Bacharelado em Cincias Biolgicas

Disciplina: Monografia I

SOLICITAO DE QUALIFICAO DE ANTEPROJETO DE

MONOGRAFIA
Em anexo, encaminho o Anteprojeto da Monografia de Concluso do Curso de Cincias
Biolgicas Bacharelado, declarando para os devidos fins que este trabalho de minha inteira autoria.
Solicito a composio de Banca Examinadora para a qualificao da mesma.

Nome do aluno: Jssica Bohusch Oliseski

Matrcula: 12105333-4

Telefone(s): (51) 99685482

Endereo eletrnico: jessica.oliseski@acad.pucrs.br

Ttulo do Anteprojeto:

COEVOLUO ENTRE FULGORA (HEMIPTERA: FULGOROMORPHA:

FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.
Data: __/__/____

Assinatura do aluno: __________________________

PROTOCOLO (Para uso da secretaria)

Recebido
em:
__/__/____
____________________________

Por:

________________________

Parecer do Professor Responsvel:

Data: __/__/____
Assinatura do Professor responsvel:

___________________________________________________________________

Assinatura:

PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCINCIAS

JSSICA BOHUSCH OLISESKI

COEVOLUO ENTRE ESPCIES DE FULGORA (HEMIPTERA:

FULGOROMORPHA: FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.

Porto Alegre
2015

JSSICA BOHUSCH OLISESKI

COEVOLUO ENTRE ESPCIES DE FULGORA (HEMIPTERA:

FULGOROMORPHA: FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.

Trabalho de Concluso de Curso apresentado como requisito

parcial para a obteno do grau de Bacharel em Cincias
Biolgicas pela Faculdade de Biocincias da Pontifcia
Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.

Porto Alegre
2015

AGRADECIMENTOS

minha me, Veronika Bohusch Oliseski, que com muita determinao e fora
proporcionou tudo nossa famlia.
Ao meu pai, Doutor Silvio Luiz Rocha Oliseski, por compreender e mostrar-se feliz
pelas minhas escolhas, sempre, e por ter influenciado meu caminho at aqui.
Ao Prof. Dr. Gervasio da Silva Carvalho, por ser meu orientador, pai, av, amigo e
carrasco durante esses curtos 4 anos. Seus ensinamentos e azedumes sero levados sempre no
meu corao.
ps-doutoranda Andressa Paladini, pelas conversas, ensinamentos, ideias e amizade
de que vou lembrar sempre que estiver colorindo acompanhada de uma xcara de ch.
Thayana Tabarkiewicz, minha simbiose, por me ajudar a transformar as coisas ruins
da vida em piada.
Ao meu namorado, Tiago Corra Incio, por me trazer a paz nos dias mais tensos e por
afastar meus medos com amor.
E por ltimo, mas no menos importante, aos meus colegas de laboratrio, de aula e da
vida, que diminuem o peso dos dias, quebram a rotina cansativa e acabam sendo uma famlia,
um apoio, uma alegria.

Prezo insetos mais que avies.

Prezo a velocidade
das tartarugas
mais que a dos msseis.
Tenho em mim
esse atraso de nascena.
Eu fui aparelhado
para gostar de passarinhos.
Tenho abundncia
de ser feliz por isso.
Meu quintal
maior do que o mundo.
(Manoel de Barros)

RESUMO

Os Fulgoromorpha, comumente chamados de cigarrinhas, constituem um grupo de insetos

sugadores de seiva do floema das plantas. O txon compreende aproximadamente 14.000
espcies em 21 famlias. Os insetos pertencentes Fulgoridae (Insecta: Hemiptera:
Auchenorrhyncha:

