Professional Documents
Culture Documents
Figura 5.1. Conjugacin bacteriana. Paso del plsmido F de una clula donadora a una receptora a travs del conducto
proteico denominado pili. Al centro se muestra como slo una de las hebras del DNA del plsmido se inserta en la clula
hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final
ambas clulas presentan al plsmido F.
Algunos plsmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugacin por s mismos, pero pueden ser
transferidos (plsmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plsmidos con genes
tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio
oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugacin, incluyendo los que codifican para la
formacin del pili.
En relacin al plsmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas:
-
Cepa F . Clula bacteriana que no posee un plsmido F, y que acta como clula receptora en la
conjugacin.
Cepa F+. Clula bacteriana que posee un plsmido F independiente del cromosoma bacteriano, acta
como clula donadora en la conjugacin y transfiere al plsmido F a la clula receptora transformndola
en clula F+.
Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plsmido F integrado a su
cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (clula
donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinacin. No transfieren el plsmido F, por lo
que al trmino de la conjugacin de las clulas receptora permanece como F.
Cepa F. Clula bacteriana que posee un plsmido F extracromasmico, pero que antes estuvo
integrado al cromosoma y que se encidi llevando consigo genes bacterianos. Acta como clula
donadora en la conjugacin y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la
clula receptora en una clula F, la cual ser un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendr dos
copias de los genes bacterianos que estn presentes en el plsmido F. A ese tipo de transferencia se
le conoce como sex-duccin.
Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una clula F- en un tiempo constante. Se calcula en
aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta
caracterstica ha sido utilizada en el mapeo gentico localizando un determinado marcador gentico en
un tiempo dado.
2
Material biolgico
Un cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37C.
Un cultivo de E. coli W3110/FKmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37C.
Materiales y equipo
1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estril
5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml)
2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
3 pipetas de 1 mL estriles
100 palillos de madera estriles
1 asa bacteriolgica
1 propipeta
1 mechero
Incubadora a 37C
Bao Mara a 37C
Refrigerador a 4C
Por grupo para controles de las cepas
1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 g/ml)
1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
Desarrollo de la prctica
1. En condiciones estriles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estril y hacer la
siguiente mezcla de conjugacin: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str ms 0.2 mL del cultivo
E. coli W3110/FKmTn3 (Figura 5.2).
2. Incubar el tubo a 37C SIN AGITACIN durante 30 min.
3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la
zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugacin y la zona 3 como bacteria
donadora. Colocar una gota pequea de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se
absorba.
4. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugacin.
5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja
petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estra las cepas donadora y
receptora en cada mitad respectivamente. Incubar a 37C durante 24 h. Al observar crecimiento
refrigerar las cajas.
6. Despus del tiempo de incubacin trabajar con la caja del paso 3. Tomar una asada de las zonas
receptora y de conjugacin y sembrar por estra en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de
estreptomicina, cada una en una caja diferente. Incubar a 37C durante 24 h.
7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2%
sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y despus la
replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias
de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo
para as transferir la bacteria. En la prctica una colonia se transferir con el palillo del cultivo de
bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibitico
3
0.5 mL
E. coli JM1452Str
cepa receptora
0.2 mL
E. coli W3110/FKmTn3
cepa donadora
Mezcla de
conjugacin
Luria-Estreptomicina
Incubar 24 h, 37C
Sembrar por estra las cepas receptora y transconjugante
en Agar Luria-estreptomicina
(se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso)
Incubar 24 a 37C
Cepa receptora
Cepa transconjugante
Referencias
Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467.
Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272.
Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opern lac.
Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
Parchar 50 colonias
Luria- Kanamicina
Luria-Estreptomicina
Luria-Estreptomicina
Luria-Kanamicina
Figura 5.2. Esquema experimental de conjugacin bacteriana. Produccin de una cepa transconjugante, a partir de una cepa
receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la informacin gentica para la resistencia a
kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos.
Cuestionario
1. Qu es un plsmido?
5
Objetivos
Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas.
Realizar la tcnica de transformacin bacteriana.
Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo.
Conocer la definicin de organismo transgnico.
Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.
Introduccin
Desde pocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con caractersticas fenotpicas
deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando
la produccin de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en
promedio 2000 a 3000 litros de leche al ao. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio
de 6000 litros al ao, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una
gallina hace 100 aos produca en promedio 70 huevos al ao, en este siglo las mejores razas
producen cerca de 250 al ao.
Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin
embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por
ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llev a producir a la mula, organismo estril. As, el nmero
de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse slo entre los
miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.
Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de
tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, la ingeniera gentica. Debido a que el
DNA contiene un cdigo gentico esencialmente similar para todos los organismos, en principio se
pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir
organismos con caractersticas tiles y particulares, que de otra manera sera imposible de obtener, los
denominados organismos transgnicos.
