- 26 -

4.

PROCEDIMIENTOS DE CALIBRACIN

4.1

Calibracin mediante espectrofotometra UV-visible

Procedimiento general

Por lo general, para el anlisis mediante espectrofotometra UV-visible es posible

preparar curvas de calibracin "permanentes." Esto se refiere a que una curva de calibracin
puede usarse con varios lotes de anlisis, durante varios meses. Se prepara una nueva curva de
calibracin, cuando de patrones muestran un cambio de la pendiente o cuando se comienza a
usar un nuevo lote de reactivos.
La curva estndar inicial debe incluir un blanco reactivo y, por lo menos, ocho
estndares que. cubran toda la escala de concentraciones que se usarn en los anlisis rutinarios
del laboratorio y que permite medir el mtodo analtico.
El instrumento debe ponerse en cero con agua destilada. A este punto se denomina
"Lnea base del blanco."
El blanco "de reactivos" se refiere a la respuesta analtica (por ejemplo absorbancia)
causada por los reactivos cuando se analiza agua pura que no contiene el parmetro. Cuando
se traza la curva de calibracin, no se resta el blanco reactivo de las otras lecturas, sino que se
trata como un punto correspondiente a la concentracin cero (por ejemplo, C = O).
Las curvas de calibracin pueden ser lineales o no lineales. En la mayora de casos,
cuando la curva es lineal se aplica la Ley de Beer. Para definir la curva de calibracin que
mejor representa la relacin entre la absorbancia (A) y la concentracin (C) se pueden usar
clculos de regresin lineal de la siguiente manera:

Dadoque A=mC+b

donde:
A
C

absorbancia
concentracin

- 27 Se puede demostrar que:

- LAEc
m= nEAc
2
nl:c - (LC) 2

b=EA-mEc
n
n
donde:
m

b
n

=
=

la pendiente de Ja curva de calibracin (tambin denominada "factor de

calibracin").
Ja interseccin del valor de absorbancia o del eje "y".
el nmero de observaciones (lotes de valores de C y de A).

Aunque estos clculos pueden realizarse manualmente, resulta mucho ms conveniente

utili7.ar una computadora o una calculadora manual para elaborar el anlisis de regresin.
Por ejemplo, dados Jos siguientes resultados de concentracin (C) con relacin a la
absorbancia (A),

e
o.o

0.032

2.0

0.128

4.0

0.240

6.0

0.331

8.0

0.426

10.0

0.537

12.0

0.618

14.0

0.724

16.0

0.824

- 28 se puede calcular,
m
b

=
=

(pendiente)
(interseccin de y)

0.0493
0.035

La ecuacin de la mejor lnea se da mediante la siguiente ecuacin:

A = 0.0493C + 0.035
Con el fin de trazar estos valores en un papel cuadriculado, se sustituye simplemente
dos valores para C, se calculan los valores correspondientes a A, se ubican los dos puntos en
un grfico y luego se les une con una lnea recta. Por ejemplo, se puede calcular C = O, A =
0.035; y C = 10.0, A = 0.528. Estos valores pueden ser marcados y puede trazarse una lnea
recta tal como lo indica la figura 2.
Ahora, la curva de calibracin est lista para ser usada en el anlisis de muestras.
Recuerde que la curva fue elaborada sin hacer correcciones en el blanco. Se entiende que las
muestras deben analizarse y los valores de la concentracin deben calcularse, usando la curva
sin hacer, correcciones por el blanco en forma directa. Por regla general, el blanco, los
estndares y las muestras deben analizarse exactamente de la misma manera.
En algunos casos, se puede corregir el blanco; entonces, de cierto modo se cambia el
procedimiento analtico. En lugar de usar la curva de calibracin de la figura 2, que incluye
un valor positivo de absorbancia a la concentracin cero, slo se usa el factor de calibracin.
En otras palabras, en un lote de anlisis se procesan tanto las muestras como el blanco, luego
se substrae el valor de absorbancia del blanco del mismo valor de la muestra. La concentracin
de la muestra se calcula por medio de la siguiente ecuacin.

A
factor de calibracin

Si se usa el ejemplo anterior, el factor de calibracin es 0.0493, por lo tanto, la

concentracin se puede calcular de la siguiente manera:
A
0.0493

C=---

Esta ecuacin es equivalente y paralela a la curva de la figura 2, pero con la

interseccin en el origen (A=O, C=O).

- 29 -

0.9

o.a
0.7
<(
(.)

0.6

z 0.5

<(

a:

oen

0.4

<(

0.3
0.2
0.1

8
10
CONCENTRACION

Figura 2
CURVA DE CONCENTRACIN

12

14

16

- 30 -

Cuando se usa una curva de calibracin "permanente" o factor se requiere verificar su

exactitud con cada lote de anlisis, mediante el anlisis de un patrn o estndar de verificacin1,
antes de analiz.ar las muestras . Asimismo, se recomienda analiz.ar un blanco antes de la
muestra, no para verificar la curva de calibracin, sino para observar la pureza y estabilidad de
los reactivos. Estos valores del blanco tambin pueden ser trazados en una carta de control que
tiene O como valor central y sirve para controlar los cambios en la pureza de los reactivos. En
conclusin, una vez que se ha establecido la curva de calibracin, un lote tpico de anlisis
conlleva lo siguiente:
1)
2)
3)
4)
5)

Se coloca la absorbancia en O (100% de transmisin) con agua destilada.

Se determina la absorbancia del blanco de reactivos.
Se analiza el estndar o patrn de verificacin para validar la exactitud de la
curva de calibracin.
Se analizan las muestras (hasta 10).
Se repiten los anlisis del blanco o testigo de reactivos.

Si se van a analiz.ar ms de 10 muestras en un lote, se repiten los pasos del 3 al 5 tantas

veces como sea necesario, hasta que se completen los anlisis.
En el paso 3 si se estima conveniente, puede analiz.arse ms de un patrn o estndar de
verificacin. Tal como se seal antes, tambin stos pueden usarse en el control de su
precisin.

Finalmente, por lote se analizan por los menos 2 blancos para poder calcular el lmite
de deteccin. Para mayores detalles, vase el anexo 4.

La concentracin del patrn o estndar de verificacin, por lo general, es de aproximadamente 0.9 Cm, donde el
Cm representa el lmite superior de concentracin que puede ser medido con el mt!:todo analftico. Esta alta
concentracin es sensible para detectar los cambios que se producen en la curva de calibracin. A menudo, tamb~
se analiza el patrn o estndar de verificacin de una concentracin menor (0.2 Cm) para controlar niveles mcnora.
Ea:tos patrones o estndares de verificacin pueden ser usados como muestras de control cuando se miden
conjuntamente para verificacin de la curva de calibracin y para aplicar los datos de las cartas de control de la
prcciai6n.

- 31 ANEXO 4

ESTIMACIN EXPERIMENTAL DE WS LMITES DE DETECCIN

Por lo general, en mtodos que usan espectrofotometra UV-visible, se determina
experimentalmente sus lmites de deteccih, por medio de la evaluacin de la variabilidad de los
anlisis del blanco. La teora del lmite de deteccin adoptada est tratada con detalle en el
informe tcnico N 66 del Water Research Center, pp. 44-49. Como ejemplo se discute la
aplicacin de esta teora.
La ecuacin bsica para calcular el lmite de deteccin es la siguiente:

Lmite de deteccin (LO)

= 2.83 lo. 1 S.m

en donde

to. 1
S.m

=
=

el punto del 10% del t de student para pruebas dobles cola y

la desviacin estndar del blanco dentro de un grupo.

Con el fin de calcular el valor de S.m, analizar los blancos por duplicado en una serie
de lotes. Mientras mayor sea el nmero de determinaciones (por duplicado) medidas, mejor ser
la estimacin del lmite de deteccin. La ecuacin usada para calcular la desviacin estndar
dentro de un grupo es la siguiente:

en donde
di
m

la diferencia entre las determinaciones del blanco, dentro del lote.

el nmero de determinaciones del blanco por duplicado.

A continuacin, se seala un ejemplo de la determinacin del lmite de deteccin de los

anlisis de mercurio con datos generados en el CEPIS/LAB.

- 32 diferencia di

Blanco 1

Blanco 2

Lote No.

(Jlg/l)

(Jlg/l)

.521

.508

.013

1.69

10"4

.459

.445

.014

1.96

10"4

.608

.490

.118

139.24

10"4

.480

.386

.094

88.36

10"4

231,25

10"4

di1

donde sustituyendo
LD

2.83

~. 1

SdB

2.83 (2.13) (0.0537) 0.324 g/l

Ntese que el valor del t de student corresponde al valor que tiene cuatro grados de
libertad en el punto del 10% del t de student para las pruebas doble cola. A continuacin, se
presentan los valores del t de student de uso comn en el clculo del lmite de deteccin.
grados de libertad

6.31 2.92 2.35 2.13 2.02 1.94 1.89 1.86

grados de libertad

.2

10

12

.u

2Q

1.83

1.81

1.78

1.75

1.72

Para una buena estimacin del lmite de deteccin, se debe analizar blancos duplicados
en un nmero mayor de lotes, y no slo los cuatro utilizados en el ejemplo. Para el clculo
inicial, se sugiere un mnimo de diez lotes de datos, luego se vuelve a calcular, a medida en que
se encuentren disponibles ms mediciones y, por ende, ms grados de libertad.

- 33 -

4.2

Calibracin de autoanalludores

4.2.1

Introduccin

El uso de autoanali7.adores para el anlisis del agua es cada vez mayor; adems, existen
procedimientos disponibles para calibrar y obtener buenos resultados analticos a partir de las
lecturas instrumentales. Esta seccin describe los procedimientos recomendados por el Water
Research Centre (WRC) de .Inglaterra, mediante su Informe Tcnico N 32.
Aqu slo se incluyen aquellos proredimientos que se usan para la calibracin y
evaluacin del sistema Autoanalizadot 11 (AAII). Para mayores detalles puede consultarse el

mencionado informe.
El uso de mtodos de calibracin y evaluacin apropiados depende de la exactitud
requerida para los resultados analticos de un programa en particular (algunos parmetros pueden
requerir procedimientos diferentes), y del tipo de instrumento que se use (por ejemplo el AAI
o el AAII). Por ello, no es posible usar un mismo procedimiento para todas las situaciones; en
su lugar, se pone nfasis en principios generales y sugerencias sobre los procedimientos que
pueden usarse en diversas aplicaciones.

4.2.2

Calibracin

la respuesta de los sistemas AAI se obtiene en unidades % T (porcentaje de

transmisin), mientras que la respuesta para los sistemas AAII se obtiene en absorbancia. Esta
diferencia puede determinar el uso de diferentes mtodos en algunos aspectos de su calibracin.
El sistema AAII es ms simple y su uso se est difundiendo; ste se describe a continuacin.

Sistema AAII
El procedimiento que se recomienda para cada lote de muestras en las que se va a medir
un parmetro particular es el convencional, el que consiste en calibrar el equipo mediante el
anlisis de soluciones patrn, y luego el de muestras. El anlisis de patrones se repite
peridicamente. Generalmente se incluye uno de concentracin cero y otro de concentracin
parecida a la de las muestras que se van a medir. Los distintos aspectos de este mtodo se
discuten en las secciones 2.1.1 a la 2.1.6, las cuales pueden estudiane conjuntamente con la
figura 3, como una manera de verificar los pasos seguidos para lograr una calibracin ptima.

