversos para tropinas, alcoholes, anestsicos generales, esteroides neuroactivos, canabinoides, cationes divalentes y ciertos derivados del glutamato, por lo que su
capacidad de respuesta es tremenda.
238
239
En muchas neuronas la ruta de sntesis termina aqu, introducindose la dopamina en las vesculas sinpticas a travs del transportador tpico de 12 hlices. Pero en otras neuronas no dopaminrgicas como las adrenrgicas la dopamina va a continuar la ruta de sntesis hasta dar
lugar a noradrenalina y adrenalina.
A continuacin la dopamina es oxidada a noradrenalina (nor = sin grupo metilo) por la dopamina--hidroxilasa que introduce
oxgeno (-OH) en la posicin del
resto de etanol. La dopamina-hidroxilasa es una cuproprotena
que presenta cobre y precisa de
cido ascrbico para realizar su
funcin. La accin de acomplejantes
de cobre como los carbamatos tales
como el disulfiran suprmmimen su actividad aumentando los niveles de dopamina que desencadenan en nauseas, mareos y vmitos por ello el alcoholismo crnico se trata con estos agentes. Esta enzima se utiliza como marcador para el diagnstico de algunos tipos de cncer, como los feocromocitomas, es decir, tumores de la mdula adrenal afines a la tincin, y neuroblastomas del sistema nervioso.
Al igual que antes, para algunas neuronas la ruta de sntesis finaliza con la formacin de noradrenalina, pero finalmente otras van a utilizarla para generar adrenalina.
A continuacin la noradrenalina es metilada a adrenalina por la feniletanolamina
N-metiltransferasa (FNMT) que introduce
metilo en la posicin N. El donador de
grupos metilos es la S-adenosilmetionina
(SAM) y la adrenalina va a ser acumulada
en las vesculas sinpticas.
2 Rutas dopaminrgicas
Las rutas dopaminrgicas ms importantes
a nivel del sistema nervioso central son la
ruta mesolimbocortical y la mesoestriatal.
Se sabe que esta ltima ejerce un papel
funcional en la actividad motora y por ello,
los daos de estas neuronas producen tremores y parlisis en la enfermedad de Parkinson.
Adems de en la coordinacin se sabe que
la dopamina est implicada en la motivacin, recompensa y reforzamiento.
240
3 Inactivacin de catecolaminas
No existen sistemas enzimticos de degradacin de catecolaminas en el espacio sinptico,
como ocurra para ACh, por ello la dopamina, noradrenalina y adrenalina van a ser eliminadas
por difusin y captura desde el espacio sinptico.
Para la degradacin de catecolaminas van a intervenir dos sistemas enzimticos:
-
Monoamino oxidasa (MAO) es una flavoproteina con FAD que cataliza una desaminacin oxidativa. Se trata de una enzima marcadora de la membrana mitocondrial externa y la reaccin que cataliza
consiste en una desaminacin (prdida de N en forma
de amonio) seguida de la introduccin de oxgeno (oxidacin) dando siempre como
producto final un aldehdo.
Puesto que los aldehdos son
muy reactivos porque reaccionan con los grupos amino
libres, las oxidasas y reductasas de los tejidos los transforman en cidos o alcoholes como productos finales.
Catecol-O-metiltransferasa
(COMT) que introduce metilo en los oxgenos de la posicin 3 o 4, es una protena soluble.
Estas enzimas pueden actuar alternativamente sobre las catecolaminas dando lugar a diferentes productos finales que sern alcoholes o cidos.
4 Sistema dopaminrgico
Agonistas del sistema dopaminrgico como la cocacina y las anfetaminas inhiben a los transportadores de recuperacin del neurotransmisor provocando la activacin continuada de los
receptores.
Los antagonistas dopaminrgicos como la reserpina inhiben al transportador vesicular de
monoaminas y compuestos como el AMPT (-metil--tirosina) inhiben a la tirosin hidroxilasa
impidiendo la sntesis de DOPA.
Los inhibidores de MAO se utilizan para el tratamiento de la depresin, ya que se aumenta el
tiempo de permanencia del neurotransmisor en
el espacio o trminal sinptica, ya que el transportador funciona en ambas direcciones en
funcin de la concentracin. Pero MAO presen241
ta dos variantes:
-
MAO-A tiene como sustrato preferente la noradrenalina y la serotonina. Est distribuida a nivel del SNC, el intestino, el hgado y la placenta.
MAO-B presenta amplio espectro de actuacin y se distribuye en la sangre y las plaquetas, adems del en el SNC.
Por lo tanto compuestos como anfetaminas, cocana, morfina, nicotina, alcohol, crack y otros
prolongan las acciones de la dopamina aumentando el sentimiento de placer y recompensa,
por lo que se desarrolla adiccin.
Recordemos que los transportadores de alta afinidad de las terminales sinpticas son dependientes de sodio y por lo tanto la recuperacin de catecolaminas va a estar afectada por ouabaina y veratridina. Ante una despolarizacin permanente de la membrana generada por veratridina, las concentraciones de sodio se equilibran a ambos lados de la membrana y por lo
tanto deja de funcionar el transporte.