Fulgoromorpha)

so

caracterizados

principalmente

por

serem

extremamente grandes e robustos, tendo pelo menos de trs a quatro vezes a massa corporal
de quaisquer outras espcies neotropicais, e se aproximam do tamanho do corpo de pequenos
lagartos, chegando a mimetiz-los. Esta famlia mostra uma notvel diversidade de
associaes simbiticas com bactrias. As relaes simbiticas nutricionais em vrias ordens
de insetos desenvolveram-se independentemente com diferentes tipos de microrganismos. Os
simbiontes tm diversos efeitos ecolgicos e evolutivos em seus hospedeiros, influenciando
aspectos de interaes ecolgicas da nutrio defesa. Estudos demonstram que as
associaes entre microrganismos e hospedeiros multicelulares so obrigatrias, sendo
cruciais em termos evolutivos, na gerao de diversidade fenotpica e na origem de fentipos
complexos capazes de colonizar novos ambientes. Tais evidncias so importantes para os
sistemas simbiticos encontrados nestes insetos. A metodologia deste estudo envolve a
utilizao de metagenmica para conhecimento dos simbiontes e a realizao de reaes em
cadeia da polimerase (PCR) para amplificao e posterior sequenciamento de fragmentos de
DNA dos hospedeiros, representados por oito espcies de Fulgora. A anlise e comparao
das topologias obtidas nos permitir observar se no gnero Fulgora houve um processo de
coevoluo com seus simbiontes.

Palavras-chave: Simbiontes. Hospedeiros. Coevoluo. Fulgoridae.

ABSTRACT

The Fulgoromorpha, commonly called planthoppers, are composed by a group of plant

phloem sap feeding insects. The taxon has approximately 14.000 species in 21 families. The
insects that belong to the Fulgoridae family (Insecta: Hemiptera: Auchenorrhyncha:
Fulgoromorpha) are characterized by being extremely large and robust. They have at least
three to four times the corporal mass of any other neotropical species, and their size
approximate to small lizards, that they even mimic. This family shows a notorious diversity of
symbiotic associations with bacteria. The nutritional symbiotic relationship of several order of
insects developed independently along with different types of microorganisms. The symbionts
have several ecological and evolutionary effects on their hosts, that influence their aspects of
ecological interactions, from nutrition to defenses. Studies have shown that associations
between microorganisms and multicellular hosts are obligatory, being crucial in evolutionary
terms, in the generation of phenotypic diversity and in the origin of phenotypical complexes
that are able to colonize new environments. Such evidences are important to the symbiotic
systems found in these insects. The methodology of this study involves the use of
metagenomic for symbionts and knowledge of conducting polymerase chain reactions (PCR)
for amplification and further sequencing of DNA fragments into the host, represented by eight
species of Fulgora. The analysis and comparison of the topologies obtained allow us to
observe if there was a process of coevolution with their symbionts in the genus Fulgora.

Keywords: Symbionts. Hosts. Coevolution. Fulgoridae.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Fulgora sp................................................................................................................11

Figura 2 Fulgora laternaria...................................................................................................11
Figura 3 - Diagrama esquemtico dos passos evolutivos na aquisio de bactrias simbiontes
com nfase em cigarrinhas (Cicadellidae)................................................................................13
Figura 4 - Espcies de Fulgoridae utilizadas para a anlise de aquisio de bactrias............14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Pesquisas de Mller sobre aquisio de bactrias....................................................14

SUMRIO

1 INTRODUO..................................................................................................................... 9
1.1 SIMBIONTE.........................................................................................................................9
1.2 HISTRICO DO TXON..................................................................................................10
1.3 COEVOLUO.................................................................................................................12
2 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................17
3 OBJETIVOS.........................................................................................................................18
3. 1 OBJETIVO GERAL..........................................................................................................18
3. 2 OBJETIVOS ESPECFICOS.............................................................................................18
4 MATERIAL E MTODOS.................................................................................................19
4.1 EXTRAO.......................................................................................................................19
4.2 REAES EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)........................................................19
4.3 AMPLIFICAO DE DNA DE FULGORA.....................................................................20
4.3.1 Amplificao do gene rRNA 16S.....................................................................................20
4.4 SEQUENCIAMENTO DO DNA DE FULGORA.............................................................21
4.4.1 Sequenciamento do gene 16S..........................................................................................21
4.5 ALINHAMENTO DAS SEQUNCIAS.............................................................................21
4.6 FILOGENIA.......................................................................................................................21
5 RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS..........................................................23
REFERNCIAS..................................................................................................................24
APNDICE A......................................................................................................................26
APNDICE B......................................................................................................................27