- 34 4.2.2.1 Estabilizacin preliminar del sistema

Al inicio, debe medirse la solucin de lavado en forma continua hasta que la respuesta
del instrumento sea estable. La experiencia indicar el tiempo requerido; sin embargo, ste
puede variar de parmetro a parmetro.
4.2.2.2 Seleccin de las soluciones patrn o estndares de calibracin
En la calibracin inicial, por lo general deben emplearse seis soluciones patrn o
estndares de calibracin (incluido el blanco*). Estos estndares deben tener una estrecha
relacin con las concentraciones de O.O Cm, 0.2 Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm y 1.0 Cm, en
donde Cm representa la mayor concentracin que debe cubrir la curva de calibracin.
En un sistema particular es posible reducir el nmero de soluciones patrn o estndar.
Por ejemplo, si los anlisis muestran una curva de calibracin recta, los estndares correspondientes a O.O Cm, 0.5 Cm y 1.0 Cm son suficientes1 .

Las soluciones patrn o estndares tienen que ser preparadas siguiendo instrucciones
claras, tantas veces como sea necesario, de acuerdo a la estabilidad de las soluciones.
4.2.2.3 Respuesta inicial para los patrones o estndares O.O Cm y 1.0 Cm
Si los cambios en las respuestas de los patrones o estndares O.O Cm y 1.0 Cm (durante
el anlisis del conjunto de muestras) no tienen importancia, se puede colocar el instrumento en
cero en el caso del blanco y en un nivel de respuesta mxima para el caso del estndar 1.0 Cm.
Luego, las concentraciones de las muestras se pueden leer directamente.
Si hay cambios apreciables en las respuestas de los estndares O.O Cm y 1.0 Cm, es
mejor registrar la respuesta. En el caso del blanco, en una escala ligeramente superior a cero
y, en el caso de la solucin patrn o estndar 1.0 Cm, un valor ligeramente menor al mximo
de la escala. Con estas mediciones y experiencia, se puede determinar los valores correctos para
realizar los ajustes.

El trmino "blanco" se refiere a una solucin de composicin idntica a las otras soluciones patrn o
estndares, sin el analito. Se analiza exactamente como los otros patrones o estndares, es decir, se
coloca en el recipiente para muestras (sobre la rejilla para las rnuestras).

- 35 -

4.2.2.4 Orden de los anlisis de los patrones o estndares de calibracin

El orden adecuado para el anlisis de los patronr,s o estndares de calibracin depende
de b naturaleza y magnitud de la cor.laminacin cru.ada1 entre una solucin y otra. Es ideal
que los sistemas se seleccionen y operen empleando una relacin muestra/agua tal que la
contaminacin cruzada carez.ca de importancia. Sin embargo, es necesario conocer: (i) la
relacin muestra/agua de dilucin, (ii) el nmero y estabilidad de las muestras a ser analizadas,
y (iii) la exactitud requeridll (error aceptado). Con frecuencia aparece alguna de las siguientes
contaminaciones cruzadas:
a)

Contaminacin cruzada de poca importancia

En este caso, por lo general, el orden de los anlisis carece de importancia; sin
embargo, si lo tomamos en cuenta el proceso se hace ms simple. Para ello, podramos seguir
el siguiente orden: O.O Cm, 0.2 Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm, 1.0 Cm y O.O Cm. Estos siete
anlisis deben llevarse a cabo despus del control inicial del agua de dilucin y de la solucin
patrn o estndar 1.0 Cm.

b)

Contaminacin cruzada de porcentaje constante

Cuando una solucin se mezcla parcialmente con la solucin que la precede y el grado
de mezcla es constante, el orden del anlisis (a) de la figura 2 producir una curva de calibracin
con una pendiente menor que la real. Este efecto, a menudo, puede carecer de importancia.
Sin embargo, se puede reducir mediante el siguiente orden en los anlisis de los patrones o
estndares O.O Cm, 0.4 Cm, 0.2 Cm, 0.8 Cm, 0.6 Cm, 1.0 Cm, O.O Cm. Este orden asegura
la anulacin de los errores positivos y negativos producidos por contaminacin cruzada.
c)

Contaminacin cruzada debido a la absorcin

En algunos autoanalizadores, los compuestos de color suelen ser absorbidos en la

superficie del tubo, celda de flujo continuo, etc. Por ello, resulta comn que al pasar de una
solucin de alta concentracin a una de baja concentracin, aumente la contaminacin cruzada.
Esto se puede apreciar observando los residuos que quedan en la parte superior. En estas
condiciones, es mejor analizar los estndares en orden ascendente, es decir O.O Cm, O.O Cm,
0.2 Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm, 1.0 Cm, O.O Cm y O.O Cm. Si la contaminacin fuese de
grandes proporciones, podra resultar necesario analizar tres blancos sucesivos cada vez que se

La mayor contaminacin cruzada puede ocurrir cuando las muestras contienen componentes absorbidos
en las superficies internas de los sistemas de los autoanalizadores. Por ello, debe prestarse especial
atencin a los posibles efectos debidos a la contaminacin cruzada. Por ejemplo, cuando se analizan
afluentes que contienen aceites y grasas, la magnitud de la contaminacin cruzada puede evaluarse
mediante el anlisis de tres porciones de un estndar 0.9 Cm, tres porciones de un estndar O. 1 Cm y
tres porciones adicionales del estndar de 0.9 Cm.

- 36 analice una solucin de concentracin alta; la respuesta del primer blanco se usa para evaluar
los resultados del tercer blanco de cada grupo de tres.
d)

Otros tipos de contaminacin cruzada

Si la contaminacin cruzada es de importancia, pero su naturaleza es diferente a la de

(b) y (c), se requiere de otro orden de anlisis, seleccionado de acuerdo con la experiencia local.
4.2.2.5 Controles regulares de calibracin durante cada perodo
Lo ideal sera que la curva de calibracin no sufra cambios de consideracin durante
un perodo completo de trabajo, por ello, vale la pena tratar de mejorar el rendimiento analtico
para lograr estabilidad2 en las mediciones. Sin embargo, esto no siempre puede lograrse, an
as, la estabilidad siempre debe confirmarse en forma experimental mediante el control peridico
de la calibracin.

a)

Contaminacin cruzada de poca importancia

En este caso, por lo menos se necesitan, dos soluciones patrn o estndar para el

control de la calibracin; un blanco para verificar el cero y una solucin patrn o estndar para
verificar la pendiente de la curva de calibracin. En forma regular y peridica se debe analizar
un patrn o estndar de 1.0 Cm y otro de O.O Cm en este orden 3 El nmero de muestras que
se debe analizar entre cada control4 se trata en la seccin 3.
b) Contaminacin cruzada actual
Se debe tratar en lo posible que las muestras que se analizan en cada lote tengan una
concentracin bastante similar; aunque, obviamente, dicha concentracin puede variar de un lote
a otro. Cuando se adopta este mtodo, por lo general resulta conveniente que se realicen
algunos cambios en los procedimientos de (a).

i.

La concentracin del patrn o estndar de control debe ser similar a la de las muestras
de su lote. Por ello, puede necesitarse soluciones patrn de control con diferente
concentracin, de acuerdo al lote de muestras a analizar; o sea, las concentraciones de
las soluciones patrn de control pueden variar de un grupo a otro.

Los fabricantes de Autoanalizadores Technicon exigen que la desviacin de lo1 1i1temu AAll no sea mayor al 2~
por hora; en caso de que la desviacin fuera mayor, la compaa Technicon debe recomendar medidas al respecto.
3

Por lo general, se espera que el estndar de 1 .O Cm, que es el de mayor sensibilidad, permita detectar
los cambios en la pendiente de la curva de calibracin .
De aqu en adelante, usaremos el trmino grupo o lote para referirnos a los anlisis que se realicen entre
los controles de calibracin sucesivos.

- 37 -

1.

ESTA8ILiliCI<li PRELIMINAR
(5occ1dn 2.1.1)

An41 lsls d9 la aolucldn da lavado

axitlr1.m huta ...-

t 111: rmd==nta

atlble.

AJUSTlt INICIAL DE LAS RESIUSTAS PARA LDS ESTAhOAOES

2.

t.IC..yl.IC.
(5ec:cl6n 2.1.3)

"''

uyor ccnc91"1tracldn dal r-v:> ser cal lbrado

SI la re~ta a t.ble a travH

dial .-11sls de 1 .,..tras

.,.......
---

1"9Spuata

_,.....,.
---

1.1

con>

Co

escala

... Co

c.

... Co

total

3.

r.-punta
ligera

> e""'

do
~
la ucala

ANALISIS DE LDS ESTAllJARES DE

CALillRACION

(S.Ccl&a 2.1.4)

FIGURA 2
PROCEDIMIENTOS PARA LA CALIBRACION DE LOS SISTEMAS AA11

- 38 -

'
(a)

r.onstante
ccntinecidn
cruz-

(b) 1

C.OOt lnac ldn

ln8dvertlbl
(1)

c.

(i)

9.&

0.8

(y

Ci) 1.1 C

9.1 C.

c.

Cv 1.6 C
Cvl> G,8 C.
(vlil)
Cix> e.e C.

e. c.

(vi i i) 1.11 C
Clx) 1.8 C.

,..,t. de <>1 (b)

o Ce) = r
otras
de
an6ll1l1 da acuerdo
a I experi.-.cia

e.2 c.

Ctv~ e.4

c.

otros tipos de
contlnacl6n
cruz-

SI hay c:ontMlnacl(n cruz.ta dlfe-

(TI~ 1.11 C.

011

Cvl l e.e c.
{vil) 1.8 C.

CvT> 1.9Ca
(vil)

c.

Clil} 9.4 C
( lv~ 0,2 C.

Cd)

cruzada por
.tsorcl6n

Oll e.e c.

m 0.2 c.

( li) t.4 Ca
elv> 1.6 c.
(V)

(c) Contamlnacl6n

local.

CtEQ..W REGULAR DE LA CALIBRACION

DURANTE CADA CDliIDA
CS.ix:in 2.1.5)

Si hay contlnKidn
cruzada inadvertible

(f}

Ccm:>

1.8
~ra

Cii)

'"Ca

Cl.llndo

poslbl, con cada lot

las -..estrn deben r de c:on-

general, I pn.Jllb

centrac i 6n sli1ar

de cal ibr-.cidn dupu dti lotas

dos porcio-

nes de la prlHra -...tra deben

de 15 .WI Isla Caiestru y pru.r

ser .anal Izadas en al lote,

ba de control de sal ida) se

cW:ien ru I 1zar

(1)
(ii)

(111)

1.1 Cb

c.
.c.

-Cb: ooncentracln de las - . -

tras .,,, el lote,

5.

CtEWED DE LA CALIBRACICll FINAL

CS.c:cl6n 2.1.6)

....

Anal izar nuw...,,t I Jusgo comple-

to de estlndares de callbr..:ldn cc.:i

- 39 -

ii.

Se debe analizar sucesivamente dos porciones del blanco en forma conjunta con el
patrn de verificacin, ya que la primera puede proporcionar una lectura ms elevada
de lo normal.

iii.

As mismo, es necesario analizar dos porciones sucesivas de la primera muestra del

lote, ya que la primera puede dar resultados errneos.

En este mtodo debe tomarse en cuenta ms factores que permitan observar e indicar
que la contaminacin cruz.ada no tiene mayor importancia.
4.2.2.6 Control final de la calibracin
Si no existe la seguridad de que la curva de calibracin siga siendo lineal durante todo
el perodo, entonces debe volverse a analizar todo el conjunto de soluciones estndares iniciales
de calibracin. Sin embargo, siempre que la curva de calibracin se prepare al inicio y se
verifique durante un perodo, ser suficiente realizar el anlisis de las dos soluciones patrn que
se especifican en la seccin 2.1.5, para conCluir este perodo.
4.2.3

Anlisis de las muestras

4.2.3. l Nmero de anlisis que deben realizarse entre cada control de calibracin
El nmero de anlisis que se realice entre cada control de calibracin depende tanto de
la estabilidad de la calibracin, como de la precisin que se requiera. En general, es
conveniente realizar 15 anlisis entre cada control de calibracin, nmero que puede ser variado
de acuerdo a la experiencia. Dentro de estos 15 anlisis se anali7.arn conjuntamente muestras
y soluciones patrones o estndares de control (vase la seccin 5).
4.2.3.2 Orden del anlisis de las muestras
Cuando la contaminacin cruz.ada en muestras sucesivas carece de importancia, el orden
en que se las analiza tampoco tendr importancia. Por lo tanto, el orden lo determinar la
estabilidad de las muestras.
Si la contaminacin cruzada es importante, los errores que surjan de esta fuente deben
controlarse mediante el anlisis de muestras, de acuerdo a un orden predeterminado que permita
minimizar los errores de concentracin de las muestras sucesivas y los patrones o estndares de
control. (Vase tambin la seccin 2.1.5 (b)).