Un nmero amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad
de buscar mtodos para introducir o modificar un gene para adquirir una caracterstica deseable, como
por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al
introducir genes no propios al husped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que la
caracterstica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiologa y
sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera indiscriminada a
otros organismos.
Requisitos para construir un vector de clonacin
An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos
del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es
introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un organismo genticamente modificado se
tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de
inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la funcin del gene en el nuevo
husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se
le debe agregar una regin promotora en el extremo 5 del gen para que sea reconocido por el aparato
7
Figura 5.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la
transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; fl ori, origen de
replicacin fl y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonacin
mltiple, el sitio de unin al represor lacI.
Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas
vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una
clula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en esta
clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA
vector con el DNA de inters (inserto) se denomina molcula vector recombinante.
Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer al menos tres
caractersticas (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de
replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonacin
mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan
secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en
la forma y orientacin deseada. 3) Debe poseer marcadores genticos seleccionables que permitan
aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La
mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea
de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una
misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el
8
Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas circunstancias
metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del
donador por uno que asegure su expresin, denominados promotores fuertes, que tambin pueden ser
inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento.
Transformacin
Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la
microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector o bacterias. En
este ltimo caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el factor
Ti ocasiona los sntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se conduce a la
expresin del transgene en la planta. En el caso de la transformacin de bacterias, generalmente se
introduce el DNA extrao por microelectroporacin o por choque trmico.
En el caso del choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con agentes
que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura,
as como de iones que se encargan de cambiar la carga elctrica de la membrana al recubrir las
cabezas polares de lpidos (por ejemplo con iones Ca2+), lo que disminuye la repulsin de cargas
elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la membrana y adems facilita la entrada del plsmido
al interior celular. A las clulas que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la
introduccin de material gentico se denominan clulas competentes.
Posteriormente a la introduccin del material gentico a las clulas competentes, se disminuye la
temperatura y se diluye el calcio, con lo que se permite que se restaure la permeabilidad membranal. Al
colocarlas en una condicin ptima de crecimiento se obtienen las clulas transformantes.
En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se
encuentra insertado el gen de la -lactamasa. Se realizar la transformacin mediante la tcnica de
choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que las clulas son
transformantes.
Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la construccin del vector pETTEM-1. Se inserto el gen que codifica para la -lactamasa en el sitio de clonacin mltiple del vector pET24. El transgene,
ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa. Adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del
gen, a la secuencia que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana
externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo
que la secuencia seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima.
Material biolgico
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo mantenerlas
congeladas hasta su uso.
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo mantenerlas
congeladas hasta su uso.
Plsmido PET-TEM-1.
Materiales y equipo
2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL)
Tubos de microfuga de 1.5 mL
Varilla de vidrio en forma de L
Recipiente para hielo
Mechero Bunsen
Micropipeta de 100-1000L
Micropipeta de 10-100 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Material por grupo
Bao de incubacin a 42C
Incubadora con agitacin a 37C
10
http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
Cuestionario
1. Qu es un organismo transgnico?
2. Cules son las principales diferencias entre los mtodos de reproduccin asistida y la de
produccin de organismos transgnicos para la produccin de organismos mejorados?
3. Cules son las consideraciones ticas que consideras se deben de tomar en cuenta para
producir los organismos transgnicos?
4. Qu es un vector de clonacin?
5. Cules son los requisitos que debe cumplir un vector de clonacin para ser utilizado para
transformar a un organismo?
6. Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica?
7. Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas ya sea de animales, hongos o
plantas.
8. Cul fue el marcador de seleccin de cepas transformantes que se utiliz en la prctica?
9. Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se deben tener
para su manipulacin o almacenamiento?
Referencias
11
12
Reactivos
Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 g/mL)
Solucin GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
3 M Acetato de potasio pH 4.8
70% Etanol
Isopropanol
10 N NaOH
10% SDS
13
14
Inocular
Clulas transformantes
Cuestionario
1. Cules son las propiedades del DNA plasmdico que nos permiten separarlos del DNA
cromosomal o genmico?
2. Explica por qu se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificacin de
plasmidos.
3. Cules son los principales contaminantes de una preparacin de plsmidos?
4. Cmo los eliminas?
5. Cules son los usos que se le dan a los plsmidos una vez purificados?
6. Cules son los mtodos utilizados para cuantificar a los nucletidos?
7. Qu experimento realizaras para determinar si el plsmido que obtuviste se encuentra puro?
8. Porqu a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmdico?
Referencias
Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, John
Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin, WH
Freeman.
15
16
Objetivos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la biotecnologa.
Introduccin
Las endonucleasas de restriccin se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia
usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la molcula
de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biologa molecular,
debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su
capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de restriccin, debido
a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasin por bacteriofagos, es decir, restringen
la invasin por el DNA viral.
Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir segmentos de
DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de
restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simtricas del centro del
palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados
extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de
simetra, produciendo extremos romos (Figura 5.6).
EcoRI
HindIII
HaeIII
Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas
EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce
fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de
la bacteria de donde se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia
coli.
Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las
tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminacin
de secuencias genmicas desde un nucletido hasta cientos de bases, as como en la introduccin de
secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas recombinantes.
Diferentes factores afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los
contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras protenas, el
fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentracin de sales. Los efectos de la
17
Material biolgico
DNA plasmdico purificado de la prctica anterior.
Materiales y equipo
Recipiente para hielo
Tubos para microfuga
Gradilla para tubos de microfuga
Recipientes para teir el gel.
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Vrtex
Horno de microondas
18
Figura 5.7. Preparacin de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendr el gel y B. Adicin de la
agarosa disuelta en TBE.
Preparacin y cargado de las muestras.
1.
Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2
2.
Aadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta para
cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin cruzada.
Tabla 5.1. Preparacin de muestras para aplicar en el gel de agarosa.
Reactivos
Estndar
Plsmido sin
Plsmido digerido Plsmido digerido
(E)
digerir
con una enzima
con dos enzimas
(P)
(R1)
(R2)
Muestra
6 L
3 L
6 L
6 L
H2O
4 L
7 L
4 L
4 L
Amortiguador de
3 L
3 L
3 L
3 L
muestra
3.
4.
5.
Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el lquido en el fondo.
Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tienen que estar orientados
hacia el ctodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota: Procurar colocar la
cmara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se incremente durante la corrida
del gel.
Se toman los 13 L de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra en
la Figura.
20
6.
7.
8.
9.
Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro
con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras
migren hacia el lado positivo de la cmara.
Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observacin de
DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lmpara de luz UV
para visualizar las bandas de DNA. La radiacin ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales
o colocar una pantalla de acrlico entre el observador y la fuente de luz UV.
Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas que estuvieron en contacto
con el bromuro de etidio.
Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de
DNA detectadas. Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as como
del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que se
proporcionaran durante la prctica. Llenar la siguiente tabla.
Referencias
Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2
Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein
Science (1998) A.4I.1-A.4I.3.
Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd.
www.els.net.
Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring
Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317.
Localizacin QH345 L43
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring
Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed.
John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.
Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras analizadas.
Estndar de DNA Plsmido sin restringir Plsmido restringido Plsmido restringido
Banda
con 2 enzimas de
con 1 enzima de
s
restriccin
restriccin
Distancia Pares Distancia Pares de Distancia Pares de Distancia Pares de
en mm
de
en mm
bases
en mm
bases
en mm
bases
bases
estimado
estimado
estimado
1
2
3
4
5
6
7
10.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
5.
22
Objetivos
Introduccin
La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas
como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
protenas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas ms utilizados para este fin, debido a que
son fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos
y se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas
inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en proyectos de
produccin a gran escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas.
A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las protenas de eucariotes o las
protenas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico del
citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, as como las enzimas que se encargan de las
modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por ejemplo,
los sistemas de expresin de bacterias no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin como
los sistemas de clulas de mamfero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las
protenas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es
crtica, aunque el costo de stos sistemas es considerablemente ms alto y la tecnologa que se
necesita es ms complicada. Adicionalmente, la produccin de grandes cantidades de protenas como
algunos productos teraputicos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas animales.
Muchas compaas ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresin muy
variadas, con o sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin
de la protena deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y con
promotores distintos. Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la
expresin de protenas heterlogas.
En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de expresin fuerte del bacteriofago
T7, la expresin de la protena es inducida cuando la clula hospedera provee una cantidad de RNA
polimerasa T7. En unas pocas horas de induccin, la formacin del producto puede llegar a ser ms del
50% de la protena total en la clula. Otro beneficio importante es que en ausencia del inductor la
transcripcin del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia
del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se
estudiar con ms detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora, que
para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de nuestra protena
de inters, se tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el Isopropil -D
tiogalactosido (IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial o
gratuito del opern de la lactosa.
23
1.5 ml
Medio LB-kanamicina
Leer a 600 m.
hasta obtener 0.6-0.8 Abs.
Agregar__________L 100mM IPTG
(concentracin final 0.5 mM)
1 mL
t=0
Incubar a 37 0C / agitacin.
Tomar una alcuota cada 30 min
t=0
1 mL
t = 30 min
1 mL
t = 60 min
1 mL
t = 90 min
1 mL
t = 120 min
25
26
Cuestionario
1. Qu es una protena recombinante?
2. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes de
comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante?
3. Cul es la funcin del IPTG?
4. Cul fue el tiempo en el que produjo la mxima cantidad de protena recombinante?
5. Qu otros parmetros se podran modificar para obtener el mayor rendimiento de la protena?
6. Qu son los cuerpos de inclusin?
7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma soluble o en
forma agregada?
8. Qu mtodo propondra para purificar a la protena recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de manera
comercial, explicando sus usos.
Referencias
Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors
in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442.
Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for
biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in
Protein Science 5.1.1-5.1.8.
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring
Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed.
John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.
27