1 INTRODUO

1.1 SIMBIONTE

As bactrias so microrganismos altamente adaptveis com caractersticas necessrias

para habitar praticamente todos os ecossistemas, incluindo viver dentro de outros organismos.
Embora microrganismos patognicos que tm efeitos prejudiciais sobre animais e plantas
venham sendo amplamente estudados, a grande maioria dos relacionamentos na natureza
representam associaes simbiticas benficas e sustentveis (1).
Muitos invertebrados abrigam bactrias simbiontes. Muitas vezes a codependncia
mtua (2). Em animais invertebrados, tais bactrias simbiticas so frequentemente
transmitidas para seus descendentes. Embora a prevalncia de simbiose tenha sido
reconhecida com base em observaes de microscopia (2), a maioria dos aspectos das origens
e funes simbiticas era misteriosa antes da idade de tcnicas moleculares (3).
Os simbiontes tm diversos efeitos ecolgicos e evolutivos em seus hospedeiros,
influenciando aspectos de interaes ecolgicas, da nutrio defesa, e afetando o sistema
reprodutivo, com consequncias para a estrutura da populao, isolamento reprodutivo e
especiao (3).
Os simbiontes tambm permitem a seus hospedeiros sobreviver em dietas restritas, que
se constituem como uma nica fonte alimentar. Assim, os simbiontes fornecem aos seus
respectivos hospedeiros suplementos nutricionais como aminocidos e vitaminas do complexo
B (4, 5). Apenas insetos da ordem Hemiptera utilizam a seiva do floema como principal ou
nica fonte de alimento. Esse estilo de vida evoluiu vrias vezes entre os hempteros,
envolvendo a maioria dos Sternorryncha e muitos Auchenorryncha (6). Em razo das
qualidades nutricionais desbalanceadas do contedo floemtico, todos os hempteros que se
alimentam unicamente de seiva elaborada necessitam de microrganismos simbiontes (7).

10

Anlises filogenticas com dados moleculares demonstram a estabilidade desses

mutualistas obrigatrios por longos perodos evolutivos, variando de dezenas a centenas de
milhes de anos, o que permitiu aos seus hospedeiros explorarem fontes nutricionais e
habitats inadequados. Assim, a aquisio desses microrganismos pode ser vista como uma
inovao fundamental na evoluo do hospedeiro (8).

1.2 HISTRICO DO TXON

Os Fulgoridae (Insecta: Hemiptera: Auchenorrhyncha: Fulgoromorpha), comumente

chamados de cigarrinhas, constituem um grupo de insetos sugadores de seiva do floema de
plantas. O txon compreende aproximadamente 14.000 espcies em 21 famlias, incluindo
Fulgoridae, famlia qual pertencem as espcies estudadas neste projeto. As interaes destas
cigarrinhas com plantas hospedeiras so essenciais no s como fontes de alimento, mas
tambm como oviposio, como locais de acasalamento e como abrigo. Espcies de diferentes
famlias atuam como pragas de culturas agrcolas em todo o mundo, danificando as plantas
por ovipositar nos tecidos vegetais e alimentar-se do floema, por vezes podendo inocular uma
srie de patgenos. Alguns so causadores de doenas proporcionando srios danos em uma
grande variedade de plantaes economicamente importantes (9).
As espcies includas em Fulgora so caracterizadas principalmente por serem
extremamente grandes e robustas, tendo pelo menos de trs a quatro vezes a massa corporal
de quaisquer outras espcies neotropicais de Fulgoromorpha e se aproximando do tamanho do
corpo de pequenos lagartos, chegando a mimetiz-los. A maior caracterstica est na cabea,
que apresenta um processo proeminente inflado, assemelhando-se a um amendoim ou a uma
cabea de jacar, incluindo manchas oculares falsas nas asas posteriores (10) (Figuras 1 e 2).
composta por oito espcies: Fulgora linnaeus, F. castresii, F. crocodilia, F. lampetis, F.
laternaria, F. lucfera, F. riograndensis e F. cearenses (10). A famlia qual pertence Fulgora
mostra uma notvel diversidade de associaes simbiticas com bactrias (11).