- 40 4.2.4

Evaluacin
Sistemas AAII

4.2.4.1 Preparacin de la curva de calibracin

Si la calibracin es estable durante una corrida, los valores de la concentracin podrn
leerse directamente de los registros o de la impresora. En este caso no se requerir de una
curva de calibracin. Algunas veces es conveniente usar este mtodo; sin embargo, se prefiere
el que se describe en el siguiente prrafo.
Si la curva de calibracin vaa durante un perodo, se sugiere emplear el siguiente
procedimiento. Se trax.a una lnea para unir las respuestas de:
(i)
(ii)

el primer blanco, exactamente antes del primer patrn de calibracin y

el ltimo blanco de la serie inicial de patrones de calibracin (seccin 2.1.4).

Las alturas mximas de todos esos patrones o estndares, se miden a partir de la lnea
base y se grafican contra las concentraciones conocidas. La mejor lnea recta que se obtenga
de la unin de los puntos, constituye la curva de calibracin. Si se sigue el procedimiento que
se deline en la seccin 2.1.4 (b), el penltimo blanco debe registrarse como un punto y la curva
de calibracin se trax.a a partir del origen.

Cuando los resultados se obtienen con una impresora, las lecturas de los dos blancos,
(i) e (ii), de la serie inicial de calibracin, deben examinarse con el fin de determinar si es
necesario hacer alguna correccin a la desviacin de la lnea base. Si fuera necesario, las
lecturas de la impresora o del cuadro de registros se usan como respuestas analticas y se
c0rrigen sobre la base que se estableci en el prrafo anterior.
4.2.4.2 Verificacin de la curva de calibracin
Con el fin de definir las respuestas de las determinaciones sucesivas a partir del blanco5
a travs de cada corrida, se trax.a una lnea apropiada en el registro y a partir de sta se miden
las alturas mximas de las muestras y patrones o estndares de verificacin.
Las concentraciones que corresponden a las alturas mximas de los patrones o
estndares de verificacin deben obtenerse a partir de la curva de calibracin. En caso de que
las concentraciones se encuentren cerca del valor real, podr emplearse la calibracin inicial para
todas las muestras durante la corrida. Si las concentraciones que se obtienen para los patrones
o estndares de concentracin difieren sistemticamente del valor real por un gran margen, las

Si se usa el procedimiento delineado en la seccin 2.1.5 (b), esta lfnea se debe trazar a partir de las
respuestas del segundo blanco de cada par.

- 41 respuestas que se obtuvieron para los patrones de verificacin deben emplearse en la elaboracin
de una serie de curvas de calibracin.
Cuando los resultados de cada lote de muestras controladas con un patrn de
verificacin no varan en forma apreciable, se puede usar otra curva de calibracin. Cada una
de estas curvas de calibracin, se obtiene por medio de la altura mxima del patrn de
verificacin corregido por el blanco graficado contra la concentracin de los patrones y
dibujando una lnea entre el punto del patrn y el origen. Otra vez si se usa impresora y se ve
la necesidad de crear una serie de curvas de calibracin, stas deben efectuarse, teniendo en
cuenta el proceso anterior.
4.2.4.3 Obtencin de resultados analticos de las muestras
Cada medida de la muestra, corregida por la altura mxima del blanco, se convierte en
concentracin al usar la curva de calibracin apropiada (vase la seccin 4.2.2.5 (b), punto (iii)).
4.2.5

Control de calidad analtica

Para estimar la precisin de los resultados analticos se realizan pruebas experimentales.

Estas se discuten en detalle en (1) y (2). Las pruebas requeridas se eligen teniendo en cuenta
su aplicacin particular; sin embargo, la siguiente informacin puede resultar de utilidad.
Las soluciones patrn o estndar pueden emplearse para verificar la precisin y algunas
fuentes de errores sistemticos. Si la calibracin inicial para analizar muestras se usa durante
una corrida, la solucin patrn o estndar de verificacin (seccin 2.1.5) acta como un estndar
de control 1 Por el contrario, si ese patrn o estndar de verificacin se usa para definir curvas
de calibracin (seccin 4.1.2) es necesario emplear otro patrn o estndar para el control de
calidad. La concentracin que constituye el estndar de control, puede ser igual o diferente del
estndar de verificacin, segn se requiera. En documentos como el Technical Memorndum
TM 56 (2), se discute sobre la seleccin apropiada de la concentracin del patrn. Si adems
del patrn o estndar de verificacin, se analiza un patrn o estndar de control, ste debe ser
el ltimo que se realice antes que se midan los estndares de verificacin con cada lote de
anlisis (seccin 2.1.5). Los resultados requeridos para el control estndar, deben evaluarse a
partir de la curva de calibracin que se emplea para las muestras del mismo lote.
Asimismo, una muestra por lote se analiza por duplicado. Un esquema simple puede
ser el analizar una segunda porcin de la primera muestra de cada lote. Este anlisis se realiza
antes del de los patrones o estndares de control y si stas no se analizan, se efecta antes de
los patrones o estndares de verificacin.

El trmino estandar de control" se refiere a una solucin estandar que se analiza y evala como
muestra. El resultado de este an.illisis, se emplea en el control de calidad analltica.

- 42 -

Mientras mayor sea la experiencia con respecto a la precisin de los resultados, la

confiabilidad de los sistemas analticos aumenta, pudindose reducir pasos dentro del control de
calidad analtica. Por ejemplo, tanto las mediciones del estndar de control, como el de la
muestra duplicada, pueden aplicarse en lotes alternos y no en cada lote.
La calibracin del autoanalizador se efecta con cada grupo de anlisis. Al prepararse
(como usualmente se hace) patrones o estndares de control a partir de la misma solucin
estndar que se usa para preparar los patrones o estndares de calibracin, los resultados de los
patrones de control no revelarn errores sistemticos causados, por ejemplo, por el empleo de
soluciones patrones o estndar incorrectas o soluciones (reactivos) deterioradas. Sin embargo,
se recomienda mantener el control de la calibracin y operacin de los instrumentos ms
sensibles. Cambios repentinos o pequeas desviaciones ameritan una revisin de los patrones
o estndares y de los reactivos.

- 43 F.JEMPLOS DE AUTOANALIZAOOR CON UN SOPORTE DE MUESTRAS

1.

Sistemas AAII

Con el fin de ilustrar los diferentes aspectos vertidos en las secciones 2, 3 y 5, se

muestra algunos ejemplos sobre el orden en que deben analizarse las soluciones
2.

Contaminacin cruz.ada de poca importancia

CALIBRACIN ESTABLE

Prueba No.
l
2-6
7
8-20
21
22
23
24-37
38
39
40
41

Solucin
Blanco
Patrones de calibracin
Blanco
Muestras 1-13
Muestra 1
Patrones de control
Blanco
Muestras 14-26
Muestra 14
Patrones de control
Blanco
Ciclos repetidos 8-23

CALIBRACIN INESTABLE
Prueba No.
1
2-6
7
8-20
21
22
23
24
25-37
38
39
40
41

Solucin
Blanco
Patrones de calibracin
Blanco
Muestras 1-13
Muestra 1
Patrones de control
Patrones de calibracin
Blanco
Muestras 14-26
Muestra 14
Patrones de control
Patrones de calibracin
Ciclos repetidos 7-23

- 44 -

3.

Contaminacin cruzada presente

CALIBRACIN ESTABLE
Prueba No.

1
2
3-8
9
10

11-23
24
25
26
27
28-40
41
42
43

CALIBRACIN INESTABLE

Solucin
Blanco
Blanco
Patrones de calibracin
Blanco
Blanco
Muestras 1-13
Muestra 1
Patrones de control
Blanco
Blanco
Muestras 14-26
Muestra 14
Patrones de control
Ciclos repetidos 9-25

Prueba No.
1
2
3-8
9
10

11-23
24
25
26
27
28
29-41
42
43
44
45

Solucin
Blanco
Blanco
Patrones de calibracin
Blanco
Blanco
Muestras 1-13
Muestra 1
Patrones de control
Patrones de calibracin
Blanco
Blanco
Muestras 14-26
Muestra 14
Patrones de control
Patrones de calibracin
Ciclos repetidos 9-26

Vase la seccin 4.2.2.4 donde se establece el orden de los anlisis de los patrones o
estndares de calibracin.

4.3

Procedimientos de calibracin y de control de calidad mediante la espectrofotometra de absorcin atmica

En general, la espectrofotometra de absorcin atmica se encuentra libre de muchos

de los errores comunes a otros anlisis qumicos. En lo que respecta al anlisis de metales, la
tcnica es bastante especfica y sus mediciones pueden ser muy precisas y estar relativamente
libre de errores sistemticos. Sin embargo, existen ciertas fuentes de error que si se presta
atencin al proceso de calibracin y los procedimientos de control de calidad pueden ser
identificados, corregidos y controlados.
Antes de establecer los procedimientos de calibracin y de control de calidad, es
necesario discutir brevemente sobre algunas definiciones y principios bsicos.
En primer lugar, en este documento se define al mtodo analtico como "El grupo de
instrucciones escritas que definen completamente al procedimiento que debe adoptar el analista,
con el fin de obtener el resultado analtico que requiere". Bajo esta definicin, el mtodo

- 45 analtico debe ser especfico y, si se quiere obtener buenos resultados, el analista debe ceirse
a las instrucciones para desarrollar la medicin.
Dado que el mtodo est formado por un "grupo de instrucciones escritas, no es
posible decir, que el mtodo es preciso. Mas bien debe decirse que los resultados analticos
tuvieron una precisin de". Diversos laboratorios usan el mismo mtodo, sin embargo, el que
obtengan los mismos resultados, tanto para la precisin como para el error sistemtico depende
de cmo se hayan realizado los anlisis. Esta afirmacin no excluye que el mtodo pueda tener
tendencia inherente a obtener resultados imprecisos o errores sistemticos. Sin embargo, el
grado de error sistemtico, as como los valores especficos depende del desempeo de cada
laboratorio.
El requerimiento de que todos los blancos, patrones o estndares y muestras se analicen
exactamente por el mismo procedimiento, tiene estrecha relacin con la definicin antes mencionada, puesto que permite reducir el error sistemtico asociado a la calibracin o blanco. Si los
procedimientos que se usan para analizar los blancos, patrones o estndares y muestras difieren
en algn punto, el analista deber determinar experimentalmente si esta diferencia origina errores
sistemticos aceptables.
En el anexo se trata el tema de estimacin del "lmite de deteccin de forma
independiente. En los anlisis de trazas, generalmente se prefiere "corregir el blanco" de los
resultados analticos de las muestras (p.e. resultado = resultado de la muestra menos el resultado
del blanco). En el procedimiento de calibracin que se sigue en el CEPIS/LAB primero se
coloca la aguja del instrumento en cero con el blanco (p.e. blanco del reactivo), de esta manera,
la correccin por el blanco se convierte en una parte inherente del mtodo analtico. Por otro
lado, para que el procedimiento de correccin del blanco sea adecuado, es necesario que se
corrija el blanco de cada una de las muestras. Si se usa el procedimiento de calibracin que se
propone, el instrumento debe colocarse en cero con el blanco cada vez que se requiera medir
niveles bajos de trazas de metales. Si el resultado de la muestra es mayor que el blanco, no se
necesitar realizar ninguna correccin ni repetir el anlisis.
En las secciones siguientes slo se discutir los procedimientos de calibracin que deben
seguirse al analizar un grupo de muestras (4 ms). Cuando se analicen pocas muestras, podr
usarse cualquiera de los mtodos que se describen en el captulo sobre "Recoleccin y Manejo
de Datos".

