l mtodo original Folin-Ciocalteu reactivo (1) segn lo dado por Lowry y

colaboradores (2) para la estimacin de la protena total. Bensadoun y

Weinstein (3) introducido un cido tricloroactico procedimiento desoxicolato
(DOC-TCA) para la precipitacin cuantitativa de albmina de suero bovino (BSA)
a concentraciones hasta <l pg / ml. Este procedimiento permite el anlisis de
muy diluir soluciones de protenas, junto con la eliminacin de la mayora de
las sustancias que interfieren. Wang y Smith (4) y Dulley y Grieve (5)
encontraron que el sodio dodecilsulfato (SDS) previene la formacin habitual
precipitado resultante de los detergentes no inicos y catinicos. Estos
detergentes son comnmente utilizado en la investigacin de protenas de
membrana. Lees y Paxman (6) tambin encontrado que el SDS en presencia de
lcali es un agente solubilizante eficaz para proteolipdica protenas. La alta
temperatura y la exposicin prolongada a los lcalis tienen ha utilizado para
proporcionar la solubilizacin y desnaturalizacin de proteolipdica adecuada
las protenas y las protenas de membrana, en particular de precipitados de
cido (7-9). Sin embargo, tales condiciones causan la oxidacin de los lpidos
grave, que posteriormente reaccionar (IO) con el ensayo de Lowry et al. (2). De
SDS no lo hace interferir con el ensayo, y en presencia de NaOH permite
inmediata solubilizacin, dejando a los lpidos transparente y que no interfiere
(6).
Bates y McAllister ( 11 ) y Stauffer ( 12 ) han demostrado que el no lineal Lowry
curva estndar de protena se transforma en una funcin lineal representando
grficamente la logaritmo de la absorbancia vs el log de la concentracin de
protena . La protena clculos de este modo se pueden realizar de forma
rpida y objetiva con la pequea programable calculadoras . Finalmente,
Schacterle y Pollack ( 13 ), entre otros han modificado los reactivos Lowry para
obtener un reactivo de cobre alcalino estable, lo que facilita la simplicidad del
ensayo. En este estudio , he reexaminado estas modificaciones con cierto
detalle , confirm y ampliado los descubrimientos originales , y los modificados
en su caso para producir un mtodo consolidado. El resultado es una
simplificada y ms ensayo de protenas generalmente aplicable, modificado a
partir el mtodo de Lowry et al. ( 2 ) .

MTODOS
A. Imagenes de Reactivos
1. -carbonate Cobre-tartrato (CTC). Una solucin de aproximadamente 20% de
sodio carbonato se aade lentamente mientras se agita a una solucin de
cobre sulfatetartrate para dar concentraciones finales de 0,1% de sulfato de
cobre (pentahidrato), Tartrato de potasio 0,2%, carbonato de sodio 10%. Esta
solucin es estable durante por lo menos 2 meses a temperatura ambiente (20
C).
2. 10% de sodio dodecil sulfato (SDS). SDS de Sigma (aproximadamente 95%
de SDS) es comparable en las cualidades requeridas a Sequanal de Pierce
grado SDS, y es menos costoso. Tiene una absorbancia (a 750 nm) de

aproximadamente 0,005 en una concentracin final 1% en el ensayo, que est

controlado por una blanco de reactivo apropiado.
3. 0.8 N de hidrxido de sodio.
4. Folin -CiocaEteu reactivo de fenol. Obtenido de Fisher Scientific como 2 N
solucin.

B. Working Solutions
I. 0.15% desoxicolato de sodio (DOC). El cido tricloroactico
2. 72% (TCA).
3. Albmina de suero bovino (BSA) (mglml OS). Sigma de cristalizado y
liofilizado BSA tiene aproximadamente la misma extincin como su BSA que
est ms preparado como BSA "esencialmente graso libre de cido".
Cualquiera de preparacin es mezclado en cantidad, junto con 1 mg / ml de
azida de sodio, como no interferente agente antibacteriano, y se almacena
congelado (-90 C) en pequeas alcuotas. Alcuotas descongeladas se
almacenan en el refrigerador y se desechan despus de 5 das.
4. Reactivo A. Mezcle partes iguales de acciones de CTC, NaOH, SDS, y H, O.
Esto mantiene al menos 2 semanas a temperatura ambiente (20 C). La
presencia de una pequea cantidad de precipitado oscuro, o un precipitado
floculante blanco (SDS), no afecta el desarrollo del color si sacudido bien antes
de usar. SDS vendr fuera de la solucin ms fcilmente a temperaturas ms
fras , pero redisuelve sobre el calentamiento o la dilucin . Reactivo A se
prepara fresca cuando la oscuridad precipitado se acumula o cuando la
viscosidad se vuelve excesivo (la solucin puede gel despus de varias
semanas ) .
5. Reactivo B. Un volumen de reactivo de fenol de Folin - Ciocalteu se mezcla
con cinco volmenes de agua destilada . Es estable a temperatura ambiente
( 20 C) en una botella mbar .
C. Procedimiento de ensayo
1. ensayo estndar . a. Etapa de precipitacin . Llevar muestra que contiene
entre 5 y 100 pg de protena hasta un volumen total de 1,0 ml con agua
destilada agua. Aadir 0,1 ml de 0,15 % DOC , mezclar y dejar reposar durante
10 minutos a temperatura ambiente ( 20 C ) . Aadir 0,1 ml de TCA 72 % ,
mezcla, y se centrifuga a 3000 g durante 15 min. Se elimina de manera
eficiente el sobrenadante a ser desechada por decantacin inmediatamente
despus de la centrifugacin y girando la boca del tubo abajo sobre un papel
absorbente en un rack . Se retira el fluido restante desde el borde y los lados
del tubo mediante aspiracin antes de devolver el tubo de a la posicin vertical
. El sedimento se guarda para el paso 1.b. Este paso se puede omitir si las
sustancias que interfieren estn ausentes, en insignificante cantidades , o
debidamente controlados [ ver Refs . ( 3 ) , ( 14 ) - ( 18 )] . Si la protena est

demasiado diluida , mltiplos de las proporciones sealadas aqu pueden ser

utilizados para aumentar la protena total recuperada en el precipitado . Sin
embargo, ya tiempos de centrifugacin pueden ser necesarios en tales casos
para asegurar completa granulacin [ ver Ref . ( 3 )] .
b . Paso espectrofotomtrica .
Llevar muestra que contiene entre 5 y 100 pg de protena a un volumen total
de 1 .O ml con agua destilada. Esto es ya sea El sedimento obtenido
anteriormente en la etapa 1 .a. , o alguna parte alcuota si el precipitacin paso
no es necesario . Aadir 1,0 ml de reactivo A , mezclar y dejar reposar durante
10 min a temperatura ambiente ( 20 C). La solubilizacin de la protena
DOCTCA grnulos es inmediata despus additi