11

Figura 1 Fulgora sp.

Fonte: Imagem da autora.

Nota: Espcime consta no Museu de Cincias e Tecnologia da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande
do Sul (PUCRS).

Figura 2 Fulgora laternaria

Fonte: Imagem da autora.

Nota: Espcime consta no Museu de Cincias e Tecnologia da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande
do Sul (PUCRS).

12

1.3 COEVOLUO

A diversidade microbiana representa o mais vasto repertrio gentico do planeta.

Entretanto, apenas uma pequena frao dessa diversidade conhecida. O sequenciamento
massivo tem proporcionado a caracterizao de organismos no cultivados que compem as
comunidades microbianas (12).
O bilogo Paul Ernest Christof Buchner citou Auchenorrhyncha como o "reino das
fadas de simbiontes", e descreveu uma grande diversidade de associaes simbiticas em
diferentes espcies (11). Dados de sequncias de nucleotdeos permitem a discriminao
inequvoca do tipo de simbionte e a reconstruo das suas relaes evolutivas entre si e para
com outras bactrias (11). Os dados da sequncia tm contribudo muito para o conhecimento
de simbiontes. Esta abordagem possibilitada pelo PCR, seguido do sequenciamento de
fragmentos de DNA (11).
O grupo de insetos que inclui cigarras e cigarrinhas (Hemiptera: Auchenorrhyncha),
mostra uma notvel diversidade de associaes simbiticas. Mller estudou centenas de
espcies de cigarrinhas na tentativa de reconstruir a evoluo dessa diversidade
desconcertante de associaes (2). Estudos filogenticos moleculares tm melhorado muito
nossa compreenso das origens e evoluo das simbioses animais, validando e estendendo a
tese de Buchner ao afirmar que muitas dessas associaes tm longas histrias evolutivas.
Tais estudos tm mostrado repetidamente que simbiontes nutricionais evoluram em paralelo
com os seus hospedeiros (13).

13

Figura 3 - Diagrama esquemtico dos passos evolutivos na aquisio de bactrias simbiontes

com nfase em cigarrinhas (Cicadellidae)

Fonte: Moran, 2007 (13).

Nota: Diagrama mostrando Fulgoromorpha com aquisio de novos simbiontes.

Na tabela 1, podemos observar que pesquisas de Mller apontam duas bactrias

presentes em Fulgoridae: Sulcia e Vidania. Porm, na figura 4 podemos ver que as anlises
foram realizadas apenas em espcies de outros gneros que no Fulgora. Devido ao hbito
alimentar e s caractersticas semelhantes dos indivduos da famlia, h a hiptese de que
Fulgora demonstre aquisio destas mesmas bactrias. Um estudo mais aprofundado de seus
hospedeiros promete fornecer informaes importantes sobre como a simbiose bacteriana
gerida pelos animais que servem como hospedeiros, podendo ser encontrados indivduos
includos em Archaea.

14

Tabela 1 - Pesquisas de Mller sobre aquisio de bactrias

Fonte: Urban e Cryan (14).

Figura 4 - Espcies de Fulgoridae utilizadas para a anlise de aquisio de bactrias

Fonte: Urban e Cryan (14).