Una vez que los principios han sido mencionados y comprendidos se proceder a
discutir los procedimientos de calibracin y de control de calidad especficos.

- 46 En un laboratorio se utilizan diversos mtodos de anlisis, sin embargo, para los

propsitos de este estudio, los mtodos pueden clasificarse en tres grupos:

(1)

Metales disueltos en agua

- Filtracin a travs de un filtro membrana de

0.45 u. e inyeccin acuosa directa.

(2)

Cantidad total de metales

en el agua

- Digestin, seguida de inyeccin acuosa.

(3)

Cantidad total de metales

en suelos, sedimentos o lodos

- Digestin vigorosa, seguida de inyeccin

acuosa.

F.n ciertos casos se usa otros mtodos de anlisis (p.e. extraccin por solvente}; al
respecto, debe consultarse al Coordinador de Garanta de Calidad en qu condiciones es til
aplicar estos procedimientos, as como todo lo relacionado con los procedimientos de calibracin
y control de calidad.
F.n el primer caso, se suele preservar las muestras de agua con HNO, (3 mi por litro) 1:1
redestilado o de calidad ultrapuro para anlisis de trazas. En consecuencia, todos los blancos
y los patrones o estndares deben prepararse con una cantidad similar de HN03 ; y seguir las
instrucciones para la calibracin. Esto se hace con el fin de no confundir conceptos sobre la
calibracin y el control de calidad que se est tratando. Esta eleccin es arbitraria puesto que,
si se desea, los datos de la determinacin de los lmites de deteccin en diversos grupos pueden
acumularse, conjuntamente con los de la calibracin.

El procedimiento de calibracin es como sigue:

(1)

(2)
(3)

(4)
(S}

(6)

Se coloca la aguja del instrumento en "cero" con el blanco adecuado al anlisis

(p.e. blanco con HN03 agua bidestilada o solvente).
Se calibra con un mnimo de cuatro patrones o estndares.
Se analiu muestras (hasta nueve).
Se analiu el patrn o estndar de verificacin de concentracin equivalente a O. 9
Cm, donde Cm es el lmite superior de la concentracin que mide el mtodo
analtico.
Si es posible, se analiu un segundo estndar de verificacin que equivale a 0.2
Cm.
Se repite los pasos (3 al S} hasta terminar de analiur las muestras.

F.n este primer caso, que podra usarse para el anlisis de aguas de consumo, u otro tipo

de aguas limpias, no habra diferencia entre el anlisis de patrones o estndares de calibracin

y los de verificacin.

- 47 Los resultados de los anlisis de patrones o estndares de verificacin se registran en los

formularios que tiene el laboratorio para tal fin. Una vez anali:nido un buen nmero de patrones
o estndares de verificacin (p.e. 20 o ms), se puede preparar las cartas de control, y los
subsiguientes patrones o estndares de verificacin pueden usarse como estndares de control.
Para el segundo tipo de anlisis (p.e. presencia total de metales en el agua) se requiere
de digestin. Si, tanto los blancos como los patrones o estndares y las muestras se analizan
siguiendo exactamente el mismo procedimiento, la calibracin ser idntica a la que se emple
en el caso l. Sin embargo, con frecuencia, se preparan patrones o estndares de calibracin
directamente con HN03 diluido, mientras que las muestras se digieren antes del anlisis. Al
seguir este procedimiento, tambin se debe analiz.ar un patrn o estndar de verificacin que
haya pasado por el proceso de digestin (p.e. analiz.ar un patrn o estndar de verificacin por
medio del mismo procedimiento que se us para la muestra). El patrn o estndar de
verificacin provee de informacin sobre la precisin, pero, adems, indica si en la calibracin
hay algn error sistemtico. Del mismo modo que el patrn o estndar de verificacin, el
blanco debe pasar por todo el procedimiento, incluyendo la digestin, con el fin de proveer una
base para la correccin del blanco. Se debe enfati7.111' que esto slo es necesario cuando la
calibracin de patrones o estndares se realiz:a de manera distinta a las muestras. En suma, se
tiene dos posibles procedimientos de calibracin para el segundo tipo de anlisis:
(a) Cuando los blancos, estndares y muestras se procesan en forma idntica, tanto la
calibracin como el control de calidad se efectan de la misma forma que en el caso l.
(b) Cuando los estndares de calibracin se analiz:an en forma diferente que las muestras:

(1)

Se coloca la aguja del instrumento en "cero" con el blanco con HN03

(2)

Se calibra directamente con los estndares preparados con HN03

(3)

Se analiz:a las muestras (hasta 9).

(4)

Se analiz:a el patrn o estndar de calibracin de la concentracin que equivale a

0.9 Cm, utilizando un patrn o estndar de verificacin durante todo el procedimiento (p.e. incluye la digestin).

(5)

Si es posible se analiz:a un segundo patrn o estndar de verificacin de una

concentracin que equivale a 0.2 Cm, usando el procedimiento descrito en (4).

(6)

Se analiz:a el blanco (p.e. usar el blanco durante todo el procedimiento), requerido

para hacer la "correccin por el blanco" de los resultados de las muestras.
Asimismo, se acostumbra determinar el lmite de deteccin a partir de la variabilidad del blanco; por ello en cada grupo se analiz:a un segundo blanco.

- 48 Finalmente, el principio bsico que consiste en anali7.ar de la misma forma blancos,

patrones o estndares y muestras no es posible en el anlisis de suelos, sedimentos y lodos. No
hay forma de preparar un blanco o un patrn o estndar de suelo, ya que es imposible tener la
seguridad de que el metal de inters est ausente de la muestra del suelo que se usar para
preparar el blanco y el patrn o estndar. Incluso, la mayora de los suelos, contienen trazas
de casi todos los metales de inters.
Debido a la complejidad de las matrices de los suelos, es muy frecuente encontrar
interferencias qumicas, adems de la presencia de metales. Por ello, usamos el mtodo de
calibracin de adicin de un patrn o estndar, con el fin de reducir el error por las interferencias. Fn este mtodo se realiza una calibracin preliminar con patrones o estndares diluidos
con HN03 Luego, se anali7.a la muestra y se registra la absorbancia resultante. Se separa
alcuotas de la muestra y se efecttlan adiciones del analito de inters. Estas adiciones
corresponden al 50, 100 o 150% de la cantidad de analito que se supone contiene la muestra,
las soluciones se anali7.an y se registran las correspondientes absorbancias. Posteriormente, se
traza una lnea entre las absorbancias y las concentraciones, como se indica en la Figura 1, en
la cual puede leerse la concentracin de la muestra.
Este procedimiento puede corregir algunos errores sistemticos causados por las
interferencias; sin embargo, no puede corregir todas las fuentes de errores sistemticos. Para
corregir el error por el blanco, se hace por medio del anlisis de blancos, de acuerdo al mtodo
establecido (p.e. uno debe pasar por el procedimiento de digestin). Fn conclusin, se usa el
siguiente procedimiento para el anlisis de suelos, sedimentos y lodos.

- 49 -

Cero
Absorbonce
Conc

Absorbancia

cero
Conc. de la
muestra

Adicin O
No adicin

Addn 1
Addn del SO 9l

Addn2
Addn del 100 91

a la cantidad supuesta

a la cantidad
supuesta

Addn3
Addn del 1S091
a la cantidad
supuesta

Figura 4
CURVA DE CALIBRACIN DE ADICIONES ESTNDAR

- 50 (1)
(2)
(3)
(4)

(5)

(6)

Se coloca "cero" con el blanco de HN03 diluido.

Se calibra directamente con los estndares preparados con HNO, (es suficiente
con una calibracin aproximada que usa un patrn o estndar simple).
Se anali:z.a la muestra (determinar la absorbancia de la muestra).
Se hace tres adiciones estndar sobre la base de la estimacin preliminar de la
curva de calibracin y se anali:z.an como sigue:
(a) adicin del 50% a la cantidad supuesta.
(b) adicin del 100 % a la cantidad supuesta.
(c) adicin del 150% a la cantidad supuesta.
Se elabora un diagrama que contiene cuatro valores de absorbancia obtenidos
experimentalmente, como se indica en la f"igura 3 y se hace una inferencia con
el fin de determinar la concentracin de la muestra 1.
Se repite los pasos del (3 al 5) con todas las muestras que se van a anali:z.ar.

A pesar de que el procedimiento mencionado se usa para anali:z.ar muestras del suelo1,
sedimento o lodo, tambin se usa en el anlisis de muestras acuosas con matrices complejas.
Para determinar la recuperacin se usa un estndar de adicin simple. Tomando como base esta
recuperacin se decide si es necesario reali:z.ar el procedimiento completo de adicin estndar.
Para mayores detalles, vea la seccin correspondiente al tema en el Manual de Mtodos de la
EPA.
Cuando se sigue el procedimiento de adiciones patrn o estndar, no siempre se necesita
llevar a cabo el anlisis de los patrones o estndares de verificacin, puesto que los estndares
estn incorporados dentro del procedimiento mismo. Sin embargo, es esencial que la preparacin de las soluciones patrn o estndar sea exacta, con el fin de evitar errores sistemticos
dentro del procedimiento analtico. Por ello, se pone extremo cuidado en la preparacin de las
soluciones patrones o estndares y cuando se hacen las adiciones (exactas) a las muestras.
En discusiones precedentes, se ha puesto nfasis en el uso de soluciones patrones o
estndares para verificacin y control de la precisin de los anlisis. El uso de soluciones
estndar tambin puede indicar la presencia de errores sistemticos en el procedimiento de
calibracin. Asimismo, los anlisis de los blancos constituyen un medio para evaluar, detectar
y corregir una posible contaminacin de los reactivos, y para estimar el lmite de deteccin.
De otro lado, se puede usar otros procedimientos de control de calidad para ciertos tipos
de muestras, como las pruebas de control de precisin y de recuperacin, de acuerdo a los
objetivos del programa de medicin.

La precisin de los anlisis de las muestras se evalan mediante el anlisis regular de dos
porciones de una muestra real y la grfica de la diferencia de resultados: de la primera y de la

La palabra "suelo" se emplea aqul y en el resto de la discusin para denominar al sedimento, lodo y suelo.

- 51 -

segunda porcin, tornando como valor medio cero. El desvo patrn que se usa para fijar, tanto
los lmites de advertencia como los de rechaw en la carta de control es dos veces mayor a la
desviacin estndar dentro de cada lote de resultados individuales sujetos a la misma desviacin
patrn que est siendo graficada. Este tipo de control est limitado a muestras cuyas
concentraciones tienen desviaciones patrn similares. Si se dan muchos rangos de concentracin
o rangos de desviacin estndar, se elaboran cartas de control en cada caso.
Las pruebas de control de recuperacin de las muestras se realizan con el fin de evaluar
errores sistemticos que tienen su origen en las impurez.as de las muestras. Las recuperaciones
que se observan estn graficadas en una carta de control, que tiene como valor central la
recuperacin terica. Si los resultados de la muestra y la muestra enriquecida constituyen
respectivamente R1 y R2 el resultado de la recuperacin A es:

SA

= sRJ.2

+ sRi2

Si Sa depende de la concentracin del analito y las concentraciones de las muestras varan

apreciablemente, ningn valor de SA se aplicar a los resultados de las pruebas de recuperacin.
Por ello, este tipo de control se aplica ms a muestras cuyas concentraciones no tienen mucha
variacin. La cantidad del analito que se agrega a la porcin "enriquecida" de la muestra es la
misma.
:En el captulo sobre errores analticos del Manual de Anlisis de la Contaminacin del
agua se presenta una discusin detallada sobre las cartas de control con ejemplos experimentales.
Si se requiere de ayuda adicional en la preparacin de las cartas de control, se debe consultar
al Coordinador de Garanta de Calidad .