El Parkinson supone un dficit de dopamina que se trata con L-DOPA. La dopamina se siblera
en el ncleo accumens, amgdala y corteza anterior, reguladoras de las emociones (circuito de
recompensa y placer).
Tambin abunda en el lbulo estriado (aprendizaje), hipocampo (memoria) y corteza prefrontal (juicio y planificacin de actividades).
Todos los receptores de dopamina son metabotrpicos. Existen 5 genes (D1-D5) y parecen
estar acoplados a protenas G donde unas activan a adenilato ciclasa y otros a PLC.
5 Sistema adrenrgico
Los receptores del sistema adrenrgico son sensibles a noradrenalina y adrenalina, y vamos a
encontrar cuatro tipos que se localizan en
posiciones pre- y post-sinpticas. Se nombran como receptores adrenrgicos 1, 2,
1 y 2 y son todos metabotrpicos.
Muchas de las drogas que afectan a las sinapsis dopaminrgicas tambin afectan al
sistema adrenrgico como es el caso de la
reserpina. Adems el transportador que
recapta estos neurotransmisores del espacio
sinptico tambin se fe afectado por cocana y anfetaminas.
6 Sistema serotoninrgico
La indolamina serotonina es sintetizada a partir del aminocido triptfano mediante dos reacciones sucesivas. En primer lugar la triptfano hidroxilasa cataliza la oxidacin del triptfano
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introduciendo oxgeno (-OH) para formar el 5-hidroxitriptfano. Esta enzima requiere oxgeno
y la tetrahidrobiopterina que se transforma en dihidrobiopterina.
En segundo lugar la descarboxilasa de aminocidos aromticos cataliza la descarboxilacin de
la molcula generando la 5-hidroxitriptamina, ms conocida como serotonina.
La serotonina es sintetizada en muchas regiones cerebrales inervadas por las fibras serotoninrgicas que estn implicadas en el control del sueo y la vigilia, el comportamiento y la ansiedad.
Se ha relacionado con la serotonina el hambre, sueo, actividad sexual, emociones, actividad
autonmica, motora, cognitiva y ritmos circadianos. Las drogas que afectan a la sntesis, liberacin o captura de la serotonina se utilizan en el tratamiento
de depresiones, ansiedad y
esquizofrenia.
Hoy en da se utiliza Fenfluramina (anortico) para combatir
la obesidad. El sumaptriptan es
muy eficaz contra migraas y
cefaleas. El prozac o pldora de
la felicidad, es un agonista del
sistema que facilita la liberacin
de serotonina y por ello se provoca un estado de bienestar.
La farmacologa de los receptores de serotonina es muy amplia y existen 5 clases diferentes,
entre los que encontramos ionotrpicos y metabotrpicos. A diferencia de los estudiados en
este tema que son todos metabotrpicos.
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1 Encefalinas
La leucinaencefalina y la metioninencefalina son
dos pentapptidos de 5 aminocidos cuyo primer
resto es el de tirosina y su ltimo aminocido es
leucina y metionina respectivamente. Estos dos
pptidos adoptan la misma conformacin espacial
y van a ser reconocidos por el mismo receptor.
En cuanto a los opiceos (morfina, herona y cocana) y opioides (metilencefalina, leucinencefalina y endorfina), todos se unen a receptores acoplados a protenas Gi que reducen la actividad de adenilato ciclasa.
Un angonista de estos receptores es la metadona (opioide sinttico) y una antagonista la naloxona.
Los efectos que provocan son la analgesia, adiccin, tolerancia, placer, indiferencia a estmulos, inmunosupresin, depresin respiratoria, bradicardia,
Cuando a una persona se le administra un opiceo, esta se une al receptor y baja la actividad
de adenilato ciclasa, pero las clulas reaccionan aumentado la expresin de adenilato ciclasa
debido a la importancia de mantener el sistema de AMPc. Por ello cada vez se desarrolla ms
tolerancia a la droga.
Pero si se produce una supresin de la administracin, el estmulo que pone en marcha al sistema adenliato ciclasa dispara los niveles de AMPc (al igual que la toxina del clera) dando
lugar nuseas y diarreas, as como al desarrollo de tremores.
Para saber si una determinada percepcin de dolor est relacionada con los receptores de
neuropeptidos se administra el antagonista naloxona. La acupuntura en el tratamiento de dolores se basa en la liberacin de encefalinas y endorfinas porque las agujas se sitan en los
puntos de liberacin de estos neuropeptidos. Pero si primero administramos naloxona, que
ocupa a los receptores, se impide la atenuacin del sistema de adenilato ciclasa que producen
los neuropeptidos y por lo tanto la sensacin de dolor contina.
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4 Receptores de neuropeptidos
Todos los receptores de neuropeptidos son metabotrpicos y estn acoplados a protenas G inhibidoras. Su
topolota es del tipo 7tm con un alto
grado de polimorfismo.
En general se establece que hay tres
clases de receptores de opiceos
principales denominados , y .
La exposicin prolongada de los receptores de opioides a sus agonsitas estimula la va inhibidora de adenilato ciclasa activando a las protenas Gi. Precisamente la toxina pertusis se une a
estas subunidades G inhibidoras provocando su adenilacin e impidiendo que frenen a adenilato ciclasa.
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