15

A motivao evolutiva para assimilar genes estranhos decorre do fato bvio de que as
espcies diferem em conjuntos de genes e de capacidades correspondentes. Assim, a
associao ntima entre duas linhagens pode facilmente surgir atravs da seleo natural,
atuando dentro de cada espcie para corrigir alelos que promovem a estreita associao com
as outras espcies. Embora as diferenas nas capacidades metablicas entre espcies sejam
evidentes, a genmica est fornecendo uma viso detalhada de como essas diferenas
surgiram (13). H provas esmagadoras de que existe uma associao obrigatria entre
microrganismos e hospedeiros multicelulares, sendo crucial em muitos acontecimentos
marcantes na evoluo, na gerao de diversidade fenotpica e na origem de fentipos
complexos capazes de colonizar novos ambientes. Tal evidncia abundante para os sistemas
simbiticos encontrados em insetos, em grande parte por causa dos estudos moleculares e
genmicos (13).
A metagenmica vem sendo aplicada para responder questes fundamentais da
microbiologia ambiental como: quantos so? Quem so? E fazendo o qu? Por isso, a
metagenmica representa uma importante ferramenta para estudo da ecologia microbiana e
prospeco do potencial metablico atravs da anlise da diversidade taxonmica e
localizao de genes e operons responsveis pela sntese de molculas com propriedades de
interesse biotecnolgico (12, 15, 16).
O sequenciamento do gene rRNA 16S permite a identificao de clulas, mesmo em
pequenas quantidades, o que proporciona informaes sobre a composio taxonmica da
comunidade microbiana. A construo de bibliotecas genmicas de rRNA 16S representa uma
tima ferramenta para a anlise da diversidade molecular de comunidades de microrganismos
(28).
A anlise do genoma uma ferramenta essencial para determinar as relaes
evolutivas. A sequncia completa do DNA de um organismo define a sua natureza com
preciso. Como o DNA est sujeito a mudanas aleatrias que se acumulam durante longos
perodos de tempo, o nmero de diferenas entre as sequncias de DNA de dois organismos
pode proporcionar uma direta, objetiva e quantitativa indicao da distncia evolutiva entre
eles (12).

16

Portanto, a partir da anlise de processos de metagenmica ser possvel um

conhecimento amplo em relao aos simbiontes existentes nas espcies de Fulgora, indo alm
das pouqussimas diferenciaes morfolgicas que determinam as diferenas dessas oito
espcies de cigarrinhas e visualizando as diferenas fisiolgicas que as denominam diferentes.

17

2 JUSTIFICATIVA

O entendimento classificatrio de qualquer txon leva a um sistema de referncia para

qualquer discusso em biodiversidade, conservao e sustentabilidade. Promove informaes
que sero utilizadas convenientemente pela agricultura, alm de outros campos do
conhecimento, no manejo adequado dos recursos. A filogenia sempre ser uma representao
hipottica que nos d uma ideia de como aquele determinado grupo de espcies esto
relacionadas entre si.
Dados de sequncias genmicas, juntamente com anlises evolutivas, trouxeram novas
complementaes importantes para a nossa compreenso da evoluo biolgica. Uma das
maiores revelaes se d na medida em que adaptao biolgica e inovao fenotpica, dentro
de uma linhagem gentica particular, tm dependido de adoo de sistemas funcionais j
altamente especializados de outras linhagens, muitas vezes apenas remotamente relacionadas
com o destinatrio (11).
Muitos grupos de insetos tm se diversificado com base em associaes simbiticas
adquiridas no incio de suas histrias evolutivas. As associaes resultantes so altamente
complexas, envolvendo muitas vezes tipos de clulas especializadas, mecanismos de
desenvolvimento que assegurem a transferncia de simbiontes entre as geraes e
mecanismos de controle da proliferao simbionte e localizao. Vrios simbiontes
frequentemente coexistem no mesmo hospedeiro, resultando em coadaptao entre vrios
genomas filogeneticamente distantes (13).