En vez de preparar un diagrama de los datos como se indica en la figura 3, se puede elaborar una
inferencia matemtica. Para ello se usa una calculadora manual con capacidad de determinar una
ecuacin de regresin lineal. En este caso, se ingresa los datos junto con la concentracin en el eje de
las y y la absorbancia en el eje de las x. Posteriormente, se calcula la interseccin de la y de la
ecuacin de regresin lineal y su valor absoluto se toma como co"espondiente a la concentracin de la
muestra.

- 52 ANEXOS

MITE DE DETECCIN
La teora sobre los lmites de deteccin detalla, en el Informe Tcnio N 66 del Water
Research Centre, pp. 44-49. Aqu slo se discute la aplicacin de esta teora en la espectrofotometra de absorcin atmica y se pone nfasis en las mediciones y en el mtodo de clculo.

El fundamento para establecer el lmite de deteccin es la variabilidad de la medicin del

blanco. Con el fin de realizar este clculo, la variabilidad se mide como la desviacin estndar
dentro de un lote. Generalmente, una mejor estimacin se obtiene por medio de la combinacin
de las desviaciones estndar que se obtuvieron a partir de las mediciones del blanco por
duplicado de varios lotes. Para obtener una estimacin preliminar del lmite de deteccin, se
mide la variabilidad del blanco dentro de un mismo lote. Ambos procedimientos se discuten en
este documento. El analista debe elegir cul es el procedimiento ms apropiado y conveniente
para el laboratorio.
Antes de proceder a medir el blanco, el analista debe calibrar el instrumento. Esto es
necesario si se necesita convertir los valores de respuesta del blanco a unidades de concentracin
(claro est que para el registro directo de la concentracin, la respuesta luego de la calibracin
se da en unidades de concentracin).
El analista decide el procedimiento de calibracin que usar. El criterio primario que
debe considerar es la capacidad para hacer el anlisis de suficientes soluciones patrones o
estndares, de tal forma que la variabilidad de la respuesta de los patrones o estndares no afecte
la exactitud del clculo del lmite de deteccin.
Si el lmite de deteccin se estima a partir de mediciones del blanco medidos dentro de
un mismo lote, se prefiere calibrar por medio de mediciones repetitivas (cuatro o ms) de una
misma solucin patrn o estndar, cuya concentracin es aproximadamente 20 veces el valor del
lmite de deteccin probable. Luego, el resultado promedio de estas mediciones repetitivas se
emplea para calibrar la respuesta del blanco. El que se utilice para calibrar un estndar de una
concentracin 20 veces el valor del lmite de deteccin probable, se debe a que a menores
concentraciones el error aleatorio de las mediciones poda generar errores inaceptables en la
calibracin.
Si el lmite de deteccin se estima a partir de determinaciones del blanco (tomados por
duplicados) en varios lotes de anlisis, la calibracin se debe realii:ar de manera normal (p.e.
medicin de por lo menos cuatro soluciones patrones o estndares, con el fin de determinar el
factor de calibracin).
Para calibrar, se coloca el instrumento en cero, de acuerdo con el procedimiento descrito
en la parte principal de este captulo. Para ello se emplea un blanco (de reactivos). En algunos

- 53 casos es ms conveniente usar agua destilada en vez del blanco. Esta eleccin no debe afectar
el resultado final, porque lo que interesa es la variabilidad del blanco y no los valores absolutos.
La estimacin del lmite de deteccin, a partir de la variabilidad del blanco dentro de un
mismo lote, se debe realizar con once mediciones por lo menos (diez grados de libertad). El
clculo de la desviacin estndar dentro del lote es como sigue:

sda

L,x~ - <L,xifn
='----==-..;.._n-1

donde:
X;

= valores para las respuestas del blanco individuales

nmero de los resultados

Para estimar el lmite de deteccin de varios lotes a partir de determinaciones del blanco
por duplicado, se calcula la desviacin estndar dentro del lote de la siguiente manera:

s,. --~di2
2m
donde:
di
m

diferencia entre las determinaciones del blanco dentro de un mismo lote

nmero de determinaciones del blanco medido por duplicado

Para mayores detalles sobre el uso de esta frmula para el clculo de desviacin estndar,
vase el anexo 4 del captulo "Procedimientos de Calibracin. -Visible".
Finalmente, el lmite de deteccin tambin puede calcularse por medio de la combinacin
de estimaciones de la desviacin estndar procedentes de lotes que contienen distinto nmero de
determinaciones del blanco.
En este caso, las desviaciones estndar se calculan para los lotes individuales y se aplica
la ecuacin (1) ya mostrada. Luego, estos valores individuales se combinan por medio de la
siguiente ecuacin:

(3)

- 54 donde:
v;

Nmero de los grados de libertad de las soluciones individuales usadas

para estimar S;. La estimacin de S, tiene V; grados de libertad.
Por ejemplo, si se dan las siguientes mediciones del blanco en dos lotes:
Lote 1: 0.29, 0.04, 0.13, 0.22, gil
Lote 2: 0.35, 0.14, 0.03, 0.26, 0.08, 0.02, 0.17, 0.31, 0.07 gil

La estimacin de las desviaciones estndar para cada grupo es como sigue:

S1 = 0.1086 y S2 = 0.1225

Las desviaciones del estndar del blanco combinadas dentro del mismo lote, se calculan
de la siguiente forma:
2

3.(0.1086) + 8(0.1225)
11

= 0.1189

Despus de calcular la desviacin estndar del blanco, el lmite de deteccin se calcula

por medio de la siguiente frmula:

= 2.83

t0.1 S46

donde:
LD

to.1

sdB

=
=
=

lmite de deteccin
coeficiente de la "t" de student al 10% para pruebas bilaterales con 11 g.l.
desviacin estndar del blanco dentro de un lote.

De los datos del ejemplo, se puede calcular el lmite de deteccin:

LD

= 2.83 (1.795) (0.1189)

6 LD 0.6 g/l

Ntese que los grados de libertad, en todos los casos, son iguales a la suma de los grados
de libertad de cada lote individual y que los grados de libertad para cada lote es un grado menor
que el nmero de mediciones en el lote.

- 55 ANLISIS DE MERCURIO POR ABSORCIN ATMICA

Proce<limiento cuando no
1)
2)
3)
4)

5)

se reali?.a correccin del blanco

Se corre los patrones o estndares (el blanco y cuatro patrones o estndares en el rango
analtico). Se registra los valores de porcentaje de absorcin.
Se corre las muestras desconocidas. Se registra los valores de porcentaje de absorcin.
Se convierte los valores de porcentaje de absorcin en absorbancia (A) usando la tabla.
Se tra7.a la lnea de A con relacin a la de concentracin (C) de los estndares. (Se
aplica la regresin lineal para establecer la lnea de mejor ajuste. Se puede reali7.ar esta
operacin con una minicomputadora y as se obtiene una copia del grfico).
Se lee los valores de la concentracin de las muestras desconocidas, usando los valores
de absorbancia (A).

Procedimiento cuando

se realiza correccin del blanco

(Para concentraciones bajas, es necesario reali?.ar correcciones del blanco, con el fin de
mejorar la exactitud de la medida).
1)
2)
3)
4)
5)

Se corre los patrones o estndares (el blanco reactivo y cuatro patrones o estndares en
el rango analtico). Se registra los valores de porcentaje de absorcin.
Se corre muestras desconocidas y el blanco para la correccin de la absorcin base. Se
registrar los valores del porcentaje de absorcin.
Se convierte los valores del porcentaje de absorcin en absorbancia (A) usando la tabla.
Se corrige los valores de absorbancia (A) de las muestras desconocidas, substrayendo a
las absorbancias de las muestras la absorbancia del blanco.
Se tra7.a la lnea de A con relacin a la de concentracin (C) para los patrones o estndares (se aplica la regresin lineal para establecer la lnea de mejor ajuste). Se puede
reali7.ar esta operacin en una minicomputadora, para obtener una copia del grfico.

- 56 TABLA 1 - VALORES DE ABSORBANCIA EN PORCENTAJE DE ABSORCIN

Para convertir la absorcin en porcentajes (%A) a absorbancia, buscar el porcentaje de
absorcin que ms se acerque a un dgito entero en la columna de la izquierda; lea la lnea horirontal hasta llegar a la columna que corresponde a la dcima del porcentaje deseado y lea el
valor de absorbancia. Por ejemplo, el valor de absorbancia que corresponde al 26.8% de
absorcin es 0.1355.
%A

.o

.1

.2

.3

.4

.s

.6

.7

.8

.9

o.o
1.0
2.0
3.0
4.0

s.o

.0000
.0044
.0088
.0132
.0177
.0223

.0004
.0048
.0092
.0137
.0182
.0227

.0009
.0052
.0097
.0141
.0186
.0232

.0013
.0051
.0101
.0146
.0191
.0236

.0017
.0061
.0106
.0150
.0195
.0241

.0022
.0066
.0110
.OISS
.0200
.0246

.0026
.0070
.0114
.0159
.0205
.0250

.0031
.0074
.0119
.0164
.0209
.0255

.0035
.0079
.0123
.0168
.0214
.0259

.0039
.0083
.0128
.0173
.0218
.0264

6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0

.0269
.0315
.0362
.0410
.0458
.0506

.0273
.0320
.0367
.0414
.0462
.0511

.0278
.0325
.0372
.0419
.0467
.0516

.0283
.0329
.0376
.0472
.0521

.0287
.0334
.0381
.0429
.0477
.0526

.0292
.0339
.0386
.0434
.0482
.0531

.0297
.0342
.0391
.0438
.0487
.0535

.0301
.0348
.0395
.0443
.0491
.0540

.0306
.0353
.0400
.0448
.0496
.OS4S

.o311
.0357
.0405
.0453
.OSO!