18

3 OBJETIVOS

3. 1 OBJETIVO GERAL

Identificar os simbiontes de maior abundncia, pelo mtodo de metagenmica,

ocorrentes de modo semelhante ou no nas 8 espcies de Fulgora e verificar o processo de
coevoluo a partir de anlise molecular de Fulgora em comparao com os simbiontes.

3. 2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Comparar a filogenia entre hospedeiro e seus simbiontes.

Mostrar que adaptaes biolgicas e inovaes fenotpicas dependem da adoo de

sistemas funcionais de outras linhagens.

19

4 MATERIAL E MTODOS

Os locais de realizao da pesquisa sero os laboratrios de Entomologia e de Biologia

Molecular da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul (PUCRS) e o Instituto
do Petrleo e dos Recursos Naturais do TecnoPuc para os mtodos de metagenmica. Os
espcimes de Fulgora ssp. sero obtidos na coleo entomolgica do Museu de Cincias e
Tecnologia da PUCRS.

4.1 EXTRAO

Para a extrao, ser utilizado um abdome de cada um dos espcimes para a obteno
da sequncia dos simbiontes e uma perna, previamente macerada, para a obteno da
sequncia de cada espcie de Fulgora. Os abdomens dos espcimes ou a musculatura da perna
sero submergidos em soluo contendo 180l de buffer ATL e 20l de proteinase K (mistura
para lise celular) incubadas por 12 horas a 55C. Neste extrato ser posteriormente utilizado o
Qiagen DNEasy Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA), seguindo um protocolo com os
seguintes passos: adio em cada amostra de buffer AL (lise celular), etanol 100% e
posteriormente utilizao da centrfuga em combinao com a lavagem das amostras com
buffer AW (lavagem) e buffer AE (eluio).

4.2 REAES EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)

As reaes em cadeia da polimerase (PCR) sero conduzidas utilizando-se 25l total

de produto: 17,5l de gua pura, 2,5l de tampo 10X buffer para PCR, 1,5 l de sal MgCl2
(25mM) 2,0l de DNTPs (10mM), 0,5l de primers e 0,15l de polimerase Ampli-Taq (PE
Applied Biosystem, Foster City CA) com o seguinte protocolo de ciclos: 30 segundos a 94C

20

para desnaturao inicial seguidos de 3035 ciclos de 1 minuto cada a 4060C para
anelamento, 1 minuto a 72C, terminando com 7 minutos incubando a 72C. Controles
negativos sero includos em todas as reaes para a deteco de possveis contaminaes.

4.3 AMPLIFICAO DE DNA DE FULGORA

Adiciona-se o tampo, enzima TAQ, gua, sal (cloreto de magnsio), primers e os

nucleotdeos sintticos. Os componentes so adicionados na mquina de reaes em cadeia de
polimerase, na qual ocorrero de 30 a 35 ciclos compostos por temperatura de desnaturao,
temperatura de anelamento e temperatura para funcionamento da enzima. O produto bruto
posto no gel de agarose para verificar a amplificao. Esta amostra purificada e mandada
para sequenciamento.

4.3.1 Amplificao do gene rRNA 16S

A reao de PCR para amplificao do gene rRNA 16S realizada utilizando-se

iniciadores desenhados para o anelamento em regies conservadas dentro de rRNA 16S
especficos para Eubacteria, gerando fragmentos de aproximadamente 1,5kb. O programa
utilizado ser: 95 C por 3 minutos, seguido de 25 ciclos de 95 C por 1 minuto, 51 C por 1
minuto e 30 segundos e 72 C por 3 minutos. A extenso final ocorre na temperatura de 72 C
por 30 minutos. Reao: 10, 8 L gua milli Q; 2 L Tampo 10X; 2 L dNTP (10mM); 2
L BSA 10X; 1 L PR (5mM); 1 L PF (5mM); 0,2 L Taq (5U/L); 1 L DNA (50ng)
para um volume total de 20 L.
Aps a verificao do material amplificado, uma corrida em gel de agarose 1% TAE
1X realizada para sacar as bandas correspondentes aos produtos de amplificao do gene
rRNA 16S. A purificao realizada com kit comercial Ultra Clean DNA Purification (Mo
Bio). A efetividade da purificao verificada em gel de agarose 1% TBE 1X.

21

4.4 SEQUENCIAMENTO DO DNA DE FULGORA

Cada gene ser sequenciado separadamente para cada combinao de primers. Todos
os dados cromatogrficos das sequncias sero revisados, editados e as fitas complementares
do DNA combinadas para a obteno de uma fita consenso utilizando-se o programa
Sequencher 4.8. A utilizao das fitas complementares (obtendo-se uma fita consenso)
permite uma maior confiabilidade nas posies nucleotdicas a serem utilizadas para o
posterior alinhamento.

4.4.1 Sequenciamento do gene 16S

Ser realizado em parceria com o Instituto do Petrleo e dos Recursos Naturais do
TecnoPuc a partir da utilizao do Ion Torrent PGM, que utiliza chips semicondutores,
tecnologia de sequenciamento mais simples, rpida, rentvel e escalvel do que outras
tecnologias de sequenciamento clssicas. A partir de uma biblioteca de DNA previamente
amplificada, o Ion Torrent PGM produzir sequncias que posteriormente sero, atravs de
anlises de bioinformtica, classificadas e ordenadas por abundncia.

4.5 ALINHAMENTO DAS SEQUNCIAS

O alinhamento inicial de todas as sequncias de DNA e rRNA 16S ser realizado em

ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw), utilizado quando as sequncias tm tamanho
prximo. A partir do alinhamento obtida a matriz pelo mesmo programa.

4.6 FILOGENIA

22

O estudo das relaes evolutivas feito a partir de trs programas:

Tree analysis using New Technology (TNT): realiza a anlise de parcimnia.

Garli 2.0: para obteno de mxima verossimilhana.

MrBayes: programa de inferncia bayesiana, estatstica que descreve as incertezas

sobre quantidades invisveis de forma probabilstica.
Os trs programas so aplicados tanto para matriz dos simbiontes quanto para a matriz

das 8 espcies de Fulgora. A aplicao dos trs programas resultar em trs topologias de
simbiontes e trs topologias de cada cigarrinha. As topologias sero comparadas para a
obteno de uma topologia final de cada Fulgara e simbionte. Com as topologias finais ser
possvel verificar a coevoluo entre hospedeiro e seus simbiontes.
A descrio dos procedimentos de materiais e mtodos para os fulgordeos seguiu o
padro de elaborao descrito na tese de Paladini A., 2012 (17).

23

5 RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS

Com a realizao deste trabalho espera-se obter os sequenciamentos dos genes das oito
espcies de Fulgora, realizar o alinhamento dos genes e inferir uma filogenia. A partir disso,
ser possvel realizar a comparao com a filogenia obtida dos simbiontes mais abundantes
selecionados por metagenmica, tornando, ento, vivel a anlise da hiptese de coevoluo
entre os espcimes de Fulgora em comparao com seus simbiontes.

24

REFERNCIAS

1.

Moran NA. Symbiosis. Current Biology. 16 (20).

2.
Buchner P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. New York, N.Y.:
Interscience;1965.
3.
Moran NA, McCutcheon JP and Nakabachi A. Genomics and Evolution of Heritable
Bacterial Symbionts. Rev. Genet. 2009 04 30;42:165-190.
4.
Buchner P. Endosymbioosis of animals with plant microorganisms. New York: J.
Wiley, p. 909, 1865.
5.
Nogge G. Significance of Symbionts for the maintenance of na optional nutritional
state for successful reproduction in hematophagous arthropods. Parasitology, Cambridge,
v.82, p.101-104, 1981.
6.

Dolling W R. The Hemiptera. Oxford University. 1991. 274p.