.0555
.0605
.0655
.0706
.0151
.0809

.0560
.0610

.0570
.0620
.0670
.0721
.0773
.0825

.0575
.0625
.0615
.0726
.0778
.0830

.0580
.0630
.0680
.0731
.0783
.0835

.0585
.0635
.0685
.0737
.0788
.0841

.0590
.0640
.0691
.0742
.0794
.0816

.0595
.0645
.0696
.0747
.0799
.0851

.0600

.0711
.0762
.0814

.0565
.0615
.0665
.0716
.0768
.0830

18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0

.0862
.0915
.0969
.1024
.1079
.1135

.0867
.0921
.0975
.1029
.1085
.1141

.0872
.0926
.0980
.1035
.1090
.1146

.0878
.0931
.0985
.1040
.1096
.1152

.0883
.0937
.0991
.1046
.1101
.1158

.0888
.0942
.0996
.1051
.1107
.1163

.0894
.0917
.1002
.1057
.1113
.1169

.0899
.0953
.1007
.1062
.1118
.1175

.0904
.0958
.1013
.1068
.1124
.1180

.0910
.0964
.1018
.1073
.1129
.1186

24.0
25.0
26.0
27.0
28.0
29.0

.1192
.1249
.1308
.1367
.1427
.1487

.1198
.1255
.1314
.1373
.1433
.1494

.1203
.1261
.1319
.1379
.1439
.1500

.1209
.1267
.1325
.1385
.1445
.1506

.1215
.1273
.1331
.1391
.1451
.1512

.1221
.1278
.1337
.1397
.1457
.1518

.1226
.1284
.1343
.1403
.1463
.1524

.1232
.1290
.1349
.1409
.1469
.1530

.1238
.1296
.1355
.1415
.1475
.1537

.1244
.1302
.1361
.1421
.1481
.1543

30.0
31.0
32.0
33.0
34.0
35.0

.1549
.1612
.1675
.1739

.1555
.1618
.1681
.1746
.1811
.1878

.1561
.1624
.1688
.1752
.1818
.1884

.1568
.1630
.1694
.1759
.1824
.1891

.1574
.1637
.1701
.1765
.1831
.1898

.1580
.1643
.1707
.1m
.1838
.1904

.1586
.1649
.1713
.1778
.1844
.1911

.1593
.1656
.1720
.1785
.1851
.1918

.1599
.1662
.1726
.1791
.1858
.1925

.1605
.1669
.1733
.1798
.1864
.1931

12.0
13.0
14.0
15.0
16.0
17.0

.!SOS

.1871

.0660

.0424

.osso
.0650
.0701
.0752
.0804
.0857

- 57 -

"A

.o

.1

.2

.3

.4

.5

.6

.7

.8

36.0
37.0
38.0
39.0
40.0
41.0

.1938
.2007
.2076
.2147
.2218
.2291

.1945
.2013
.2083
.2154
.2226
.2299

.1952
.2020
.2090
.2161
.2233
.2306

.1959
.2027
.2097
.2168
.2240
.2314

.1965
.2034
.2104
.2175
.2248
.2321

.1972
.2041
.2111
.2182
.2255
.2338

.1979
.2048
.2118
.2190
.2262
.2336

.1986
.2055
.2125
.2197
.2269
.2343

.1993
.2062
.2132
.2204
.2277
.2351

.2140
.2211
.2284
.2358

2.0
43.0
44.0
4S.O
46.0
47.0

.2366
.2441
.2518
.2596
.2676
.2757

.2373
.2449
.2526
.2604
.2684
.2765

.2381
.2457
.2534
.2612
.2692
.2774

.2388
.2464
.2541
.2620
.2700
.2782

.2396
.2472
.2549
.2628
.2708
.2790

.2403
.2480
.2557
.2636
.2716
.2798

.2411
.2487
.2565
.2644
.2725
.2807

.2418
.2495
.2573
.2652
.2733
.2815

.2426
.2503
.2581
.2660
.2741
.2823

.2434
.2510
.2668
.2749
.2749
.2832

48.0
49.0
SI.O
S2.0
S3.0

.2840
.2924
.3010
.3098
.3188
.3279

.2848
.2933
.3019
.3107
.3197
.3288

.2857
.2941
.3028
.3116
.3206
.3298

.2865
.2950
.3036
.3125
.32!S
.3307

.2874
.2958
.3045
.3134
.3224
.3316

.2882
.2967
.3054
.3143
.3233
.3325

.2890
.2976
.3063
.3152
.3242
.3335

.2899
.2984
.3072
.3161
.3251
.3344

.2907
.2993
.3080
.3170
.3161
.33S4

.2916
.3002
.3089
.3179
.3270
.3363

S4.0
SS.O
56.0
S7.0
SS.O
S9.0

.3372
.348
.3565
.3665
.3768
.3872

.3382
.3478
.351S
.3675
.3778
.3883

.3391
.3487
.3S8S
.3686
.3788
.3893

.3401
.3497
.3595
.3696
.3799
.3904

.3410
.3507
.3605
.3706
.3809
.3915

.3420
.3516
.3615
.3716
.3820
.3925

.3429
.3526
.3625
.3726
.3830
.3936

.3439
.3S36
.363S
.3737
.3840
.3947

.3449
.3546
.364S
.3747
.3851
.3958

.3458
.3SS6
.3655
.3151
.3862
.3969

60.0
61.0
62.0
63.0
64.0
65.0

.3979
.4089
.4202
.4318
.4437
.4SS9

.3990
.4101
.4214
.4330
.4449
.4572

.4001
.4112
.4225
.4342
.4461
.4584

.4012
.4123
.4237
.4353
.4473
.4597

.4023
.4134
.4248
.436S
.448S
.4609

.4034
.4145
.4260
.4377
.4498
.4622

.4045
.4157
42.71
.4389
.4SIO
.4634

.40S6
.4168
.4283
.4401
.4S22
.4647

.4067
.4179
.429S
.4413
.4S3S
.4660

.4078
.4191
.4306
.4425
.4S47
.4672

66.0
67.0
68.0
69.0
70.0
71.0

.4685
.481S
.4948
.S086
.S229
.S376

.4698
.4828
.4962
.5100
.5243
.S391

.4711
.4841
.4976
.5114
.5258
.5406

.4724
.4855
.4989
.Sl29
.S272
.5421

.4737
.4868
.5003
.5143
.5287
.5436

.4750
.4881
.S017
.Sl57
.5302
.S4S2

.4763
.4895
.S031
.Sl71
.5317
.5467

.4776
.4908
.5045
.5186
.S331
.S482

.4789
.4921

.5200
.5346
.5498

.4802
.4935
.S072
.5214
.5361
.5513

72.0
73.0
74.0
7S.O
76.0
77.0

.5S28
.5686
.58SO
.6021
.6198
.6383

.5S44
.5702
.S867
.6038
.6216
.6402

.5560
.5719
.5884
.60SS
.6234
.6421

.5515
.S13S
.S901
.6073
.6253
.6440

.S591
.5751
.5918
.6091
.6271
.6459

.5607
.S768
.S93S
.6108
.6289
.6478

.S622
.5784
.S952
.6126
.6498

.5638
.5800
.S969
.6144
.6326
.6517

.5654
.S817
.S986
.6162
.634S
.6536

.5670
.5834
.6003
.6130
.6364
.6556

78.0
79.0

.6576
.6778
.6990
.7212
.7447
.7696

.6596
.6799
.7011
.7235
.7471

.6615
.6819
.7033
.7258
.7496
.7747

.663S
.6840
.7055
.7282
.7520
.7773

.6655
.6861
.7077
.7305
.7545
.7799

.6676
.6882
.7100
.7328
.7570
.7825

.6696
.6904
.7122
.7352
.7595
.7852

.6716
.9625
.7144
.7375
.7620
.7878

.6737
.6946
.7167
.7399
.7645
.7905

.6757
.6968
.7190
.7423
.7670
.7932

so.o

so.o

81.0
82.0
83.0

.m1

.6308

.sosa

.9
.2000

.2069

- 58 ll\A

.o

.1

.2

.3

.4

.5

.6

.7

.8

.9

84.0

.1959
.8239
.8539
.8861
.9208
.9586

.7986
.8268
.8570
.8894
.9245
.9626

.8013
.8297
.8601
.8928
.9281
.9666

.8041
.8327
.8633
.8962
.9318
.9706

.8069
.8356
.8665
.8996
.9355
.9747

.8097
.8386
.8697
.9031
.9393
.9788

.8125
.8416
.8729
.9066
.9431
.9830

.8153
.8447
.8761
.9101
.9469
.9872

.8182
.8177
.9794
.9136
.9508
.9914

.8210
.8508
.8827
.9172
.9547
.9951

as.o

86.0
87.0
88.0
89.0

6)

Determinar por medio de los registros de la computadora o por medio de clculos, la

pendiente de la curva de calibracin.
G(Y) = 0.01599 + 0.02876 F(X)

donde 0.02876

7)

pendiente = m

Una vez que se conoce la pendiente y asumiendo que los valores corregidos del blanco
regresen a la concentracin cero, cuando la absorbancia es cero, convertir los valores
de absorbancia corregidos del blanco en concentracin, valindose de la siguiente
relacin:

e= -m
A

donde:

= concentracin en gil
m = pendiente de la curva de calibracin
A = absorbancia.

Nota:

Los valores de concentracin que se siten por debajo del lmite de deteccin en
forma experimental, deben registrarse como < LD (menor que el lmite de deteccin).

- 59 -

4.4

Calibracin en cromatografa de gases

Existen dos procedimientos bsicos que se usan para la calibracin de sistemas de

cromatografa de gases (C.O.):
a.
b.

Calibracin externa
Estandariz.acin interna

En la calibracin externa o directa se inyectan cantidades exactas de la muestra pura.

Se grafican los valores de las alturas de los picos (o reas) contra la cantidad en peso conocida
del compuesto inyectado. De esta manera, se obtiene la curva de calibracin, la cual debe ser
lineal y pasar a travs del origen.
Las curvas de calibracin de e.o. no son vlidas para perodos de tiempo largos. Sin
embargo, stas definen en forma clara el rango lineal de respuesta del detector, que corresponde
al rango de concentracin sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante de e.o.
Antes de hacer cualquier cuantificacin con un detector nuevo o totalmente renovado, se
construye las curvas de linearidad para los compuestos de inters, bajo las condiciones de
operacin prevalentes. Se realiza revisiones frecuentes que aseguran que la operacin continua
se efecta dentro de rangos de concentracin aceptables.
Cuando no se est trabajando dentro del rango lineal del detector, el procedimiento
apropiado para la cuantificacin es espaciar las inyecciones de estndar mixto durante todo un
da de trabajo, con frecuencia adecuada, para sealar las fluctuaciones de la respuesta. Se hace
referencia cuantitativa con un estndar espaciado. Para obtener mxima exactitud, se intercala
la inyeccin de la muestra desconocida con las inyecciones del estndar justo antes y despus
de la muestra.
La ecuacin aplicada en el anlisis de e.o. para calcular un pico desconocido a partir
de un pico de un estndar de concentracin conocida es la siguiente:
R

= abe
cd

donde:
a
b
c
d
R
e

=
=

=
=

nanogramos del compuesto orgnico desconocido representado por pico

estndar
altura (o rea) del pico de la muestra
altura (o rea) del pico estndar
ml (o gramos) de la muestra original
concentracin del residuo en partes por milln o billn
factor de dilucin que se obtiene de la siguiente relacin

- 60 \/Olumen final del extracto 1

l inyectados
Esla ecuacin bsica puede ser simplificada cuando se realizan anlisis repetitivos en

forma rutinaria.
las unidades que frecuentemente se usan en el CEPIS/LAB en anlisis de trazas
orgnic& son:

p.g
"g

- 1O..S gramos
== 10-9 gramos

ml = lo-3 litros
.il = 104.tros

pg
- 10-12gramos
ppm "" partes por milln = mg/l; g/g; g/ml; ng/mg o pg/.ig
ppb = partes por billn = gil; ng/g; ng/ml o pg/mg
ppt = partes por trilln = pg/g; pg/ml

En el procedimiento de estandarizacin interna, tambin conocida como calibracin

relativa o indirecta, como se conoce la relacin de pesos del componente de inters y del
estndar (ya sellalado) se prepara la mezcla y se inyecta en el cromatgrafo. La relacin de
reas de componente/estndar se grafica contra la relacin de peso del componente/estndar.
El uso de un estndar interno aadido al iniciar el ensayo puede ayudar a compensar cualquier
prdida que pueda ocurrir. Para producir resultados precisos, el estndar interno debe tener
exactamente los mismos cambios de concentracin que el analito y la misma sensitividad al
detector usado.
Una cantidad exactamente conocida del estndar interno se adiciona a una muestra
desconocida y esta mezcla se inyecta al cromatgrafo y se miden las relaciones de rea y de la
curva de calibracin y se determina la relacin entre la concentracin desconocida de la muestra
y el estndar. Como la cantidad de estndar aadido se conoce mediante un clculo simple, se
determina la cantidad del compuesto desconocido presente.

En lugar de graficar las relaciones de rea versus las relaciones de peso (o relaciones
de concentracin) puede hacerse una grfica de un factor de respuesta (RF) con relacin a la
concentracin del contaminante que ha sido medido. El factor de respuesta se define como:
FR = (As Csi) / (Asi Cs)

Este volumen es en ul para ppb y en mi para ppm

- 61 donde:
As
Asi
Csi
Cs

rea integrada o la altura de pico del compuesto estndar

= pico integrado o la altura del pico para el estndar interno

-

concentracin del estndar interno

concentracin del compuesto estndar.

Si se aade una cantidad constante conocida de estndar interno (Csi) a cada muestra
o extracto de la muestra, la concentracin del compuesto (Co) en la muestra se calcula usando
la siguiente ecuacin:
Co = (As) (Csi) / (Asi) (RF) (Yo)
donde:
Vo

El volumen (o peso) de la muestra original; los otros trminos se definieron

anteriormente

Para escoger el patrn o estndar interno se debe tener en cuenta:

a.

El pico del patrn o estndar debe encontrarse prximo al pico del compuesto a
analizar pero bien separado de ella.

b.

Se debe escoger la concentracin del estndar interno, de manera que no sea necesario
cambiar la atenuacin.

c.

Se pueden emplear dos o ms patrones internos.

d.

Se debe cubrir el rango de concentracin esperado. No se puede extrapolar los datos

de la grfica.

Si el estndar interno, es elegido de forma adecuada, esta tcnica corrige prdidas

durante la extraccin y la recoleccin, y compensa errores debido a diferencias en el volumen
de inyeccin y las variaciones no advertidas por la sensibilidad del instrumento. Una ventaja
particular del uso del mtodo de estandarizacin interna es que la cantidad inyectada no necesita
ser medida exactamente. Adems, no se necesita conocer la respuesta del detector porque
cualquier cambio en la sensibilidad no afectar la relacin de las reas. Si un estndar interno
ideal tiene propiedades fsicas y qumicas similares a aquellos compuestos que nos interesan, se
asegura una diferencia despreciable en la extraccin, derivatizacin y factores cromatogrficos
durante la preparacin de la muestra. Slo en el paso final del anlisis debe distinguirse en
forma clara el compuesto(s) de inters y el estndar interno.

- 62 4.4.1

Control de Calidad en Cromatografa de gases

Adems de una calibracin correcta en la cromatografa de gases, se requiere de

procedimientos de control de calidad para asegurar que se cumple con los requerimientos
analticos de exactitud. Normalmente se hacen tres tipos de pruebas de control:
a.
b.
c.

Pruebas de control de la precisin de estndares

Pruebas de control de la precisin en muestras por duplicado
Pruebas de control del error sistemtico con muestras adicionadas, agregando una
cantidad conocida de estndar a las muestras reales.

Debido a que el laboratorio opera bajo limitaciones de presupuesto y lmites de

tiempo, es necesario asignar prioridades a los diferentes tipos de pruebas de control. Se asigna
prioridad a las pruebas de control de la precisin con soluciones patrones o estndares. Estas
soluciones patrones o estndares se preparan independiente de los patrones o estndares de
calibracin, a fin de proporcionar una evaluacin independiente que incluya la exactitud y
estabilidad de la solucin patrn o estndar de calibracin. La siguiente prioridad es para la
elaboracin de cartas de control de la precisin basadas en el anlisis de duplicados de muestras
reales. Las pruebas de control de error sistemtico son la tercera prioridad y se basan en la
recuperacin de muestras adicionadas.
4.4.2

Pruebas de control de la precisin

La precisin de un mtodo cromatogrfico se determina por el grado de analito

recuperado en cada fase del anlisis. Para ello, se deben considerar los siguientes puntos: las
muestras colectadas deben ser representativas del agua que se ha muestreado. La tcnica de
coleccin no debe alterar la concentracin de los componentes de la muestra. Debe prevenirse
la degradacin qumica o biolgica de la muestra antes de su anlisis. Las tcnicas de limpieza
o de preparacin de un derivado del analito de la muestra deben proveer una recuperacin
completa del analito o, por lo menos reproducible.
El adicionar a la muestra cantidades conocidas del analito en varias etapas a travs del
anlisis puede ayudar a localizar en dnde ocurren las prdidas y ayudar a estimar la precisin.
4.4.2.1

Soluciones estndar

Para evaluar la precisin de los anlisis se analiza un patrn o estndar con cada lote
de muestras. Generalmente se elige un estndar de concentracin de aproximadamente 0.9 Cm,
(Cm es el lmite mximo de concentracin del mtodo, por ejemplo, el lmite mximo de la
curva de calibracin lineal). Mediante el uso de una concentracin alta se puede detectar
fcilmente cualquier cambio en la precisin. En algunos casos para evaluar la precisin se
analiza un segundo estndar que contiene una concentracin baja (aproximadamente 0.2 Cm).
Si la precisin de los anlisis a estas dos concentraciones es aceptable, se asume que la precisin
de todos los anlisis de concentraciones intermedias tambin son aceptables.

- 63 El patrn o estndar de control se debe analizar con el mismo procedimiento usado

para las muestras (incluyendo, extraccin, purificacin y determinacin cromatogrfica
apropiada). Se pone nfasis en la calibracin con un patrn o estndar preparado con un
solvente puro y, que cuando contiene al analito a medir por un procedimiento analtico completo,
es posible detectar y estimar el error sistemtico debido a la calibracin. Los errores serios
asociados a la calibracin indican la necesidad de analizar los patrones o estndares de
calibracin de manera idntica a las muestras.
Se registran los resultados de los anlisis de los patrones o estndares a medir. Para
mejores resultados en el control de calidad se realiza, por lo menos, 20 determinaciones para
el clculo de la desviacin estndar S. Estos resultados no necesitan ser obtenidos el mismo da.
Con ello se harn las cartas de control que, como ya se ha mencionado, se emplean para
controlar y evaluar mediciones repetidas. Con la desviacin estndar se construye la carta de
control con los lmites de "advertencia" dados por X 2S; y los lmites de "accin" dados por
X 3S (ver el ejemplo de la figura 5). Como los lmites de control se basan en estimados de
la desviacin estndar, sta debe actualizarse en forma peridica agrupando estimados
preliminares y recientes. Ntese que los lmites de advertencia y accin, (en este caso), estn
graficados en forma simtrica alrededor de la concentracin media esperada. Esto porque se
conoce la concentracin de la solucin. Cuando el resultado del estndar est fuera de los
lmites de "accin, los anlisis estn fuera de control, por ello deben repetirse tanto los anlisis
de todas las muestras como del estndar de control.

4.4.2.2

Duplicados de las muestras naturales

Para evaluar la precisin de los anlisis en las muestras naturales, con cada lote de
mediciones debe analizarse una muestra por duplicado. Si las concentraciones de la muestra son
constantes en todos los lotes, las cartas de control se basan en el control de la desviacin
estndar dentro del lote. Esta desviacin estndar se calcula mediante el uso de la siguiente
frmula:

donde:

s...
di
m

desviacin estndar dentro del lote

diferencia entre las mediciones efectuadas por duplicado en cada lote
nmero de lotes (para determinar los lmites de control se requiere de
un mnimo de 20 mediciones).

- 64 En las cartas de control los lmites de advertencia" se establecen por medio del
clculo X 2 v'2 s., y los lmites de "accin" por X 3 v'2 S.,.
Cuando las concentraciones del parmetro a medir varan en forma considerable de
muestra a muestra, no es suficiente una sola estimacin de la desviacin estndar dentro del lote.
En este caso, las diferencias de las muestras duplicadas slo se evalan en forma semicuantitativa y no son aplicables las cartas de control. Las determinaciones de duplicados sirven
para, detectar de manera aproximada los problemas de precisin.
4.4.2.3

Pruebas de control de error sistemtico (BIAS)

Tambin se pueden preparar las cartas de control mediante la evaluacin de la

recuperacin del analito en una muestra natural adicionada. Este tipo de control se aplica a
muestras cuyas concentraciones no cambian en forma significativa y cuando la cantidad
"adicionada" que se recupera es constante.
La recuperacin se calcula de la diferencia entre la concentracin del compuesto de
inters en la muestra adicionada y la muestra original. La desviacin estndar de la
concentracin recuperada puede obtenerse despus de haber ejecutado 10 pruebas de
recuperacin en los anlisis de rutina. Con la estimacin apropiada de la desviacin estndar,
se construye la carta de control donde la lnea media corresponde a la recuperacin terica ;
el lmite de advertencia a 2S y los lmites de accin a 3S. En algunos casos, las cartas
de recuperacin se expresan en trminos de porcentaje de recuperacin, donde la recuperacin
esperada es de 100%.
Cuando no se tiene una carta de control de recuperacin en forma preliminar se
efecta un mnimo de muestras adicionadas con matrices tpicas para establecer si el mtodo
analtico cumple con los objetivos de error sistemtico1

El procedimiento para evaluar Ja recuperacin se presenta en la pginas 107 del Informe N66 del
Water Research Centre, 1978.

,.

- 65 Lmite de rechazo (posterior)

'3

12

Lmite de rechazo (preliminar)

--- - --- - - ---------- -- --- - - - -- --- ---- -- - ------- --- -- - -- - ------ --- - - -- - -- - -- --

- -- - - --- --- -- - --- - ------ -- -- -e----- -- ----- - - -- - - -- - ---- - -- --- - -- - - - - - -- - - - - -

''

Lmite de advertencia (posterior)

Lmite de advertencia (preliminar)

o o
o

o
'Concentracin esperada

'o

09

o
L

OB

_____ -

-- -

-- --- --- --- --- -

--

- - --- ---- ---- --- ---- - - -- --- ---- ---

.._ _____ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ - - - - _ - - - - __ - - - - - - - - - - __ - - - - - - -

o1

Lmite de advertencia (preliminar)

Lmite de advertencia (posterior)
' Lmite de rechazo (preliminar)
Lmite de rechazo (posterior)

o6

FECHA DE LOS ANALISIS

Figura 5
CARTA DE CONTROL ASIMTRICO

- 66 -

4.4.2.4

Estimacin de la recuperacin de muestras adicionadas

En el siguiente ejemplo hay n determinaciones, tanto de muestras adicionadas y no

adicionadas, medidas en m lotes. Para mostrar que la recuperacin media no difiere
significativamente (a un nivel de significancia 0.05) de % de la cantidad aadida (100 D), se
usa el procedimiento siguiente.

Calcule tanto la recuperacin como la diferencia entre los resultados para n pares de
muestras adicionadas y no adicionadas en cada lote de mediciones. Calcule la recuperacin
media R de los mn resultados. Tambin calcule la desviacin estndar S de las m recuperaciones medias de los m lotes. La cantidad adicionada ser d (en las mismas unidades que R). La
recuperacin media ser aceptable si:
S.t oc
R
a) R > (1.00 - 0.1 D) d - - 2- fpara - < (1.00 - 0.01 D)]
m
d

S.'2..

b) R < (1.00 + 0.1 D) d + - - fpara - > (1.00 + 0.01 D)]

m
d
donde:
~oc

to.05 de student con (m-1) grados de libertad y un nivel de probabilidad de

2oc

4.4.2.5

Determinacin de los blancos

Antes de procesar cualquier muestra, se demuestra con el anlisis de un blanco (la

EPA lo denomina como un mtodo del blanco con agua destilada) que todo el material de vidrio
y los reactivos estn libres de interferencia. De igual modo, cada vez que se procesa un blanco,
o cuando hay cambio de los lotes de reactivos para evaluar la posible contaminacin crnica del
laboratorio, se analiza un lote de muestras. Los valores de las determinaciones del blanco se
usan tambin para la determinacin del lmite de deteccin.
4.4.2.6

Determinaciones de lmites de deteccin

Los lmites de deteccin dependen del tipo de detector, las caractersticas y cantidad
de los compuestos interferentes presentes, y concentracin de la preparacin de la muestra. En
la ausencia de picos interferentes, el detector de conductividad trmica es capaz de detectar
cantidades de material en el rango de microgramo; el detector coulomtrico en el rango de
nanogramo; el detector de ionizacin de llama en el rango de 10 pg y los detectores de captura
de electrones y termoinicos en el rango de picogramo.