7.
Douglas AE. Phloem-sap feeding by animals: problems and solution. Journal of
Experimental Botany, Oxford, v.57, p.747-754, 2006.
8.
Moran NA, Telang A. Bacteriocyte associated Symbionts of insects. Bioscience,
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9.
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Auchenorrhyncha) da coleo do Museu de Cincias e Tecnologia da PUCRS (MCTP).
Seminrio Interno de Avaliao da Iniciao Cientfica - PUCRS. FAPERGS; 2014.
10.
OBrien LB. New World Fulgoridae, part I: genera with elongate head processes.
Tallahassee. Florida, USA. Entomology, Florida A & M University;1956.
11.
Moran NA, Tran P and Gerardo NM. Symbiosis and Insect Diversication: an Ancient
Symbiont of Sap-Feeding Insects from the Bacterial Phylum Bacteroidetes. Applied and
Environmental Microbiology. 2005 08 23;71(12):8802-8810.
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13.
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PNAS. 2007 05 15;104(1):8627-8633.
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planthoppers (Insecta: Hemiptera: Fulgoroidea). BMC Evolutionary Biology 2012, 12:87. 119.

25

15.
Steele HL and Streit WR. Metagenomics: Advances in ecology and biotechnology.
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16.

Handelsman J. Metagenomics: Application of Genomics

Microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 68, p.669-685, 2004.

to

Uncultured

17.

Paladini A. Filogenia dos Cercopdeos Neotropicais (Hemiptera, Cercopidae,

Tomaspidinae). Curitiba (PR): Universidade Federal do Paran; 2012.

26

APNDICE A - Cronograma

Atividades
Anlise morfolgica dos
espcimes pertencentes a
Fulgora
Seleo dos espcimes para
retirada do abdome

Jan - Abril

Mai - Ago

Set -Dez

Jan - Abril

Mai - Ago

Set - Dez

Realizao do PCR
X

Sequenciamento dos genes

bacterianos

Sequenciamento dos genes de

Fulgora

Extrao de DNA

Edio de sequncias

Alinhamento de todas as
sequncias

Construo das filogenias

X

Cladogramas comparativos

Discusso dos resultados

X

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APNDICE B Oramento

O oramento abaixo requer principalmente a aquisio de materiais para uso no

laboratrio de molecular. O oramento inclui a compra de uma licena do programa
computacional Sequencher (GeneCodes Corporation, Ann Arbor) para o laboratrio de
entomologia, pagamento do servio de sequenciamento pela empresa Macrogen e material de
consumo utilizado no laboratrio molecular diariamente.
Materiais de consumo
QJAGEN DNeasy Blood and Tissue
Kit (150U)
Iniciadores (Primers)

Go Taq Flexi DNA polimerase

Propsito
Kit para extrao de 250
amostras de DNA.
Sntese de fitas de
oligonucleotdeos para
utilizao no PCR.
DNA polimerase para
amplificao.

Sequenciamento na Macrogen
http://dna.macrogen.com/eng/

Desoxiribonucleotdeos
para amplificao por
PCR.
Marcador de peso.
Corante fluorescente para
cidos nucleicos para
observao dos produtos
de PCR aps eletroforese.
Reagentes de uso geral no
laboratrio, por exemplo,
lcool etlico, agarose,
TBE, ponteiras de pipetas,
microtubos de PCR,
luvas, etc.
Propsito
Reaes de purificao,
sequenciamento e leitura
do gel de sequenciamento.

TOTAL

----

Set de dNTPs (100mM)

1kb DNA ladder
GelRed 10,000x in Water (0,5ml)

Outros reagentes e consumveis plsticos

de uso rotineiro no laboratrio de
biologia molecular

Servios de terceiros

Preo (R$)
1.745.00

1.500.00

1.446.00

750.00
700.00
700.00

3.000.00

Preo (R$)

20.000.00
30.000.00