- 67 -

A continuacin, se describe el mtodo usado para estimar el lmite de deteccin del

mtodo analtico. Este se basa en la variabilidad del blanco, donde el blanco es procesado
siguiendo la totalidad del mtodo analtico. El(los) compuesto(s) de inters, como normalmente
sucede, no se presentan en el blanco y la respuesta de ste normalmente corresponde al ruido
de fondo.

F.n cromatografa de gases, una estimacin simple del lmite de deteccin se basa en
por lo menos diez anlisis de un blanco. Este procedimiento es especificado en varios mtodos
recomendados por la EPA con la siguiente frmula:

LD (o/l) = X tt
'
BxAtt

. X o//
'

donde:
LD
A

B
Att

Nota:

lmite de deteccin en gil u otras unidades de concentracin apropiadas

cinco veces el nivel de ruido en mm a un perodo exacto de retencin
correspondiente al compuesto de inters o el desplazamiento de la lnea base
en mm para el cero terico a un perodo de retencin exacto correspondiente al compuesto de inters
altura del pico (mm) del patrn o estndar de concentracin igual a X gil
factor de atenuacin.
El estndar de concentracin X gil debe ser mnimo 10 veces el valor final
estimado del lmite de deteccin.

Muchas veces las interferencias en las muestras incrementan el ruido comparado con
el fondo (background) del valor del blanco usado en el clculo del lmite de deteccin. Si esta
interferencia es seria, el lmite de deteccin calculado no es vlido. En este caso, si se necesitan
hacer mediciones y las concentraciones estn cerca del lmite de deteccin, es necesario una
extraccin ms fuerte.
Las constantes interferencias pueden invalidar la utilidad del lmite de deteccin de una
muestra especfica. Se considera que el valor estimado es de utilidad cuando es caracterstica
propia del mtodo analtico e indica que el laboratorio es capaz de cumplirlo bajo circunstancias
controladas.
El lmite de deteccin se calcula para un mtodo analtico especfico. Por ejemplo,
el mtodo puede sealar que se tome un litro de muestra, que se concentre a 10 mi, y que del
extracto se inyecte 5 l. Si se realiza cualquier desviacin de las instrucciones del mtodo se
debe esperar un cambio en el lmite de deteccin (por un factor correspondiente). Las
desviaciones en el mtodo deben ser tomadas en cuenta cuando se reportan los resultados de las
muestras naturales.

- 68 -

4.4.3

Guas para la revisin del cromatgrafo de gases

INSTRUMENTO

Cromatgrafo de gas con

detector de captura de
electrones

FRECUENCIA

COMPUESTO A
REVISAR

PROCEDIMIENTO

Diaria

Resolucin y reproductibilidad de la relacin

rea/altura del pico

El instrumento se acondicion con un estndar y

luego se calibra. Los estndares se repiten cada S
muestns para actualizar la
calibracin.

Mensual

Contaminacin del DCE'

La salida y el fondo del

detector se monitorea para
detectar posible contaminacin. Los DCE se limpian
trmicamente el fm de
semana una vez por mes.

Mensual

Resolucin

Si se conoce el estndar de
PCB inyectado y se compara con la del mes ante-

rior.
Cromatgrafo de gas con
detector de ioni7.11Cin de
llama

Anual o cuando sea

Diaria

Contaminacin del DIF'

Se limpia el detector manualmente usando un equipo

deHP

Resolucin y reproductibilidad de la relacin

rea/altura del pico

El instrumento se evala
con un estndar calibrado.
Los estndares se repiten
cada S muestras para actua!izar la calibracin.

necesario

DCE: detector de captura de electrones

' DIF: detector de ioni7.11Cin de llama

4.4.4

Revisin de las columnas cromatogrficas de gas

La revisin de las columnas cromatogrficas se lleva a cabo midiendo el factor de pico

asimtrico. Este factor compara la base de la segunda mitad del pico cromatogrfico con la
primera mitad de ste, tal como se aprecia en la figura 6.
Para cada tipo de columna se deben establecer los valores aceptables del factor de pico
asimtrico. Por ejemplo, en la realizacin de anlisis de plaguicidas se acepta si el factor de
pico de aldrn es menor que 2.

- 69 E

Figura 6

CLCUW DEL FACTOR DE PICO

Factor de pico = BC

AB

Ejemplo de clculo:
Altura de pico = DE = 100 mm
10% de altura de pico = BD = 10 mm
Ancho del pico a 10% de la altura de pico = AC = 23 mm
AB = 11 mm
BC = 12 mm
Por lo tanto, el factor de pico = 12/11 = 1.1
4.4.5

Tcnicas de inyeccin

Una fuente frecuente de error en la cuantificacin de compuestos orgnicos por

cromatografa gas-lquido es la inyeccin de la muestra, ya que la cantidad de muestra que se
inyecta no es reproducible. Porque la tcnica de inyeccin no es de la uniformidad que se desea
o es deficiente.

- 70 -

Antes de usar una jeringa se revisa que est totalmente limpia, libre de residuos,
porque Ja falta de limpieza puede estropear completamente el cromatograma.
Se toma un tamao de muestra moderado en un frasco que Juego es sellado. Si el
frasco de la muestra es pequeo y/o un buen nmero de muestras van a ser colectadas, el frasco
es primero presurizado por inyeccin de un gas inerte (por ejemplo, el gas acarreador) en el
frasco. Con una jeringa nunca se debe obtener una muestra cuando hay presin negativa dentro
del frasco de la muestra. Se empuja totalmente el mbolo, con cuidado de no tocarlo. Se agita
el frasco con la muestra. Se toma la jeringa en forma vertical para atrapar al gas y que ste
pueda ascender y escapar. Se inserta la aguja en el frasco, de tal forma que est en su totalidad
inmersa en Ja muestra. En seguida, se mueve el mbolo hacia afuera y a una distancia corta
hasta humedecer la superficie interior del mbolo y del cuerpo de la jeringa. Esto neutraliza
cualquier movimiento del lquido, debido a la capilaridad. Despus, mediante bombeo, se retira
el mbolo hasta llenar Ja jeringa entre un 5 y un 10%. Se retira la aguja, se toma Ja jeringa
verticalmente, se llena Ja aguja cuidando que no presente burbujas o espuma. Se empuja el
mbolo lentamente y sacude el exceso de lquido deteniendo el mbolo en Ja marca previamente
seleccionada. El exceso de lquido de Ja aguja es descartado despus que sta se ha sacado del
frasco. Si se descarga mientras se encuentra Ja aguja dentro del frasco, puede presentarse una
pequea prdida de muestra al retirar la aguja. Se debe leer cuidadosamente Ja graduacin de
la jeringa. La mejor manera es tomar la jeringa frente a los ojos quedando la parte final del
mbolo en posicin horizontal. Esto elimina cualquier paralelaje que pueda causar lecturas
errneas. Tambin se recomienda que la parte final del mbolo, que contiene un volumen de
lquido siempre sea ledo en el "tope", es decir, en el borde de la lnea de calibracin. Esto
eliminar cualquier posibilidad de error, debido al espesor de la lnea de calibracin. Mientras
se lee el volumen contenido en la jeringa, se debe revisar de nuevo que no haya en la muestra
burbujas o materia extraa. Frote la aguja para limpiarla con un pao, tenga cuidado de no
limpiar cualquier muestra fuera o el extremo de la aguja y nos transfiera el calor que puedan
generar los dedos a la aguja. En un rpido movimiento, se introduce la aguja a travs del
septum del cromatgrafo y se inyecta la muestra. Inmediatamente despus de inyectar la
muestra se retira la aguja para prevenir la vaporizacin del lquido remanente en la aguja con
el consiguiente resto. Despus de que la aguja ha sido retirada, la jeringa puede ponerse
verticalmente con la aguja hacia arriba y el mbolo empujado hacia afuera a una distancia corta.
Esto arrasa con el lquido residual fuera de la aguja al interior de la jeringa, donde este volumen
pueda medirse. La cantidad total inyectada puede determinarse restando el volumen residual del
volumen original en la jeringa.
Otra tcnica que puede usarse es succionar una pequea cantidad de aire en Ja jeringa,
tomar las muestras y finalmente otro poco de aire. Eso nos dar una especie de "sandwich" de
lquido entre dos fracciones de aire. El volumen de la muestra lquida puede leerse exactamente
por medio de las graduaciones de la jeringa. Despus de introducir la aguja a travs del
septum, el mbolo puede empujarse totalmente. El aire delante de la muestra permite la
medicin exacta del volumen de lquido contenido y el aire detrs del lquido permite que toda
la muestra sea inyectada en el cromatgrafo. No habr residuos remanentes ni espacios muertos
entre el extremo del mbolo y el inicio del contenedor de Ja jeringa. Uno de estos dos mtodos

- 71 es recomendado particularmente si la jeringa est equipada con una aguja desechable. El mtodo
del "sandwich" descrito slo es usado para muestras que no se contaminen por el aire. Si este
ltimo es un contaminante, la muestra puede ser puesta como "sandwich" entre dos capas del
gas acarreador.
Para muestras pequeas de 0.05 a 1.0 microlitros se dispone de jeringas y agujas, con

las cuales se toma la muestra lquida. La parte inferior del mbolo y la punta de la aguja
forman parte del volumen total contenido en la jeringa. Esto asegura una medicin exacta de
la cantidad inyectada y esencialmente elimina cualquier efecto final. El volumen de la muestra
se lee en el contenedor como una jeringa ordinaria.
Un problema especial es el muestreo de lquidos altamente viscosos. Con frecuencia,
la viscosidad puede disminuir por calentamiento de la muestra en una jeringa protegida y
mantenida a alta temperatura hasta el momento de la inyeccin; si sta no contiene fracciones
ligeras, las cuales sern vaporizadas por la alta temperatura. Otra manera de muestrear es por
encapsulado en un contenedor de metal o de vidrio.
Otro mtodo de manejo de muestras viscosas es el disolverlas en un solvente neutro
de baja viscosidad. La solucin puede manejarse fcilmente con una jeringa estndar. El
problema es encontrar un solvente que no interfiera. Tal solvente es difcil encontrar para
muchas muestras, por lo que este mtodo, que tericamente es posible, en la prctica tiene poco
uso.
Algunas muestras lquidas son manejadas bajo presin para obtener las fracciones de
gas en solucin. La muestra puede estar contenida en un frasco con un septum fuerte. El
problema es que tan pronto como la aguja es retirada del septum del frasco de la muestra, el
extremo de la aguja es expuesto a la presin atmosfrica. El contenido y los gases presurizados
en la muestra lquida se expandirn a travs de la aguja y escaparn a la atmsfera. Sin
embargo, el dimetro interior de la aguja es pequeo, 0.006 pulgadas o menos. Si se hace
rpidamente, puede taparse con un tapn de caucho o con una pieza pesada de material de
septum. Para hacer esto se coloca un tapn contra el septum de bote de la muestra antes de
insertar la aguja. La aguja perfora el tapn, antes del septum. Cuando la aguja se retira del
frasco de la muestra, la punta queda dentro del tapn, entonces sta se coloca contra el septum
del cromatgrafo y la aguja se desliza a travs de ste antes de entrar al septum a la columna.
Con este procedimiento se mantiene dentro de la jeringa, muchos de los gases aunque algunos
se pierden antes y despus de los deslizamientos de la aguja.